Настоящая заявка основана на китайской патентной заявке № 202010692337.9, поданной 17 июля 2020 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки и испрашивает преимущество приоритета.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области химических лекарственных препаратов, в частности, относится к применению 2,4,5-тризамещенных 1,2,4-триазолонов в противовирусной терапии. На основании исследований in vitro показано, что такие соединения способны эффективно ингибировать различные вирусные инфекции, в частности, соединение BAY 2402234 обладает эффективным ингибирующим эффектом в отношении коронавируса, вируса гриппы, энтеровируса, вируса Зика, буньявируса и т.д.
Предшествующая область техники
Вирус представляет собой внеклеточную форму жизни, которая состоит только из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и должна паразитировать в живых клетках и размножаться путем репликации. Он заражает организм разными способами и размножается в восприимчивых к нему клетках-хозяевах.
Вирусы, инфицирующие человека, могут вызывать разную степень поражения человеческого организма. Например, некоторые заболевания, вызываемые вирусами, практически всегда приводят к смертельному исходу, такие как ВИЧ, вирус Эбола, вирус бешенства и др.; другие заболевания, вызванные вирусами, приводят к потере трудоспособности и даже пожизненной инвалидности, например, гепатит, вызванный вирусом гепатита А, гепатита В и другими 5 типами вируса гепатита, вирусный миокардит, вызванный вирусом Коксаки, вирусом гриппа и т.д. Кроме того, другие вирусные заболевания также представляют серьезную угрозу для здоровья человека, например, вирус денге и вирус Зика из семейства флавивирусов, буньявирус из семейства буньявирусов, энтеровирус из семейства пикорнавирусов и т.д.
Среди них коронавирус представляет собой оболочечный, несегментированный одноцепочечный РНК-вирус с положительной цепью, который имеет широкий спектр животных-хозяев. Коронавирусы, такие как SARS и MERS, происходящие от инфекционных заболеваний животных, могут приводить к смертельному исходу у людей.
11 февраля 2020 г. Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) объявил о появлении нового коронавируса -- тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2). В тот же день Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила, что заболевание, вызванное этим вирусом, получило официальное название COVID-19. В настоящее время новую коронавирусную инфекцию в основном лечат поддерживающей терапией в больнице, и для нее не существует специфических противовирусных препаратов. Существует настоятельная необходимость в разработке препаратов, способных эффективно ингибировать размножение описанных выше вирусов, в особенности SARS-CoV-2.
Соединения на основе 2,4,5-тризамещенных 1,2,4-триазолонов (формула I приведена ниже) являются новыми противоопухолевыми препаратами, разработанными фирмой Bayer AG. Противоопухолевое действие проявляется за счет ингибирования пролиферации опухолевых клеток и индуцирования дифференциации. Данные препараты обладают большим потенциалом для клинического лечения злокачественных опухолей костного мозга. В ряду этих соединений BAY 2402234 демонстрирует хорошую противоопухолевую активность как in vivo, так и in vitro, и в настоящее время проходит I фазу клинических испытаний с показаниями для опухолей костного мозга.
Содержание изобретения
В настоящем исследовании автором изобретения найдено, что BAY 2402234 способен ингибировать различные вирусы и проявляет низкую цитотоксичность в некоторых тестах. Это обеспечивает новый способ и возможность эффективной профилактики и/или лечения заболеваний или симптомов, вызванных вирусами.
В первом аспекте в изобретении предложено применение соединения формулы I, или его N-оксида, таутомера, геометрического изомера, сольвата, гидрата, фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемой соли его таутомера или N-оксида для изготовления лекарственного средства, где лекарственное средство используют для профилактики и/или лечения заболевания, вызванного вирусом, а соединение формулы I представлено ниже,
где
R1 представляет группу, выбранную из
3-пентила, 2,2-диметилпропила, 4-гептила, 4-фторфенилциклопропила, циклопентила, циклогексила, циклогептила, циклопентилметила, циклогексилметила, 1-циклогексилэтила, 1-гидроксипропан-2-ила, 2-гидроксипропила, 1-гидроксибутан-2-ила, 1-цианобутан-2-ила, 1-фенилбутан-2-ила, 1-амино-2-пропила, 1-амино-2-бутила, 1-амино-1-оксобутан-2-ила, индан-2-ила,
5-6-членной гетероциклоалкильной группы, которую выбирают из тетрагидрофуран-3-ила, тетрагидро-2H-пиран-4-ила и пиперидин-4-ила, и которая необязательно замещена одной или двумя метильными группами,
фенильной группы, которая необязательно замещена одним, двумя или тремя заместителями, причем каждый заместитель независимо выбирают из атома фтора или атома хлора, или группы, выбранной из метила, этила, пропила, изопропила, дифторметила, трифторметила, метокси, -O-C(=O)-1,1-диметилэтила, гидрокси, -C(=O)OCH3, -C(=O)NH-циклопропила, амино, метиламино, аминометила, -S-CH3, -S(=O)2CH3 и -S(=O)(NH)CH3, и
моноциклической гетероарильной группы, которую выбирают из оксазол-2-ила, пиразол-3-ила, пиразол-5-ила, пиридин-2-ила, пиридин-3-ила, пиридин-4-ила, пиримидин-2-ила, пиримидин-4-ила, хинолин-5-ила, индазол-5-ила, и которая необязательно замещена одним или двумя заместителями, причем каждый заместитель независимо выбирают из метильной и метокси-группы,
R2 представляет атом водорода, или атом фтора или хлора,
R3 представляет группу, выбранную из пропила, 2-метилпропила, 3-пентила, циклопропилметила, циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, дифторметила, трифторметила, 1,1-дифторэтила, проп-2-ен-1-ила, 2-метилпроп-1-ен-1-ила, N,N-диметиламиноэтила и фенила,
R4 представляет группу, выбранную из метила, этила, пропила, изопропила, 2-бутила, проп-2-ен-1-ила, циклопропилметила, бензила, циклопропила, циклобутила, циклопентила и 2-гидроксиэтила,
R5 представляет атом хлора или группу, выбранную из метила, этила, пропила, изопропила, 2-бутила, изобутила, трет-бутила, циклопропила, циклобутила, циклопентила, трифторметила, гидроксиметила, 1-гидроксиэтила, 2-гидроксипропан-2-ила, 1-хлорэтила, 1-гидрокси-2,2,2-трифторэтила, 1-метоксиэтила, метокси, изопропокси, метилсульфанила, аминометила, (метиламино)метила, (диметиламино)метила, 1-аминоэтила, 2-аминоэтила, метиламино и этил(метил)амино, -C(=O)OH, -C(=O)OCH3, -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)NHcyclopropyl, -C(=O)N(CH3)2 и -S(=O)(=NH)CH3.
