Способ получения стабильного высококонцентрированного коллоидного раствора на основе лазерно-аблированных наночастиц золота диаметром до 10 нм для биомедицинского применения Российский патент 2025 года по МПК A61K33/242 A61K47/56 B01J13/00 B82B1/00 B82Y40/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для создания новых средств для диагностики и терапии заболеваний. Использование данного изобретения позволит изучать в экспериментальных условиях особенности анатомических систем, опухоли различной локализации, обнаруживать метастатические очаги, уточнять параметры кровоснабжения и анатомо-топографические особенности животного для дальнейших манипуляций [Pandharipande P.V., Krinsky G.A., Rusinek Н., Lee V.S. (2005). Perfusion imaging of the liver: current challenges and future goals. Radiology, 234(3), 661-673. doi: 10.1148/radiol.2343031362 Lauber, D.Т., Ftilop, A., Kovacs, Т., Szigeti, K., Mathe, D., Szijarto, A. (2017). State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory animals, 51(5), 465-478. doi: 10.1177/0023677217695852 Clark, D. P., Badea, С.T. (2014). Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica medica, 30(6), 619-634. doi: 10.1016/j.ejmp.2014.05.011 Lee, Y. C, Antonio, S., Antonio, S. (2015). Comparison of multimodality image-based volumes in preclinical tumor models using In-Air micro-CT image volume as reference tumor volume. Open Journal of Medical Imaging, 5(03), 117. doi: 10.4236/ojmi.2015.53016 Toy, R., Hayden, E., Camann, A., Berman, Z., Vicente, P., Tran, E., Karathanasis, E. (2013). Multimodal in vivo imaging exposes the voyage of nanoparticles in tumor microcirculation. ACS nano, 7(4), 3118-3129. doi: 10.102l/nn3053439 Topcu, O., Kurt, A., Nadir, I., Arid, S., Koyuncu, A., Aydin, C. (2009). Effects of contrast media on the hepato-pancreato-biliary system. World Journal of Gastroenterology: WJG, 15(38), 4788. doi: 10.3748/wjg. 15.4788 Cuenod, C. A., Leconte, I., Siauve, N., Resten, A., Dromain, C, Poulet, В., Frija, G. (2001). Early changes in liver perfusion caused by occult metastases in rats: detection with quantitative CT. Radiology, 218(2), 556-561. doi: 10.1148/radiology.218.2.r01fe 10556 Torchilin, V.P., Frank-Kamenetsky, M.D., Wolf, G.L. (1999). CT visualization of blood pool in rats by using long-circulating, iodine-containing micelles. Academic radiology, 6(1), 61-65. doi: 10.1016/S1076-6332(99)80063-4].

В настоящее время для изучения возможностей лучевых технологий (диагностики и терапии) у мелких лабораторных животных используют контрастные средства, различные по своему типу и составу [Торси, О., Kurt, A., Nadir, I., Arici, S., Koyuncu, A., Aydin, C. (2009). Effects of contrast media on the hepato-pancreato-biliary system. World Journal of Gastroenterology: WJG, 15(38), 4788. doi: 10.3748/wjg.l5.4788 Cuenod, C. A., Leconte, I., Siauve, N., Resten, A., Dromain, C, Poulet, В., Frija, G. (2001). Early changes in liver perfusion caused by occult metastases in rats: detection with quantitative CT. Radiology, 218(2), 556-561. doi: 10.1148/radiology.218.2.r01fe 10556 Torchilin, V.P., Frank-Kamenetsky, M.D., Wolf, G. L. (1999). CT visualization of blood pool in rats by using long-circulating, iodine-containing micelles. Academic radiology, 6(1), 61-65. doi: 10.1016/S1076-6332(99)80063-4Ehling, J., Theek, В., Gremse, F., Baetke, S., Mockel, D., Maynard, J., Lammers, T. (2014). Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. The American journal of pathology, 184(2), 431-441. doi: 10.1016/j.ajpath.2013.10.014], однако их применение в качестве дозоповышающих агентов для лучевой терапии затруднено ввиду быстрой почечной экскреции. Биосовместимые наночастицы, благодаря своим физическим свойствам, позволяют преодолеть эти ограничения благодаря низкой скорости выведения из кровеносного русла.

