Способ оценки интенсивности фотосинтеза винограда с использованием показателя относительной копийности хлоропластной ДНК Российский патент 2024 года по МПК F26B9/06 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для оценки интенсивности фотосинтетических процессов с использованием оценки относительной копийности гена RPS16 хлоропластной ДНК винограда методом Real Time-PCR.

Известен способ оценки селекционного материала гороха посевного на интенсивность фотосинтеза листьев (RU 2626586 C1), включающий измерение интенсивности поглощения молекул углекислого газа на единицу поверхности листьев первого плодоносящего узла в фазу плодообразования, при этом измерения проводят с 9:00 до 11:00 часов дня с помощью переносного газоанализатора марки LI-6400 XT, который фиксирует и показывает значение интенсивности фотосинтеза на цифровом экране, при этом измерительную камеру прикрепляют к листу растения и в течение 1,5-2 минут ожидают стабилизации газообмена в измерительной камере. Изобретение позволяет сократить временные затраты и повысить точность по сравнению с известными способами.

К недостаткам способа следует отнести то, что используют переносный газоанализатор и измеряет интенсивность поглощения углекислого газа листьями гороха. Однако он не предоставляет детальную информацию о молекулярно-генетических механизмах, ответственных за фотосинтетические процессы.

Известен способ оценки функционального состояния тканей и органов растений, не содержащих хлорофилл (RU 2606923 C2). Способ заключается в измерении оптических характеристик исследуемого объекта. При этом в течение заданного времени от 3 секунд и более измеряют динамику мерцания спеклов отраженного или прошедшего через объект когерентного лазерного излучения. По степени и скорости флуктуации интенсивности заданного участка спекл-картины судят о функциональном состоянии тканей - чем они выше, тем выше уровень метаболической активности исследуемого объекта. Способ позволяет уменьшить трудоемкость анализов и оценить функциональное состояние, метаболическую активность и жизнеспособность растений.

К недостаткам способа следует отнести тот факт, что измеряют оптические характеристики тканей растений, используя динамику мерцания спеклов. Он может быть полезен для оценки функционального состояния, но не предоставляет специфической информации о фотосинтетических процессах и их интенсивности.

В качестве прототипа выбран способ флуорометрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, устройство для его осуществления и измерительная камера» (RU 2354958 C2). В способе, включающем световое воздействие на образец пробы анализируемой среды, импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду и изменяемую длительность, при этом характеристики флуоресценции хлорофилла измеряют при постоянной фоновой подсветке, имитирующей интенсивность облучения объекта в момент проведения исследований в естественных условиях, и после адаптации его в темноте. Устройство включает измерительную камеру, четное количество источников измерительного света, оптически сопряженных с измерительной камерой, модуль измерения флуоресценции образца, блок управления, стабилизатор токов источников света и датчик естественной облученности. Измерительная камера содержит корпус, регистратор флуоресценции и четное число источников света, которые расположены попарно диаметрально противоположно друг другу в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса. Технический результат - повышение точности определения.

Недостатком способа является то, что он не является специфическим для оценки интенсивности фотосинтетических процессов и требует специализированного оборудования.

Задачей способа оценки интенсивности фотосинтеза винограда с использованием показателя относительной копийности хлоропластной ДНК является оценка степени фотосинтетических процессов в листьях винограда с целью определения оптимальных условий его выращивания в лабораторных и естественных условиях.

