Способ непрямой оценки интенсивности окислительного фосфорилирования в тканях винограда с использованием показателя относительной копийности митохондриальной ДНК Российский патент 2025 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области «биотехнология» и предназначено для непрямой оценки интенсивности процессов окислительного фосфорилирования с использованием параметров относительной копийности гена NAD1 митохондриальной ДНК по отношению к ядерному референсному гену GAPDH винограда методом Real Time-PCR.

Известен способ флуориметрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, устройство для его осуществления и измерительная камера (RU2354958C2). В способе, включающем световое воздействие на образец пробы анализируемой среды, импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду и изменяемую длительность, при этом характеристики флуоресценции хлорофилла измеряют при постоянной фоновой подсветке, имитирующей интенсивность облучения объекта в момент проведения исследований в естественных условиях, и после адаптации его в темноте. Устройство включает измерительную камеру, четное количество источников измерительного света, оптически сопряженных с измерительной камерой, модуль измерения флуоресценции образца, блок управления, стабилизатор токов источников света и датчик естественной облученности. Измерительная камера содержит корпус, регистратор флуоресценции и четное число источников света, которые расположены попарно диаметрально противоположно друг другу в одной плоскости, перпендикулярной оси корпуса. Технический результат - повышение точности определения.

Способ измеряет флуоресценцию хлорофилла, но не предоставляет информацию о митохондриальной ДНК или окислительном фосфорилировании. Он ориентирован на фотосинтез и может быть неприменим для оценки других энергетических процессов в клетке.

Наиболее близким по функционалу к данному способу непрямой оценки интенсивности окислительного фосфорилирования относится способ оценки селекционного материала гороха посевного на интенсивность фотосинтеза листьев (RU 2626586 C1). Способ оценки функционального состояния тканей и органов растений, не содержащих хлорофилл, измеряет оптические характеристики тканей растений, но не специфически связан с фотосинтезом или окислительным фосфорилированием. Он может быть полезным для оценки функционального состояния, но не предоставляет прямой информации о специфических процессах интенсивности энергетики в клетке. Изобретение представляет собой способ оценки селекционного материала гороха посевного на интенсивность фотосинтеза листьев, включающий измерение интенсивности поглощения молекул углекислого газа на единицу поверхности листьев первого плодоносящего узла в фазу плодообразования, при этом измерения проводят с 9:00 до 11:00 часов дня с помощью переносного газоанализатора марки LI-6400 XT, который фиксирует и показывает значение интенсивности фотосинтеза на цифровом экране, при этом измерительную камеру прикрепляют к листу растения и в течение 1,5-2 минут ожидают стабилизации газообмена в измерительной камере. Изобретение позволяет сократить временные затраты и повысить точность по сравнению с известными способами.

Недостатком способа является тот факт, что способ позволяет измерять интенсивность поглощения углекислого газа листьями гороха для оценки фотосинтеза. Он не учитывает специфические молекулярно-генетические механизмы и гены, связанные с окислительным фосфорилированием, и не предоставляет информацию о конкретных молекулярных процессах в клетке.

Технической задачей способа является упрощение не прямой оценки интенсивности процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда с целью определения оптимальных условий его выращивания в лабораторных и естественных условиях.

Технический результат заключается в упрощении непрямойоценки интенсивности процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ непрямой оценки интенсивности окислительного фосфорилирования в тканях винограда с использованием показателя относительной копийности митохондриальной ДНК, включающий оценку обменных процессов в проростках растений, дополнительно проращивали растения Vitis vinifera L. сорта 'Chardonnay', оценивали влияние температурной обработки проростков растений в условиях in vitro в режиме 45°С 120 минут на интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда, по показателю относительной копийности митохондриальной ДНК, при этом экспланты винограда выращивали на базовой среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), экспериментальные сосуды с питательной средой и эксплантами, разделяли на 2 группы: экспериментальную группу растений подвергали тепловой обработке в режиме 45°С, 120 минут (ехр) в суховоздушном термостате, после окончания тепловой обработки листьев винограда эксперимент и контрольная группа растений, не подвергавшихся тепловой обработке, объединяли и растения инкубировали при температуре 23±1°С при 16-часовом фотопериоде и освещении 40-ваттными флуоресцентными лампами холодного белого света с интенсивностью 105-115 мкмоль PPFD/m2/c в течение 30 дней, из каждой группы растений случайным образом отбирали образцы листовых пластин для последующей экстракции суммарной ДНК, с препаратами полученной суммарной ДНК проводили реакцию количественной RT-PCR в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 5 нг ДНК в объеме 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров форвард и реверс (Таблица 1) в концентрации 0,33 мкМ, RT-PCR проводили с использованием автоматического анализатора при начальной денатурации при 95°С в течение 5 мин -1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек, получали первичные данные в формате C_t., определяли относительную копийность гена митохондриальной ДНК NAD1 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH в качестве референсного, рассчитывали относительную копийность митохондриального гена NAD1 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных (ехр) и контрольных образцов.