В настоящее время можно выделить три принципиальных подхода к синтезу наночастиц золота.

1. Конденсационный метод (химический синтез из солей золота) [Богачева Н.В., Смирнова Д.Н., Дармов И.В., Крупина К.А. «Способ получения наночастиц коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм». Патент РФ №2644466, дата публ. 12.02.2018].

2. Метод постоянного тока или дисперсионный метод, источником наночастиц в котором служат два электрода из золота, через которые подается в раствор постоянный ток. В процессе подачи тока электрод постепенно разрушается, а освободившееся в виде наночастиц золото оказывается в жидкой фракции, куда помещены электроды [Чигонин Н.Н., Агафонов А.В., Тукмачев В.А. «Способ получения порошка золота». Патент РФ №2033443, дата публ. 20.04.1995].

3. Метод лазерной абляции (фиг. 1), основанный на взаимодействии импульсного лазерного излучения с поверхностью металлического золота [Белотицкий В.И., Кумзеров Ю.А., Сысоева А.А. (2021). «Способ получения наночастиц золота». Патент №2754227, дата регистрации 30.08.2021; Миргоров Ю.А., Емельянов С.Г., Борщ Н.А. «Способ получения наночастиц золота из сырья, содержащего железо и цветные металлы». Патент РФ №2516153, дата публ. 27.09.2013].

Большинство зарегистрированных в настоящее время методов получения наночастиц золота описывают различные способы (технологии) химического синтеза, в частности, по методу Туркевича.

Известен «Способ получения наночастиц коллоидного золота со средним диаметром 25-30 нм» [Богачева Н.В., Смирнова Д.Н., Дармов И. В., Крупина К.А. (Патент РФ №2644466, дата публ.: 12.02.2018]. Данный метод не применим для получения наночастиц, которые будут использовать in vivo ввиду высокой вероятности эмболизации аппарата мочевыведения почки.

Известен «Способ получения порошка золота» [Чигонин Н.Н., Агафонов А.В., Тукмачев В.А. (Патент РФ №2033443, дата публикации: 20.04.1995]. Недостатком данного метода является то, что наночастицы получают химическим методом, в растворе остается большое количество токсичных компонентов растворителя.

Известен «Способ получения наночастиц золота из сырья, содержащего железо и цветные металлы» [Миргоров Ю.А., Емельянов С.Г., Борщ Н.А. (Патент РФ №2516153, дата публикации: 20.05.2014]. Недостатком является то, что данный химический метод получения наночастиц золота не предполагает введения в биологический объект.

Известен «Метод получения наночастиц золота, основанный на химическом получении коллоидов золота» [Patent No. 10,040,124 Jurczakowski R., Piwowar J., Gralec В., Lewera A. (2018). U.S. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office]. Для введения в живую систему не рекомендован ввиду сложности очистки.

Известен «Способ получения порошкового препарата наночастиц благородных металлов» [Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. (Патент РФ №2489231, дата публ.: 10.08.2013]. Это химический метод получения наночастиц золота с этапом лиофилизации. Приготовление раствора для инъекций и/или введения в живые системы из лиофилизата потребует внесения дополнительных растворителей, что осложняет работу ввиду увеличения промежуточных измерений концентрации наночастиц и их гидродинамического диаметра.

Известны «Монодисперсные наночастицы золота и простой, экологически безопасный процесс их изготовления». [Patent No. US 8257670 B1. Dakshinamurthy R, Sahi S. (2012). Monodisperse gold nanoparticles and facile, environmentally favorable process for their manufacture. U.S. Western Kentucky University Research Foundation]. Недостатком данного метода является то, что кроме самих наночастиц в растворе присутствуют углеводы и дополнительные источники калия и фосфатов, что может стать ограничивающим фактором при многократном введении препарата или некоторых видах патологий.

