Способ оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток с привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител Российский патент 2022 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток с привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител.

Научные исследования указывают на взаимосвязь и общность механизмов развития гестационной патологии. Изменения в организме женщины начинаются с момента формирования и функционирования фетоплацентарного комплекса. Эволюционно сложившийся, гемохориальный тип плацентации обеспечивает необходимую тесную взаимосвязь между организмом матери и плода для гармоничного и своевременного развития всех систем последнего. Данный тип плацентации с ранних сроков задействует все слои спиральных артерий, включая сосудистый эндотелий. Местная реакция на контакт двух генетически различных тканей может сопровождаться гиперактивацией защитных систем беременной и формировать специфический ответ на эти процессы, что, несомненно, может повлечь осложнения, изначально связанные с процессом плацентации.

Плацентарная недостаточность - острый или хронический клинико-морфологический симптомокомплекс, возникающий в результате сочетанной реакции плода и плаценты на различные нарушения состояния материнского организма. Плацентарная недостаточность является самым распространенным осложнением в акушерской практике, встречается с частотой около 30 % [Ailamazyan E.K. Obstetrics: national guidelines / E.K. Ailamazyan, V.I. Kulakov, V.E. Radzinsky, G.M. Saveliev. - M.: GEOTAR - Media, 2014].

Ни один орган не может сравниться с плацентой по разнообразию своих функций, потому что она выполняет действия всех основных систем органов, в то время как они дифференцируются и созревают у плода. Плацента также обладает основными эндокринными действиями, которые модулируют физиологию и метаболизм матери и обеспечивают безопасную и защитную среду, в которой может развиваться плод. Эффективность плацентарного обмена определяется сложным взаимодействием между ростом плаценты, экспрессией белка-переносчика, скоростью плацентарного кровотока, градиентами трансмембранной концентрации и метаболическими потребностями тканей плаценты. Это взаимодействие организуется материнскими, плацентарными и фетальными гормонами и при благоприятных условиях обеспечивает адекватное снабжение плода без чрезмерного истощения материнских резервов [Graham J. Burton and Abigail L. Fowden. The placenta: a multifaceted, transient organ. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015 Mar 5 DOI: 10.1098/rstb.2014.0066].

5-10% беременностей осложняются ограничением роста плода. Задержка роста плода характеризуется как неспособность плода достичь своего внутреннего потенциала роста. Это связано с повышенным риском неонатальной смертности, заболеваемости и неблагоприятными долгосрочными последствиями, такими как нарушение нейродевелопмента, сердечно-сосудистыми, эндокринными и метаболическими заболеваниями [Romy E Bezemer, Mirthe H Schoots , Albertus Timmer. Altered Levels of Decidual Immune Cell Subsets in Fetal Growth Restriction, Stillbirth, and Placental Pathology. Frontiers in Immunology 2020 Aug 20 (11). DOI: 10.3389/fimmu.2020.01898].

Ограничение роста плода продолжает оставаться ведущей причиной предотвратимого мертворождения и плохих неврологических исходов у потомства, а кроме того, ассоциируется с акушерскими осложнениями ятрогенных преждевременных родов и преэклампсии. Большее понимание многофакторного патогенеза как раннего, так и позднего начала задержки роста плода, особенно роль лежащих в основе плацентарных патологий, может дать представление о целенаправленном лечении, которое сохранит функцию плаценты [Melanie C. Audette, John C. Kingdom. Screening for fetal growth restriction and placental insufficiency. Semin Fetal Neonatal Med 2018 Apr; 23 (2) DOI: 10.1016/j.siny.2017.11.004].

Формирование плаценты — это сложный и многоэтапный процесс, полноценность которого во многом определяется васкуло- и ангиогенезом.

Васкулогенез — это образование новых кровеносных сосудов из мезодермальных клеток-предшественников эндотелиальных клеток (гемангиобластов), которое начинается в конце 3-й недели гестации [Rosen L.S. VEGF-targeted therapy: therapeutic potential and recent advances. Oncologist. 2005;10:382–391. DOI: 10.1634/theoncologist.10-6-382].

Ангиогенез — это образование сосудов из уже существующих структур за счет механизмов элонгации, инвагинации и капиллярного почкования [Соколов Д.И. Васкулогенез и ангиогенез в развитии плаценты. Журнал акушерства и женских болезней. 2007;56 (3):129–133].