В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы II,
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой РНК-содержащий вирус.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства коронавирусов, ортомиксовирусов, флавивирусов, буньявирусов, пикорнавирусов, аренавирусов, филовирусов, или вирус западного конского энцефалита (WEE).
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства коронавирусов.
В некоторых вариантах осуществления вирус семейства коронавирусов выбирают из HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой SARS-CoV-2.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства ортомиксовирусов.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус гриппа.
В некоторых вариантах осуществления вирус семейства ортомиксовирусов представляет собой вирус гриппа.
В некоторых вариантах осуществления вирус гриппа представляет собой вирус гриппа А (например, H1N1, H5N1, H7N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 или H10N8), вирус гриппа B или вирус гриппа C.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства флавивирусов.
В некоторых вариантах осуществления вирус семейства флавивирусов выбирают из вируса Зика, вируса денге, вируса Западного Нила, вируса желтой лихорадки и вируса гепатита (HCV).
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства буньявирусов.
В некоторых вариантах осуществления вирус семейства буньявирусов представляет собой буньявирус или флебовирус.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства пикорнавирусов.
В некоторых вариантах осуществления вирус семейства пикорнавирусов представляет собой энтеровирус или вирус ящура.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус семейства филовирусов.
В некоторых вариантах осуществления вирус семейства филовирусов выбирают из вируса Эбола, вируса Марбург и вируса Лловиу.
В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат применяют для профилактики и/или лечения заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, вирусом гриппа, вирусом Зика, вирусом денге, буньявирусом или энтеровирусом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления лекарственный препарат применяют для профилактики и/или лечения заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV, MERS-CoV, или SARS-CoV-2, например, SARS, MERS или COVID-19.
BAY 2402234 проявляет превосходную противовирусную активность по отношению к коронавирусу, в частности, к SARS-CoV-2, и может быть использован для лечения заболеваний, вызванных заражением вирусом, например, простой инфекции, такой как лихорадка, кашель, боль в горле и т.д., пневмонии, острой или тяжелой респираторной инфекции, гипоксической дыхательной недостаточности, острого респираторного дистресс-синдрома, сепсиса и септический шок и т.д. Благодаря творчески проведенному исследованию автором изобретения найдено, что BAY 2402234 способен ингибировать репликацию SARS-CoV-2 и обладает отличным терапевтическим эффектом при заболеваниях, вызванных SARS-CoV-2. Так, в некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления лекарственное средство применяют для профилактики и/или лечения заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, такого как COVID-19.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство предназначено для использования людьми.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство предназначено для использования животными.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
В некоторых вариантах осуществления соединение является единственным фармацевтически активным ингредиентом.
В некоторых вариантах осуществления соединение применяют в комбинации с другими фармацевтически активными ингредиентами. В некоторых вариантах осуществления соединение и другие фармацевтически активные ингредиенты входят в состав одной и той же дозы медикамента. В некоторых вариантах осуществления соединение и другие фармацевтически активные ингредиенты находятся в разных дозах медикамента. В некоторых вариантах осуществления соединение и другие фармацевтически активные ингредиенты вводят одновременно, по отдельности или последовательно. В некоторых вариантах осуществления прочие фармацевтически активные ингредиенты представляют собой противовирусные препараты, такие как амантадин, римантадин, энфувиртид, маравирок, ацикловир, ганцикловир, валацикловир, фамцикловир, фосфонат натрия, ламивудин, зидовудин, энтелтабин, тенофовир, адефовир дипивоксил, эфавиренз, невирапин, саквинавир, озельтамивир, занамивир, рибавирин и интерферон, и т.д.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой твердое или жидкое средство. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой таблетку, препарат для инъекции или спрей. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой таблетку или средство для инъекции.
Во втором аспекте изобретение также относится к применению соединения, определенного в первом аспекте, или его N-оксида, таутомера, геометрического изомера, сольвата, гидрата, фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемой соли его таутомера или N-оксида для изготовления лекарственного средства, где это лекарственное средство используют для ингибирования репликации вируса в клетке (например, клетки млекопитающего).
В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой человека, собаку или свинью.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство предназначено для использования людьми или использования животными.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
В некоторых вариантах осуществления соединение является единственным фармацевтически активным ингредиентом или используется в комбинации с другими фармацевтически активными ингредиентами (например, лекарственное средство является составным средством).
В некоторых вариантах осуществления прочие фармацевтически активные ингредиенты представляют собой противовирусные препараты, такие как один или более препаратов, выбранных из амантадина, римантадина, энфувиртида, маравирока, ацикловира, ганцикловира, валацикловира, фамцикловира, фосфоната натрия, ламивудина, зидовудина, энтелтабина, тенофовира, адефовира дипивоксила, эфавиренза, невирапина, саквинавира, озельтамивира, занамивир, рибавирин и интерферона, и др.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой твердое или жидкое средство.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой таблетку, средство для инъекции или спрей, предпочтительно таблетку или средство для инъекции.
В третьем аспекте изобретение также относится к применению соединения, определенного в первом аспекте, или его N-оксида, таутомера, геометрического изомера, сольвата, гидрата, фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемой соли его таутомера или N-оксида для получения ингибитора вируса.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор используют для ингибирования репликации или репродукции вируса в клетке (например, клетке млекопитающего).
В некоторых вариантах осуществления хозяин является млекопитающим.
В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека, собаку или свинью.
В четвертом аспекте изобретение относится к способу профилактики и/или лечения заболевания, вызванного вирусом, который включает в себя стадию введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения, определенного в первом аспекте, или его N-оксида, таутомера, геометрического изомера, сольвата, гидрата, фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемой соли его таутомера или N-оксида.
В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, таким как человек.
В некоторых вариантах осуществления соединение, или его N-оксид, таутомер, геометрический изомер, сольват, гидрат, фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемую соль его таутомера или N-оксида вводят отдельно или в комбинации с другим фармацевтическим ингредиентом, например, вводят одновременно, по отдельности или последовательно.
В некоторых вариантах осуществления прочие фармацевтически активные ингредиенты представляют собой противовирусные препараты, такие как один или более препаратов, выбранных из амантадина, римантадина, энфувиртида, маравирока, ацикловира, ганцикловира, валацикловира, фамцикловира, фосфоната натрия, ламивудина, зидовудина, энтелтабина, тенофовира, адефовира дипивоксила, эфавиренза, невирапина, саквинавира, озельтамивира, занамивир, рибавирин и интерферона, и т.д.