Известен «Процесс получения наночастиц золота» [Patent No. US 7232474 B2 Bouvrette P., Liu Y., Luong J.H., Male K.B. (2007). Process for producing gold nanoparticles. U.S.. National Research Council of Canada]. Метод требует длительной очистки наночастиц.

Известен «Способ получения наноразмерных металлических и металлоксидных частиц» [Александрова Г.П., Медведева С.А., Грищенко Л. А., Сухов Б. Г., Трофимов Б. А. (Патент РФ №2260500, дата публикации: 20.09.2005]. Это химический метод получения наночастиц золота, используемых в различных областях техники.

Известен «Способ получения наноструктурных металлических частиц» [Егорова Е.М., Ревина А.А. (Патент РФ №2147487, дата публикации: 20.04.2000] - химический метод получения наночастиц золота, требующий специфических сложных технических решений.

Наиболее близким вариантом получения такого типа наночастиц является патент США «Сопряженные наночастицы золота» [Sun D., Chen Н., Qian W., Che Y., Ito M., Paholak H., Sansanaphongpricha K. (2014). Conjugated gold nanoparticles. U.S. Patent No. US9234078B2. IMRA America Inc University of Michigan], принятый нами за прототип.

Для получения наночастиц золота авторы патента-прототипа предлагают использовать разноразмерные по золотому ядру наночастицы, которые покрывают биосовместимым полимером. Исследователи получали частицы, покрытые смесью биосовместимых полимеров (модифицированный полиэтиленгликоль), имеющих сродство к поверхности золотых наночастиц, один из которых содержал также и функциональную группу (аминогруппу) для возможности дальнейшей модификации поверхности. Размер этих наночастиц варьировал в достаточно широких пределах. Кроме того, в указанном патенте не предусматривается возможность концентрирования, а также не проверялась биосовместимость на живых системах. Следовательно, данных о том, могут ли они быть использованы в области лучевой диагностики, нет.