Элонгация — это удлинение сосуда за счет пролиферации эндотелиальных клеток, которое представляет собой неразветвляющийся ангиогенез. Инвагинация и капиллярное почкование являются разветвляющимся ангиогенезом. При инвагинации происходит образование нового сосуда внутри просвета предыдущего за счет миграции эндотелиальных клеток, а при капиллярном почковании новая боковая ветвь сосуда формируется при помощи ее латерального роста.

Антифосфолипидный синдром (далее - АФС) – это аутоиммунное заболевание, характеризующееся развитием сосудистых тромбозов (артериальных и венозных) и/или акушерской патологии при наличии постоянно циркулирующих антифосфолипидных антител (антител к кардиолипину, далее – АФА), волчаночного антикоагулянта и антител к β2-гликопротеину-1, определенных у пациента два и более раз с интервалом не менее 12 недель [Miyakis S. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS) / S. Miyakis, M.D. Lockshin, T. Atsumi et al. // J. Thromb. Haemost. - 2006. - Vol. 4. - № 2. - P. 295–306]. Несмотря на то, что не все патогенетические механизмы достаточно изучены и исследования в этой области активно продолжаются, доказано и не вызывает сомнений ученых, что антифосфолипидные антитела многосторонне влияют на процессы формирования и развития трофобласта с момента установления маточно-плацентарного кровотока.

Причиной развития акушерских осложнений при АФС длительное время считалось непосредственное образование тромбов в материнско-плацентарном кровотоке, однако тромбообразованием невозможно объяснить все гистопатологические процессы, обнаруживаемые в плацентах женщин с АФС [Viall C.A. Histopathology in the placentae of women with antiphospholipid antibodies: A systematic review of the literature / C.A. Viall, L.W. Chamley // Autoimmun. Rev. - 2015. - Vol. 14. - № 5. - P. 446–71].

Одним из патогенетических механизмом в развитии акушерской патологии является воспаление [Alijotas-Reig J. Is obstetric antiphospholipid syndrome a primary nonthrombotic, proinflammatory, complement-mediated disorder related to antiphospholipid antibodies? / J. Alijotas-Reig, M. Vilardell-Tarres// Obstet. Gynecol. Surv. - 2010. - Vol. 65. - № 1. - P. 39–45; Redecha P. Neutrophil activation by the tissue factor/Factor VIIa/PAR2 axis mediates fetal death in a mouse model of antiphospholipid syndrome / P. Redecha, C.W. Franzke, R. Wolfram et al. // J. Clin. Invest. - 2008. - Vol. 118. - № 10. - P. 3453–61; Staub H.L. The antiphospholipid syndrome and Tregs / H.L. Staub, E.R.R. Dal Ben, M.E. Bauer // Autoimmun. Rev. - 2014. - Vol. 13. - № 6. - P. 697–698]. Так у женщин с повышенным уровнем АФА при гистологическом исследовании плаценты отмечают: плацентарные инфаркты, нарушение ремоделирования спиральных артерий, децидуальное воспаление, увеличение числа синцитиальных почек, уменьшение васкулосинцитиальных мембран и отложение продуктов активации системы комплемента C4d [Viall C.A. Histopathology in the placentae of women with antiphospholipid antibodies: A systematic review of the literature / C.A. Viall, L.W. Chamley // Autoimmun. Rev. - 2015. - Vol. 14. - № 5. - P. 446–71].

Васкулогенез и ангиогенез регулируются цитокинами и факторами роста [Demir R. Expression of VEGF receptors VEFGR-1 and VEGFR-2, angiopoietin receptors Tie-1 and Tie-2 in chorionic villi tree during early pregnancy. Folia Histochem Cytobiol. 2009; 47(3):435–445. DOI: 10.2478/v10042-009-0100-5]. Маркером ранней дифференцировки клеток-предшественников гемопоэза и эндотелиальных клеток является трансмембранный белок CD34, он локализуется в ворсинках плацент и сосудистой сети [Robin C., Bollerot K., Mendes S. et al. Human placenta is a potent hematopoietic niche containing hematopoietic stem and progenitor cells throughout development. Cell Stem Cell. 2009;5(4):385–395. DOI: 10.1016/j.stem.2009.08.020]. Данный белок определяет сосудистую плотность, а его уровень коррелирует с процессами васкулогенеза [Ульянина Е.В., Фаткуллин И.Ф. Роль сосудистого эндотелиального фактора роста в прогнозе сосудистых нарушений у беременных с синдромом задержки развития плода. Казанский медицинский журнал. 2015;96(2):220–223]. На фоне плацентарной недостаточности, задержки роста плода и переношенной беременности уровень экспрессии CD34 в капиллярах ворсин цитотрофобласта снижается [Федорова М.В., Смирнова Т.Л. Иммуногистохимические различия плацент при пролонгированной и истинно переношенной беременности. Вестник Чувашского университета. 2013;3:560–563]. Маркер CD34 используется для иммуногистохимической детекции кровеносных сосудов и оценки их плотности в ткани [Нефедова Н.А., Харлова О.А., Данилова Н.В. и др. Маркеры ангиогенеза при опухолевом росте. Архив патологии. 2016:2:55–62].