Поставленная задача решается тем, что способ оценки интенсивности фотосинтеза винограда с использованием показателя относительной копийности хлоропластной ДНК, при этом свежие листья винограда использовались для экстракции суммарной ДНК, суммарную геномную ДНК из 5-10 мг растительной ткани каждого образца экстрагировали с использованием модифицированной процедуры экстракции ДНК, количественную ПЦР (кПЦР) проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 при начальной денатурация при 95°С в течение 5 мин - 1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек, определяли уровни ДНК органелл по отношению к ядерному гену-мишени, количество полученной ДНК измеряли флуориметрическим методом и использованием набора реагентов, реакцию количественной RT-PCR проводили в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 10 нг общей ДНК 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров, определяли относительную копийность гена хлоропластной ДНК RPS16 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH b качестве референсного (Таблица 1), для оценки относительной копийности митохондриальной ДНК использовали алгоритмы 2^-ΔCt и 2^-ΔΔC_t, анализ первичных данных проводили с помощью программного продукта амплификатора, рассчитывали относительную копийность митохондриального гена rps16 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных и контрольных образцов, где K=K_exp/K_normal, где K_ехр - относительная копийность гена RPS16 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда после экспериментального воздействия, K_normal - относительная копийность гена RPS16 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда в отсутствие каких-либо экспериментальных воздействий, при значениях, отличающихся от контрольных показателей на 10% и более, приходят к выводу об угнетении (K_exp<K_normal) или интенсификации (K_exp>K_normal) окислительного фосфорилирования в тканях растения, оцениваемое по показателям относительной копийности митохондриальной ДНК, если K_exp=K_normal в пределах 10% погрешности, делается вывод о неизменности данного показателя.

Общие с прототипом признаки:

- световое воздействие на образец анализируемой пробы.

Отличительные признаки заявленного решения:

- свежие листья растения использовались для экстракции суммарной ДНК,

- суммарную геномную ДНК из 5-10 мг растительной ткани каждого образца экстрагировали с использованием модифицированной процедуры экстракции ДНК,

- количественную ПЦР (кПЦР) проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 при начальной денатурация при 95°С в течение 5 мин -1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек,

- определяли уровни копийности ДНК хлоропластов по отношению к ядерному гену-мишени,

- количество полученной ДНК измеряли флуориметрическим методом и использованием набора реагентов,

- реакцию количественной RT-PCR проводили в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 10 нг общей ДНК в объеме 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров,

- определяли относительную копийность гена хлоропластной ДНК RPS16 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH в качестве референсного,

для количественной оценки относительной копийности митохондриальной ДНК использовали алгоритмы 2^-ΔCt и 2^-ΔΔC_t,

- анализ первичных данных проводили с помощью программного продукта амплификатора,

- рассчитывали относительную копийность митохондриального гена RPS16 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных и контрольных образцов.

Заявленный способ обеспечивает оценку интенсивности фотосинтеза винограда с использованием показателя относительной копийности хлоропластной ДНК.

Способ реализуется следующим образом.

Хлоропластная ДНК (хпДНК) существует в виде множественных копий на органеллу. хпДНК содержится в листьях, и изменяет свою морфологию и копийность в зависимости от функциональной нагрузки хлоропласта. [Kuroiwa Т. Review of cytological studies on cellular and molecular mechanisms of uniparental (maternal or paternal) inheritance of plastid and mitochondrial genomes induced by active digestion of organelle nuclei (nucleoids). J Plant Res. 2010 Mar;123(2):207-30. doi: 10.1007/s10265-009-0306-9]

Количество копий ДНК в хлоропластах оказывает непосредственное влияние на уровень экспрессируемой ими РНК и, таким образом, этот показатель может быть использован как маркер интенсивности работ этих органелл у растений [Udy DB, Belcher S, Williams-Carrier R, Gualberto JM, Barkan A. Effects of reduced chloroplast gene copy number on chloroplast gene expression in maize. Plant Physiol. 2012 Nov; 160(3): 1420-31. doi: 10.1104/pp.112.204198].

Количественная ПЦР (кПЦР) позволяет измерять уровни ДНК органелл по отношению к ядерному гену-мишени. Мы использовали этот подход для определения изменений числа копий ДНК органелл относительно ядерного генома в листьях проростков винограда в условиях in vitro.

Свежие листья винограда использовались для экстракции суммарной ДНК. Суммарную геномную ДНК из 5-10 мг растительной ткани каждого образца экстрагировали с использованием модифицированной процедуры экстракции ДНК методом СТАВ, описанной в работе и др. & Temel, Melih & Pamay, Seda & Kardelen, Altin & Kaya, Hilal. (2023). An Improved Method for Efficient DNA Extraction from Grapevine. 6. 21-36. https://doi.org/10.38001/ijlsb.1150387]. Количество полученной ДНК измеряли флуориметрическим методом с использованием флуориметра All Sheng Fluorometer, Fluo-100 (Китай) и набора реагентов QuantiFluor® dsDNA System («Promega»). Дизайн всех праймеров осуществлялся для не перекрывающихся генов органелл с использованием программы Primer-BLAST Для гена GAPDH использовалась последовательность EF192466.1, для гена NAD 1 использовалась последовательность NC_012119Л и для гена rpsl6 использовалась последовательность NC_007957.1. Количественный показатель растительной ткани обеспечивает необходимую чувствительность способа. Основные свойства праймеров приведены в Таблице 1.