В пятом аспекте изобретение также относится к способу ингибирования репликации или репродукции вируса в клетке (например, клетке млекопитающего), который включает в себя стадию введения нуждающемуся в этом субъекту или приведения в контакт клетки с эффективным количеством соединения, определенного в первом аспекте, или его N-оксида, таутомера, геометрического изомера, сольвата, гидрата, фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемой соли его таутомера или N-оксида.
В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, таким как человек.
В некоторых вариантах осуществления клетка млекопитающего является клеткой человека.
В некоторых вариантах осуществления соединение, или его N-оксид, таутомер, геометрический изомер, сольват, гидрат, фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемую соль его таутомера или N-оксида вводят отдельно или в комбинации с другим фармацевтическим ингредиентом, например, вводят одновременно, по отдельности или последовательно.
В некоторых вариантах осуществления прочие фармацевтически активные ингредиенты представляют собой противовирусные препараты, такие как один или более препаратов, выбранных из амантадина, римантадина, энфувиртида, маравирока, ацикловира, ганцикловира, валацикловира, фамцикловира, фосфоната натрия, ламивудина, зидовудина, энтелтабина, тенофовира, адефовира дипивоксила, эфавиренза, невирапина, саквинавира, озельтамивира, занамивир, рибавирин и интерферона, и др.
Вирус и заболевание в аспектах со второго по пятый такие же, как определено в первом аспекте.
В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой коронавирус, такой как HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV, или SARS-CoV-2, в частности, SARS-CoV-2.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание, вызванное SARS-CoV-2, например, простую инфекцию (такую как лихорадка, кашель и/или боль в горле), пневмонию, острую или тяжелую респираторную инфекцию, гипоксическую дыхательную недостаточность, острый респираторный дистресс-синдром, сепсис или септический шок, в частности, COVID-19.
В настоящей заявке, если не указано иначе, использованные научные и технические термины имеют значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области. Кроме того, все методики с использованием клеточной культуры, молекулярной генетики, химии нуклеиновых кислот, иммунологических лабораторных операций, используемые здесь, являются общепринятыми и широко применяются в соответствующих областях. При этом для лучшего понимания настоящего изобретения далее приведены определения и пояснения соответствующих терминов.
Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемая соль» включает в себя соль неорганической кислоты или соль органической кислоты, и соль неорганического основания или соль органического основания, такую как соли натрия, соли калия, соли кальция, соли лития, соли меглумина, гидрохлоридные соли, гидробромидные соли, гидройодидные соли, нитраты, сульфаты, фосфаты, гидрофосфаты, ацетаты, пропионаты, бутираты, оксалаты, триметилацетаты, адипаты, альгинаты, лактаты, цитраты, тартраты, сукцинаты, малеаты, фумараты, пикраты, аспартаты, глюконаты, бензоаты, метансульфонаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, п-толуолсульфонаты или памоаты, и т.д.
Используемый в настоящем описании термин «геометрический изомер» относится к стереоизомеру, образующемуся в результате различного пространственного расположения групп в молекулах, имеющих двойную связь или циклическую структуру вследствие затруднения свободного вращения атомов или групп атомов, связанных с двойной связью или циклом, например, к цис/транс изомерам.
Соединение формулы I, приведенное в описании, может существовать в форме сольвата (предпочтительно, гидрата), и включает полярный растворитель, в частности, воду, метанол или этанол, в качестве структурного элемента кристаллической решетки. Количество полярного растворителя является стехиометрическим или нестехиометрическим. Следует понимать, что даже несмотря на то, что сольваты соединения формулы I, используемые для лечения заболевания или инфекции, определенных в настоящей заявке, могут иметь разные свойства (включая фармакокинетические свойства), после адсорбции субъектом образуется соединение формулы I, поэтому применение соединения формулы I включает в себя использование любого сольвата соединения формулы I.
Специалисты в данной области должны понимать, что поскольку для окисления до оксидов необходимо наличие у атома азота неподеленных электронных пар, не все азотсодержащие гетероциклы могут образовывать N-оксиды; специалисты в данной области смогут определить азотсодержащие гетероциклы, способные образовать N-оксиды. Специалистам в данной области также должно быть ясно, что третичные амины способны образовывать N-оксиды. Методы синтеза N-оксидов или гетероциклов и третичных аминов известны специалистам в данной области, включая использование пероксикислот, таких как пероксиуксусная кислота, м-хлорпероксибензойная кислота (MCPBA), перекись водорода, алкилгидроперекисей, таких как третбутилгидроперекись, пербората натрия и диоксирана, такого как диметилбисэтиленоксид, для окисления гетероциклов и третичных аминов. Данные способы получения N-оксидов широко известны и описаны в литературе, см., например, T. L. Gilchrist, Comprehensive Organic Synthesis, vol. 7, pp 748-750; A. R. Katritzky и A. J. Boulton, Eds., Academic Press; а также G. W. H. Cheeseman и E. S. G. Werstiuk, Advances in Heterocyclic Chemistry, vol. 22, pp 390-392, A. R. Katritzky и A. J. Boulton, Eds., Academic Press.
Соединение формулы I может существовать в виде смеси двух или более структурно различных форм (обычно называемых таутомерами) в состоянии быстрого равновесия. Иллюстративные примеры таутомеров включают кето-енольные таутомеры, фенол-кетонные таутомеры, нитрозо-оксимные таутомеры, имин-енаминные таутомеры и т.д. Следует понимать, что в объем заявки входят все такие изомеры в любом соотношении (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) или их смеси.
В настоящем изобретении термин «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» относится, в рамках медицинского назначения, к количеству, которого достаточно для лечения или профилактики заболевания у пациента, но которое достаточно мало для того, чтобы избежать серьезных побочных эффектов (при разумном соотношении польза/риск). Терапевтически эффективное количество соединения может изменяться в зависимости от факторов, включающих конкретное выбранное соединение (например, с учетом активности, эффективности и периода полувыведения), выбранный способ введения, подлежащее лечению заболевание, тяжесть подлежащего лечению заболевания, возраст, рост, массу и физическое состояние пациента, получающего лечение, историю болезни пациента, получающего лечение, продолжительность лечения, природу сопутствующей терапии, желательный терапевтический эффект и т.д., но оно все еще может быть определено обычным образом специалистами в данной области.
