ЛИГАНДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, КОНЪЮГАТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07H13/06 C07H15/26 C07H21/00 C12N15/113 A61K31/7028 A61K31/7115 A61K31/713 A61K47/54 A61K48/00 A61P1/16 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к технологической области доставки нуклеиновых кислот. Раскрыты лигандные соединения, конъюгаты олигонуклеотидов и способы их получения и применения.

Сведения о предшествующем уровне техники

Азиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR) представляет собой распространенный эндоциклический рецептор гетероолигомеров, который существует преимущественно на поверхности клеточной мембраны паренхиматозных клеток печени, обращенной в сторону синусоидального пространства, и обладает специфичностью к сахару. Поскольку концевая сиаловая кислота гликопротеинов удаляется посредством гидролиза ферментами или ацидолиза, обнаженные предпоследние остатки представляют собой остатки галактозы. Следовательно, специфичностью связывания с сахаром ASGPR на самом деле является галактозил, и его также называют галактозоспецифическим рецептором. ASGPR в основном распределены в паренхиматозных клетках печени и в небольшом количестве содержатся в других клетках. Таким образом, ASGPR обеспечивают возможные рецепторы для таргетного транспорта в печень.

Гликопротеины, оканчивающиеся невосстанавливающими остатками галактозы (Gal) или N-ацетилгалактозамина (GalNAc), могут распознаваться ASGPR, при этом сродство GalNAc к ASGPR примерно в 50 раз выше, чем у Gal (Iobst ST et al, J Biol Chem. 1996, 271 (12) 6686-6693). Эксперименты in vitro показывают, что сродство кластеризованных остатков сахара намного выше, чем сродство некластеризованных остатков сахара, за счет одновременного занятия сайтов связывания с рецептором с порядком сродства тетра-антенные > трех-антенные > > двух-антенные > > одно-антенные галактозиды (Lee Y C, et al, J Biol Chem, 1983, 258 (1): 199-202).

Опосредованная рецептором ASGPR таргетная доставка в печень олигонуклеотида является новым прорывом в области исследований инновационных лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот. В 2012 году компания Alnylam Pharmaceuticals Inc. ковалентно связала трех-антенную структуру GalNAc, ранее изученную с малой интерферирующей РНК (siRNA), для достижения таргетной доставки siRNA в печень in vivo. Используя эту технологию, исследователи разработали лекарственные средства для лечения амилоидоза, гемофилии, гиперхолестеринемии, порфирии, гепатита В и других заболеваний. В 2019 году было одобрено первое лекарственное средство GalNAc-siRNA, при этом еще два лекарственных средства добиваются одобрения. Клинические исследования прошли более десяти лекарственных средств-кандидатов (http://www.alnylam.com/product-pipeline/). В 2014 году компания ISIS Pharmaceuticals из США ковалентно связала трех-антенный GalNAc и антисмысловую нуклеиновую кислоту для достижения таргетной доставки лекарственного средства в печень у животных с 10-кратным увеличением активности антисмысловой нуклеиновой кислоты после связывания (Prakash, T. P. et al, Nucleic Acids Res. 42, 8796-807).

Краткое описание изобретения

В данном изобретении обеспечены химические соединения (например, соединение или фармацевтически приемлемая соль и/или гидрат, и/или сокристалл указанного соединения, и/или комбинация лекарственных средств, содержащая указанное соединение), которые содержат один или несколько фрагментов лиганда для асиалогликопротеинового рецептора (ASGPR). Иллюстративные химические соединения могут дополнительно содержать олигонуклеотид. Указанные химические соединения можно применять, например, для таргетной доставки олигонуклеотидов в клетки печени (например, в паренхиматозные клетки печени). Химические соединения можно применять, например, в лечении состояний или заболеваний, вызванных экспрессией (например, аномальной экспрессией) одного или нескольких генов в клетках печени. В данном изобретении также обеспечены композиции, содержащие указанные соединения, а также способы их применения и изготовления.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает соединения формулы (I):

Формула (I)

или их фармацевтически приемлемую соль, где: R^X, R³, c, R⁴, d и R⁵ могут быть такими, как определено в любой части настоящего документа.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение конъюгата формулы (II):

Формула (II)

или его фармацевтически приемлемую соль, где:

R⁵ представляет собой , где Oligo представляет собой олигонуклеотид, который присоединен к L через 5'-конец, 3'-конец или середину последовательности любой цепи через фосфатную группу; и

-L-, R^X, R³, c, R⁴ и d могут быть такими, как определено для формулы (I) в любой части настоящего документа.

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечены фармацевтические композиции, содержащие химическое соединение, как описано в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечены способы лечения и/или предупреждения патологических состояний или заболеваний у субъекта, где состояния или заболевания вызваны экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени, при этом способ включает введение субъекту химического соединения, как описано в настоящем документе (например, соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли); или фармацевтической композиции, содержащей химическое соединение, как описано в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В дополнительном аспекте в настоящем документе обеспечены способы обнаружения или локализации РНК в печени у субъекта, включающие введение субъекту химического соединения, как описано в настоящем документе (например, соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли); или фармацевтической композиции, содержащей химическое соединение, как описано в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Другие варианты осуществления включают те варианты осуществления, которые описаны в разделе «Подробное описание изобретения» и/или в формуле изобретения.

Дополнительные определения

Для облегчения понимания изобретения, изложенного в настоящем документе, ниже определен ряд дополнительных терминов. Как правило, номенклатура, используемая в настоящем документе, и лабораторные процедуры в органической химии, медицинской химии и фармакологии, описанные в настоящем документе, хорошо известны и широко используются в данной области. Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины, обычно имеют значения, общепринятые среди специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение. Каждый из упомянутых в настоящем документе и прилагаемых приложениях патентов, заявок, опубликованных заявок и других публикаций, полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.

Используемый в настоящем документе термин «олигонуклеотид» относится к олигомерному соединению, содержащему множество связанных химически модифицированных или немодифицированных нуклеотидов длиной менее чем около 100 нуклеотидов, такой как, например, 1-20 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов, 40-60 нуклеотидов, 60-80 нуклеотидов, 80-100 нуклеотидов или 1-50 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид может включать группу конъюгата, не содержащую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит рибонуклеиновую кислоту (РНК), дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК). В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид является двухцепочечным или одноцепочечным. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой siRNA, аптамер, антисмысловую нуклеиновую кислоту, sgRNA, tractRNA или crRNA.

Используемый в настоящем документе термин «конъюгат» или «группа конъюгата» означает атом или группу атомов, связанную с олигонуклеотидом. В некоторых случаях группы конъюгата изменяют одно или более свойств олигонуклеотида, с которым они связаны, включая, но без ограничения, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, поглощения, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.

Используемый в настоящем документе термин «рецептор» относится к биологической макромолекуле, состоящей из гликопротеинов или липопротеинов, присутствующей в клеточной мембране, цитоплазме или ядре клетки, при этом различные рецепторы имеют специфические структуры и конфигурации. Используемый в настоящем документе термин «лиганд» относится к веществу, которое обладает способностью распознавать рецептор и связываться с ним. В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой лиганд, обладающий сродством к рецептору асиалогликопротеина (ASGPR). В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой углевод, такой как моносахариды и полисахариды, включая, но без ограничения: галактозу, N-ацетилгалактозамин, маннозу, глюкозу, глюкозамин и фукозу.

Используемый в настоящем документе термин «полисахарид» относится к полимеру, образованному из множества моносахаридных групп, связанных гликозидными связями. В настоящем изобретении полисахариды включают олигозы и олигосахариды. Как правило, «олигоза» относится к полимеру, состоящему из 2-10 моносахаридных групп, связанных гликозидными связями, и «олигосахарид» относится к полимеру, состоящему из менее чем 20 моносахаридных групп, связанных гликозидными связями.

Используемый в настоящем документе термин «около» должен быть понятен для специалистов в данной области техники и величина, к которой он относится, будет варьироваться до некоторой степени в зависимости от контекста, в котором он используется. В случае, если специалистам в данной области не ясен смысл указанного термина в контексте, в котором он используется, термин «около» следует понимать как плюс или минус 10% от конкретной величины или диапазона.

Используемый в настоящем документе термин «предупреждение» относится к предупреждению или отсрочке начала заболевания.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» относится к излечению или по меньшей мере частичной остановке прогрессирования заболевания, или облегчению симптомов заболевания.

Используемый в настоящем документе термин «эффективное количество» относится к количеству, эффективному для достижения намеченной цели. Например, количество, эффективное для предупреждения заболевания, относится к количеству, эффективному для предупреждения, остановки или отсрочки начала заболевания. Определение таких эффективных количеств находится в компетенции специалиста в данной области.

Используемый в настоящем документе термин «приемлемый» в отношении состава, композиции или ингредиента означает отсутствие стойкого вредного воздействия на общее состояние здоровья субъекта, подвергаемого лечению.

«API» относится к активному фармацевтическому ингредиенту.

Термин «вспомогательное вещество» или «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, носитель, растворитель или инкапсулирующий материал. В одном варианте осуществления каждый компонент является «фармацевтически приемлемым» в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами фармацевтического состава и подходит для применения в контакте с тканями или органами человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции, иммуногенности или других проблем или осложнений, сопоставимых с разумным соотношением польза/риск. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к составу соединения, который не вызывает значительного раздражения в организме, в который его вводят, и не аннулирует биологическую активность и свойства соединения. В некоторых случаях фармацевтически приемлемые соли получают путем реакции соединения, описанного в настоящем документе, с кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п. В некоторых случаях фармацевтически приемлемые соли получают путем реакции соединения, описанного в настоящем документе, имеющего кислотную группу, с основанием с образованием соли, такой как соль аммония, соль щелочного металла, такая как соль натрия или калия, соль щелочноземельного металла, такая как соль кальция или магния, соль органических оснований, такая как дициклогексиламин, N-метил-D-глюкамин, трис(гидроксиметил)метиламин, и соли с аминокислотами, такими как аргинин, лизин и т.п., или с помощью других способов, определенных ранее. Фармакологически приемлемая соль конкретно не ограничена, пока ее можно использовать в лекарственных средствах. Примеры солей, которые образуют соединения, описанные в настоящем документе, с основанием, включают следующие: их соли с неорганическими основаниями, такими как натрий, калий, магний, кальций и алюминий; их соли с органическими основаниями, такими как метиламин, этиламин и этаноламин; их соли с основными аминокислотами, такими как лизин и орнитин; и соль аммония. Соли могут представлять собой кислотно-аддитивные соли, которые конкретно представлены кислотно-аддитивными солями, образуемыми со следующими кислотами: минеральными кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота; органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, метансульфоновая кислота и этансульфоновая кислота; кислыми аминокислотами, такими как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к смеси соединения, описанного в настоящем документе, с другими химическими компонентами (обозначаемыми в настоящем документе как «вспомогательные вещества»), такими как носители, стабилизаторы, разбавители, диспергирующие агенты, суспендирующие агенты и/или загустители. Фармацевтическая композиция облегчает введение соединения в организм. В данной области техники существует множество способов введения соединения, включая, но без ограничения: ректальное, пероральное, внутривенное, аэрозольное, парентеральное, глазное, легочное и местное введение.

Термин «субъект» относится к животному, включая, но без ограничения, примата (например, человека), обезьяну, корову, свинью, овцу, козу, лошадь, собаку, кошку, кролика, крысу или мышь. Термины «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо в отношении, например, субъекта-млекопитающего, такого как человек.

Термин «генозависимое заболевание» относится к заболеванию, которое возникает в результате аномальной экспрессии одного или нескольких генов и/или аномальной активности белков, экспрессируемых этими генами. Точно так же эти гены известны как гены, связанные с заболеванием.

Термин «галогено» относится к фтору (F), хлору (Cl), брому (Br) или йоду (I).

Термин «алкил» относится к углеводородной цепи, которая может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь, содержащую указанное число атомов углерода. Например, C_1-10 означает, что группа может содержать от 1 до 10 (включительно) атомов углерода. Неограничивающие примеры включают метил, этил, изопропил, трет-бутил, н-гексил.

Термин «галогеналкил» относится к алкилу, в котором один или несколько атомов водорода заменены на независимо выбранный галогено (например, -CF₃).

Термин «алкокси» относится к -O-алкильному радикалу (например, -OCH₃).

Термин «алкилен» относится к двухвалентному алкилу (например, -CH₂-).