Отличительной особенностью метода получения наночастиц золота методом лазерной абляции в жидкости является то, что они могут быть не синтезированы, а сформированы из химически чистого металлического золота в объеме химически инертной деионизированной воды и/или ином физиологическом растворителе. В случае использования метода импульсной лазерной абляции золотой мишени, погруженной в жидкость, основным плюсом метода является возможность генерировать стабильные наноколлоиды золота, избегая химических прекурсоров, восстановителей и стабилизирующих лигандов, которые могут мешать и быть проблематичными для последующей функционализации и стабилизации. Эти особенности выгодно отличают данный метод от химических методов получения золотых наноноколлоидов. Таким образом, метод лазерной абляции позволяет получать химически чистые наночастицы в деионизованной воде или с минимальным количеством низкомолекулярных стабилизаторов синтеза, например, хлорида натрия (Таблица) [Kimling, J., Maier, М., Okenve, В., Kotaidis, V., Ballot, H., Plech, A. (2006). Turkevich method for gold nanoparticle synthesis revisited. The Journal of Physical Chemistry B, 110(32), 15700-15707. doi: 10.1021/jp061667w; Menendez-Manjon, A., Chichkov, B. N., Barcikowski, S. (2010). Influence of water temperature on the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles from laser ablation. The Journal of Physical Chemistry C, 114(6), 2499-2504. doi: 10.1021/jp909897v; Kim, M, Osone, S., Kim, Т., Higashi, H., Seto, T. (2017). Synthesis of nanoparticles by laser ablation: A review. KONA Powder and Particle Journal, 34, 80-90. doi: 10.14356/kona.2017009; Semaltianos, N. G. (2010). Nanoparticles by laser ablation. Critical reviews in solid state and materials sciences, 35(2), 105-124. doi: 10.1080/10408431003788233; Muto, H., Miyajima, K., Mafune, F. (2008). Mechanism of laser-induced size reduction of gold nanoparticles as studied by single and double laser pulse excitation. The Journal of Physical Chemistry C, 112(15), 5810-5815. doi: 10.1021/jp711353m; Tarasenko, N. V., Butsen, A. V., Nevar, E. A., Savastenko, N. A. (2006). Synthesis of nanosized particles during laser ablation of gold in water. Applied surface science, 252(13), 4439-4444. doi: 10.1016/j.apsusc.2005.07.150; Torrisi, L., Restuccia, N., Paterniti, I. (2018). Gold nanoparticles by laser ablation for X-ray imaging and protontherapy improvements. Recent patents on Nanotechnology, 12(1), 59-69 doi: 10.2174/1872210511666170609093433; Letzel, A., Santoro, M„ Frohleiks, J., ZiefuB, A. R., Reich, S., Plech, A., Gokce, B. (2019). How the re-irradiation of a single ablation spot affects cavitation bubble dynamics and nanoparticles properties in laser ablation in liquids. Applied Surface Science, 473, 828-837. doi: 10.1016/j.apsusc.2018.12.025; Saraeva, I. N., Van Luong, N., Kudryashov, S. I., Rudenko, A. A., Khmelnitskiy, R. A., Shakhmin, A. L. V., Minh, P. H. (2018). Laser synthesis of colloidal Si@ Au and Si@ Ag nanoparticles in water via plasma-assisted reduction. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 360, 125-131. doi: j.jphotochem.2018.04.004; Car, J., Blazeka, D., Krstulovic, N. (2022). Advanced quantitative analysis of colloidal solution of metal nanoparticles produced by laser ablation in liquids. Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer, 290, 108318. doi: 10.1016/j.jqsrt.2022.108318; Naser, H., Shanshool, H. M., Imhan, К. I. (2021). Parameters affecting the size of gold nanoparticles prepared by pulsed laser ablation in liquid. Brazilian Journal of Physics, 51(3), 878-898. doi: 10.1007/sl3538-021-00875-x; Pambudi, S. Handoko, D. (2020, April). Simple gold nanoparticles production method by ablated laser: Diameter modification. In Journal of Physics: Conference Series (Vol. 1528, No. 1, p.012059). IOP Publishing, doi: 10.1088/1742-6596/1528/1/012059.].

Задачей предложенного способа является получение биосовместимого высококонцентрированного коллоидного раствора наночастиц золота для биомедицинского применения в лучевой диагностике.

Задача решается с помощью технологии покрытия с одновременным концентрированием, а также включением нескольких последовательных этапов очистки:

- от крупных частиц,

- от непокрытых частиц,

- от солей.

Приведен пример применения КТ-сканирования живого объекта, которое реализовывали in vivo, с оценкой визуализирующих потенций полученных заявленным методом наночастиц золота.

Техническим результатом заявляемого способа является получение стабильного биосовместимого высококонцентрированного коллоидного раствора наночастиц золота для биомедицинского применения в лучевой диагностике.