Кроме того, следует отметить, что конкретная дозировка и способ введения соединения формулы I, или его геометрического изомера, фармацевтически приемлемой соли, сольвата или гидрата определяются множеством факторов, включая возраст пациента, массу тела, пол, состояние здоровья, состояние питания, активность лекарственного препарата, продолжительность приема, скорость метаболизма, тяжесть заболевания и субъективное мнение врача. Предпочтительная доза составляет 0.001-1000 мг/кг массы тела/сутки.
Описание чертежей
Описание чертежей в описании предоставлено для дальнейшего пояснения настоящего изобретения и составляет часть настоящей заявки. Приведенные в качестве примера варианты осуществления и описание предназначены для пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как какое-либо неприемлемое ограничение настоящего изобретения. На рисунках:
На фиг. 1 показано влияние вирусной нагрузки РНК на клетки Vero E6, инфицированные штаммом SARS-CoV-2, где на рисунке (a) показано, что BAY 2402234 способен ингибировать вирусную нагрузку РНК на клетки через 24 ч после инфицирования клеток штаммом SARS-CoV-2, и ингибирующая активность зависит от дозы; ордината cлева представляет собой процентную степень ингибирования (соответствует красным точкам и аппроксимирующей их кривой), рассчитанную на основе числа копий вирусной РНК в образце, а ордината справа представляет процент цитотоксичности, рассчитанный из данных по жизнеспособности клеток (соответствует синим точкам и аппроксимирующей их кривой), на оси абсцисс отмечена концентрация лекарственного препарата; на рисунке (b) показано, что BAY 2402234 способен ингибировать вирусную нагрузку РНК на клетки через 48 ч после инфицирования клеток штаммом SARS-CoV-2, и ингибирующая активность зависит от дозы; ордината cлева представляет собой процентную степень ингибирования (соответствует красным точкам и аппроксимирующей их кривой), рассчитанную на основе числа копий вирусной РНК в образце, а ордината справа представляет процент цитотоксичности, рассчитанный из данных по жизнеспособности клеток (соответствует синим точкам и аппроксимирующей их кривой), на оси абсцисс отмечена концентрация лекарственного средства.
На фиг. 2 представлена цитотоксичность BAY 2402234 и его активность в отношении вируса гриппа при исследованиях in vitro.
Конкретный способ осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение четко и полностью иллюстрировано при помощи следующих примеров в сочетании с чертежами. Очевидно, что это лишь часть, а не все примеры. По крайней мере, один из следующих примеров является иллюстративным и не должен рассматриваться как ограничивающий каким-либо образом настоящее изобретение, а также его применение и использование. Все другие варианты осуществления, сделанные специалистом в данной области техники без проведения исследований в свете настоящего изобретения, также подпадают под объем охраны настоящего изобретения.
Пример 1. Эксперимент по изучению снижения нагрузки вирусной нуклеиновой кислоты на клетки, инфицированные штаммом SARS-CoV-2, под действием BAY 2402234
(1) Обработка инфицированных вирусом клеток лекарственным средством
Клетки Vero E6 (ATCC, кат. № 1586) помещали в 24-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов, затем осуществляли заражение клеток вирусом, в частности, вирус SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (штамм nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019, предоставленный Уханьским институтом вирусологии Китайской академия наук) разбавляли 2%-ным стабилизирующим раствором (состав: FBS (Gibco, кат. № 16000044) прибавляли к MEM (Gibco, артикул № 10370021) при объемном соотношении 2%, получая в результате 2%-ный стабилизирующий раствор) до соответствующей концентрации, а затем добавляли в 24-луночный планшет так, чтобы каждая лунка содержала вирусную нагрузку 100TCID50. После этого BAY 2402234 (MCE, арт. № HY-112645) разбавляли 2%-ным стабилизирующим раствором до соответствующей концентрации и прибавляли в соответствующие лунки таким образом, чтобы конечная концентрация лекарственного препарата составляла 100 мкМ, 33 мкМ, 11 мкМ, 3,7 мкМ, 1,23 мкМ, 0,41 мкМ, 0,14 мкМ, соответственно, а затем планшет помещали в инкубатор при 37°C в атмосфере 5% CO2 и непрерывно культивировали в течение 48 ч, а в контрольную группу клеток-носителей добавляли только 2%-ный стабилизирующий раствор без добавления тестируемого лекарственного препарата.
(2) Экстракция РНК
Набор реагентов для экстракции РНК приобретали у Qiagen, арт. № 74106. Все расходные материалы (центрифужная колонка, пробирка-резервуар объемом 2 мл, не содержащая РНКаз, и т.д.) и реагенты (RLT, RW1, RPE, вода, не содержащая РНКаз, и т.д.), используемые в следующих стадиях экстракции РНК, входили в состав набора. Все следующие этапы экстракции были рекомендованы инструкциями, имеющимися в наборе.
1) из планшета для тестирования отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли в пробирку Евр. Фарм., не содержащую нуклеаз, затем добавляли туда 350 мкл буфера RLT, перемешивали при помощи пипетки для полного лизирования, и центрифугировали, чтобы произвести отбор надосадочной жидкости;
2) к надосадочной жидкости со стадии 1) прибавляли равный объем 70%-ного этанола и хорошо перемешивали;
3) перемешанный раствор, полученный на описанной выше стадии 2), переносили в центрифужную колонку, не содержащую РНКаз, центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 с и отбрасывали оставшуюся жидкость;
4) в центрифужную колонку прибавляли 700 мкл буферного раствора RW1, затем осуществляли центрифугирование при 12000 об/мин в течение 15 с для очистки центрифужной колонки и отбрасывали оставшуюся жидкость;
5) в центрифужную колонку прибавляли 500 мкл буферного раствора RPE, затем осуществляли центрифугирование при 12000 об/мин в течение 15 с для очистки центрифужной колонки и отбрасывали оставшуюся жидкость;
6) в центрифужную колонку прибавляли 500 мкл буферного раствора RPE, затем осуществляли центрифугирование при 12000 об/мин в течение 2 мин для очистки центрифужной колонки и отбрасывали оставшуюся жидкость;
7) центрифужную колонку помещали в новую пробирку-резервуар объемом 2 мл, не содержащую РНКаз, и осуществляли центрифугирование при 12000 об/мин в течение 1 мин для осушения центрифужной колонки, а затем центрифужную колонку целиком переносили в пробирку-резервуар объемом 1,5 мл стадии 8);
8) центрифужную колонку, высушенную на стадии 7), помещали в новую пробирку-резервуар объемом 1,5 мл, прибавляли 30 мкл воды без РНказ и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин, полученный элюент содержал соответствующую РНК, и к нему добавляли ингибитор РНказ (NEB, арт. № M0314L), и использовали Nano Drop (Thermo scientific, Nano Drop One) для определения концентрации каждой РНК.