Термин «алкенил» относится к углеводородной цепи, которая может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь, имеющую одну или несколько углерод-углеродных двойных связей. Алкенильный фрагмент содержит указанное число атомов углерода. Например, C_2-6 означает, что группа может содержать от 2 до 6 (включительно) атомов углерода.

Термин «алкинил» относится к углеводородной цепи, которая может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь, имеющую одну или несколько тройных углерод-углеродных связей. Алкинильный фрагмент содержит указанное число атомов углерода. Например, C_2-6 означает, что группа может содержать от 2 до 6 (включительно) атомов углерода.

Термин «арил» относится к моно-, би-, три- или полициклической группе с 6-20 атомами углерода, в которой по меньшей мере одно кольцо в системе является ароматическим (например, моноциклическая с 6 атомами углерода, бициклическая с 10 атомами углерода или бициклическая с 14 атомами углерода ароматическая кольцевая система); и где 0, 1, 2, 3 или 4 атома каждого кольца могут быть замещены заместителем. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, тетрагидронафтил и т.п.

Используемый в настоящем документе термин «циклоалкил» включает неароматические циклические углеводородные группы, имеющие от 3 до 20 атомов углерода в кольце, предпочтительно от 3 до 16 атомов углерода в кольце и более предпочтительно от 3 до 12 атомов углерода в кольце, или 3-10 атомов углерода в кольце, или 3-6 атомов углерода в кольце, где циклоалкильная группа может быть необязательно замещенной. Циклоалкильные группы могут иметь любую степень насыщения при условии, что ни одно из колец в кольцевой системе не является ароматическим. Соответственно, циклоалкил может быть полностью насыщенным. Неограничивающие примеры включают: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. Циклоалкил может также включать частично ненасыщенные циклические углеводородные группы, имеющие от 3 до 20 атомов углерода в кольце, предпочтительно от 3 до 16 атомов углерода в кольце и более предпочтительно от 3 до 12 атомов углерода в кольце, или 3-10 атомов углерода в кольце, или 3-6 атомов углерода в кольце. Неограничивающие примеры могут включать циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил и циклооктенил. Циклоалкил может включать множество конденсированных и/или мостиковых колец. Неограничивающие примеры конденсированного/мостикового циклоалкила включают: бицикло[1.1.0]бутан, бицикло[2.1.0]пентан, бицикло[1.1.1]пентан, бицикло[3.1.0]гексан, бицикло[2.1.1]гексан, бицикло[3.2.0]гептан, бицикло[4.1.0]гептан, бицикло[2.2.1]гептан, бицикло[3.1.1]гептан, бицикло[4.2.0]октан, бицикло[3.2.1]октан, бицикло[2.2.2]октан и т.п. Циклоалкил также включает спироциклические кольца (например, спироциклический бицикл, в котором два кольца соединены только через один атом). Неограничивающие примеры спироциклических циклоалкилов включают спиро[2.2]пентан, спиро[2.5]октан, спиро[3.5]нонан, спиро[3.5]нонан, спиро[3.5]нонан, спиро[4.4]нонан, спиро[2.6]нонан, спиро[4.5]декан, спиро[3.6]декан, спиро[5.5]ундекан и т.п.

Используемый в настоящем документе термин «гетероарил» означает моно-, би-, три- или полициклическую группу, содержащую от 5 до 20 атомов в кольце, альтернативно, 5, 6, 9, 10 или 14 атомов в кольце; и имеющую 6, 10 или 14 пи-электронов, разделенных в циклическом ряду; где по меньшей мере одно кольцо в системе является ароматическим (но не обязательно должно быть кольцом, которое содержит гетероатом, например, тетрагидроизохинолинил, например, тетрагидрохинолинил), и по меньшей мере одно кольцо в системе содержит один или несколько гетероатомов, независимо выбранных из группы состоящий из N, O и S. Гетероарильные группы могут быть незамещенными или замещенными одним или несколькими заместителями. Примеры гетероарила включают тиенил, пиридинил, фурил, оксазолил, оксадиазолил, пирролил, имидазолил, триазолил, тиодиазолил, пиразолил, изоксазолил, тиадиазолил, пиранил, пиримидинил, пиридазинил, триазинил, тиазолил, бензотиенил, бензоксадиазолил, бензофуранил, бензимидазолил, бензотриазолил, циннолинил, индазолил, индолил, изохинолинил, изотиазолил, нафтиридинил, пуринил, тиенопиридинил, пиридо[2,3-d]пиримидинил, пирроло[2,3-b]пиридинил, хиназолинил, хинолинил, тиено[2,3-c]пиридинил, пиразоло[3,4-b]пиридинил, пиразоло[3,4-c]пиридинил, пиразоло[4,3-c]пиридин, пиразоло[4,3-b]пиридинил, тетразолил, хроман, 2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин, бензо[d][1,3]диоксол, 2,3-дигидробензофуран, тетрагидрохинолин, 2,3-дигидробензо[b][1,4]оксатиин, изоиндолин и другие. В некоторых вариантах осуществления гетероарил выбран из тиенила, пиридинила, фурила, пиразолила, имидазолила, изоиндолинила, пиранила, пиразинила и пиримидинила.

Термин «гетероциклил» относится к моно-, би-, три- или полициклической неароматической кольцевой системе с 3-16 атомами в кольце (например, 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической кольцевой системе), содержащей 1-3 гетероатома в случае моноциклической, 1-6 гетероатомов в случае бициклической, или 1-9 гетероатомов в случае трициклической или полициклической, при этом указанные гетероатомы выбраны из O, N или S (например, атомы углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов N, O или S в случае моноциклической, бициклической или трициклической, соответственно), где 0, 1, 2 или 3 атома каждого кольца могут быть замещены заместителем. Примеры гетероциклильных групп включают пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрагидрофуранил и т.п. Гетероциклил может включать несколько конденсированных и мостиковых колец. Неограничивающие примеры конденсированного/мостикового гетероциклила включают: 2-азабицикло[1.1.0]бутан, 2-азабицикло[2.1.0]пентан, 2-азабицикло[1.1.1]пентан, 3-азабицикло[3.1.0]гексан, 5-азабицикло[2.1.1]гексан, 3-азабицикло[3.2.0]гептан, октагидроциклопента[c]пиррол, 3-азабицикло[4.1.0]гептан, 7-азабицикло[2.2.1]гептан, 6-азабицикло[3.1.1]гептан, 7-азабицикло[4.2.0]октан, 2-азабицикло[2.2.2]октан, 3-азабицикло[3.2.1]октан, 2-оксабицикло[1.1.0]бутан, 2-оксабицикло[2.1.0]пентан, 2-оксабицикло[1.1.1]пентан, 3-оксабицикло[3.1.0]гексан, 5-оксабицикло[2.1.1]гексан, 3-оксабицикло[3.2.0]гептан, 3-оксабицикло[4.1.0]гептан, 7-оксабицикло[2.2.1]гептан, 6-оксабицикло[3.1.1]гептан, 7-оксабицикло[4.2.0]октан, 2-оксабицикло[2.2.2]октан, 3-оксабицикло[3.2.1]октан и т.п. Гетероциклил также включает спироциклические кольца (например, спироциклический бицикл, в котором два кольца соединены только одним атомом). Неограничивающие примеры спироциклических гетероциклилов включают 2-азаспиро[2.2]пентан, 4-азаспиро[2.5]октан, 1-азаспиро[3.5]нонан, 2-азаспиро[3.5]нонан, 7-азаспиро[3.5]нонан, 2-азаспиро[4.4]нонан, 6-азаспиро[2.6]нонан, 1,7-диазаспиро[4.5]декан, 7-азаспиро[4.5]декан, 2,5-диазаспиро[3.6]декан, 3-азаспиро[5.5]ундекан, 2-оксаспиро[2.2]пентан, 4-оксаспиро[2.5]октан, 1-оксаспиро[3.5]нонан, 2-оксаспиро[3.5]нонан, 7-оксаспиро[3.5]нонан, 2-оксаспиро[4.4]нонан, 6-оксаспиро [2.6]нонан, 1,7-диоксаспиро[4.5]декан, 2,5-диоксаспиро[3.6]декан, 1-оксаспиро[5.5]ундекан, 3-оксаспиро[5.5]ундекан, 3-окса-9-азаспиро[5.5]ундекан и т.п.

Кроме того, предполагается, что атомы, составляющие соединения по настоящим вариантам осуществления, включают все изотопные формы таких атомов. Изотопы, используемые в настоящем документе, включают атомы, имеющие одинаковый атомный номер, но разные массовые числа. В качестве общего примера и без ограничения изотопы водорода включают тритий и дейтерий, а изотопы углерода включают ¹³С и ¹⁴С.

Кроме того, предполагается, что соединения, раскрытые в настоящем документе в целом или конкретно, включают все таутомерные формы. Так, например, соединение, содержащее фрагмент: , включает таутомерную форму, содержащую фрагмент: . Точно так же пиридинильная или пиримидинильная группа, которая, как описано, необязательно замещена гидроксилом, включает таутомерные формы пиридона или пиримидона.

Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления изобретения представлены на прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей, а также из формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение обеспечивает химические соединения (например, соединение или фармацевтически приемлемую соль и/или гидрат, и/или сокристалл указанного соединения, и/или комбинацию лекарственных средств, содержащую указанное соединение), которые содержат один или несколько фрагментов лиганда для рецептора асиалогликопротеина (ASGPR). Иллюстративные химические соединения могут дополнительно содержать олигонуклеотид. Указанные химические соединения можно применять, например, в таргетной доставке олигонуклеотидов в клетки печени (например, в паренхиматозные клетки печени). Химические соединения можно применять, например, в лечении состояний или заболеваний, вызванных экспрессией (например, аномальной экспрессией) одного или нескольких генов в клетках печени. Данное изобретение также обеспечивает композиции, содержащие указанные соединения, а также способы их применения и изготовления.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединения формулы (I):

Формула (I)

или их фармацевтически приемлемую соль, где:

каждый R^X независимо выбран из группы, состоящей из:

- H;

- -CH₂OR^X2, где R^X2 представляет собой H, C_1-6 алкил или защитную группу для гидроксильной группы; и

- (A1),

при условии, что по меньшей мере один R^X представляет собой группу формулы (A1);

каждый R¹ представляет собой независимо выбранную группу, способную к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPR);

каждый R² независимо выбран из группы, состоящей из: -C(R⁶)₂-; -OC(R⁶)₂C(R⁶)₂O-; -C(R⁶)(OH)-C(R⁶)(OH)-; *-C(=O)NR⁷-; *-NR⁷C(=O)-; C_6-10 арилена; C_2-6 алкенилена; и C_2-6 алкинилена,

где каждый из C_6-10 арилена, C_2-6 алкенилена и C_2-6 алкинилена необязательно замещен 1-4 заместителями, независимо выбранными из R^a, и * представляет точку присоединения к ;

R³ выбран из группы, состоящей из:

- ; , где aa представляет точку присоединения к ;

- -(CR⁶R⁶)_x-O-(CR⁶R⁶)_y-, где x и y независимо равны 0, 1, 2 или 3; и

- -L³-L^3C-, где L^3C выбран из группы, состоящей из: C_3-10 циклоалкилена, C_6-10 арилена, 5-10-членного гетероарилена и 4-10-членного гетероциклилена, каждый из которых необязательно замещен 1-4 заместителями, независимо выбранными из R^a;

-L³ представляет собой -C(R⁶)₂-,

R⁴ выбран из группы, состоящей из: -C(R⁶)₂-; -OC(R⁶)₂C(R⁶)₂O-; *-C(=O)NR⁷-; *-NR⁷C(=O)-; C_6-10 арилена, C_3-10 циклоалкилена, 5-10-членного гетероарилена и 4-10-членного гетероциклилена,

где каждый из C_6-10 арилена, C_3-10 циклоалкилена, 5-10-членного гетероарилена и 4-10-членного гетероциклилена независимо замещен 1-4 независимо выбранным R^a, и

где * представляет точку присоединения к ;

R⁵ выбран из группы, состоящей из:

- гидроксила; C(O)OH;

- , где Pg представляет собой группу, активирующую карбоксильную группу, или защитную группу для карбоксильной группы;

- ; , где Z представляет собой защитную группу для гидроксильной группы;

- , где Pg² представляет собой защитную группу для гидроксильной группы; и

- , где: L представляет собой связь или двухвалентную группу, выбранную из группы, состоящей из:

- -R²-, -R³-, -R⁴-, -O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-,

- , , где Pg³ представляет собой H или Pg²;

- , , где Z² представляет собой H или защитную группу для гидроксильной группы; и

- или ;

где bb представляет точку присоединения к Oligo, и

- Oligo представляет собой олигонуклеотид;

каждый R⁶ независимо выбран из группы, состоящей из: H; C_1-3 алкила; C_1-3 галогеналкила; и галогено;

каждый R⁷ независимо выбран из группы, состоящей из: H; и C_1-3 алкила.