Для реализации предложенного способа при практическом применении оптимальным является использование наночастиц золота, полученных методом лазерной абляции в водной среде размера до 10 нм. Метод был разработан [Sylvestre, J.P., Poulin, S., Kabashin, A.V., Sacher, E., Meunier, M., Luong, J. H. (2004). Surface chemistry of gold nanoparticles produced by laser ablation in aqueous media. The Journal of Physical Chemistry B, 108(43), 16864-16869.doi: 10.1021/jp047134+; Kabashin, A.V., Meunier, M., Kingston, C, Luong, J.H. (2003). Fabrication and characterization of gold nanoparticles by femtosecond laser ablation in an aqueous solution of cyclodextrins. The Journal of Physical Chemistry B, 107(19), 4527-4531.doi: 10.1021/jp034345q; Besner, S., Kabashin, A. V., Winnik, F. M., Meunier, M. (2009). Synthesis of size-tunable polymer-protected gold nanoparticles by femtosecond laser-based ablation and seed growth. The Journal of Physical Chemistry C, 113(22), 9526-9531. doi: 10.1021/jp809275v] и запатентован [Миргоров Ю.А., Емельянов С.Г., Борщ Н.А. «Способ получения наночастиц золота из сырья, содержащего железо и цветные металлы». Патент РФ №2516153, опубл. 20.05.2014]. Наночастицы золота в водной среде, синтезированные одностадийным методом фемтосекундной лазерной абляции, были взяты как основа будущего контрастного средства. При синтезе наночастиц золота был использован Yb:KGW лазер с длиной волны 1030 нм, длительностью импульса 250 фс, энергией одного импульса 30 мкДж и частотой следования лазерных импульсов 100 кГц. Был синтезирован коллоидный раствор наночастиц золота в водном растворе 1 мМ NaCl объемом 1000 мл, со средним размером ядра до 10 нм и массовой концентрацией золота 0,14 мг/мл (фиг. 3А) [Skribitsky V.A., Pozdniakova N.V., Lipengolts A.A., Popov A.A., Tikhonowski G.V., Finogenova Y.A., Grigorieva Е.Y. (2022). А Spectrophotometric Method for Estimation of the Size and Concentration of Laser Ablated Gold Nanoparticles. Biophysics, 67(1), 22-26. doi: 10.1134/S0006350922010171].

Заявляемый способ иллюстрирован фиг. 1-11.

На фиг. 1 представлена принципиальная схема синтеза коллоидного раствора наночастиц.

На фиг. 2 - схема этапов получения наночастиц золота по заявленному способу.

На фиг. 3 представлена фотография наночастиц золота в микропробирках. В ней использованы буквенные обозначения: А -коллоидный раствор наночастиц золота до центрифугирования; Б -коллоидный раствор наночастиц золота после центрифугирования; В -итоговый коллоидный раствор наночастиц золота.

На фиг. 4 представлено устройство использованного роторного испарителя, где цифрами обозначено: 1 - приемная колба, 2 - холодильник, 3 - привод, 4 - отгонная колба, 5 - водяная баня.

На фиг. 5 представлены фотографии колонки PD-10 с сорбентом Sephadex G-25M, где буквами обозначено состояние колонки А - до нанесения коллоидного раствора наночастиц золота; Б - с нанесенным коллоидным раствором наночастиц золота; В - после снятия образца (непокрытые наночастицы золота).

На фиг. 6 представлено изображение полученных спектров поглощения для коллоидного раствора наночастиц золота в видимой и ультрафиолетовой области спектра излучения. Буквенное обозначение: А - коллоидный раствор наночастиц золота до центрифугирования (разведение деионизированной водой 1:1, средний размер золотого наноядра 8±2 нм, массовая концентрация золота - 0,16 мг/мл); Б - коллоидный раствор наночастиц золота после центрифугирования (разведение деионизированной водой 1:1, средний размер золотого наноядра 5±1 нм, массовая концентрация золота - 0,12 мг/мл); В - итоговый коллоидный раствор наночастиц золота (разведение деионизированной водой 1:1399, средний размер золотого наноядра 6±1 нм, массовая концентрация золота 112 мг/мл).

На фиг. 7 представлено распределение наночастиц золота в коллоидном растворе в зависимости от гидродинамического диаметра наночастицы золота. Буквенное обозначение: А - исходный коллоидный раствор наночастиц золота (средний гидродинамический диаметр 56±19 нм); Б - коллоидный раствор наночастиц золота после центрифугирования (средний гидродинамический диаметр 20±5 нм); В - итоговый коллоидный раствор наночастиц золота (средний гидродинамический диаметр 31±9 нм).

На фиг. 8 представлено изображение наночастиц золота, полученное методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Буквенное обозначение: А - СЭМ-изображение исходных наночастиц золота; Б - стандарт СЭМ-изображение итоговых наночастиц золота. Для всех изображений СЭМ-изображения приведены с одинаковым масштабом, стандарты СЭМ-изображения подобраны под калибровочную шкалу.