Ангиогенез и развитие сосудов имеют важное значение для развития и роста плода, при этом потеря беременности на ранних сроках и другие связанные с беременностью патологии связаны с аберрантным развитием сосудов.

Проблема невынашивания беременности при аутоиммунной патологии, а также ассоциированных с ними высоких рисков тромбоэмболических осложнений, является одной из наиболее актуальных в современной репродуктивной медицине.

На сегодняшний день не сформулированы единые терапевтические рекомендации для осуществления иммунотерапии АФС при ведении беременности. В прошлом веке иммунотерапия АФС проводилась с помощью метода иммунносупрессии (глюкокортикоидами).

Теоретическим обоснованием применения глюкокортикоидов является их противовоспалительная активность и снижение уровня АФА при их применении. Однако в 1989 Lockshin M. публикует данные о неэффективности преднизолона у пациенток с синдромом потери плода и АФС, а также данные об угрозе здоровью для матери и плода при его применении. Наличие многочисленных побочных эффектов у глюкортикоидов переключило внимание ученых в сторону разработки методов иммуномодуляции, например, с помощью внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ) (Prednisone does not prevent recurrent fetal death in women with antiphospholipid antibody. Lockshin MD, Druzin ML, Qamar T.Am J Obstet Gynecol. 1989 Feb; 160(2):439-43.)

В акушерско-гинекологической практике для лечения женщин с АФС ВВИГ был впервые предложен к применению в 1992 году как альтернатива глюкортикоидам. К настоящему времени они стали препаратами выбора при лечении антифосфолипидного синдрома у беременных женщин.

На данный момент нет установленных критериев оценки эффективности лечения ВВИГ беременных. До сих пор иммуногистохимическое исследование плаценты не применялось как метод контроля за проведенной терапией. Представленная методика имеет особое значение для обоснования терапии пациенток с привычным невынашиванием и АФА в период беременности. Применение предлагаемого способа оценки эффективности лечения ВВИГ беременных в практическом здравоохранении позволит врачам - патологоанатомам использовать информацию, необходимую для совершенствования подходов к комплексному патоморфологическому исследованию плаценты и оформлению гистологического заключения по плаценте, а акушерам-гинекологам - данные для разработки персоинфицированного подхода при реабилитации женщин в послеродовом периоде, а также для предгравидарной подготовки к следующей беременности с целью снижения рисков развития акушерских осложнений.

Задачей предлагаемого способа является обеспечение точной и достоверной оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток c привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител.

Техническим результатом заявляемого способа является расширение арсенала морфологических диагностических средств оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток c привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител.

Заявляемый технический результат достигается тем, что при иммуногистохимическом исследовании плаценты определяют относительную площадь экспрессии эндотелиального маркера (СD34+). При значении относительной площади экспрессии эндотелиального маркера (СD34+) равном 14 % или более подтверждают эффективность лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток c привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител.

Новизна изобретения заключается в том, что для оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток c привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител впервые определяют относительную площадь экспрессии эндотелиального маркера (СD34+).

CD34+ — мембранный белок, молекула межклеточной адгезии (сцепления между клетками), играющая роль на ранних этапах кроветворения. CD34+ опосредует связывание стволовых клеток с внеклеточным матриксом костного мозга или напрямую со стромальными клетками. Служит белковым каркасом для присоединения специфичных гликанов, который позволяет стволовым клеткам прикрепляться к лектинам, вырабатываемыми клетками стромы или другими компонентами костного мозга. Кроме этого, высокогликозилированный CD34+ предоставляет углеводные лиганды для селектинов. CD34+ состоит из 385 аминокислот, обладает высоким уровнем гликозилирования. Содержит единственный трансмембранный фрагмент. CD34-позитивные мононуклеарные клетки периферической крови способны дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro. В настоящее время наиболее часто используемые маркеры для определения эндотелиальных клеток-предшественников – это сочетание CD34, CD133 и VEGFR2 (KDR).