каждое a и b независимо выбрано из целых чисел от 1 до 10;

каждое c и d независимо выбрано из целых чисел от 1 до 10; и

при каждом появлении, R^a независимо выбран из группы, состоящей из: галогено, циано, C_1-6 алкила, C_1-6 галогеналкила, C_1-6 алкокси и C_1-6 галогеналкокси.

Переменная R^X

В некоторых вариантах осуществления каждый R^X выбран из группы, состоящей из:

- H; и

- (A1),

В некоторых вариантах осуществления каждый R^X выбран из группы, состоящей из:

- -CH₂OR^X2, где R^X2 представляет собой H, C_1-6 алкил или защитную группу для гидроксильной группы; и

- (A1).

В некоторых вариантах осуществления защитная группа для гидроксильной группы выбрана из группы, состоящей из: силильной защитной группы; 4-монометокситритила (MMTR); 4,4-диметокситритила (DMTR); и тритила.

В некоторых из этих вариантов осуществления силильная защитная группа выбрана из группы, состоящей из: трет-бутилдиметилсилила (TBMDS); трет-бутилдифенилсилила (TBDPS) и триизопропилсилила (TIPS).

В некоторых вариантах осуществления каждый из по меньшей мере двух R^X независимо представляет собой группу формулы (A1).

В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R^X независимо представляет собой группу формулы (A1).

В некоторых вариантах осуществления каждый R^X представляет собой основание формулы (A1); и каждый R^X является одинаковым.

Переменная R¹

В некоторых вариантах осуществления каждый R¹ представляет собой независимо выбранный углеводный фрагмент. В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R¹ независимо представляет собой моносахарид или полисахарид (например, моносахарид или дисахарид). В некоторых вариантах осуществления каждый R¹ выбран из группы, состоящей из: галактозы, N-ацетилгалактозамина, маннозы, глюкозы, глюкозамина и фукозы. В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R¹ является одинаковым.

В некоторых вариантах осуществления каждый R¹ независимо представляет собой группу формулы (B1) или (B2):

(B1)

(B2)

где:

R^D выбран из группы, состоящей из: R^C и ;

каждый R^B независимо выбран из группы, состоящей из: -NR^ER^F и -OR^C;

каждый R^C независимо выбран из группы, состоящей из: H и C(=O)C_1-6 алкила;

каждый R^E независимо представляет собой C(=O)C_1-6 алкил;

каждый R^F независимо выбран из группы, состоящей из: H и ;

R^G представляет собой C_1-6 алкил; и

каждый q независимо представляет собой целое число от 1 до 10.

В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R¹ независимо представляет собой группу, имеющую формулу (B1-a), (B1-b) или (B2-a):

Формула (B1-a)

Формула (B1-b)

Формула (B2-a).

В некоторых вариантах осуществления формулы (B1), (B2), (B1-a), (B1-b) или (B2-a) каждый R^B независимо представляет собой NR^ER^F. В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R^E независимо представляет собой C(=O)C_1-6 алкил. Например, каждый R^E может представлять собой C(=O)CH₃. В некоторых вариантах осуществления каждый R^F представляет собой H. В некоторых вариантах осуществления каждый R^F представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления формулы (B1), (B2), (B1-a), (B1-b) или (B2-a) каждый R^B представляет собой NHC(=O)CH₃.

В некоторых вариантах осуществления формулы (B1), (B2), (B1-a), (B1-b) или (B2-a) каждый R^B представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления формулы (B1), (B2), (B1-a), (B1-b) или (B2-a), каждый R^B независимо представляет собой -OR^C.

В некоторых вариантах осуществления формулы (B1), (B2), (B1-a), (B1-b) или (B2-a), каждый R^C независимо представляет собой C(=O)C_1-6 алкил. Например, каждый R^C может представлять собой C(=O)CH₃.

В некоторых вариантах осуществления формулы (B1), (B2), (B1-a), (B1-b) или (B2-a), каждый R^C представляет собой H.

В некоторых вариантах осуществления формулы (B2) или (B2-a) каждый R^G представляет собой CH₃.

В некоторых вариантах осуществления каждый R¹ выбран из группы, состоящей из следующего:

где q представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10;
где q' представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10;
где q представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10;
где q' представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10.

В некоторых вариантах осуществления каждый R¹ является одинаковым.

Например, каждый R¹ может представлять собой . В другом неограничивающем примере каждый R¹ может представлять собой .

Переменные R², a и b

В некоторых вариантах осуществления каждый R² независимо представляет собой *-C(=O)NR⁷- или *-NR⁷C(=O)-. В некоторых вариантах осуществления каждый R² независимо представляет собой *-C(=O)NR⁷-. В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R² представляет собой *-C(=O)NH-.

В некоторых вариантах осуществления каждый R² независимо представляет собой -C(R⁶)₂-. В некоторых из этих вариантов осуществления каждый R² представляет собой -CH₂-. В некоторых вариантах осуществления каждый R² является одинаковым.

В некоторых вариантах осуществления каждое a независимо равно 1, 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления каждое a независимо равно 5, 6 или 7. В некоторых вариантах осуществления каждое a независимо равно 8, 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления каждое a независимо выбрано из целого числа от 1 до 4. В некоторых вариантах осуществления каждое a независимо равно 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления каждое a является одинаковым.

В некоторых вариантах осуществления каждое b независимо равно 1, 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления каждое b независимо равно 5, 6 или 7. В некоторых вариантах осуществления каждое b независимо равно 8, 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления каждое b представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 4. В некоторых из этих вариантов осуществления каждое b независимо равно 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления каждое b является одинаковым.

В некоторых вариантах осуществления, каждое a является одинаковым; каждое b является одинаковым; и каждый R² является одинаковым.

В некоторых из этих вариантов осуществления a представляет собой целое число от 1 до 4; b представляет собой целое число от 1 до 4; и R² представляет собой *-C(=O)NR⁷. Например, a может быть равно 3; b может быть равно 3; и R² может представлять собой *-C(=O)NH.

В некоторых вариантах осуществления (когда каждое a является одинаковым; каждое b является одинаковым; и каждый R² является одинаковым), a является целым числом от 1 до 4; b является целым числом от 1 до 4; и R² представляет собой -C(R⁶)₂-. Например, R² может представлять собой -CH₂-; и 3≤(a+b)≤5.

Переменная R³

В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой или .

В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления R³ представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой -C(R⁶)₂-. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой -CH₂-.

Переменная R⁴, c и d

В некоторых вариантах осуществления c независимо равно 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления c независимо равно 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления c независимо равно 5, 6 или 7. В некоторых вариантах осуществления c независимо равно 8, 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления c является целым числом от 1 до 2.

В некоторых вариантах осуществления c является целым числом от 2 до 5.

В некоторых вариантах осуществления c является целым числом от 3 до 7.

В некоторых вариантах осуществления R⁴ представляет собой *-C(=O)NR⁷-. В некоторых из этих вариантов осуществления R⁴ представляет собой *-C(=O)NH-.

В некоторых вариантах осуществления R⁴ представляет собой -C(R⁶)₂-. В некоторых из этих вариантов осуществления R⁴ представляет собой -CH₂-.

В некоторых вариантах осуществления d независимо равно 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления d независимо равно 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления d независимо равно 5, 6 или 7. В некоторых вариантах осуществления d независимо равно 8, 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления d является целым числом от 1 до 2.

В некоторых вариантах осуществления d является целым числом от 3 до 7.

В некоторых вариантах осуществления R⁴ представляет собой -C(R⁶)₂-; и каждое из c и d независимо равно 1 или 2. В некоторых из этих вариантов осуществления R⁴ представляет собой -CH₂-; и каждое из c и d равно 1.

В некоторых вариантах осуществления R⁴ представляет собой -C(R⁶)₂-; и 4≤(c + d) ≤12. В некоторых из этих вариантов осуществления R⁴ представляет собой -CH₂-; и 7 ≤ (c + d) ≤ 10.

В некоторых вариантах осуществления R⁴ представляет собой *-C(=O)NR⁷-; и 5 ≤ (c + d) ≤ 10. В некоторых из этих вариантов осуществления R⁴ представляет собой *-C(=O)NR⁷-; и 7 ≤ (c + d) ≤ 9. В некоторых из вышеуказанных вариантов осуществления c равно 3.

Неограничивающие комбинации

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) выбрано из группы, состоящей из следующих соединений:

Переменная R⁵

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой C(O)OH или .

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой C(O)OH.

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой . В некоторых вариантах осуществления Pg представляет собой группу, активирующую карбоксильную группу. Используемый в настоящем документе термин «группа, активирующая карбоксильную группу» представляет собой химическую группу, которая при ковалентном связывании с атомом кислорода карбоксильной группы превращает указанный атом кислорода в уходящую группу. Соответственно, когда Pg является группой, активирующей карбоксильную группу, группа «-O-Pg» в является уходящей группой. Неограничивающие примеры групп, активирующих карбоксильную группу, включают N-центрированный гетероциклил (например, сукцинимидил) и электронодефицитные гетероарил и арил (например, пентафторфенил).

В некоторых вариантах осуществления Pg представляет собой , где кольцо D представляет собой 5-10-членный гетероарил или 4-10-членный гетероциклил, каждый из которых необязательно замещен 1-6 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из: галогено, оксо, NO₂, C(O)C_1-4 алкила, C(O)OC_1-4 алкила, S(O)C_1-4 алкила, C_1-6 алкила, C_1-6 галогеналкила и -OH. Например, Pg может представлять собой . В качестве еще одного неограничивающего примера Pg может представлять собой , который необязательно замещен 1-6 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из: галогено, NO₂, C(O)C_1-4 алкила, C(O)OC_1-4 алкила, S(O)C_1-4 алкила, C_1-6 алкила, C_1-6 галогеналкила и -OH (например, незамещенный или замещенный 1-6 независимо выбранным галогено).

В некоторых вариантах осуществления Pg представляет собой С_6-10 арил или 5-10-членный гетероарил, замещенный 1-6 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из: -F; -Cl; -NO₂; C(O)C_1-4 алкила, C(O)OC_1-4 алкила и S(O)C_1-4 алкила.

В некоторых из этих вариантов осуществления Pg представляет собой , где p представляет собой целое число от 1 до 5; и каждый R^p представляет собой -F, -Cl или -NO₂. В некоторых вариантах осуществления каждый R^p представляет собой -F. В качестве неограничивающего примера вышеуказанных вариантов осуществления Pg может представлять собой .

В некоторых вариантах осуществления, R⁵ представляет собой или .

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R⁵ представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления каждый из Pg² и Z независимо выбран из группы, состоящей из: силильной защитной группы; 4-монометокситритила (MMTR); 4,4-диметокситритила (DMTR); и тритила.

В некоторых из этих вариантов осуществления силильная защитная группа выбрана из группы, состоящей из: трет-бутилдиметилсилила (TBMDS); трет-бутилдифенилсилила (TBDPS) и триизопропилсилила (TIPS).

Неограничивающие иллюстративные соединения

В некоторых вариантах осуществления соединение выбрано из группы, состоящей из соединений с GalNAc-1 по GalNAc-12. Например, соединение может быть выбрано из группы, состоящей из соединений с GalNAc-1 по GalNAc-10.

GalNAc-1

GalNAc-2

GalNAc-3

GalNAc-4

GalNAc-5

GalNAc-6

GalNAc-7:

GalNAc-8:

GalNAc-9:

GalNAc-10:

GalNAc-11:

GalNAc-12:

GalNAc-13

GalNAc-14

GalNAc-13 и GalNAc-14 можно использовать, например, в качестве промежуточных соединений при получении соединений формулы (I).