На фиг. 9 представлен корональный срез КТ-изображения мыши на уровне сердца (выделено прямоугольным контуром). Буквенное обозначение: А - до введения наночастиц золота; Б - после введения наночастиц золота через внутривенный путь.

На фиг. 10 представлена томограмма коронального среза КТ-изображения мыши на уровне печени (выделена пунктирным овалом) и селезенки (выделена сплошным овалом). Буквенное обозначение: А - до введения наночастиц золота; Б - после введения наночастиц золота через внутривенный путь.

На фиг. 11 представлен корональный срез КТ-изображения мыши на уровне правой задней лапы с перевитой подкожно аденокарциномой молочной железы ЕМТ6. Буквенное обозначение: А - до введения наночастиц золота; Б - после введения наночастиц золота через внутривенный путь.

Способ получения стабильного высококонцентрированного коллоидного раствора наночастиц золота с полимерным биосовместимым покрытием (например, SH-PEG) осуществляют следующим образом:

1. раствор наночастиц (фиг. ЗА), полученных методом фемтосекундной лазерной абляции в жидкости объемом 1 л, фильтруют через обеззоленную фильтровальную бумагу;

2. проводят аликвотирование по 20 мл раствора наночастиц золота во флаконы 50 мл с коническим дном (Артикул N-602052, NEST, Китай) и центрифугируют 20 мин при 4255 g при комнатной температуре для удаления крупнодисперсных наночастиц золота (центрифуга BECKMAN COULTER Allegra X-30R, США);

3. проводят отбор супернатанта в отдельный мерный стакан из стекла объемом 1 л (фиг. 3 Б);

4. проводят измерение концентрации супернатанта и среднего значения размера золотого наноядра согласно Skribitsky V.A., Pozdniakova N.V., Lipengolts A.A., Popov A.A., Tikhonowski G.V., Finogenova Y.А., Grigorieva Е.Y. (2022). A Spectrophotometric Method for Estimation of the Size and Concentration of Laser Ablated Gold Nanoparticles. Biophysics, 67(1), 22-26. doi: 10.1134/S0006350922010171;

5. по полученным в п. 4 результатам вычисляют суммарную площадь поверхности наночастиц золота в коллоидном растворе произвольного объема по формуле:

где

C_m - массовая концентрация золота в коллоидном растворе наночастиц золота, измеренная в п. 4;

Р_р-ра - объем коллоидного раствора наночастиц золота с массовой концентрацией C_m

ρ - плотность золота;

D_нч - средний диаметр наночастиц золота в коллоидном растворе, измеренный в п. 4.

6. проводят покрытие наночастиц золота биосовместимым полимером, например, SH-PEG (CAS. 134874-49-0, Sigma-Aldrich, Китай) путем смешивания полимера с раствором наночастиц золота по следующей методике:

6.1. вычисляют необходимую массу навески, исходя из принципа 2 молекулы полимера, например, SH-PEG, на 1 нм площади поверхности 1 наноядра по формуле:

где

S_пов-ти - площадь поверхности наночастиц золота в коллоидном растворе объемом Р_р-ра, вычисленная в п. 5;

N_A- число Авогадро;

М - молекулярная масса SH-PEG.

6.2. навеску полимера, например, SH-PEG массой m - разводят деионизированной водой - 1 мл;

6.3. стеклянный мерный стакан с наночастицами золота помещают на магнитную мешалку (BioSan MS-3000, Латвия) с якорем В40 40×8, фторопласт, овальный с кольцевым утолщением, без подогрева и оставляют смешиваться при комнатной температуре скоростью вращения якоря 1250 об/мин 5 минут до получения воронки в растворе;

6.4. после образования воронки в раствор наночастиц золота вносят по каплям раствор полимера SH-PEG в деионизированной воде;

6.5. после внесения всего объема полимера SH-PEG в деионизированной воде смешивание продолжают еще 24 часа при NT и скорости вращения 250 об/мин таким образом, чтобы воронки в растворе не было;

