ВАРИАНТЫ СВИНОГО G-CSF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/53 A61K38/19 A61P31/04 A61P37/04 

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США с серийным номером 62/570877, поданной 11 октября 2017 года, и включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к вариантным полипептидам свиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (pG-СSF), содержащим синтетические аминокислоты. Синтетическую аминокислоту модифицируют присоединением молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ). Пегилированный вариант pG-СSF применяют для лечения бактериальных инфекций у свиней. Когда свинья представляет собой свиноматку в околородовой период, бактериальная инфекция может быть синдромом мастита, метрита и агалактии (ММА). Снижение бактериальных инфекций у беременных свиноматок улучшает выживаемость поросят.

Экономическое влияние инфекционных заболеваний на производство животных продуктов хорошо документировано. Инфекционные заболевания снижают прибыль, увеличивают производственные затраты и подвергают опасности пищевую продукцию, а также влияют на показатели, здоровье и благополучие животных. Заболевания могут вызывать заболеваемость и смертность новорожденных, молодых (например, ремонтное поголовье) или взрослых животных, что приводит к разрушительным последствиям для производства животных продуктов.

У свиней одним из таких заболеваний может быть синдром мастита, метрита и агалактии (ММА). Мастит представляет собой бактериальную инфекцию вымени. Может быть поражена только одна или две железы, или инфекция может распространиться на несколько желез. Метрит представляет собой бактериальную инфекцию мочеполовых путей, иногда представленную в виде влагалищных выделений. Агалактия представляет собой снижение или полную потерю молочной продуктивности у свиноматки. Синдром ММА может быть очень изменчивым и может не включать все вышеперечисленные симптомы. Таким образом, синдром ММА может быть трудно обнаружить и диагностировать, и он может быть не обнаружен до тех пор, пока молочный поросенок не покажет признаки голода, потери массы или даже смерти.

Поскольку синдром ММА трудно обнаружить, предпочтительным является профилактическое лечение. Использование антибиотиков, особенно антибиотиков общего класса, не рекомендуется для кормящих животных, поэтому при лечении свиней предпочтительна терапия не антибиотиками. Такой цитокин, как pG-СSF, может увеличивать количество нейтрофилов у животных, таким образом, примируя врожденную иммунную систему для быстрого реагирования на бактериальную инфекцию. Модификация варианта pG-CSF с помощью PEG может продлить фармакокинетику и стабильность цитокина, таким образом, усиливая его действие.

Пегилированный бычий G-CSF можно использовать для лечения мастита у молочного крупного рогатого скота (WO2010/011735). Пегилированный человеческий G-CSF также был описан (WO 2000/044785). Пегилированный свиной G-CSF дикого типа был предложен для лечения респираторной инфекции, а также вирусной инфекции (WO2005/025593). Как описано в различных аспектах в настоящем документе, пегилированный вариант pG-СSF повышает количество нейтрофилов в крови свиньи, уменьшает заболеваемость синдромом ММА у свиноматок в околородовой период и/или улучшает выживаемость поросят.

Настоящее изобретение относится к вариантам свиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (pG-СSF), имеющим консенсусную последовательность: X₁PLSPASSLPQSFLLKX₂LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLCX₃PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX₄EDLRX₄APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 13). Переменная X₁ может быть дипептидом метионин-аланин, как в SEQ ID NO: 2 и 9, дипептидом норлейцин-аланин, как в SEQ ID NO: 7 и 10, аланином, как в SEQ ID NO: 4 и 11, или отсутствовать, как в SEQ ID NO: 8 и 12. Переменная X₂ может быть цистеином, как в SEQ ID NO: 2, 4, 7, и 8, или X₂ может быть серином, как в SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12. Переменная X₃ может быть синтетической аминокислотой. Синтетическая аминокислота может присутствовать в положении 43 (положение относительно зрелого pG-СSF дикого типа, как указано в SEQ ID NO: 3), как показано в SEQ ID NO: 13. Синтетическая аминокислота может быть пара-ацетил фенилаланином (pAF). Переменная X₄ может быть метионином, как в SEQ ID NO: 2, 4, 8, 9, 11, и 12, или X₄ может быть норлейцином, как в SEQ ID NO: 7 и 10. Синтетическая аминокислота pAF может быть ковалентно присоединена к молекуле полиэтиленгликоля (ПЭГ). ПЭГ может иметь молекулярную массу приблизительно от 20 кДа до приблизительно 50 кДа или молекулярную массу приблизительно 30 кДа. Предпочтительно, ПЭГ представляет собой линейную молекулу ПЭГ.