Соединения конъюгата

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение конъюгата формулы (II):

Формула (II)

или его фармацевтически приемлемую соль, где:

R⁵ представляет собой , где Oligo представляет собой олигонуклеотид; и

-L-, R^X (включая R¹, R², a и b), R³, c, R⁴, и d могут быть такими, как определено для формулы (I) в других частях в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления Oligo представляет собой олигонуклеотид, который присоединен к L через 5'-конец, 3'-конец или середину последовательности любой цепи через фосфатную группу.

Переменная L

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой связь.

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой C(=O).

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой -O-.

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой , где bb является точкой присоединения к Oligo.

В некоторых вариантах осуществления L выбран из группы, состоящей из: и .

В некоторых из этих вариантов осуществления, L представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления, Pg³ представляет собой H. В некоторых вариантах осуществления, Pg³ представляет собой защитную группу для гидроксильной группы.

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления Z² представляет собой H. В некоторых вариантах осуществления Z² представляет собой защитную группу для гидроксильной группы.

В некоторых вариантах осуществления защитная группа для гидроксильной группы выбрана из группы, состоящей из: силильной защитной группы; 4-монометокситритила (MMTR); 4,4-диметокситритила (DMTR); и тритила.

В некоторых из этих вариантов осуществления силильная защитная группа выбрана из группы, состоящей из: трет-бутилдиметилсилила (TBMDS); трет-бутилдифенилсилила (TBDPS) и триизопропилсилила (TIPS).

Олигонуклеотидный фрагмент

В некоторых вариантах осуществления Oligo представляет собой олигонуклеотид, который содержит одноцепочечный олигонуклеотид и/или двухцепочечный олигонуклеотид.

В некоторых из этих вариантов осуществления Oligo представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления Oligo представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид.

В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из: siRNA, miRNA, pre-miRNA, антагомира, мРНК, антисмыслового олигонуклеотида (ASO), аптамера, crRNA, tracRNA и sgRNA.

Олигонуклеотид в настоящем документе может содержать немодифицированные нуклеотиды и/или модифицированные нуклеотиды. Неограничивающие примеры модифицированных нуклеотидов включают: 2'-O-(2-метоксиэтил)-модифицированные нуклеотиды; 2'-O-алкил-модифицированные нуклеотиды (например, 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды); 2'-O-аллил-модифицированные нуклеотиды; 2'-C-аллил-модифицированные нуклеотиды; 2'-фтор-модифицированные нуклеотиды; 2'-дезокси-модифицированные нуклеотиды; 2'-гидрокси-модифицированные нуклеотиды; нуклеотиды, модифицированные запертыми нуклеиновыми кислотами (LNA); нуклеотиды, модифицированные гекситолнуклеиновыми кислотами (HNA); нуклеотиды, модифицированные гликоль-нуклеиновыми кислотами (GNA), и нуклеотиды, модифицированные незапертыми нуклеиновыми кислотами (UNA). В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из: 2'-O-алкил-модифицированных нуклеотидов, и 2'-фтор-модифицированных нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит модифицирующую группу, при этом модифицирующая группа выбрана из группы, состоящей из: холестерина, полиэтиленгликоля, флуоресцентных зондов, биотина, полипептидов, витаминов, направленных на ткани молекул и их комбинации. В некоторых из этих вариантов осуществления модифицирующая группа представляет собой концевую модифицирующую группу.

Oligo может быть присоединен к L через 5'-конец, 3'-конец или середину последовательности любой цепи через фосфатную группу. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа представляет собой фосфодиэфирную группу. В некоторых вариантах осуществления фосфатная группа представляет собой модифицированную фосфатную группу. В некоторых из этих вариантов осуществления модифицированная фосфатная группа выбрана из одного или нескольких из: тио-модифицированного фосфата (например, фосфоротиоата) и амино-модифицированного фосфата.

В некоторых вариантах осуществления Oligo содержит одну или несколько пептидных нуклеиновых кислот и/или морфолино-нуклеиновых кислот (например, морфолино антисмысловые олигонуклеотиды).

В некоторых вариантах осуществления Oligo представляет собой олигонуклеотид, состоящий из 5-100 основных пар. Например, Oligo может представлять собой олигонуклеотид, состоящий из 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 или 90-100 основных пар.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (II) синтезируют посредством твердофазного синтеза или жидкофазного синтеза. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (II) синтезируют с помощью твердофазного синтеза. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (II) синтезируют с помощью жидкофазного синтеза.

В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид может быть таким, как описано где-либо в параграфах [0335]-[410] в US 2015/0119444 или параграфах [0341]-[416] в US 2015/0119445, и эти разделы включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Неограничивающие примеры соединений конъюгатов

Неограничивающие примеры соединений формулы (II) включают следующие соединения (где каждое из n, m и m' представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 10):

Фармацевтические композиции и введение

Общее описание

В еще одном аспекте данное изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие химическое соединение, как описано в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В некоторых вариантах осуществления химические соединения можно вводить в комбинации с одним или несколькими общепринятыми фармацевтическими вспомогательными веществами. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают, но без ограничения, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, самоэмульгирующиеся системы доставки лекарственных средств (SEDDS), такие как d-α-токоферол полиэтиленгликоль-1000 сукцинат, поверхностно-активные вещества, используемые в фармацевтических дозированных формах, такие как Tweens, полоксамеры или другие аналогичные полимерные матрицы для доставки, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, трис, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, двузамещенный фосфорнокислый натрий, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена с полиоксипропиленом и ланолин. Для усиления доставки описанных в настоящем документе соединений также могут быть использованы циклодекстрины, такие как α-, β и γ-циклодекстрин, или их химически модифицированные производные, такие как гидроксиалкилциклодекстрины, включая 2- и 3-гидроксипропил-β-циклодекстрины, или другие растворимые производные. Могут быть изготовлены лекарственные формы или композиции, содержащие химическое соединение, как описано в настоящем документе, в количестве от 0,005% до 100%, и нетоксичный носитель в количестве по балансу. Предполагаемые композиции могут содержать 0,001%-100% химического соединения, обеспеченного в настоящем документе, в одном варианте осуществления 0,1-95%, в другом варианте осуществления 75-85%, в еще одном варианте осуществления 20-80%. Существующие в настоящее время способы изготовления таких дозированных форм известны или очевидны специалистам в данной области; например, см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Edition (Pharmaceutical Press, London, UK. 2012).

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена в виде дозированной формы, выбранной из группы, состоящей из: порошков, таблеток, гранул, капсул, растворов, эмульсий, суспензий, инъекций, спреев, аэрозолей, ингаляций сухого порошка и пластырей с микроиглами.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция подходит для введения субъекту, нуждающемуся в этом, внутривенно, внутримышечно, подкожно, с помощью пластырей с микроиглами, перорально, с помощью перорального или назального спрея или местно.

В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, включая крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней, собак, кошек, грызунов и приматов. Например, субъектом может являться человек.

Дозировки

Дозировки могут варьироваться в зависимости от потребности пациента, тяжести состояния, подлежащего лечению, и конкретного используемого соединения. Определение надлежащей дозировки для конкретной ситуации может определить специалист в области медицины. Общая суточная доза может быть разделена и введена порциями в течение дня или при помощи средств, обеспечивающих непрерывную доставку.

В некоторых вариантах осуществления единичная доза составляет менее 1,4 мг на кг массы тела субъекта или менее 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001 мг на кг массы тела. В некоторых вариантах осуществления единичная доза составляет от 0,00001 до 10 мг на кг массы тела. В некоторых вариантах осуществления единичная доза составляет от 0,001 до 2 мг на кг массы тела.

Режимы

Вышеуказанные дозы можно вводить ежедневно (например, в виде разовой дозы или в виде двух или более разделенных доз) или не ежедневно (например, через день, каждые два дня, каждые три дня, один раз в неделю, два раза в неделю), раз в две недели, раз в месяц).

Способы лечения

В еще одном аспекте данное изобретение обеспечивает способы лечения и/или предупреждения патологических состояний или заболеваний у субъекта, при этом состояния или заболевания вызваны экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени, причем способ включает введение субъекту химического соединения, описанного в настоящем документе (например, соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли); или фармацевтической композиции, содержащей химическое соединение, как описано в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В некоторых вариантах осуществления один или более генов выбраны из: генома HBV, генома HCV, PCSK9, ксантиноксидазы, URAT1, APOB, генов, связанных с фиброзом печени (AP3S2, AQP2, AZINl, DEGSl, STXBP5L, TLR4, TRPM5 и т.д.), и генов, связанных с неалкогольной жировой болезнью печени (PNPLA3, FDFTl), первичным билиарным циррозом (HLA-DQB1, IL-12, IL-12RB2 и др.).

В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из: наследственного ангионевротического отека, семейной тирозинемии I типа, синдрома Алажиля, дефицита альфа-1-антитрипсина, нарушения синтеза желчных кислот и метаболических нарушений, атрезии желчевыводящих путей, фиброзно-кистозного заболевания печени, идиопатического неонатального гепатита, митохондриального заболевания печени, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, первичного склерозирующего холангита, транстиретинового амилоидоза, гемофилии, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гипергликемии, и заболеваний, сопровождающиеся аномально повышенной выработкой глюкозы в печени аналогично диабету II типа, гепатиту и печеночным порфиринам.

В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, включая крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней, собак, кошек, грызунов и приматов. Например, субъект может являться человеком.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы обнаружения или локализации РНК в печени у субъекта, включающие введение субъекту химического соединения, как описано в настоящем документе (например, соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли); или фармацевтической композиции, содержащей химическое соединение, как описано в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностировано одно или несколько состояний или заболеваний, которые вызваны экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени.

В некоторых вариантах осуществления один или более генов выбраны из: генома HBV, генома HCV, PCSK9, ксантиноксидазы, URAT1, APOB, генов, связанных с фиброзом печени (AP3S2, AQP2, AZINl, DEGSl, STXBP5L, TLR4, TRPM5, и т.д.), и генов, связанных с неалкогольной жировой болезнью печени (PNPLA3, FDFTl), первичным билиарным циррозом (HLA-DQB1, IL-12, IL-12RB2, и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из: наследственного ангионевротического отека, семейной тирозинемии I типа, синдрома Алажиля, дефицита альфа-1-антитрипсина, нарушения синтеза желчных кислот и метаболических нарушений, атрезии желчевыводящих путей, фиброзно-кистозного заболевания печени, идиопатического неонатального гепатита, митохондриального заболевания печени, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, первичного склерозирующего холангита, транстиретинового амилоидоза, гемофилии, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гипергликемии, и заболеваний, сопровождающиеся аномально повышенной выработкой глюкозы в печени аналогично диабету II типа, гепатиту и печеночным порфиринам.

В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, включая крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней, собак, кошек, грызунов и приматов. Например, субъект может являться человеком.

В некоторых вариантах осуществления химическое соединение, описанное в настоящем документе (например, соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль), вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, с помощью пластырей с микроиглами, перорально, с помощью перорального или назального спрея или местно.