(3) Обратная транскрипция РНК
В данном эксперименте для обратной транскрипции РНК использовали набор для обратной транскрипции (набор реагентов PrimeScript™ RT reagent Kit с ферментом гДНК Eraser, кат. № RR047Q) производства TaKaRa Company. Осуществляли следующие стадии:
1) удаление гДНК: собирали образцы РНК из каждой экспериментальной группы, отбирали из них по 1 мкг и подвергали обратной транскрипции. Сначала в образец РНК каждой экспериментальной группы добавляли 2 мкл 5× буфера гДНК Eraser, в реакционную систему добавляли воду, не содержащую РНКазы, до объема 10 мкл и помещали на водяную баню при температуре 42°C на 2 мин для удаления гДНК, которые могут присутствовать в образце;
2) Обратная транскрипция: к образцу, полученному на стадии 1), добавляли соответствующие количества фермента, праймера Mix и реакционного буферного раствора, прибавляли воду, не содержащую РНКазы, до объема 20 мкл, помещали для взаимодействия на водяную баню при 37°C на 15 мин, затем помещали на водяную баню при 85°C на 5 с, получая в результате транскрипции кДНК.
(4) ПЦР в режиме реального времени
Для определения количества копий в мл первоначального раствора вируса использовали флуоресцентную количественную ПЦР.
Реакционную систему перемешивали с использованием ферментного премикса TB Green Premix (Takara, кат. № RR820A), и осуществляли реакцию амплификации и считывание при помощи амплификатора StepOne Plus Real-time PCR (марка ABI). Рассчитывали число копий на мл первоначального раствора вируса. Осуществляли следующие стадии:
1) Установление стандартов: плазмиду pMT-RBD (плазмида предоставлена Уханьским институтом вирусологии Китайской академии наук) разбавляли до 5×108 копий/мкл, 5×107 копий/мкл, 5×106 копий/мкл, 5×105 копий/мкл, 5×104 копий/мкл, 5×103 копий/мкл, 5×102 копий/мкл. Для кПЦР использовали 2 мкл стандарта или кДНК темплату.
2) В эксперименте использовали праймеры со следующими последовательностями: (все указаны в направлении 5'-3'):
RBD-qF: CAATGGTTTAACAGGCACAGG
RBD-qR: CTCAAGTGTCTGTGGATCACG
3) Использовали следующую методику проведения реакции:
Предварительная денатурация: 95°C в течение 5 минут;
Параметры цикла: 95°C в течение 15 секунд, 54°C в течение 15 секунд, 72°C в течение 30 секунд, в общей сложности 40 циклов.
Степень ингибирования (%) = (число копий РНК в группе, обработанной лекарственным препаратом)/(число копий РНК в инфицированной группе) × 100%
(5) Тест на цитотоксичность лекарственного препарата
Цитотоксичность лекарственного препарата определяли с использованием набора CCK-8 (Beoytime). Осуществляли следующие конкретные стадии:
1) Клетки 1×104 Vero E6 (ATCC) помещали в 96-луночный планшет и инкубировали при 37°C в течение 8 часов.
2) Препарат разбавляли ДМСО до соответствующей концентрации маточного раствора, а затем разбавляли средой MEM (Gibco, кат. № 10370021), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044), до той же концентрации, что и в случае обработки препаратом. Первоначальную среду из 96-луночного планшета отбрасывали, в лунки добавляли 100 мкл среды MEM, содержащей препарат, и готовили по три лунки для каждой концентрации. Использовали контрольную группу с носителем (в лунки с клетками добавляли ДМСО и среду без добавления лекарственного препарата) и контрольную группу с холостой пробой (в лунки добавляли ДМСО и среду без клеток). После добавления препарата клетки культивировали при 37°C в течение 48 часов.
3) В лунку для тестирования добавляли 20 мкл раствора CCK-8 (Beoytime), осторожно перемешивали, чтобы не допустить образования пузырьков, и непрерывно инкубировали при 37°C в течение 2 часов. OD450 считывали на микропланшетном ридере (Molecular Devices, модель SpectraMax M5), и рассчитывали жизнеспособность клеток:
Активность клеток (%) = (A(группа обработки препаратом) - A(контрольная группа с холостой пробой)) / (A(контрольная группа с носителем) - A(контрольная группа с холостой пробой)) ×100%
где А - показание микропланшетного ридера.
(6) Результаты эксперимента
Результаты эксперимента по ингибированию пролиферации вируса показали, что тестируемое соединение в концентрации 10 мкМ, 3,3 мкМ, 1,1 мкМ, 0,3 мкМ, 0,1 мкМ и 0,03 мкМ способно эффективно ингибировать репликацию генома вируса SARS-CoV-2 в инфицированной надосадочной жидкости (фиг. 1).
Результаты теста по определению цитотоксичности показали, что обработка тестируемым соединением (BAY 2402234) не приводила к изменению жизнеспособности клеток при концентрации менее 10 мкМ, то есть что тестируемое соединение не оказывало токсического действия на клетки в диапазоне всех тестируемых концентраций (фиг. 1).
(7) Вывод
Соединение BAY 2402234 значительно ингибирует изоляты SARS-CoV-2 nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019, при этом EC50 данного соединения составляет 0,0070 мкM и 0,0027 мкM соответственно через 24 часа и 48 часов после инфицирования, CC50 равна 198,8 мкM, а соответствующий терапевтический индекс SI равен 28400 и 73629,63 соответственно.