7. процесс концентрирования раствора, содержащего наночастицы золота, проводят по следующей схеме:

7.1. полученный ранее в п. 6.5 раствор помещают в испарительную колбу объемом 1000 мл (NS 29/32) ротационного испарителя, например, BUCHI Rotavapor®-R (Швецария), подключенного к вакуумному насосу Value VE 135N (Россия), с давлением 20 Па. Схема роторного испарителя представлена на фиг. 4;

7.2. колбу с раствором начинают вращать со скоростью 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя при комнатной температуре 15 минут;

7.3.через 15 минут начинают нагрев водяной бани до 37°С;

7.4. проводят термометрию воды в емкости водяной бани;

7.5. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.6. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 42°С;

7.7. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.8. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 47°С;

7.9. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.10. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 52°С;

7.11. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.12. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 57°С;

7.13. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.14. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 60°С;

7.15. вращение колбы продолжают при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя с упариванием объема до 100-200 мл раствора в колбе;

7.16. объем полученных наночастиц золота перемещают из колбы роторного испарителя в колбу для роторного испарителя объемом 250 мл (NS 29/32);

7.17. раствор в колбе начинают вращать со скоростью 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя при комнатной температуре 15 минут;

7.18. через 15 минут вращения колбы с наночастицами золота начинают нагрев водяной бани до 37°С;

7.19. проводят термометрию воды в емкости водяной бани;

7.20. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.21. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 42°С;

7.22. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.23. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 47°С;

7.24. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.25. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 52°С;

7.26. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.27. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 57°С;

7.28. продолжают вращение колбы 10 минут при скорости 150 об/мин в водяной бане роторного испарителя;

7.29. проводят нагрев объема воды в водяной бане до 60°С;

7.30. вращение колбы продолжают с упариванием объема до 5-10 мл раствора в колбе;

7.31. полученный объем перемещают в флакон с конусным дном на 15 мл;

7.32. проводят гель-фильтрацию по следующей методике:

7.32.1. готовую для использования колонку PD-10 с сорбентом для гель-фильтрации, например, Sephadex G-25M (17-0851-01, Pharmacia Швеция);

7.32.2. промывают 20 мл деионизированной воды;

7.32.3. вносят 2 мл концентрированного раствора из п. 7.31 наночастиц золота;

7.32.4. дополнительно вносят 0,5 мл деионизированной воды;

7.32.5. элюирование наночастиц осуществляют в отдельный флакон с конусным дном на 15 мл, добавляя 3,5 мл деионизированной воды на колонку;

7.32.6. колонку промывают 20 мл деионизированной воды;

7.32.7. процесс повторяют с п. 7.32.3 по п. 7.32.6 до окончания объема раствора наночастиц золота. Результаты гель-фильтрации представлены на фиг. 5;

7.33. проводят диализ полученного раствора наночастиц золота по следующей методике:

7.33.1. диализ полученного раствора сконцентрированных наночастиц золота проводят в диализном мешке (диализные мембраны Cellu Sep HI, диаметр 40 мм, длина 30 см, толщина стенки мембраны 18 мкм, размер пор мембраны 25000 MWCO, Франция) с размером пор 25 кДа, в который дозатором переносят весь объем из п. 7.32.7;

7.33.2. диализный мешок помещают в мерный стакан с деионизированной водой объемом 2 л;

7.33.3. стакан с диализным мешком оставляют на 48 часов при перемешивании на магнитной мешалке при скорости 250 об/мин и комнатной температуре со сменой буфера через 24 часа;

7.33.4. коллоидный раствор переливают в отдельную емкость;

7.34. проводят фильтрацию наночастиц золота через гидрофильный фильтр с размером пор 0,22 мкм, например, Millex-GV, Durapore (Германия);

7.35. отфильтрованные наночастицы золота переносят в стерильную стеклянную колбу для роторного испарителя объемом 20 мл (NS 24/29);