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечено соединение (например, соединение формулы (II)) или его фармацевтически приемлемая соль, или его фармацевтическая композиция для применения в лечении состояний или заболеваний, вызванных экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из: наследственного ангионевротического отека, семейной тирозинемии I типа, синдрома Алажиля, дефицита альфа-1-антитрипсина, нарушения синтеза желчных кислот и метаболических нарушений, атрезии желчевыводящих путей, фиброзно-кистозного заболевания печени, идиопатического неонатального гепатита, митохондриального заболевания печени, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, первичного склерозирующего холангита, транстиретинового амилоидоза, гемофилии, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гипергликемии, и заболеваний, сопровождающиеся аномально повышенной выработкой глюкозы в печени аналогично диабету II типа, гепатиту и печеночным порфиринам. Субъект может быть таким, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечено соединение (например, соединение формулы (II)), или его фармацевтически приемлемая соль, или его фармацевтическая композиция для применения в обнаружении или локализации РНК в печени субъекта. Субъект может быть таким, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечено применение соединения (например, соединения формулы (II)), или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтической композиции в лечении состояний или заболеваний, вызванных экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из: наследственного ангионевротического отека, семейной тирозинемии I типа, синдрома Алажиля, дефицита альфа-1-антитрипсина, нарушения синтеза желчных кислот и метаболических нарушений, атрезии желчевыводящих путей, фиброзно-кистозного заболевания печени, идиопатического неонатального гепатита, митохондриального заболевания печени, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, первичного склерозирующего холангита, транстиретинового амилоидоза, гемофилии, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гипергликемии, и заболеваний, сопровождающиеся аномально повышенной выработкой глюкозы в печени аналогично диабету II типа, гепатиту и печеночным порфиринам. Субъект может быть таким, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечено применение соединения (например, соединения формулы (II)), или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтической композиции для обнаружения или локализации РНК в печени субъекта. Субъект может быть таким, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечено применение соединения (например, соединения формулы (II)), или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного средства для лечения состояний или заболеваний, вызванных экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из: наследственного ангионевротического отека, семейной тирозинемии I типа, синдрома Алажиля, дефицита альфа-1-антитрипсина, нарушения синтеза желчных кислот и метаболических нарушений, атрезии желчевыводящих путей, фиброзно-кистозного заболевания печени, идиопатического неонатального гепатита, митохондриального заболевания печени, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, первичного склерозирующего холангита, транстиретинового амилоидоза, гемофилии, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гипергликемии, и заболеваний, сопровождающиеся аномально повышенной выработкой глюкозы в печени аналогично диабету II типа, гепатиту и печеночным порфиринам. Субъект может быть таким, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

В еще одном аспекте в настоящем документе обеспечено применение соединения (например, соединения формулы (II)), или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного средства для обнаружения или локализации РНК в печени у субъекта. Субъект может быть таким, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

Получение соединения

Как может быть понятно специалистам в данной области, способы синтеза соединений формул, представленных в настоящем документе, являются очевидными для специалистов в данной области. Преобразования синтетической химии и методики работы с защитными группами (защита и снятие защиты), применимые при синтезе соединений, описанных в настоящем документе, известны в данной области и включают, например, те, которые описаны в публикациях R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and RGM. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); и L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), и их последующих изданиях. Исходные вещества, используемые при получении соединений по изобретению, известны, получают известными способами или коммерчески доступны. Квалифицированный специалист также поймет, что условия и реагенты, описанные в настоящем документе, могут быть заменены альтернативными эквивалентами, признанными в данной области техники. Например, во многих реакциях триэтиламин может быть заменен другими основаниями, такими как ненуклеофильные основания (например, диизопропиламин, 1,8-диазабициклоундек-7-ен, 2,6-ди-трет-бутилпиридин или тетрабутилфосфазен).

Квалифицированному специалисту будут известны различные аналитические методы, которые могут быть использованы для характеристики описанных в настоящем документе соединений, включая, например, ¹H ЯМР, гетероядерный ЯМР, масс-спектрометрию, жидкостную хроматографию и инфракрасную спектроскопию. Приведенный выше список представляет собой подмножество методов характеризации, доступных квалифицированному специалисту, и не предназначен для ограничения.

Чтобы дополнительно проиллюстрировать вышеизложенное, включены следующие неограничивающие иллюстративные схемы синтеза. Вариации таких примеров в объеме формулы изобретения находятся в компетенции специалистов в данной области техники и рассматриваются как попадающие в объем изобретения, как описано и заявлено в настоящем документе. Читателю будет понятно, что квалифицированный специалист, руководствующийся настоящим описанием и работающий в данной области, может получить и применить соединения по изобретению без исчерпывающих примеров.

Примеры

Изобретение далее описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, как описано в формуле изобретения. Конкретные условия, которые не указаны в примерах, осуществляют при обычных условиях или условиях, рекомендованных изготовителем. Используемые реагенты или приборы, производитель которых не указан, являются общепринятыми коммерчески доступными продуктами. Пример 1. Получение GalNAc-1

Схема синтеза

Методика получения

(1) Пентаэритрит (50 г), раствор NaOH (6 мл, водный, 50%) и гидроксид тетрабутиламмония (9,5 г) добавляли к трет-бутилакрилату (150 г) и затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до тех пор, пока реакция не завершится. После завершения реакции добавляли этилацетат для экстрагирования органической фазы, которую затем концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки (PE:EA = 20:1-7:1) неочищенного продукта получали соединение 1;

(2) соединение 1 (10 г) и TsCl (6,5 г) растворяли в пиридине (100 мл) и полученную смесь перемешивали при 70°С. После завершения реакционную смесь концентрировали для удаления пиридина. Этилацетат добавляли к остатку, который затем концентрировали и сушили. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE:EA = 20:1-10:1) получали соединение 2;

(3) соединение 2 (2 г) растворяли в безводном DMF (50 мл), затем добавляли азид натрия (0,53 г) и реакционную смесь нагревали до 100°С. После завершения реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали для удаления DMF. Этилацетат добавляли к остатку, который затем концентрировали и сушили. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE: EA = 20:1-10:1) получали соединение 3;

(4) соединение 3 (2 г) растворяли в муравьиной кислоте (10 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. После завершения реакционную смесь концентрировали до сухого состояния и получали соединение 4;

(5) соединение 4 (1,6 г) растворяли в дихлорметане (50 мл), затем в смесь добавляли HOBt (2,23 г), EDCl (3,0 г), DIEA (3,3 г) и N-boc-1,3-диаминопропан (2,7 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до ее завершения. После завершения к реакционной смеси добавляли дихлорметан и воду для экстрагирования, после чего органическую фазу сушили и концентрировали до сухого состояния с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки (дихлорметан:метанол = 2%-5%) неочищенного продукта получали соединение 5;

(6) соединение 5 (2,5 г) растворяли в дихлорметане (50 мл), затем добавляли трифторуксусную кислоту (20 мл, 2 N) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до ее завершения. После завершения реакционную смесь концентрировали с получением соединения 6;

(7) 5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-диацетокси-6-(ацетоксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)пентановую кислоту (11 г) растворяли в дихлорметане (100 мл), затем добавляли DCC (6,2 г) и пентафторфенол (5,5 г), после чего реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь фильтровали, фильтрат промывали водой, сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE:EA=3:1-1:1) получали соединение 7;

(8) соединение 6 (2,46 г) и соединение 7 (10 г) растворяли в дихлорметане (50 мл), затем к реакционной смеси добавляли DIEA (8 мл) и перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакции к реакционной смеси добавляли дихлорметан и воду для экстрагирования, после чего органическую фазу сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол = 10%-20%) получали соединение 8;

(9) глутаровый ангидрид (10 г) и пропаргиламин (4,82 г) растворяли в тетрагидрофуране (50 мл) и затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь концентрировали до сухого состояния с получением соединения 12;

(10) соединение 12 (3,7 г) растворяли в дихлорметане (50 мл) и затем DCC (5,41 г), пентафторфенол (4,83 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь фильтровали и фильтрат промывали водой, сушили и затем концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE:EA= 3:1-1:1) получали соединение 13;

(11) соединение 13 (6,5 г) и аминокапроновую кислоту (2,54 г) растворяли в тетрагидрофуране (50 мл), затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь концентрировали до сухого состояния. К остатку добавляли дихлорметан и воду для экстрагирования. Органическую фазу сушили и затем концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки (дихлорметан:метанол = 3%-8%) неочищенного продукта получали соединение 14;

(12) соединение 14 (15 г) растворяли в дихлорметане (100 мл) и затем DCC (3,94 г), пентафторфенол (3,52 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь фильтровали и фильтрат промывали водой, затем сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE:EA=3:1-1:1) получали соединение 15;

(13) соединение 8 (0,34 г) и соединение 15 (0,09 г) растворяли в THF (5 мл), затем безводный сульфат меди (0,092 г) и 0,146 г аскорбата натрия в водном растворе (5 мл) добавляли в реакционную смесь, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения THF удаляли из реакционной смеси путем концентрирования. Полученный остаток разбавляли дихлорметаном, обесцвечивали активированным углем и сушили над безводным сульфатом натрия. Полученный раствор фильтровали для удаления нерастворимых веществ и затем концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол = 10%-15%) получали GalNAc-1.

Результат

GalNAc-1 получали в виде пенообразного белого твердого вещества (0,4 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm 7.69 (s, 1H), 7.36 (dd, 4H), 6.97 (t, 3H), 6.81 (d, 1H), 6.74 (d, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.35 (t, 3H), 5.19 (dd, 3H), 4.61 (d, 3H), 4.51 (d, 2H), 4.32 (s, 2H), 4.13 (m, 9H), 3.92 (dd, 6H), 3.65 (d, 6H), 3.50 (m, 3H), 3.27 (m, 18H), 2.68 (t, 2H), 2.44 (t, 6H), 2.33 (t, 2H), 2.21-1.26 (m, 61H). MS (ESI-TOF): m/z (M+H)⁺ 2283.44, (M+Na)⁺ 2305.41.

Пример 2. Получение GalNAc-2

Схема синтеза

Соединения 8 и 13 синтезировали, как описано в примере 1.

Методика получения

GalNAc-2 получали с использованием способа, описанного в примере 1.

Результат

GalNAc-2 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,2 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm 7.73 (s, 1H), 6.90-6.40 (m, 10H), 5.36 (d, 3H), 5.08 (m, 3H), 4.60 (s, 3H), 4.50 (d, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.14 (m, 9H), 3.92 (s, 6H), 3.66 (s, 6H), 3.51 (m, 3H), 3.27 (m, 18H), 2.79 (t, 2H), 2.45 (m, 6H), 2.25-1.80 (m, 44H), 1.80-1.26 (m, 20H). MS(ESI-TOF):m/z (M+Na)⁺2191.38.

Пример 3. Получение GalNAc-3.

Схема синтеза

Соединения 4 и 15 получали так же, как описано в примере 1.

Методика

Соединение 9, соединение 11 и GalNAc-3 получали с использованием способов получения соединения 7, соединения 8 и GalNAc-1, описанных в примере 1, соответственно.

Cbz-гексиламин-галактозу (5,5 г, полученную от компании Alading) растворяли в этилацетате (100 мл) и затем Pd/C (10%, 1 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакции гидрирования реакционную смесь фильтровали, и фильтрат сушили и концентрировали с получением соединения 10.

Результат

GalNAc-3 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,2 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm. 7.47-6.32 (m, 9H), 5.36 (s, 3H), 5.28 (m, 3H), 4.69 (s, 3H), 4.54 (s, 2H), 4.36 (m, 2H), 4.15 (m, 6H), 4.05 (m, 3H), 3.94 (dd, 6H), 3.66 (s, 6H), 3.47 (m, 3H), 3.25 (m, 12H), 2.68 (t, 2H), 2.44 (m, 6H), 2.30-1.80 (m, 42H), 1.80-1.26 (m, 32H).

MS(ESI-TOF):m/z (M+Na)⁺2133.43.

Пример 4. Получение GalNAc-4

Схема синтеза

Соединения 11 и 13 получали с использованием способов, описанных в примерах 1 и 3, соответственно.

Методика получения

GalNAc-4 получали в результате реакции соединений 11 и 13 с использованием способа, описанного в примере 1.

Результат

GalNAc-4 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,2 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm. 7.74-6.43 (m, 8H), 5.36 (d, 3H), 5.28 (m, 3H), 4.68 (d, 3H), 4.53 (d, 2H), 4.31 (s, 2H), 4.14 (ddd, 6H), 4.05 (dd, 3H), 3.89 (ddd, 6H), 3.67 (m, 6H), 3.46 (dd, 3H), 3.24 (s, 12H), 2.78 (t, 2H), 2.43 (m, 6H), 2.30-1.80 (m, 38H), 1.80-1.26 (m, 26H).

MS(ESI-TOF):m/z (M+H)⁺1998.43,(M+Na)⁺2020.42.

Пример 5. Получение GalNAc-5

Схема синтеза

Соединение 11 получали также, как описано в Примере 3.

Методика получения

(1) Соединение 16 (1,6 г) растворяли в дихлорметане (50 мл), затем к смеси добавляли HOBt (2,23 г), EDCl (3,0 г), DIEA (3,3 г) и пропаргиламин (0,3 г). Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения к реакционной смеси добавляли дихлорметан и воду для экстрагирования, после чего органическую фазу сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол = 2%-5%) получали соединение 17;

(2) соединение 17 (2 г) добавляли к метанолу (10 мл), и затем Pd/C (10%, 0,5 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакции гидрирования реакционную смесь фильтровали, фильтрат сушили и концентрировали с получением соединения 18;

(3) PFP-лаурат (4,5 г) растворяли в дихлорметане (100 мл), затем DCC (3,94 г) и пентафторфенол (3,53 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь фильтровали, фильтрат промывали водой, сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE:EA=3:1-1:1) получали соединение 19;

(4) GalNAc-5 получали в результате реакции соединений 11 и 19 с использованием способа, описанного в примере 1.