Реакцию количественной RT-PCR проводят в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (LifeScience, Roche, Penzberg, Germany), 10 нг общей ДНК в объеме 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров (форвард и реверс, 0,33 мкМ). ПЦР проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 (Roche Life Science) с использованием следующей программы: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин (1 цикл), затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек.

Определение относительной копийности гена RPS16 (хлоропластная ДНК) проводили с использованием гена GAPDH (хромосомная ДНК) в качестве референсного. Для количественной оценки относительной копийности митохондриальной ДНК использовали алгоритмы 2^-ΔCt и 2^-ΔΔCt [Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 2008;3(6):1101-8. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.73].

Затем проводят анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора, рассчитывают относительную копийность митохондриального гена RPS16 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных и контрольных образцов K=K_exp/K_normal, где K_ехр - относительная копийность гена RPS16 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда после экспериментального воздействия, K_normal - относительная копийность гена RPS16 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда в отсутствие каких-либо экспериментальных воздействий. При значениях, отличающихся от контрольных показателей на 10% и более, приходят к выводу об угнетении (K_exp<K_normal) или интенсификации (K_exp>K_normal) окислительного фосфорилирования в тканях растения, оцениваемое по показателям относительной копийности митохондриальной ДНК. Если K_exp=K_normal в пределах 10% погрешности делается вывод о неизменности данного показателя.

Данный показатель с использованием относительной копийности хлоропластной ДНК позволяет провести оценку интенсивности процессов фотосинтеза.

Пример

Проводилась оценка влияния температурной обработки проростков растений Vitis vinifera в условиях in vitro в режиме 45°С 120 мин на интенсивность процессов фотосинтеза в листьях винограда, оцениваемое по показателю относительной копийности хлоропластной ДНК.

1. Экспланты (Vitis vinifera сорта Chardonnay) выращивали на базовой среде Мурасиге-Скуга (Murashige and Skoog medium, MS) с добавлением 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л Indole-3-butyric acid (IBA) и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП). Экспериментальные сосуды с питательной средой и эксплантами, разделяли на 2 группы: экспериментальная группа растений (ехр), подвергавшихся тепловой обработке в режиме 45°С, 120 минут и контрольная группа растений (normal), не подвергавшихся тепловой обработке.

Проводилась температурная обработка проростков растений Vitis vinifera в условиях in vitro в режиме 45°С 120 мин в суховоздушном термостате ТС-80М2 (Россия).

2. После окончания тепловой обработки винограда в режиме 45°С 120 минут обе экспериментальные группы объединяли и растения инкубировали при температуре 23±1°С при 16-часовом фотопериоде и освещении 40-ваттными флуоресцентными лампами холодного белого света с интенсивностью 105-115 мкмоль PPFD/m2/c (PPFD=плотность потока фотосинтетических фотонов) в течение 30 дней. Из каждой группы растений (контрольная и после проведения тепловой обработки) были случайным образом отобраны по четырнадцать образцов листовых пластин (5-10 мг) для последующей экстракции суммарной ДНК.

3. С препаратами полученной суммарной ДНК проводили реакцию количественной RT-PCR в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (LifeScience, Roche, Penzberg, Germany), 5 нг ДНК (5 мкл), 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров (форвард и реверс, 0,33 мкМ). RT-PCR проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 (Roche Life Science) с использованием следующей программы: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин (1 цикл), затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек. Для каждого из параметров с помощью программного обеспечения прибора получали первичные данные в формате C_t. Определение относительной копийности гена rps16 (хлоропластная ДНК) проводили с использованием гена GAPDH (хромосомная ДНК) в качестве референсного. Для количественной оценки использовали алгоритмы 2^-ΔCt и 2^-ΔΔACt.

