Питательные среды для способа получения дигаплоидов озимой пшеницы Российский патент 2024 года по МПК A01G31/00 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в технологии получения дигаплоидов озимой пшеницы. Изобретение представляет собой модифицированные составы питательных сред для получения дигаплоидных растений озимой мягкой пшеницы из культивируемых пыльников in vitro на этапах индукции эмбриогенеза у пыльников и регенерации растений.

Известны питательные среды на основе питательной среды Мурасиге-Скуга, (Калашникова Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум по биотехнологии растений // М.: КолосС, 2006; Лутова Л.А Биотехнология высших растений. - Изд-во С.-Пб. университета, 2003; Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. - Киев: Наукова думка, 1990), для культивирования пыльников с изолированных растений и индукции эмбриогенеза в культуре пыльников мягкой пшеницы. К недостаткам таких сред можно отнести несбалансированный состав витаминов и фитогормонов, способствующий больше каллусообразованию, а не прямому эмбриогенезу, что существенно влияет на количество образованных гаплоидов.

Задача изобретения - получение высокого процента гаплоидов и дигаплоидов озимой пшеницы за счет улучшения состава питательных сред. Технический результат достигается благодаря включению в состав дополнительно фитогомонов в концентрациях, способствующих образованию напрямую эмбриоидных структур и растений-регенерантов пшеницы.

Получение гаплоидов имеет большое значение для селекции, так как у таких форм легче выявить и произвести отбор ценных мутаций, а удвоив хромосомный набор колхицином можно получить дигаплоиды - диплоидные растения с полностью гомозиготным набором хромосом. Данные методы позволяют сократить время получения новых сортов пшеницы.

Успех получения гаплоидов зависит не только от физических условий выращивания, но и от состава питательных сред, в которых выращиваются пыльники и растения-регенеранты.

Для получения эмбриоидных структур напрямую из пыльников за основу берется классическая среда Мурасиге-Скуга. Главным отличием данной среды является дополнительное введение крахмала в концентрации 12000 мг/л, биотина - 0,05 мг/л, 2,4-Д - 2,0 мг/л и уменьшение концентрации сахарозы до 12000 мг/л (табл.1).

Такой состав будет способствовать образованию из пыльников эмбриоидных структур напрямую, минуя стадию каллусогенеза, что существенно сократит время получения гаплоидов. Выход эмбриоидов на данной питательной среде будет увеличен на 5%, по сравнению с другими средами.

Для индукции формирования растений-регенерантов используется модифицированная среда Мурасиге-Скуга, в которую дополнительно включены 1,0 мг/л аскорбиновой кислоты 1,0 мг/л БАЛ и 0,2 мг/л индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), увеличено содержание сахарозы до 110000 мг/л (табл. 2).

Данная питательная среда позволяет получить растения-регенеранты и вырастить их в пробирках, с образованием 3-4 побегов, готовых к обработке колхицином для получения дигаплоидов.

Пример использования питательных сред

Пример 1

Модифицированную питательную среду для культивирования пыльников и индукции эмбриогенеза озимой пшеницы приготавливают на основе питательной среды Мурасиге-Скуга, используя для ее приготовления соответствующее количество маточных растворов солей, растворов витаминов. Для приготовления питательной среды в химический стакан объемом 1 л помещают 12 г сахарозы, доливают дистиллированной водой до 400 мл и после ее растворения вносят необходимые количества маточных растворов солей, витаминов (согласно прописи МС), дополнительно вносят крахмальный раствор (12 г крахмала разводят горячей водой), дополнительно вводят биотин (0,05 мг/л) и 2,4-Д (2,0 мг/л). Проверяют рН раствора, который не должен превышать 5,7-5,8, при необходимости корректируют 0,1% раствором КОН. В другом стакане нагревают агар-агар, замоченный предварительно в воде для набухания. Его смешивают с приготовленными растворами и доводят объем до 1 л. Питательную среду разливают в стеклянные пробирки или банки на треть объема, закрывают ватными пробками или алюминиевой фольгой и стерилизуют в автоклаве.

В стерильных условиях ламинарного бокса пыльники пшеницы стерильными инструментами помещают в пробирки или банки на питательную среду, размещая их равномерно по всей поверхности среды. Образование эмбриоидных структур и выхода из них гаплоидных растений с использованием модифицированной питательной среды и соблюдением всех условий был выше на 2% по сравнению с аналогом.

Пример 2

Модифицированная питательная среда для получения растений-регенерантов готовится по прописи МС, с некоторыми изменениями. В химический стакан объемом 1 л помещают 110 г сахарозы, доливают дистиллированной водой до 500 мл и после ее растворения вносят необходимые количества маточных растворов солей, витаминов (согласно прописи МС), дополнительно вносят 1,0 мг/л аскорбиновой кислоты 1,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Проверяют рН раствора, который не должен превышать 5,7, при необходимости корректируют 0,1% раствором КОН. В другом стакане нагревают агар-агар, замоченный предварительно в воде для набухания. Его смешивают с приготовленными растворами и доводят объем до 1 л. Питательную среду разливают в стеклянные пробирки или банки на треть объема, закрывают ватными пробками или алюминиевой фольгой и стерилизуют в автоклаве.

На готовую стерильную модифицированную среду для получения растений-регенерантов размещают эмбриоидные структуры. Работу проводят в условиях ламинарного бокса. Приживаемость растений-регенерантов на модифицированной питательной среде была выше на 5-7%.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в технологии получения дигаплоидов озимой пшеницы. Изобретение представляет собой модифицированные составы питательных сред для получения дигаплоидных растений озимой мягкой пшеницы из культивируемых пыльников in vitro на этапах индукции эмбриогенеза у пыльников и регенерации растений. Получение гаплоидов имеет большое значение для селекции, так как у таких форм легче выявить и произвести отбор ценных мутаций, а удвоив хромосомный набор колхицином, можно получить дигаплоиды - диплоидные растения с полностью гомозиготным набором хромосом. Данные методы позволяют сократить время получения новых сортов пшеницы. Успех получения гаплоидов зависит не только от физических условий выращивания, но и от состава питательных сред, в которых выращиваются пыльники и растения-регенеранты. 2 табл., 2 пр.

Питательная среда для получения дигаплоидных растений озимой пшеницы из культивируемых пыльников in vitro, отличающаяся тем, что среда по прописи МС для культивирования выделенных пыльников дополнительно включает крахмал в концентрации 12000 мг/л, биотин - 0,05 мг/л, 2,4-Д - 2,0 мг/л и уменьшенную концентрацию сахарозы до 12000 мг/л.