Результат

GalNAc-5 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,4 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm, 7.73-6.40 (m, 8H), 5.35 (d, 3H), 5.26 (m, 3H), 4.67 (d, 3H), 4.51 (s, 2H), 4.33 (s, 2H), 4.11 (dd, 6H), 4.07 (d, 3H), 3.89 (dt, 6H), 3.66 (m, 6H), 3.46 (dd, 3H), 3.24 (s, 12H), 2.75 (t, 2H), 2.41 (m, 6H), 2.25-1.80 (m, 38H), 1.80-1.26 (m, 40H). MS(ESI-TOF):m/z (M+H)⁺ 2096.19, (M+Na)⁺ 2119.20.

Пример 6. Получение GalNAc-6

Схема синтеза

Соединение 8 получали с использованием способа, описанного в примере 1.

Методика получения

(1) Аминокапроновую кислоту (47,9 г) растворяли в толуоле (700 мл), затем бензиловый спирт (57 мл) и 4-толуолсульфоновую кислоту (74 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем нагревали до 115°С при перемешивании до завершения реакции. После завершения реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры при перемешивании, после чего происходило осаждение большого количества твердого вещества. Метил трет-бутиловый эфир (500 мл) добавляли к реакционной смеси, которую затем фильтровали. Твердое вещество собирали и сушили с получением соединения 22; (2) соединение 22 (19 г) растворяли в дихлорметане (100 мл), затем глутаровый ангидрид (11 г) в дихлорметане (100 мл) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь концентрировали с получением соединения 23; (3) соединение 23 (5 г) растворяли в дихлорметане (100 мл), затем DCC (3,6 г) и пентафторфенол (3,3 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (PE:EA = 3:1-2:1) получали соединение 24; (4) соединение 8 (0,13 г) растворяли в этилацетате (10 мл) и безводном метаноле (10 мл), затем Pd/C (0,2 г, 10%) и 3 капли уксусной кислоты добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали с получением соединения 25; (5) соединение 25 (2,8 г) растворяли в дихлорметане (50 мл), затем DIEA (0,5 г) и соединение 24 (0,78 г) добавляли к реакционной смеси, которую перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакции реакционную смесь концентрировали до сухого состояния. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол 15%-25%) получали соединение 26; (6) соединение 26 (2,5 г) растворяли в метаноле (30 мл) и этилацетате (30 мл), затем Pd/C (1,3 г, 10%) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакции реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали с получением соединения 27; (7) соединение 27 (0,8 г) растворяли в дихлорметане, затем DCC (0,12 г), пентафторфенол (0,11 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения дихлорметан добавляли к реакционной смеси, которую затем концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол = 10%-15%) получали GalNAc-6.

Результат

GalNAc-6 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,7 г). ¹H ЯМР (400 MHz, d-DMSO) δ:ppm.7.75-7.26 (m, 11H), 5.85 (d, 3H), 5.59 (d, 3H), 5.11 (dd, 3H), 4.63 (m, 6H), 4.50 (d, 6H), 4.37 (s, 3H), 4.17 (d, 6H), 4.07 (s, 3H), 3.90-3.70 (m, 18H), 3.28 (m, 2H), 2.92 (d, 6H), 2.80-2.25 (m, 52H), 2.25-1.26 (m, 24H). MS(ESI-TOF): m/z (M+H)⁺ 2201.82, (M+Na)⁺ 2223.86.

Пример 7. Получение GalNAc-7

Схема синтеза

Соединение 25 получали, как описано в примере 6.

Методика получения

Соединение 21 получали с использованием способа получения соединения 13, описанного в примере 1.

Соединения 29, 30 и GalNAc-7 получали с использованием способов получения соединений 26, 27 и GalNAc-6 в примере 6, соответственно.

Результат

GalNAc-7 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,5 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm 7.32-6.63 (m, 10H), 5.35 (s, 3H), 5.20 (s, 3H), 4.62 (d, 3H), 4.13 (ddd, 9H), 3.92 (d, 6H), 3.66 (dd, 6H), 3.52 (d, 3H), 3.33 (m, 20H), 2.77 (t, 2H), 2.44 (s, 6H), 2.25-1.80 (m, 44H), 1.80-1.26 (m, 20H). MS(ESI-TOF):m/z (M+H)⁺2088.08, (M+Na)⁺2109.36.

Пример 8. Получение GalNAc-8

Схема синтеза

Соединения 11 и 24 получали, как описано в примере 3 и примере 6, соответственно.

Методика получения

Соединения 32, 36, 37 и GalNAc-8 получали с использованием способов получения соединений 25, 26, 27 и GalNAc-6 в примере 6.

Результат

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm. 7.7.06-6.37 (m, 8H), 5.36 (d, 3H), 5.270 (m, 3H), 4.69 (t, 3H), 4.15 (m, 6H), 4.00 (m, 3H), 3.90 (m, 6H), 3.65 (t, 6H), 3.47 (dt, 3H), 3.28 (m, 16H), 2.68 (t, 2H), 2.42 (m, 6H), 2.29 (t, 4H), 2.15-1.80 (s, 36H), 1.80-1.26 (m, 32H).

MS(ESI-TOF):m/z(M+H)⁺2030.38, (M+Na)⁺2052.41.

Пример 9. Получение GalNAc-9

Схема синтеза

Соединение 11 получали, как описано в примере 3.

Методика получения

(1) Соединение азида 11 (1,3 г) растворяли в THF (15 мл), затем Pd/C (0,3 г) и глутаровый ангидрид (0,11 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода до завершения реакции гидрирования. После завершения реакционную смесь фильтровали, фильтрат собирали и концентрировали реакционный остаток. К реакционному остатку добавляли дихлорметан и воду для экстрагирования. Экстрагированную органическую фазу концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол = 10%-15%) получали соединение 34 (0,8 г); (2) GalNAc-9 получали с использованием способа получения GalNAc-6 в примере 6.

Результат

GalNAc-9 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,8 г).

¹H ЯМР (400 MHz, d-DMSO):ppm.7.63 (s, 1H), 7.42 (s, 3H), 7.17 (s, 3H), 5.85 (d, 3H), 5.60 (t, 3H), 5.10 (dd, 3H), 4.63 (td, 6H), 4.49 (m, 6H), 4.34 (d, 3H), 4.16 (m, 6H), 4.03 (d, 3H), 3.84 (d, 6H), 3.73 (d, 6H), 3.35 (m, 2H), 2.91 (d, 6H), 2.70-2.40 (m, 42H), 2.21-1.76 (m, 24H).

MS(ESI-TOF):m/z(M+H)⁺1917.93, (M+Na)⁺1938.69.

Пример 10. Получение GalNAc-10

Схема синтеза

Соединение 28 в данном примере получали, как описано для синтеза соединения 24 в примере 6.

Методика получения

(1) Аминосоединение 32 (3 г) растворяли в дихлорметане (30 мл), затем DIEA (1 мл) и соединение 28 (1,31 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения дихлорметан добавляли к реакционной смеси и полученный раствор концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол = 10%-15%) получали соединение 38; (2) соединение 39 и GalNAc-10 получали с использованием способов получения соединения 27 и GalNAc-6 в примере 6, соответственно.

Результат

GalNAc-10 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,45 г). ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ:ppm 7.7.06-6.40 (m, 7H), 5.35 (d, 3H), 5.28 (m, 3H), 4.67 (t, 3H), 4.14 (m, 6H), 4.02 (m, 3H), 3.93 (m, 6H), 3.61 (t, 6H), 3.48 (dt, 3H), 3.29 (m, 14H), 2.67 (t, 2H), 2.43 (m, 6H), 2.28 (t, 2H), 2.15-1.80 (s, 36H), 1.80-1.26 (m, 40H).

MS(ESI-TOF):m/z (M+H)⁺ 2015.11,(M+Na)⁺ 2038.47.

Пример 11. Получение GalNAc-11

Схема синтеза

Соединение GalNAc 4 является таким же, как описано в примере 4.

Методика получения

(1) GalNAc-4 (3 г) растворяли в дихлорметане (30 мл), затем DIEA (0,3 мл), 1-гидроксигексановую кислоту (0,18 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения дихлорметан добавляли к реакционной смеси, которую затем концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол 10%-15%) получали соединение 40; (2) соединение 40 (1 г) растворяли в безводном дихлорметане (10 мл), затем реакционную смесь охлаждали до 0°С перед добавлением DIEA (0,2 мл) и оксихлорида фосфора (0,14 г). Затем реакционную смесь перемешивали при 0°С до ее завершения. После завершения дихлорметан добавляли к реакционной смеси, которую затем сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол 10%-15%) получали GalNAc-11.

Результат

Соединение 40: 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ:ppm.7.71-6.38 (m, 9H), 5.36 (d, 3H), 5.27 (m, 3H), 4.68 (d, 3H), 4.53 (s, 2H), 4.31 (s, 2H), 4.15 (m, 6H), 4.01 (dd, 3H), 3.89 (ddd, 6H), 3.65 (dd, 8H), 3.46 (m, 3H), 3.24 (m, 14H), 2.46 (d, 6H), 2.31 (d, 2H), 2.23 (s, 2H), 2.16-1.80 (m, 36H), 1.80-1.26 (m, 34H). MS(ESI-TOF):m/z (M-H)^- 1929.81.

GalNAc-11 получали в виде белого пенообразного твердого вещества (0,5 г). MS(ESI-TOF):m/z (M+Na)⁺ 2153.62.

Пример 12. Получение GalNAc-12

Схема синтеза

Соединение 42 получали от компании Alading; соединение GalNAc-5 является таким же, как описано в примере 5.

Методика получения

(1) GalNAc-5 (например, 2 г) растворяли в дихлорметане (приблизительно 20 мл), затем DIEA (приблизительно 0,3 мл), соединение 42 (приблизительно 0,44 г) добавляли к реакционной смеси, которую затем перемешивали при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения дихлорметан добавляли к реакционной смеси, которую затем сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол с использованием соответствующего градиента, например, 10%-15% метанола) получали соединение 41; (2) соединение 41 (например, 1 г) растворяли в сухом дихлорметане (приблизительно 10 мл), затем реакционную смесь охлаждали до 0°С перед добавлением DIEA (приблизительно 0,2 мл) и оксихлорида фосфора (приблизительно 0,12 г). Затем реакционную смесь перемешивали при 0°С до ее завершения. После завершения дихлорметан добавляли к реакционной смеси, которую затем сушили и концентрировали с получением неочищенного продукта. После разделения на колонке и очистки неочищенного продукта (дихлорметан:метанол при соответствующем градиенте, например, 10%-15% метанола) получали GalNAc-12.

Пример 13. Получение модифицированного одноцепочечного олигонуклеотида (антисмысловая цепь)

Последовательности, обсуждаемые в примерах 13 и 16-18, представляют собой следующие: 5'-Cy5-mUmGmAfCmAmAmAfCmGmGmGfCmAmAfCmAfUmAfC-3' (SEQ ID NO: 1). В этом примере модифицированный олигонуклеотид синтезировали в масштабе 1 мкмоль. Эксперимент проводили, как описано ниже:

(1) Взвешивали 1 мкмоль стандартного твердофазного носителя на основе стекла с регулируемым размером пор (Controlled Pore Glass, CPG) или 3'-холестерол-модифицированного твердофазного носителя на основе CPG (полученного от компании Chemgenes), или 3'-амино-модифицированного твердофазного носителя на основе CPG (полученного от компании Kinovite)]. 2'-O-TBDMS-защищенные фосфорамидитные мономеры РНК, мономеры ДНК, 2'-метоксимономеры, 2'-фтормономеры (получены от компании Sigma Aldrich); вместе с амино-С16-12-фосфорамидитом (или флуоресцентным фосфорамидитом) для синтеза 5'-модификации растворяли в безводном ацетонитриле для приготовления раствора с концентрацией 0,2 М. Для олигонуклеотидов с тио-модификацией по фосфатному остову в качестве тиореагента использовали 0,2 М раствор PADS. Готовили 0,25 М раствор 5-этилтио-1Н-тетразола в ацетонитриле (полученный от компании Chemgenes) в качестве активатора, раствор пиридин/вода с 0,02 М йода в качестве окислителя и 3% раствор трихлоруксусной кислоты в хлорметане в качестве реагента для снятия защиты, и помещали в определенные положения автоматического синтезатора ДНК/РНК (GE AKTA™ OP100).