Пример 2. Оценка активности in vitro в отношении вируса гриппа и безопасности BAY 2402234
(1) Оценка противовирусной активности препарата в отношении вируса гриппа
1) Клетки MDCK (ATCC, кат. № CCL-34) инокулировали в 96-луночный планшет при концентрации 1,5×104 клеток/лунку, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Перед экспериментом клетки трижды промывали PBS (Gibco, кат. № 10010049), добавляли 100 мкл среды D/F-12 (Gibco, кат. № 11330032), содержащей 2 мкг/мл TPCK (Sigma, кат. № T1426). После этого маточный раствор 50 мМ BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой D/F-12 методом серийного разведения до концентрации 0,444 мкМ, 0,148 мкМ, 0,049 мкМ, 0,016 мкМ, 0,005 мкМ, 1,829 нМ, 0,609 нМ и 0,203 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Наконец, вирусы гриппа A/PR/8 (хранится в Академии военно-медицинских наук), A/California/07/2009 (хранится в Академии военно-медицинских наук), A/Hongkong/08/1968 (ATCC, кат. № VR-1679), A/Zhenxing1109/2010 (хранится в Академии военно-медицинских наук), B/Lee/40 (ATCC, кат. № VR-1535) разбавляли средой D/F-12, содержащей 2 мкг/мл TPCK до соответствующей концентрации, 50 мкл разбавленного раствора добавляли в 96-луночный планшет до достижения 100 TCID50 для каждой лунки. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 0,111 мкМ разбавляли методом 3-кратного серийного разведения до достижения конечной концентрации 0,111 мкМ, 0,037 мкМ, 0,012 мкМ, 0,004 мкМ, 0,0014 мкМ, 0,457 нМ, 0,152 нМ и 0,051 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата) и положительного контроля (в лунки добавляли ДМСО, культуральную среду и вирус, но без лекарственного препарата). Клетки культивировали при 37°С в течение 72 ч.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 7 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 5 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, а жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле:
жизнеспособность клеток (%) = (A(группа обработки препаратом) - A(группа положительного контроля)) / (A(группа отрицательного контроля) - A(группа положительного контроля)) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(2) Исследование цитотоксичности лекарственного препарата
1) Клетки MDCK (ATCC, кат. № CCL-34) инокулировали в 96-луночный планшет при концентрации 1,5×104 клеток/лунку, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Перед началом эксперимента клетки трижды промывали PBS (Gibco, кат. № 10010049), добавляли 150 мкл среды D/F-12 (Gibco, кат. № 11330032), содержащей 2 мкг/мл TPCK (Sigma, кат. № T1426). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой D/F-12 методом серийного разведения до концентрации 4 мкМ, 1,333 мкМ, 0,444 мкМ, 0,148 мкМ, 0,049 мкМ, 0,016 мкМ, 0,005 мкМ, 1,829 нМ, 0,609 нМ, 0,203 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 1 мкМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 1 мкМ, 0,333 мкМ, 0,111 мкМ, 0,037 мкМ, 0,012 мкМ, 0,004 мкМ, 0,0014 мкМ, 0,457 нМ, 0,152 нМ, 0,051 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата). Клетки культивировали при 37°С в течение 72 ч.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 7 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 5 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, а цитотоксичность рассчитывали по формуле:
цитотоксичность (%) = (A(группа отрицательного контроля) - A(группа обработки препаратом)) / (A(группа отрицательного контроля) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(3) Результаты теста
Результаты теста на противовирусную активность in vitro показали, что EC50 тестируемого соединения BAY 2402234 в отношении ингибирования вирусов гриппа A/PR/8, A/California/07/2009, A/Hongkong/08/1968, A/Zhenxing1109/2010 и B/Lee/40 составляет 0,01±0,0003 мкМ, 0,03±0,009, 0,007±0,003 мкМ, 0,04±0,01 мкМ, и 0,03±0,02 мкМ, соответственно (как показано в таблице 1); результаты теста на определение цитотоксичности показали, что CC50 тестируемого соединения по отношению к MDCK составляет 0,27±0,09 мкМ (как показано в таблице 1), а соответствующий терапевтический индекс равен 27, 9, 38,57, 6,75 и 9, соответственно.
(4) Вывод
Соединение BAY 2402234 обладает относительно широким спектром ингибирующего действия в отношении вируса гриппа (H1N1, озельтамивир-резистентный штамм H1N1, H3N2, тип B).
Таблица 1. Концентрация для достижения 50% максимального эффекта в отношении вируса гриппа (EC50) и безопасность (CC50) BAY 2402234
MDCK
MDCK
MDCK
MDCK
MDCK
MDCK
Пример 3. Оценка активности in vitro в отношении вируса Зика и безопасности BAY 2402234
Оценка противовирусной активности препарата против вируса Зика
1) Клетки BHK (хранятся в Академии военно-медицинских наук) или клетки Vero (хранятся в Академии военно-медицинских наук) инокулировали в 96-луночный планшет при концентрации 5×103 клеток/лунку в случае клеток BHK и 1×104 клеток/лунку в случае клеток Vero, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Культуральную среды из 96-луночного планшета отбрасывали, добавляли 100 мкл среды DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой DMEM методом серийного разведения до концентрации 800 нМ, 266,67 нМ, 88,89 нМ, 29,63 нМ, 9,88 нМ, 3,29 нМ, 1,10 нМ и 0,37 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Наконец, добавляли 50 мкл штамма SZ-SMGC-01 вируса Зика (хранится в Академии военно-медицинских наук), разбавленного средой DMEM, содержащей 2% FBS, до достижения 100 TCID50 для каждой лунки. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 200 нМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 200 нМ, 66,67 нМ, 22,22 нМ, 7,41 нМ, 2,47 нМ, 0,82 нМ, 0,27 нМ и 0,09 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (лунки, в которые добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата) и положительного контроля (лунки, в которые добавляли ДМСО, культуральную среду и вирус, без лекарственного препарата). Клетки BHK культивировали при 37°С в течение 9 суток, а клетки Vero культивировали в течение 7 суток.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS (Gibco, кат. № 10010049) смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 5 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 2 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, а жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле:
жизнеспособность клеток (%) = (A(группа обработки препаратом) - A(группа положительного контроля)) / A(группа отрицательного контроля)) - (A(группа положительного контроля) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(2) Исследование цитотоксичности лекарственного препарата
1) Клетки BHK (хранятся в Академии военно-медицинских наук) или клетки Vero (хранятся в Академии военно-медицинских наук) инокулировали в 96-луночный планшет в концентрации 5×103 клеток/лунку для клеток BHK и 1×104 клеток/лунку для клеток Vero, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Культуральную среды из 96-луночного планшета отбрасывали, добавляли 150 мкл среды DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой DMEM методом серийного разведения до концентрации 800 нМ, 266,67 нМ, 88,89 нМ, 29,63 нМ, 9,88 нМ, 3,29 нМ, 1,10 нМ и 0,37 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 200 нМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 200 нМ, 66,67 нМ, 22,22 нМ, 7,41 нМ, 2,47 нМ, 0,82 нМ, 0,27 нМ и 0,09 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата). Клетки BHK культивировали при 37°С в течение 9 суток, а клетки Vero культивировали в течение 7 суток.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS (Gibco, кат. № 10010049) смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 5 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 2 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, а цитотоксичность рассчитывали по формуле:
цитотоксичность (%) = (A(группа отрицательного контроля) - A(группа обработки препаратом)) / (A(группа отрицательного контроля) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(3) Результаты теста
На основании предварительных результатов теста показано, что тестируемое соединение BAY 2402234 обладает ингибирующим действием в отношении вируса Зика.