где К_ехр - относительная копийность гена NAD1 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда после экспериментального воздействия, K_n0rmai - относительная копийность гена NAD1 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда в отсутствие каких-либо экспериментальных воздействий, при значениях, отличающихся от контрольных показателей на 10% и более делали вывод об угнетении (K_exp<K_normal) или интенсификации (K_exp>K_normal) окислительного фосфорилирования в тканях растения, оцениваемое по показателям относительной копийности митохондриальной ДНК. Если K_exp=K_normal в пределах 10% погрешности делали вывод о неизменности данного показателя.

Общие с прототипом признаки:

- оценка обменных процессов в проростках растений.

Отличительные признаки:

- оценка влияния температурной обработки проростков растений Vitis vinifera L. сорта 'Chardonnay' в условиях in vitro в режиме 45°С 120 минут на интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда, оцениваемое по показателю относительной копийности гена митохондриальной ДНК NAD1;

- экспланты V. vinifera сорта 'Chardonnay' выращивали на базовой среде Мурасиге-Скуга (Murashige and Skoog medium, MS) с добавлением 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП);

- экспериментальные сосуды с питательной средой и эксплантами, разделяли на 2 группы: экспериментальная группа растений, подвергавшихся обработке (ехр) и контрольная группа растений (normal), не подвергавшихся обработке;

- проводили обработку проростков растений V. vinifera экспериментальной группы;

- после окончания обработки винограда обе экспериментальные группы объединяли и растения инкубировали при температуре 23±1°С при 16-часовом фотопериоде и освещении 40-ваттными флуоресцентными лампами холодного белого света с интенсивностью 105-115 мкмоль PPFD/m2/c в течение 30 дней;

- из каждой группы растений были случайным образом отобраны листовые пластины 5-10 мг для последующей экстракции суммарной ДНК;

- с препаратами полученной суммарной ДНК проводили реакцию количественной RT-PCR в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 5 нг ДНК в объеме 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров форвард и реверс, 0,33 мкМ;

- RT-PCR проводили с использованием автоматического анализатора при начальной денатурации при 95°С в течение 5 мин -1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 с и элонгация при 72°С в течение 25 с,

- для каждого из параметров с помощью программного обеспечения прибора получали первичные данные в формате C_t.;

- определяли относительную копийность гена митохондриальной ДНК NAD1 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH в качестве референсного;

- рассчитывали относительную копийность митохондриального гена. NAD 1 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных (ехр) и контрольных (normal) образцов

.

Изменение числа копий мтДНК может влиять на функцию митохондрий и играть важную роль в оценке физиологического состояния растений и их потенциальной плодородности.

Высокое число копий мтДНК в растительных клетках наблюдается в метаболически активных клетках и наоборот. Это потенциально позволяет использовать этот маркер в качестве индикатора активности клеток, активно потребляющих энергию (Fujie et al., 1993).

Количественная ГЦР (кПЦР) позволяет измерять уровень копийности ДНК митохондрий (NAD1) по отношению к ядерному гену-мишени (GAPDH). Мы использовали этот подход для определения изменений числа копий ДНК митохондрий относительно ядерного генома в листьях проростков винограда в условиях in vitro.

Способ реализуется следующим образом.

Суммарную геномную ДНК из 5-10 мг растительной ткани каждого образца экстрагировали с использованием модифицированной процедуры экстракции ДНК №2, описанной в работе et al., 2023). Количество полученной ДНК измеряли флуориметрическим методом с использованием флуориметра All Sheng Fluorometer, Fluo-100 (Китай) и набора реагентов QuantiFluor® dsDNA System («Promega»). В таблице 1 приведены характеристики использованных праймеров.

Для проведения количественной RT-PCR геномной ДНК используют образцы суммарной ДНК, полученной из листьев винограда.

Реакцию количественной RT-PCR проводят в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (LifeScience, Roche, Penzberg, Germany), 10 нг общей ДНК (5 мкл), 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров (форвард и реверс, 0,33 мкМ).