(2) Желаемую последовательность олигонуклеотидных оснований вводили в программу синтеза, затем запускали и повторяли олигонуклеотидный синтез. Каждая стадия связывания занимала 6 минут, а каждая стадия связывания мономера галактозного лиганда занимала 10-20 минут. Твердофазный синтез олигонуклеотидов завершали после автоматической циркуляции.

(3) CPG сушили сухим азотом, а затем переносили в пробирку EP на 5 мл. Раствор аммиака/этанола (3/1) (2 мл) добавляли в пробирку EP, которую затем нагревали при 55°С в течение 16-18 часов. Полученный раствор центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Слой супернатанта собирали и его раствор аммиака/этанола удаляли при пониженном давлении с получением белого гелеобразного твердого вещества. Твердое вещество растворяли в растворе TBAF (1М в THF, 200 мкл) и встряхивали в течение 20 часов при комнатной температуре. К полученной смеси добавляли Tris-HCl буфер (рН 7,4, 1 М, 0,5 мл). Полученную таким образом смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 15 минут и центрифугировали до ½ первоначального объема. Полученную смесь дважды экстрагировали хлороформом (0,5 мл) и обрабатывали раствором для отбора проб TEAA (1 мл, 0,1 М) с получением раствора, который затем выливали в колонку для твердофазной экстракции для удаления из раствора избытка соли.

(4) Концентрацию полученного олигонуклеотида определяли на микрообъемном УФ-видимом спектрофотометре (KO5500). Масс-спектрометрию олигонуклеотида обнаруживали и анализировали на системе Oligo HTCS LC-MS (Novatia). После сканирования первого уровня молекулярную массу рассчитывали с помощью нормализованного метода в программном обеспечении Promass.

Пример 14. Получение модифицированного одноцепочечного олигонуклеотида (смысловая цепь)

Последовательности, обсуждаемые в примерах 14-18, представляют собой следующие: 5'-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA-3' (SEQ ID NO: 2). В этом примере модифицированный олигонуклеотид синтезировали в масштабе 1 мкмоль. Эксперимент проводили, как описано ниже.

(1) 1 мкмоль стандартного твердофазного носителя на основе стекла с регулируемым размером пор (CPG) или 3'-холестерин-модифицированного твердофазного носителя на основе CPG (полученного от компании Chemgenes), или 3'-амино-модифицированного твердофазного носителя на основе CPG (полученного от компании Kinovite)], мономеры ДНК, 2'-метоксимономеры, 2'-фтормономеры (полученные от компании Sigma Aldrich), амино-С16-12-фосфорамидит (или флуоресцентный фосфорамидит) для синтеза 5'-модификации растворяли в безводном ацетонитриле для приготовления 0,2 М раствора. Для олигонуклеотидов с тио-модификацией по фосфатному остову в качестве тиореагента использовали 0,2 М раствор PADS. Готовили ацетонитриловый раствор (0,25 М) 5-этилтио-1Н-тетразола (полученный от компании Chemgenes) в качестве активатора, пиридин/водный раствор (0,02 М) йода в качестве окислителя и хлорметановый раствор (3%) трихлоруксусной кислоты в качестве реагента для снятия защиты, и помещали в указанное положение в автоматический синтезатор ДНК/РНК (GE AKTAOP100).

(2) Желаемую последовательность оснований олигонуклеотида вводили в программу синтеза, затем запускали и повторяли синтез олигонуклеотида. Каждая стадия связывания занимала 6 минут, и каждая стадия связывания мономера галактозного лиганда занимала 6-10 минут. Твердофазный синтез олигонуклеотида завершался после автоматической циркуляции.

(3) CPG сушили сухим азотом, а затем переносили в пробирку EP на 5 мл. Раствор аммиака (2 мл) добавляли в пробирку EP, которую затем нагревали при 55°С в течение 16-18 часов. Полученный раствор центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Слой супернатанта собирали и его раствор аммиака/этанола удаляли при пониженном давлении с получением гелеобразного твердого вещества белого или желтого цвета. К твердому веществу добавляли пробный раствор TEAA (1 мл 0,1 М) для создания раствора, который затем выливали в колонку для твердофазной экстракции для удаления из раствора избытка соли.

(4) Концентрацию полученного олигонуклеотида определяли на микрообъемном спектрофотометре УФ-видимого диапазоне (KO5500). Масс-спектрометрию олигонуклеотида обнаруживали и анализировали на системе Oligo HTCS LC-MS (Novatia). После сканирования первого уровня молекулярную массу рассчитывали нормализованным методом в программном обеспечении Promass.

Пример 15. Получение GalNAc-модифицированных олигонуклеотидов

Амино-модифицированный олигонуклеотид (смысловая цепь), полученный в примере 14, растворяли в буферном растворе. Различные GalNAc-пентафторфенольные сложные эфиры (GalNAc выбран из GalNAc-1 - GalNAc-10), растворенные в ацетонитриле, соответственно добавляли к раствору амино-модифицированного олигонуклеотида, хорошо перемешивали и затем подвергали реакции при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 часов. После завершения реакции ацетильную защитную группу удаляли, и продукт реакции очищали ионообменной хроматографией (WATERS) с использованием ионообменной колонки DNAPAc PA-100 с линейным градиентом. Раствор подвижной фазы А представлял собой 20 мМ NaOH, и раствор подвижной фазы В представлял собой смесь 20 мМ NaOH + 2 М NaCl.

Таблица 1. GalNAc-модифицированные олигонуклеотиды (смысловая цепь) Номер образца Структура (5'-3') Измеренная молекулярная масса Смысловая цепь -101 (SEQ ID NO:3) 5'-GalNAc-1-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7497,93 Смысловая цепь -102 (SEQ ID NO:4) 5'-GalNAc-2-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7669,08 Смысловая цепь -103 (SEQ ID NO:5)5'-GalNAc-3-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7611,08 Смысловая цепь -104 (SEQ ID NO:6)5'-GalNAc-4-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7782,24 Смысловая цепь -105 (SEQ ID NO:7)5'-GalNAc-5-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7750,16 Смысловая цепь -106 (SEQ ID NO:8)5'-GalNAc-6-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7579,00 Смысловая цепь -107 (SEQ ID NO:9)5'-GalNAc-7-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7692,16 Смысловая цепь -108 (SEQ ID NO:10)5'-GalNAc-8-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7863,31 Смысловая цепь -109 (SEQ ID NO:11)5'-GalNAc-9-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7753,27 Смысловая цепь -110 (SEQ ID NO:12)5'-GalNAc-10-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3' 7810,32

Примечание: N=РНК; dN=ДНК; mN=модификация 2'OMe; и fN=модификация 2'F.

Последовательность иллюстративных модифицированных олигонуклеотидов и соответствующие результаты определения молекулярной массы (MW) показаны в таблице 1.

Пример 16. Получение двухцепочечных олигонуклеотидов

Эксперимент проводили следующим образом. Олигонуклеотиды, содержащие 5'-Cy5-антисмысловую цепь, синтезированные в примере 13, соответственно смешивали с олигонуклеотидами, содержащими смысловую цепь-GalNAc-1-10, полученными в примере 15, в соответствии с соотношением поглощения УФ-излучения 1:1. Смесь инкубировали при 95°С в течение 3 минут на водяной бане с подогревом, затем охлаждали до комнатной температуры с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов.

Таблица 2. Структуры двухцепочечной РНК Номер образца Двухцепочечная структура (5'-3') 101 (SEQ ID NO:13)5'-GalNAc-1-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA-3'
(SEQ ID NO:14)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 102 (SEQ ID NO:15)5'-GalNAc-2-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:16)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 103 (SEQ ID NO:17)5'-GalNAc-3-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:18)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 104 (SEQ ID NO:19)5'-GalNAc-4-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:20)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 105 (SEQ ID NO:21)5'-GalNAc-5-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:22)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 106 (SEQ ID NO:23)5'-GalNAc-6-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:24)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 107 (SEQ ID NO:25)5'-GalNAc-7-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:26)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 108 (SEQ ID NO:27)5'-GalNAc-8-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:28)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 109 (SEQ ID NO:29)5'-GalNAc-9-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:30)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5' 110 (SEQ ID NO:31)5'-GalNAc-10-mGfUmAfUmGfUfUmGfCfCfCmGfUfUfUmGfUfCmA3'
(SEQ ID NO:32)3'-fCmAfUmAfCmAmAfCmGmGmGfCmAmAmAfCmAmGmU-Cy5-5'

Примечание: N=РНК; dN=ДНК; mN=модификация 2'OMe; fN=модификация 2'F.

Пример 17. Обнаружение способности модифицированных олигонуклеотидов осуществлять нацеливание на клетки

Модифицированные олигонуклеотиды для экспериментов на животных перед инъекцией фильтровали через мембрану 0,22 мкм.

1. Выделение первичных мышиных гепатоцитов

Мышей, полученных от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., анестезировали. Кожу мышей и мышечный слой разрезали, чтобы обнажить печень. В воротную вену вводили перфузионный катетер, а в нижней полой вене вырезали небольшое отверстие для подготовки печени к перфузии. Перфузионный раствор I (Hank's, 0,5 мМ EGTA, pH 8) и перфузионный раствор II (DMEM с низким содержанием глюкозы, 100 ЕД/мл, тип IV, pH 7,4) предварительно нагревали до 40°С. Перфузионный раствор I (при 37°С) вводили в печень по воротной вене со скоростью 7 мл/мин в течение 5 мин до появления серого цвета печени. Затем печень перфузировали перфузионным раствором II при 37°С со скоростью потока 7 мл/мин в течение 7 минут. После завершения перфузии печень изолировали и помещали в раствор III (10% FBS, DMEM с низким содержанием глюкозы, 4°С) для прекращения расщепления. Печеночную оболочку прокалывали щипцами и осторожно встряхивали для высвобождения гепатоцитов. Гепатоциты фильтровали с помощью 70-мкм клеточного фильтра, а затем центрифугировали при 50 g в течение 2 минут. После центрифугирования супернатант удаляли. Затем гепатоциты ресуспендировали в растворе IV (среда DMEM с низким содержанием глюкозы и 40% Percoll, 4°С) и центрифугировали при 100 g в течение 2 минут. Супернатант отбрасывали и добавляли среду DMEM с низким содержанием глюкозы и 2% FBS для ресуспендирования клеток для последующих экспериментов. Окрашивание трипановым синим использовали для определения жизнеспособности клеток.

2. Определение кривой связывания GalNAc и значения Kd

Свежевыделенные первичные гепатоциты мыши высевали в 96-луночный планшет в количестве 2 × 10⁴ клеток/лунку (100 мкл/лунку). В каждую лунку добавляли разные GalNAc-siRNA (см. таблицу 2). Конечная концентрация каждого GalNAc-siRNA составляла 0,9 нМ, 2,7 нМ, 8,3 нМ, 25 нМ, 50 нМ или 100 нМ. Гепатоциты мыши инкубировали с GalNAc-siRNA в течение 2 часов при 4°С, а затем центрифугировали при 50 g в течение 2 минут. Супернатант отбрасывали. Далее гепатоциты ресуспендировали в 10 мкг/мл йодида пропидия (PI), окрашивали в течение 10 минут, и затем центрифугировали при 50 g в течение 2 минут. Затем гепатоциты промывали холодным PBS с последующим центрифугированием при 50 g в течение 2 минут. Супернатант удаляли, и гепатоциты ресуспендировали в PBS. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) живых клеток измеряли с помощью проточного цитометра (Beckman). Программное обеспечение GraphPad Prism 5 использовали для выполнения нелинейной подгонки и расчета константы диссоциации Kd.

Результаты представлены в таблице 3 ниже, которые показали, что GalNAc-siRNA может специфически нацеливаться на гепатоциты (или клетки печени). Значения Kd тестируемых лигандов GalNAc, связывающихся с клеточным рецептором, определяли в пределах 1,5-27,6 нМ.

Константу ингибирования Ki также рассчитывали по уравнению Ki=IC50/(1+[S]/Km), где IC50 обозначает 50% ингибирующую концентрацию, [S] обозначает концентрацию субстрата и Km обозначает константу Михаэлиса. По сравнению с предпочтительными галактозными лигандами, раскрытыми в PCT/US2014/046425 (со значениями Ki, определенными как находящиеся в диапазоне от 5,2 до 51,3 нМ, см. пример 44), описанные в настоящем документе лиганды GalNAc демонстрируют более высокую аффинность связывания. Кроме того, GalNAc-siRNA с различными структурами конъюгатов продемонстрировали разные способности связывания с рецепторами. Например, структуры 101, 104, 108 и 109 продемонстрировали относительно высокие аффинности связывания с рецептором (чем меньше значение Kd, тем выше аффинность).