Настоящее изобретение относится к варианту свиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (pG-СSF), имеющему последовательность:

MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC[PAF] PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQ LHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDV TDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSA FQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 2), где синтетическая аминокислота пара-ацетилфенилаланин (PAF), присутствующая в положении 43, ковалентно присоединена к линейной молекуле ПЭГ массой 30 кДа.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

Настоящее изобретение относится к способу лечения бактериальной инфекции у свиньи, включающему введение нуждающейся в этом свинье терапевтически эффективного количества любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе. Бактериальная инфекция может быть синдромом мастита, метрита и агалактии (ММА). Свинья, нуждающаяся в лечении, может быть свиноматкой в околородовой период. Терапевтически эффективное количество варианта pG-СSF может составлять примерно 10-100 мкг/кг массы тела животного, или примерно 30-50 мкг/кг массы тела животного, или примерно 40 мкг/кг массы тела животного. Введение любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, может происходить, по меньшей мере, один раз за 7 суток или менее до опороса (т.е. на сутки 107 беременности или после) или при опоросе. В некоторых аспектах способ лечения бактериальной инфекции у свиньи может включать второе введение любого из вариантов pG-СSF, описываемых в документе, в течение 14 суток или менее после опороса (т.е. в течение 1, 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или в течение через 14 суток после опороса).

Настоящее изобретение относится к способу стимуляции врожденного иммунного ответа у свиньи, включающему введение нуждающейся в этом свинье терапевтически эффективного количества любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе. Свинья, нуждающаяся в стимуляции, может быть свиноматкой в околородовой период. В других аспектах свинья, нуждающаяся в стимуляции, может быть свиньей с нарушенной или ослабленной иммунной системой. В дополнительных аспектах свинья, нуждающаяся в стимуляции, может быть свиньей, которая имеет риск развития или подвержена риску развития инфекции, включая, например, бактериальную инфекцию или вирусную инфекцию. В некоторых аспектах способ может стимулировать выработку цитокинов (например, интерферонов (IFN), факторов некроза опухолей (TNF), колониестимулирующих факторов (CSF) и/или интерлейкинов (IL), и/или активировать иммунные клетки или повышать уровни иммунных клеток, таких как дендритные клетки (DC), лимфоциты (например, В-клетки, Т-клетки, и клетки-естественные киллеры (NK)) и миелоциты (например, тучные клетки, миелобласты (например, базофилы, эозинофилы, нейтрофилы, моноциты, и макрофаги)). В некоторых вариантах осуществления этих аспектов способ может стимулировать или усиливать антибактериальную функцию нейтрофилов, например, увеличивая антибактериальную функцию, опосредованную миелопероксидазой-пероксидом водорода-галогенидами нейтрофилов.

В способах, которые стимулируют врожденный иммунный ответ, терапевтически эффективное количество варианта pG-СSF может составлять приблизительно 10-100 мкг/кг массы тела животного, или приблизительно 30-50 мкг/кг массы тела животного, или приблизительно 40 мкг/кг массы тела животного. Введение любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, может происходить, по меньшей мере, один раз за 7 суток или менее до опороса (т.е. на сутки 107 беременности или после) или при опоросе. В некоторых аспектах способ лечения бактериальной инфекции у свиньи может включать второе введение любого из вариантов pG-СSF, описываемых в документе, в течение 14 суток или менее после опороса (т.е. в течение 1, 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или в течение через 14 суток после опороса).