Пример 4: Оценка противовирусной активности in vitro в отношении буньявируса и безопасности BAY 2402234
(1) Оценка противовирусной активности препарата в отношении буньявируса
1) Клетки Huh7 (хранятся в Академии военно-медицинских наук) инокулировали в 96-луночный планшет при концентрации 5×103 клеток/лунку, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Культуральную среды из 96-луночного планшета отбрасывали, добавляли 100 мкл среды DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой DMEM методом серийного разведения до концентрации 800 нМ, 266,67 нМ, 88,89 нМ, 29,63 нМ, 9,88 нМ, 3,29 нМ, 1,10 нМ и 0,37 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Наконец, 50 мкл буньявируса (выделен в лаборатории из плазмы пациента в пекинской больнице Дитан Столичного медицинского университета) разбавляли средой DMEM, содержащей 2% FBS, до достижения 100 TCID50 для каждой лунки. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 200 нМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 200 нМ, 66,67 нМ, 22,22 нМ, 7,41 нМ, 2,47 нМ, 0,82 нМ, 0,27 нМ и 0,09 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата) и положительного контроля (в лунки добавляли ДМСО, культуральную среду и вирус, без лекарственного препарата). Клетки культивировали при 37°С в течение 6 суток.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS (Gibco, кат. № 10010049) смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 5 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 2 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, и рассчитывали жизнеспособность клеток:
жизнеспособность (%) = (A(группа обработки препаратом) - A(группа отрицательного контроля)) / A(группа отрицательного контроля)) - (A(группа положительного контроля) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(2) Исследование цитотоксичности лекарственного препарата
1) Клетки Huh7 (хранятся в Академии военно-медицинских наук) инокулировали в 96-луночный планшет в концентрации 1,5×103 клеток/лунку для клеток, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Культуральную среды из 96-луночного планшета отбрасывали, добавляли 150 мкл среды DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой DMEM методом серийного разведения до концентрации 800 нМ, 266,67 нМ, 88,89 нМ, 29,63 нМ, 9,88 нМ, 3,29 нМ, 1,10 нМ и 0,37 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 200 нМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 200 нМ, 66,67 нМ, 22,22 нМ, 7,41 нМ, 2,47 нМ, 0,82 нМ, 0,27 нМ и 0,09 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата). Клетки культивировали при 37°С в течение 6 суток.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS (Gibco, кат. № 10010049) смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 5 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 2 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, и рассчитывали цитотоксичность:
цитотоксичность (%) = (A(группа отрицательного контроля) - A(группа обработки препаратом)) / (A(группа отрицательного контроля) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(3) Результаты теста
На основании предварительных результатов теста показано, что тестируемое соединение BAY 2402234 обладает ингибирующим действием в отношении буньявируса.
Пример 5. Оценка противоэнтеровирусной активности in vitro и безопасности BAY 2402234
(1) Оценка противоэнтеровирусной активности препарата
1) Клетки Vero (ATCC, кат. № CCL-81) инокулировали в 96-луночный планшет при концентрации 1×104 клеток/лунку, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Перед началом экспериментом клетки трижды промывали PBS (Gibco, кат. № 10010049), добавляли 100 мкл DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой DMEM методом серийного разведения до концентрации 40 мкМ, 13,33 мкМ, 4,44 мкМ, 1,48 мкМ, 0,49 мкМ, 0,16 мкМ, 0,05 мкМ, 18,29 нМ, 6,09 нМ и 2,03 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Наконец, 50 мкл штамма энтеровируса СВ3 (хранится в Академии военно-медицинских наук) разбавляли средой DMEM, содержащей 2% FBS, до достижения 100 TCID50 для каждой лунки. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 10 нМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 10 мкМ, 3,33 мкМ, 1,11 мкМ, 0,37 мкМ, 0,12 мкМ, 0,04 мкМ, 13,72 нМ, 4,57 нМ, 1,52 нМ и 0,51 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата) и положительного контроля (в лунки добавляли только ДМСО, культуральную среду и вирус, без лекарственного препарата). Клетки культивировали при 37°С в течение 6 суток.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали в орбитальном встряхивателе в течение 5 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 3 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, и рассчитывали жизнеспособность клеток:
жизнеспособность клеток (%) = (A(группа обработки препаратом) - A(группа положительного контроля)) / A(группа отрицательного контроля)) - (A(группа положительного контроля) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(2) Исследование цитотоксичности лекарственного препарата
1) Клетки Vero (ATCC, кат № CCL-81) инокулировали в 96-луночный планшет при концентрации 1×104 клеток/лунку для клеток, где среда представляла собой DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащую 10% FBS (Gibco, кат. № 16000044), и культивировали в инкубаторе в течение 24 ч при 37°С в атмосфере CO2.
2) Перед началом эксперимента клетки трижды промывали PBS (Gibco, кат. № 10010049), добавляли 150 мкл среды DMEM (Gibco, кат. № 11995065), содержащей 2% FBS (Gibco, кат. № 16000044). После этого 50 мМ маточный раствор BAY 2402234 (MCE, кат. № HY-112645) разбавляли описанной выше средой DMEM методом серийного разведения до концентрации 40 мкМ, 13,33 мкМ, 4,44 мкМ, 1,48 мкМ, 0,49 мкМ, 0,16 мкМ, 0,05 мкМ, 18,29 нМ, 6,09 нМ и 2,03 нМ, при этом 50 мкл раствора каждой концентрации добавляли в планшет с культурой клеток. Конечная концентрация лекарственного препарата была в 0,25 раза меньше концентрации лекарственного препарата до обработки, то есть лекарственное средство с исходной концентрацией 10 нМ подвергали 3-кратному серийному разведению до достижения конечной концентрации 10 мкМ, 3,33 мкМ, 1,11 мкМ, 0,37 мкМ, 0,12 мкМ, 0,04 мкМ, 13,72 нМ, 4,57 нМ, 1,52 нМ и 0,51 нМ. Создавали группу отрицательного контроля (в лунки добавляли только ДМСО и культуральную среду, без лекарственного препарата). Клетки культивировали при 37°С в течение 5 суток.