Таблица 3. Значения Kd и Ki для каждой экспериментальной группы (нМ)

Пример 18. Тест на нацеливание на печень in vivo

Использовали 30 самцов мышей Balb/c-nu в возрасте 6-7 недель, не содержащих специфических патогенов (приобретенных у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.). Мышей случайным образом разделяли на 6 групп: контрольная группа, группа отрицательного контроля (или NC1, неконъюгированная с лигандом), группа 1, группа 2, группа 3 и группа 4. Количество мышей в каждой группе составляло 5 мышей. Мышам делали внутривенную инъекцию в хвост, и доза составляла около 10 мг/кг (см. таблицу 4 для схемы эксперимента). Живая визуализация всех животных, включая визуализацию в белом свете, выполнялась перед введением и через 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов после введения. Мышей подвергали эвтаназии через 6 часов после введения. Мозг, слюнные железы, сердце, селезенку, легкие, печень, почки и кишечник выделяли для визуализации органов (с помощью Xtreme фирмы Bruker Corporation).

Таблица 4. План эксперимента по нацеливанию на печень Серийный No. Группа Образец No. Вводимая доза (мг/кг) Объем введения (мл) 1 Холостой раствор Солевой раствор 0 0,2 2 NC1 100 10 0,2 3 Тестовая группа 1 104 10 0,2 4 Тестовая группа 2 107 10 0,2 5 Тестовая группа 3 108 10 0,2 6 Тестовая группа 4 110 10 0,2

Результаты визуализации in vitro показали, что образцы под номерами 100, 104, 107, 108 и 110 в основном распределялись в печени, почках и желудочно-кишечном тракте, но в меньшей степени в головном мозге, сердце, легких, селезенке и других тканях.

В соответствии со статистическими результатами среднего общего числа фотонов образцы под номерами 104, 107, 108 и 110 показали некоторые эффекты нацеливания на печень по сравнению с группой 100 (группа отрицательного контроля). Кроме того, образцы под номерами 107 и 108 показали статистически значимые различия (P<0,001). Образец под номером 104 (P<0,01) и образец под номером 110 (P<0,05) также показали статистически значимые различия.

Таблица 5. Статистические результаты значений интенсивности флуоресценции изолированных органов после вычитания фона (среднее общее число фотонов p/sec) Группа Мозг Сердце Легкие Печень Левая почка Правая почка Селезенка Желудочно-кишечный тракт Холостой раствор 1,0E+11 3,0E+10 1,2E+11 3,9E+11 5,4E+10 6,0E+10 7,2E+10 4,5E+12 NC1 4,1E+11 4,3E+11 1,6E+12 1,4E+13 6,3E+12 6,6E+12 1,4E+12 2,5E+13 Тестовая группа 1 4,9E+11 4,7E+11 1,6E+12 3,1E+13 7,7E+12 8,2E+12 1,3E+12 2,5E+13 Тестовая группа 2 6,6E+11 5,7E+11 1,9E+12 3,2E+13 7,9E+12 8,2E+12 1,5E+12 2,8E+13 Тестовая группа 3 6,3E+11 4,6E+11 2,1E+12 3,3E+13 7,0E+12 7,2E+12 1,1E+12 2,5E+13 Тестовая группа 4 5,6+11 4,1E+11 1,8E+12 2,9E+13 6,9E+12 7,8E+12 1,1E+12 2,3E+13

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ARGORNA PHARMACEUTICALS LTD

<120> LIGAND COMPOUNDS, CONJUGATES, AND APPLICATIONS THEREOF

<130> PN187920RBSW

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 1

ugacaaacgg gcaacauac 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 2

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 3

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 4

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 5

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 6

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 7

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 8

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 9

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 10

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 11

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 12

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 12

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 13

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 14

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 14

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 15

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 16

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 16

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 17

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 17

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 18

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 18

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 19

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 20

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 20

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 21

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 21

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 22

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 22

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 23

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 23

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 24

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 24

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 25

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 25

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 26

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 26

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 27

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 27

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 28

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 28

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 29

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 29

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 30

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 30

cauacaacgg gcaaacagu 19

<210> 31

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 31

guauguugcc cguuuguca 19

<210> 32

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthesized

<400> 32

cauacaacgg gcaaacagu 19

<---

Изобретение относится к соединению общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где каждый R^X независимо представляет собой группу формулы (А1); каждый R¹ независимо представляет собой группу формулы (B1-a); каждый R^B независимо представляет собой -NR^ER^F; каждый R^C независимо представляет собой -C(=O)C_1-6 алкил; каждый R^E независимо представляет собой C(=O)C_1-6 алкил; каждый R^F независимо представляет собой H; каждый R² независимо выбран из группы, состоящей из: -C(R⁶)₂-; *-NR⁷C(=O)-; где * представляет точку присоединения к структуре, представленной в формуле изобретения; R³ выбран из группы, приведенной в формуле изобретения; -L³ представляет собой –C(R⁶)₂-; R⁴ выбран из группы, состоящей из: -C(R⁶)₂-; *-NR⁷C(=O)-; - R⁵ выбран из группы, приведенной в формуле изобретения, где Pg представляет собой С_6-10 арил, замещенный 1-5 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, приведенной в формуле изобретения, где Pg² представляет собой выбранную из группы, состоящей из 4-монометокситритила (MMTR); 4,4-диметокситритила (DMTR); и трифенилметила (тритила); каждый R⁶ независимо выбран из группы, состоящей из: H; каждый R⁷ независимо выбран из группы, состоящей из: H; каждое из a и b представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 10; каждое из c и d представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 10. Также изобретение относится к конъюгированному соединению, применению конъюгированного соединения, способу обнаружения или локализации РНК в печени, фармацевтической композиции и применению фармацевтической композиции. Технический результат - новые соединений, которые содержат один или несколько фрагментов лиганда для асиалогликопротеинового рецептора (ASGPR) и которые могут дополнительно содержать олигонуклеотид, применяемых для таргетной доставки олигонуклеотидов в клетки печени. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 табл., 18 пр.

1. Соединение формулы (I):

Формула (I)

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

каждый R^X независимо представляет собой группу формулы (А1)

(A1),

каждый R¹ независимо представляет собой группу формулы (B1-a)

Формула (B1-a)

каждый R^B независимо представляет собой -NR^ER^F;

каждый R^C независимо представляет собой -C(=O)C_1-6 алкил;

каждый R^E независимо представляет собой C(=O)C_1-6 алкил;

каждый R^F независимо представляет собой H;

каждый R² независимо выбран из группы, состоящей из: -C(R⁶)₂-; *-NR⁷C(=O)-;

где * представляет точку присоединения к ;

R³ выбран из группы, состоящей из:

; , где aa представляет точку присоединения к ; -L³ представляет собой –C(R⁶)₂-,

- R⁴ выбран из группы, состоящей из: -C(R⁶)₂-; *-NR⁷C(=O)-;

- R⁵ выбран из группы, состоящей из: , где Pg представляет собой С_6-10 арил, замещенный 1-5 заместителями, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из: -F;

;

, где Pg² представляет собой выбранную из группы, состоящей из 4-монометокситритила (MMTR); 4,4-диметокситритила (DMTR); и трифенилметила (тритила); каждый R⁶ независимо выбран из группы, состоящей из: H;

каждый R⁷ независимо выбран из группы, состоящей из: H;

каждое из a и b представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 10;

каждое из c и d представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 10.

2. Соединение по п. 1, где

соединение выбрано из группы, состоящей из соединений с GalNAc-1 по GalNAc-12.

3. Конъюгированное cоединение, где конъюгированное соединение содержит соединение по любому из пп. 1, 2, за исключением R⁵, который представляет собой , где L представляет собой связь или дивалентную группу, выбранную из группы, состоящей из C(=O)O-, Oligo представляет собой олигонуклеотид, который присоединен к L через 5'-конец, 3'-конец или середину последовательности любой цепи через фосфатную группу.

4. Конъюгированное cоединение по п. 3, где олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид и/или двухцепочечный олигонуклеотид.

5. Конъюгированное соединение по п. 4, где олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из: ДНК, siRNA, miRNA, pre-miRNA, антагомира, мРНК, антисмыслового олигонуклеотида (АСО), аптамера, crRNA, tracRNA и sgRNA.

6. Конъюгированное соединение по п. 4, где олигонуклеотид содержит немодифицированные нуклеотиды и/или модифицированные нуклеотиды;

каждый из модифицированных нуклеотидов независимо выбран из группы, состоящей из: 2’-O-(2-метоксиэтил)-модифицированных нуклеотидов; 2’-O-алкил-модифицированных нуклеотидов; 2’-O-аллил-модифицированных нуклеотидов; 2’-C-аллил-модифицированных нуклеотидов; 2'-фтор-модифицированных нуклеотидов; 2’-дезокси-модифицированных нуклеотидов; 2’-гидрокси-модифицированных нуклеотидов; модифицированных запертыми нуклеиновыми кислотами (LNA) нуклеотидов, модифицированных гликолевыми нуклеиновыми кислотами (GNA) нуклеотидов и модифицированных незапертыми нуклеиновыми кислотами (UNA) нуклеотидов .

7. Конъюгированное cоединение по любому из пп. 3-6, где олигонуклеотид содержит модифицирующую группу, при этом модифицирующая группа выбрана из группы, состоящей из: холестерина, полиэтиленгликоля, флуоресцентных зондов, биотина, полипептидов, витаминов, тканенацеливающих молекул и их комбинации.

8. Применение конъюгированного cоединения по любому из пп. 3-7 в лечении или предупреждении патологических состояний или заболеваний у субъекта, где состояния или заболевания вызваны экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени.

9. Применение по п. 8, где один или несколько генов выбраны из: генома HBV, генома HCV, PCSK9, гена, экспрессирующего ксантиноксидазу (такого как XDH), URAT1, APOB, генов, связанных с фиброзом печени (таких как AP3S2, AQP2, AZINl, DEGSl, STXBP5L, TLR4, TRPM5), генов, связанных с неалкогольной жировой болезнью печени (таких как PNPLA3, FDFTl), и генов, связанных с первичным билиарным циррозом (таких как HLA-DQB1, IL-12, IL-12RB2).

10. Способ обнаружения или локализации РНК в печени у субъекта, включающий введение субъекту конъюгированного соединения по любому из пп. 3-7; или фармацевтической композиции, содержащей конъюгированное соединение по любому из пп. 3-7 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

11. Способ по п. 10, где заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из: наследственного ангионевротического отека, семейной тирозинемии I типа, синдрома Алажиля, дефицита альфа-1-антитрипсина, нарушения синтеза желчных кислот и метаболических нарушений, атрезии желчевыводящих путей, фиброзно-кистозного заболевания печени, идиопатического неонатального гепатита, митохондриального заболевания печени, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, первичного склерозирующего холангита, транстиретинового амилоидоза, гемофилии, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, инфекции, вызванной вирусом гепатита В (HBV), инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гипергликемии, и заболеваний, сопровождающихся аномально повышенной выработкой глюкозы в печени аналогично диабету II типа, гепатиту и печеночным порфиринам.

12. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью к связыванию с рецептором ASGPR, содержащая эффективное количество конъюгированного соединения по любому из пп. 3-7 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, где фармацевтическая композиция составлена в виде дозированной формы, выбранной из группы, состоящей из: порошков, таблеток, гранул, капсул, растворов, эмульсий, суспензий, инъекций, спреев, аэрозолей, ингаляций сухого порошка и пластырей с микроиглами.

14. Фармацевтическая композиция по п. 12, где фармацевтическая композиция пригодна для введения субъекту, нуждающемуся в этом, внутривенно, внутримышечно, подкожно, с помощью пластырей с микроиглами, перорально, с помощью перорального или назального спрея, или местно.

15. Фармацевтическая композиция по п. 12, где субъектом является млекопитающее.

16. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 12-15 для лечения или предупреждения патологических состояний или заболеваний у субъекта, где состояния или заболевания вызваны экспрессией одного или нескольких генов в клетках печени.