ПЦР проводят с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 (Roche Life Science) с использованием следующей программы: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин (1 цикл), затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 с и элонгация при 72°С в течение 25 с. Определение относительной копийности генов NAD1 (митохондриальная ДНК) проводят с использованием гена GAPDH (хромосомная ДНК) в качестве референсного. Для количественной оценки использовали алгоритмы 2-^ΔCt и 2^-ΔΔCt (Schmittgen, Livak, 2008).

Проводят анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора в размерности Ct, рассчитывают относительную копийность митохондриального гена NAD1 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных (ехр) и контрольных (normal) образцов.

,

где К_ехр - относительная копийность гена NAD1 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда после экспериментального воздействия, K_normal - относительная копийность гена NAD1 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда в отсутствие каких-либо экспериментальных воздействий. При значениях, отличающихся от контрольных показателей на 10% и более приходят к выводу об угнетении (K_exp<K_normal) ИЛИ Интенсификации (K_exp>K_normal) окислительного фосфорилирования в тканях растения, оцениваемое по показателям относительной копийности митохондриальной ДНК. Если K_exp=K_normal в пределах 10% погрешности делается вывод о неизменности данного показателя.

Данный показатель с использованием относительной копийности митохондриальной ДНК позволяет провести сравнительную оценку интенсивности процессов окислительного фосфорилирования.

Пример

Проводилась оценка влияния температурной обработки проростков растений Vitis vinifera L. сорта 'Chardonnay' в условиях in vitro в режиме 45°С 120 минут на интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда, оцениваемое по показателю относительной копийности митохондриальной ДНК.

1. Экспланты (V. vinifera сорта 'Chardonnay') выращивали на базовой среде Мурасиге-Скуга (Murashige and Skoog medium, MS) с добавлением 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП). Экспериментальные сосуды с питательной средой и эксплантами, разделяли на 2 группы: экспериментальная группа растений, подвергавшихся тепловой обработке в режиме 45°С, 120 минут (ехр) и контрольная группа растений (normal), не подвергавшихся тепловой обработке.

Проводилась температурная обработка проростков растений V. vinifera в условиях in vitro в режиме 45°С 120 минут в суховоздушном термостате ТС-80М2 (Россия).

2. После окончания тепловой обработки винограда в режиме 45°С 120 минут обе экспериментальные группы объединяли и растения инкубировали при температуре 23±1°С при 16-часовом фотопериоде и освещении 40-ваттными флуоресцентными лампами холодного белого света с интенсивностью 105-115 мкмоль PPFD/m2/c (PPFD=плотность потока фотосинтетических фотонов) в течение 30 дней. Из каждой группы растений (контрольная и после проведения тепловой обработки) были случайным образом отобраны по четырнадцать образцов листовых пластин (5-10 мг) для последующей экстракции суммарной ДНК.

3. С препаратами полученной суммарной ДНК проводили реакцию количественной RT-PCR в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (LifeScience, Roche, Penzberg, Germany), 5 нг ДНК (5 мкл), 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров (форвард и реверс, 0,33 мкМ). RT-PCR проводили с использованием автоматического анализатора Light-Cycler 96 (Roche Life Science) с использованием следующей программы: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин (1 цикл), затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 сек и элонгация при 72°С в течение 25 сек. Для каждого из параметров с помощью программного обеспечения прибора получали первичные данные в формате C_t. Определение относительной копийности гена NAD1 (митохондриальная ДНК) проводили с использованием гена GAPDH (хромосомная ДНК) в качестве референсного. Для количественной оценки использовали алгоритмы 2^-ΔCt и 2^-ΔΔCt.

Статистический анализ полученных данных с использованием параметрических и непараметрических критериев приведен в таблице 2.

Температурная обработка проростков растений V. vinifera в условиях in vitro (Experiment) выявила статистически достоверное (Т-тест Стьюдента, р<1%) уменьшение относительной копийности ДНК митохондрий в листьях винограда, оцениваемое по показателям средних арифметических значений, на 37,4% по сравнению с аналогичным показателем у контрольных растений (Norma), не подвергавшихся температурному воздействию.

,

тепловая обработка микрорастений винограда в использованном режиме подавляет относительную копийность митохондриальной ДНК на 37,4%.