Статистический анализ полученных данных с использованием параметрических и непараметрических критериев приведен в таблице 2.

Температурная обработка проростков растений Vitis vinifera в условиях in vitro (Experiment) выявила статистически достоверное (Т-тест Стьюдента, р<5%) уменьшение относительной копийности ДНК хлоропластов в листьях винограда, оцениваемое по показателям средних арифметических значений, на 32,5% по сравнению с аналогичным показателем у контрольных растений (Norma), не подвергавшихся температурному воздействию. Установлено, что тепловая обработка микрорастений винограда в использованном режиме подавляет процесс фотосинтеза на 32,5%_о.

В отличие от старых способов, данный способ с использованием оценки относительной копийности гена RPS16 хлоропластной ДНК винограда методом Real Time-PCR предоставляет более точную и специфическую оценку интенсивности фотосинтетических процессов. Он основан на молекулярно-генетических методах и позволяет более надежно и количественно оценить активность фотосинтеза в растениях.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для оценки интенсивности фотосинтетических процессов с использованием оценки относительной копийности гена RPS16 хлоропластной ДНК винограда методом Real Time-PCR. Способ включает световое воздействие на образец пробы анализируемой среды, при этом свежие листья винограда использовались для экстракции суммарной ДНК, суммарную геномную ДНК из 5-10 мг растительной ткани каждого образца экстрагировали с использованием модифицированной процедуры экстракции ДНК, количественную ПЦР (кПЦР) проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 при начальной денатурации при 95°С в течение 5 мин - 1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек, определяли уровни ДНК органелл по отношению к ядерному гену-мишени, количество полученной ДНК измеряли флуориметрическим методом и использованием набора реагентов, реакцию количественной RT-PCR проводили в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 10 нг общей ДНК 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров, определяли относительную копийность гена хлоропластной ДНК rps16 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDHb в качестве референсного, для количественной оценки относительной копийности митохондриальной ДНК использовали алгоритмы 2^-DCt и 2^-DDC_t, анализ первичных данных проводили с помощью программного продукта амплификатора, рассчитывали относительную копийность митохондриального гена rps16 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных и контрольных образцов, K=K_exp/K_normal. Техническая задача состоит в получении более точной и специфической оценки интенсивности фотосинтетических процессов. 2 табл., 1 пр.

Способ оценки интенсивности фотосинтеза винограда с использованием показателя относительной копийности хлоропластной ДНК, включающий световое воздействие на образец анализируемой пробы, отличающийся тем, что свежие листья винограда использовались для экстракции суммарной ДНК, суммарную геномную ДНК из 5-10 мг растительной ткани каждого образца экстрагировали с использованием модифицированной процедуры экстракции ДНК, количественную ПЦР (кПЦР) проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 при начальной денатурации при 95°С в течение 5 мин - 1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек, определяли уровни ДНК органелл по отношению к ядерному гену-мишени, количество полученной ДНК измеряли флуориметрическим методом и набором реагентов, реакцию количественной RT-PCR проводили в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 10 нг общей ДНК объемом 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров, определяли относительную копийность гена хлоропластной ДНК RPS16 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH в качестве референсного, для количественной оценки относительной копийности митохондриальной ДНК использовали алгоритмы 2^-ΔCt и 2^-ΔΔC_t, анализ первичных данных проводили с помощью программного продукта амплификатора, рассчитывали относительную копийность митохондриального гена RPS16 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных и контрольных образцов, K=K_ехр/K_normal,

где K_ехр - относительная копийность гена RPS16 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда после экспериментального воздействия, K_normal - относительная копийность гена RPS16 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда в отсутствие каких-либо экспериментальных воздействий, при значениях, отличающихся от контрольных показателей на 10% и более, приходят к выводу об угнетении (K_exp<K_normal) или интенсификации (K_exp>K_normal) окислительного фосфорилирования в тканях растения, оцениваемого по показателям относительной копийности митохондриальной ДНК, если K_exp=K_normal в пределах 10% погрешности, делается вывод о неизменности данного показателя.