Иммуногистохимическое исследование проводилось в лаборатории иммуногистохимии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина. Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 6.0. В качестве системы визуализации использовали abcamMouseandRabbitSpecific HRP Plus (ABC) Detection IHC Kit (RTU)[ab93697].

Иммуногистохимический метод исследования включал: количественную и качественную оценку экспрессии эндотелиального маркера (СD34+). Антитела использованы в стандартном разведении в соответствии с рекомендациями фирмы производителя.

Количественную оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus BX46 и программного обеспечения «CellSens 47 Entry». Из фотосъемки исключались поля зрения, содержащие дефекты ткани, дефекты окрашивания и артефакты. Фотосъемку производили на увеличении 400× (окуляр 10×, объектив 40×), в режиме Photo, время экспозиции 1/38 с, чувствительность камеры – максимальная, размер изображения 2080×1544 пикселей, графический формат изображения JPEG (normal). Долю занимаемой экспрессии изучаемого маркера рассчитывали с помощью программы «VideotestMorphology 5.2».

В каждом срезе в 5 полях зрения оценивали следующие показатели:

– оптическую плотность экспрессии – величина вычислялась автоматически в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера; использование показателя, так называемой «оптической плотности экспрессии», являющегося базовым параметром программы «VideotestMorphology 5.2». Для анализа оптических параметров микрофотографий, является приемлемым, поскольку измерения осуществляются по аналогии со спектрофотометрическим анализом;

– относительную площадь экспрессии – вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата:

Где S% - относительная площадь экспрессии эндотелиального маркера (СD34+);

S позитив – значение площади иммунопозитивных клеток;

S общая – значение площади препарата.

После чего вычислялись средние величины исследуемых показателей.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Пациентка Б., 39 лет. В анамнезе – тяжелая преэклампсия в 25/26 недель, экстренное кесарево сечение, ребенок 460/26 СЗРП, умер на 8 сутки. Далее – неразвивающаяся беременность 7/8 недель, неразвивающаяся беременность 9/10 недель. Данная беременность IV, самостоятельная.

Обратилась при сроке 12/13 недель. По данным обследования – выявлен положительный волчаночный антикоагулянт (1,53 у.е.), до беременности установлен дефицит протеина S – 46,2%. Проводилось лечение внутривенными иммуноглобулинами – 3 курса: в 8/9 недель, 16 недель, 24 недели: 5%-100 мл внутривенно медленно 3 раза с интервалом 5 дней. За время течения беременности неоднократно госпитализировалась в отделение патологии беременности с целью контроля показателей гемостаза, фетометрии, допплерометрии, назначения гипотензивной терапии, коррекции гликемии (выявлен гестационный сахарный диабет). При сроке беременности 28 недель выявлено многоводие, бактериурия, проведен курс антибактериальной терапии. При сроке беременности 31/32 недели однократно отмечались нарушения гемодинамики I степени.

Поступила для планового родоразрешения в 37/38 недель с диагнозом:
Беременность 37 2/7 недель.
Рубец на матке после операции малого кесарева сечения в 2019 г.
Гестационный СД (диета).
Хроническая артериальная гипертензия.
Наследственная тромбофилия. Дефицит протеина S.
Антифосфолипидный синдром.
ОАГА (досрочное родоразрешение в 25/26 недель в связи с тяжелой преэклампсией, ребенок 460 гр/26, СЗРП, умер на 8 сутки).

При сроке 38 2/7 недель в плановом порядке, учитывая наличие рубца на матке после операции малого кесарева сечения, была родоразрешена оперативным путем. Родился мальчик массой 3790 грамм, длиной 51 см с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов. Кровопотеря составила 950 мл. Послед был направлен на гистологическое исследование, а также участок плаценты 3х3 см был вырезан и направлен на иммуногистохимическое исследование.

Относительная площадь экспрессии CD 34 + в препарате составила 24,745%.

Эффективность лечения внутривенными иммуноглобулинами подтверждена морфологически.

Пример 2.