3) Буферный раствор и субстрат из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, кат. № G7573) смешивали в темноте, получая рабочий раствор. Рабочий раствор и PBS смешивали в соотношении 4:6. Жидкость из планшета с культурой клеток отбрасывали, а затем в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого реагента, 96-луночный планшет встряхивали на орбитальном встряхивателе в течение 5 мин, чтобы вызвать лизис клеток. После стабилизации сигнала в темноте в течение 3 мин определяли хемилюминистенцию на приборе с использованием ферментной метки (Molecular Devices, SpectraMax M5), в качестве программы чтения планшета использовали предустановленную программу CellTiter-Glo, и рассчитывали цитотоксичность:
цитотоксичность (%) = (A(группа отрицательного контроля) - A(группа обработки препаратом)) / A(группа отрицательного контроля)) × 100%
где А - показания прибора с использованием ферментной метки.
(3) Результаты теста
На основании предварительных результатов теста показано, что тестируемое соединение BAY 2402234 обладает ингибирующим действием в отношении энтеровируса.
Помимо описанных здесь вариантов осуществления, согласно вышеприведенному описанию, для специалиста в данной области техники будут очевидны различные модификации изобретения. Такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Каждая из ссылок (включая все патенты, патентные заявки, статьи в журналах, книги и любые другие публикации), цитируемых в данной заявке, настоящим включена ссылкой во всей ее полноте.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидин и его применение | 2022 |
|
RU2791523C1 |
| Способ получения 5'-О-(3-фенилпропионил)-N4-гидроксицитидина | 2022 |
|
RU2791916C1 |
| Способ получения профилактической противовирусной композиции на основе эпигаллокатехин-3-галлата (EGCG) | 2021 |
|
RU2771898C1 |
| Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе гуминовых веществ | 2020 |
|
RU2752872C1 |
| Рекомбинантный белок, связывающийся с RBD S-белка SARS-CoV-2 | 2022 |
|
RU2778942C1 |
| Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта гриба Inonotus obliquus | 2020 |
|
RU2741714C1 |
| Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе меланина из гриба Inonotus obliquus | 2020 |
|
RU2747018C1 |
| Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus Hu-C6D7-RBD - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2 | 2022 |
|
RU2788359C1 |
| ПРОИЗВОДНОЕ ИНДОЛ-3-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ SARS-COV-2 | 2022 |
|
RU2820633C1 |
| Рекомбинантный вакцинный штамм для живой интраназальной вакцины, обеспечивающей сочетанную профилактику гриппозной и коронавирусной инфекций | 2022 |
|
RU2782531C1 |
Настоящее изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к применению соединения формулы II или его фармацевтически приемлемой соли, для изготовления лекарственного средства лечения заболевания, вызванного вирусом, выбранным из SARS-CoV-2, вируса гриппа, вируса Зика, буньявируса и энтеровируса. Технический результат изобретения - лечение заболевания, вызванного вирусом, выбранным из SARS-CoV-2, вируса гриппа, вируса Зика, буньявируса и энтеровируса. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.
1. Применение соединения формулы II или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства, где лекарственное средство используют для лечения заболевания, вызванного вирусом,
где вирус выбирают из SARS-CoV-2, вируса гриппа, вируса Зика, буньявируса и энтеровируса,
2. Применение соединения формулы II или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства, где лекарственное средство используют для ингибирования репликации или репродукции вируса в клетке,
где вирус выбирают из SARS-CoV-2, вируса гриппа, вируса Зика, буньявируса и энтеровируса,
3. Применение по п. 2, в котором клетка является клеткой млекопитающего.
4. Применение по любому из пп. 1-3, в котором лекарственное средство применяют для лечения заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.
5. Применение по п. 4, в котором заболевание представляет собой простую инфекцию, такую как лихорадка, кашель и/или боль в горле, пневмонию, острую или тяжелую респираторную инфекцию, гипоксическую дыхательную недостаточность, острый респираторный дистресс-синдром, сепсис или септический шок.
6. Применение по п. 4, в котором лекарственный препарат применяют для лечения COVID-19.
7. Применение по любому из пп. 1-6, в котором лекарственное средство предназначено для применения людьми или животными.
8. Применение по любому из пп. 1-7, в котором лекарственное средство дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное средство.
9. Применение по любому из пп. 1-8, в котором соединение представляет собой единственный фармацевтически активный ингредиент.
10. Применение по любому из пп. 1-9, в котором лекарственное средство представляет собой твердое или жидкое средство;
предпочтительно, лекарственный препарат представляет собой таблетку, средство для инъекций или спрей; предпочтительно таблетку или средство для инъекций.
11. Способ лечения заболевания, вызванного вирусом, включающий в себя стадию введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества соединения формулы II или его фармацевтически приемлемой соли,
где вирус выбирают из SARS-CoV-2, вируса гриппа, вируса Зика, буньявируса и энтеровируса,
12. Способ ингибирования репликации или репродукции вируса в клетке, включающий в себя стадию введения нуждающемуся в этом субъекту или приведения клетки в контакт с эффективным количеством соединения формулы II или его фармацевтически приемлемой солью,
где вирус выбирают из SARS-CoV-2, вируса гриппа, вируса Зика, буньявируса и энтеровируса,
13. Способ по п. 12, в котором клетка является клеткой млекопитающего.
14. Способ по любому из пп. 11-13, в котором соединение или его фармацевтически приемлемую соль применяют для лечения заболевания, вызванного SARS-CoV-2.
15. Способ по п. 14, в котором заболевание представляет собой простую инфекцию, такую как лихорадка, кашель и/или боль в горле, пневмонию, острую или тяжелую респираторную инфекцию, гипоксическую дыхательную недостаточность, острый респираторный дистресс-синдром, сепсис или септический шок.
16. Способ по п. 14, в котором соединение или его фармацевтически приемлемую соль применяют для лечения COVID-19.
17. Способ по любому из пп. 11-16, в котором субъект является млекопитающим, например, человеком.
18. Способ по п. 12, в котором клетка млекопитающего является клеткой человека.
| CN 110023302 A, 16.07.2019 | |||
| RUI XIONG et al | |||
| Novel and potent inhibitors targeting DHODH, a rate-limiting enzyme in de novo pyrimidine biosynthesis, are broad-spectrum antiviral against RNA viruses including newly emerged coronavirus SARS-CoV-2 | |||
| Способ восстановления спиралей из вольфрамовой проволоки для электрических ламп накаливания, наполненных газом | 1924 |
|
SU2020A1 |
| АМИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ РНК-СОДЕРЖАЩИМИ ВИРУСАМИ | 2014 |
|
RU2628800C2 |
| АМИД 1,2,4-ТРИАЗОЛ-3-ИЛТИОГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ГРИППА | 2014 |
|
RU2626003C2 |
| Печь для отжига стекольных изделий | 1929 |
|
SU23570A1 |