7.36. выпаривание проводят аналогично описанному в п. 7.1-7.14 до объема 0,5-1 мл;

7.37. колбу извлекают из водяной бани, остужают, а затем получившийся концентрированный раствор наночастиц золота помещают в пластиковую стерильную пробирку объемом 2 мл;

7.38. проводят оценку концентрации золота и среднего диаметра золотого наноядра в растворе по следующей оригинальной методике, опубликованной в [Bailly, A. L., Correard, F., Popov, A., Tselikov, G., Chaspoul, F., Appay, R., Esteve, M. A. (2019). In vivo evaluation of safety, biodistribution and pharmacokinetics of laser-synthesized gold nanoparticles. Scientific reports, 9(1), 12890. doi: 10.1038/s41598-019-48748-3], результат представлен на фиг. 6;

7.39. для дополнительного контроля качества проводят измерения гидродинамического диаметра и получают изображение сканирующей электронной микроскопии (фиг. 7-8);

7.40. пробирку маркируют, хранят в холодильнике при температуре 4°С (фиг. 3В).

В результате были получены биосовместимые наночастицы золота, готовые для введения в сосудистое русло лабораторных животных.

Пример использования, полученных по заявляемому способу наночастиц золота.

Для оценки контрастирующей способности наночастиц золота был выбран метод создания рентгенологического изображения при помощи микроКТ-сканера. Для внутривенного введения 0,2 мл раствора наночастиц золота с концентрацией золота 100 мг/мл использовали классический метод проведения инъекции в хвостовую вену, раствор вводили в течение 30 секунд. Далее животное помещали в камеру для подачи газового анестетика «Изофлуран» с содержанием по действующему веществу анестетика 2%. Наркотизированное животное перемещали в камеру томографа. Сканирование проводили в следующих условиях: компьютерная томография (КТ) в томографе MiLabs VECTor6 (Нидерланды). Постобработка и анализ изображений проводилась в программе PMod. Результаты использования наночастиц в живой системе представлены на фиг. 9-11. Таким образом, предложенный метод получения биосовместимых наночастиц золота с диаметром ядра до 10 нм позволил решить следующие задачи:

1. приготовлена инъекционная форма коллоидного раствора наночастиц золота;

2. был решен вопрос фракционирования исходных наночастиц до необходимого размера;

3. был решен вопрос управления процессом агломерации, используя постадийное концентрирование с промежуточным обессоливанием;

4. был решен вопрос очистки коллоидного раствора от «непокрытых» наночастиц золота биосовместимым полимером (фиг. 5В);

5. решен вопрос хранения коллоидного раствора наночастиц в водном растворе;

6. получены КТ-изображения лабораторных животных после введения наночастиц.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к способу получения коллоидного раствора золота для биомедицинского применения в лучевой диагностике. Способ получения коллоидного раствора золота для биомедицинского применения в лучевой диагностике, отличающийся тем, что раствор лазерно-аблированных наночастиц золота с диаметром золотого ядра до 10 нм и биосовместимого полимера подвергают повторяющимся циклам упаривания и обессоливания с одновременным отделением непокрытых полимером целевых наночастиц золота при сохранении постоянного молярного соотношения наночастиц золота и биосовместимого полимера посредством гель-фильтрации до получения раствора с массовой концентрацией золота не менее 100 мг/мл. Изобретение позволяет получить стабильный биосовместимый высококонцентрированный коллоидный раствор наночастиц золота для биомедицинского применения в лучевой диагностике. 11 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ получения коллоидного раствора золота для биомедицинского применения в лучевой диагностике, отличающийся тем, что раствор лазерно-аблированных наночастиц золота с диаметром золотого ядра до 10 нм и биосовместимого полимера подвергают повторяющимся циклам упаривания и обессоливания с одновременным отделением непокрытых полимером целевых наночастиц золота при сохранении постоянного молярного соотношения наночастиц золота и биосовместимого полимера посредством гель-фильтрации до получения раствора с массовой концентрацией золота не менее 100 мг/мл.