Способ обеспечивает упрощение непрямой оценки интенсивности процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда для определения оптимальных условий его выращивания в лабораторных и естественных условиях.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ непрямой оценки интенсивности окислительного фосфорилирования в тканях винограда. Способ включает оценку фотосинтеза проростков растений, проращивание растения Vitis vinifera L. сорта 'Chardonnay', оценку влияния температурной обработки проростков растений в условиях in vitro в режиме 45°С 120 мин на интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда, по показателю относительной копийности митохондриальной ДНК, при этом экспланты винограда выращивали на базовой среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), экспериментальные сосуды с питательной средой и эксплантами, разделяли на 2 группы: экспериментальную группу растений подвергали тепловой обработке в режиме 45°С, 120 мин (ехр) в суховоздушном термостате, после окончания тепловой обработки листьев винограда экспериментальную группу и контрольную группу растений, не подвергавшихся тепловой обработке, объединяли и растения инкубировали при температуре 23±1°С при 16-часовом фотопериоде и освещении 40-ваттными флуоресцентными лампами холодного белого света с интенсивностью 105-115 мкмоль PPFD/m2/c в течение 30 дней, из каждой группы растений случайным образом отбирали образцы листовых пластин для последующей экстракции суммарной ДНК, с препаратами полученной суммарной ДНК проводили реакцию количественной RT-PCR в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 5 нг ДНК 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров форвард и реверс, 0,33 мкМ, RT-PCR проводили с использованием автоматического анализатора при начальной денатурации при 95°С в течение 5 мин - 1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 с и элонгация при 72°С в течение 25 с, получали первичные данные в формате C_t., определяли относительную копийность гена митохондриальной ДНК NAD1 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH в качестве референсного, рассчитывали относительную копийность митохондриального гена NAD1 отдельно для опытных (ехр) и контрольных образцов. Изобретение позволяет обеспечить упрощение непрямой оценки интенсивности процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда. 2 табл.

Способ непрямой оценки интенсивности окислительного фосфорилирования в тканях винограда с использованием показателя относительной копийности митохондриальной ДНК, включающий оценку обменных процессов в проростках растений, отличающийся тем, что дополнительно проращивали растения Vitis vinifera L. сорта 'Chardonnay', оценивали влияние температурной обработки проростков растений в условиях in vitro в режиме 45°С 120 мин на интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в листьях винограда, по показателю относительной копийности митохондриальной ДНК, при этом экспланты винограда выращивали на базовой среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), экспериментальные сосуды с питательной средой и эксплантами, разделяли на 2 группы: экспериментальную группу растений подвергали тепловой обработке в режиме 45°С, 120 мин ехр в суховоздушном термостате, после окончания тепловой обработки листьев винограда экспериментальную группу и контрольную группу растений, не подвергавшихся тепловой обработке, объединяли и растения инкубировали при температуре 23±1°С при 16-часовом фотопериоде и освещении 40-ваттными флуоресцентными лампами холодного белого света с интенсивностью 105-115 мкмоль PPFD/m2/c в течение 30 дней, из каждой группы растений случайным образом отбирали образцы листовых пластин для последующей экстракции суммарной ДНК, с препаратами полученной суммарной ДНК проводили реакцию количественной RT-PCR в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 мкл LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix, 5 нг ДНК 5 мкл, 3 мкл воды и по 1 мкл соответствующих праймеров форвард и реверс, 0,33 мкМ, RT-PCR проводили с использованием автоматического анализатора при начальной денатурации при 95°С в течение 5 мин - 1 цикл, затем 45 циклов денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 58°С в течение 25 с и элонгация при 72°С в течение 25 с, получали первичные данные в формате C_t, определяли относительную копийность гена митохондриальной ДНК NAD1 с использованием гена хромосомной ДНК GAPDH в качестве референсного, рассчитывали относительную копийность митохондриального гена NAD1 по формуле 2^-ΔCt отдельно для опытных ехр и контрольных образцов,

,

где К_ехр - относительная копийность гена NAD1 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда после экспериментального воздействия, K_normal - относительная копийность гена NAD1 по сравнению с референсным геном GAPDH в тканях винограда в отсутствие каких-либо экспериментальных воздействий, при значениях, отличающихся от контрольных показателей на 10% и более, делали вывод об угнетении K_exp<K_normal или интенсификации K_exp>K_normal окислительного фосфорилирования в тканях растения, оцениваемого по показателям относительной копийности митохондриальной ДНК, если K_exp=K_normal в пределах 10% погрешности, делали вывод о неизменности данного показателя.