Пациентка О., 32 лет. В анамнезе — 2 неразвивающаяся беременности 6/7 недель и 8/9 недель. Данная беременность III, самостоятельная. Обратилась при сроке 8/9 недель. При обследовании выявлен высокий титр волчаночного антикоагулянта (1,26 у.е.). Проводилось лечение внутривенными иммуноглобулинами – 3 курса: в 8/9 недель, 16 недель, 24 недели: 5%-100 мл внутривенно медленно 3 раза с интервалом 5 дней. За время течения беременности неоднократно дважды госпитализировалась в отделение патологии беременности с целью контроля показателей гемостаза, фетометрии, допплерометрии, коррекции анемии. Данных за хроническую плацентарную недостаточность при беременности не получено.

При сроке 38 5/7 недель самостоятельно вступила в роды. Роды велись под постоянным кардиомониторным наблюдение за состоянием плода. Родился мальчик массой 3190 грамм, длиной 50 см с оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов. Роды проведены через естественные родовые пути. Через 8 минут самостоятельно отделилась плацента и выделился послед, без дефектов плацентарной ткани. Кровопотеря составила 260 мл. Послед был направлен на гистологическое исследование, а также участок плаценты 3х3 см был вырезан и направлен на иммуногистохимическое исследование.

Относительная площадь экспрессии CD 34+ в препарате составила 16,390%.

Эффективность лечения внутривенными иммуноглобулинами подтверждена морфологически.

Пример 3.

Пациентка Т., 37 лет. В анамнезе – 3 неразвивающиеся беременности 6/7, 8/9 и 9/10 недель. На этапе планирования беременности выявлен высокий титр антител к аннексину V (23,7 IU/ml), гипергомоцистеинемия (9,27 мкмоль/л). Данная беременность IV, самостоятельная. С ранних сроков получала терапию, направленную на сохранение беременности. Учитывая наличие высокого титра антител к аннексину V, отягощенный акушерский анамнез, проведено лечение внутривенными иммуноглобулинами – 3 курса: в 8/9 недель, 16 недель, 24 недели: 5%-100 мл внутривенно медленно 3 раза с интервалом 5 дней. При сроке 15/16 недель по данным УЗИ отмечено укорочение цервикального канала, проведена антибактериальная терапия, наложен шов на шейку матки. Неоднократно госпитализировалась в отделение патологии беременности с целью контроля за показателями свертывающей системы крови, сохраняющей терапии, проведения профилактики респираторного дистресс-синдрома плода, лечения анемии.

При сроке 34 5/7 недель преждевременно излились околоплодные воды, началась регулярная родовая деятельность. Роды велись под постоянным кардиомониторным наблюдение за состоянием плода. В конце II периода родов отмечалось урежение сердцебиения плода до 90 уд/минуту, в связи с чем роды закончены путем вакуум-экстракцией плода. Родился мальчик массой 2540 грамм, длиной 48 см с оценкой по шкале Апгар 7/7 баллов. Через 5 минут самостоятельно отделилась плацента и выделился послед, без дефектов плацентарной ткани. Кровопотеря составила 310 мл. Послед был направлен на гистологическое исследование, а также участок плаценты 3х3 см был вырезан и направлен на иммуногистохимическое исследование.

Относительная площадь экспрессии CD34+ в препарате составила 15,636%.

Эффективность лечения внутривенными иммуноглобулинами подтверждена морфологически.

Приведенные примеры показывают целесообразность проведенного лечения и подтверждают его эффективность заявленным способом.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток с привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител. Для этого проводят иммуногистохимическое исследование плаценты путем определения относительной площади экспрессии эндотелиального маркера CD 34+, которую рассчитывают по формуле , где S% - относительная площадь экспрессии эндотелиального маркера CD 34+; S позитив - значение площади иммунопозитивных клеток; S общая - значение площади препарата. Эффективность лечения подтверждают при получении значения относительной площади экспрессии эндотелиального маркера CD 34+, равного 14% и более. Обеспечивается точная и достоверная оценка эффективности лечения. 3 пр.

Способ подтверждения эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток с привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител, включающий иммуногистохимическое исследование плаценты путем определения относительной площади экспрессии эндотелиального маркера CD 34+, которую рассчитывают по формуле

,

где S% - относительная площадь экспрессии эндотелиального маркера CD 34+; S позитив - значение площади иммунопозитивных клеток; S общая - значение площади препарата, причем эффективность лечения подтверждают при получении значения относительной площади экспрессии эндотелиального маркера CD 34+, равного 14% и более.