Настоящее изобретение относится к способу снижения смертности поросят, включающему введение свиноматке в околородовой период терапевтически эффективного количества любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе. Терапевтически эффективное количество варианта pG-СSF может составлять приблизительно 10-100 мкг/кг массы тела животного, или приблизительно 30-50 мкг/кг массы тела животного, или приблизительно 40 мкг/кг массы тела животного. Введение любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, может происходить, по меньшей мере, один раз за 7 суток или менее до опороса (т.е. на сутки 107 беременности или после) или при опоросе. В некоторых аспектах способ снижения смертности поросят может включать второе введение свиноматке в околородовой период любого из вариантов pG-СSF, описываемых настоящем документе, в течение 14 суток или менее после опороса (т.е. в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или в течение через 14 суток после опороса).

Настоящее изобретение относится к применению любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, при производстве лекарственного средства для бактериальной инфекции у свиньи. Бактериальная инфекция может быть синдромом ММА. Свинья может быть свиноматкой в околородовой период. Настоящее изобретение относится к применению любого из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, при производстве лекарственного средства для снижения смертности поросят.

Настоящее изобретение относится к любому из вариантов pG-СSF, описываемых в настоящем документе, для применения в терапии. Терапия может быть лечением синдрома бактериальной инфекции у свиньи. Бактериальная инфекция может быть синдромом ММА. Свинья может быть свиноматкой в околородовой период. Терапия может заключаться в снижении смертности поросят. Вариант pG-СSF можно вводить свиноматке в околородовой период в количестве приблизительно 10-100 мкг/кг массы тела, или приблизительно 30-50 мкг/кг массы тела животного, или приблизительно 40 мкг/кг массы тела животного. Вариант pG-СSF можно вводить, по меньшей мере, один раз за 7 суток или меньше до опороса (т.е. на сутки 107 беременности или после) или при опоросе. Второе введение можно проводить свиноматке в околородовой период через 14 или менее суток после опороса.

«Бактериальная инфекция» представляет собой рост одного или нескольких видов бактерий снаружи или внутри кожи, слизистых оболочек, желез, глаз, ушей, мочеполовых путей, желудочно-кишечного тракта, легких, крови или органов животного. Бактерии могут быть видами, классифицированными в пределах родов Achromobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bordatella, Brucella, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Leptospira, Listeria, Mycoplasma, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sphaerophorus, Staphylococcus, Streptococcus, или Vibrio.

Как применяют в данном документе, термин «свинья», относится к свиньям, особенно, к домашним свиньям (Sus scrofa domesticus или Sus domesticus), и может включать в себя карликовых свиней, а также породы, выведенные для мясопродукции. Под «свиньей» подразумеваются все породы свиней.

Свиноматку в околородовой период определяют как беременную самку свиньи в промежуток с последних недель беременности до первых нескольких недель после опороса. Опорос или роды, как правило, происходит примерно на сутки 114 беременности. Свиноматка в околородовой период может быть беременной самкой свиньи в промежуток приблизительно от 100 суток беременности до приблизительно 14 суток после опороса. Поросенок представляет собой свинью от рождения до отъема в возрасте приблизительно трех недель.

«Синтетическая аминокислота» относится к аминокислоте, которая не входит в число двадцати распространенных аминокислот или не является пирроизином или селеноцистеином. Примеры таких синтетических аминокислот в качестве неограничивающих примеров включают пара-ацетилфенилаланин (pAF), ацетилглюкозаминил-L-серин и N-ацетилглюкозаминил-L-треонин. Некоторые синтетические аминокислоты и их включение в полипептиды с последующей модификацией описаны в WO2010/011735 и в WO2005/074650.

Как применяют в настоящем документе, термины «лечить» или «лечение» включают ограничение, замедление, остановку, снижение, улучшение или изменение прогрессирования или серьезности симптома, нарушения, состояния или заболевания. В некоторых аспектах изобретение предлагает способы, специфичные для профилактического лечения симптома, нарушения, состояния или заболевания, которые не наблюдаются или не обнаруживаются у животных с возможным риском развития одного или нескольких таких симптомов, нарушений, состояний или заболеваний. В некоторых аспектах, лечение будет применяться терапевтически.

Термин «эффективное количество» при использовании относится к тому количеству вводимого варианта pG-СSF, которое будет иметь желаемый эффект, такой как профилактика, лечение или уменьшение бактериальной инфекции у свиньи. Когда свинья является свиноматкой в околородовой период, лечение бактериальных инфекций у свиноматки может улучшить выживаемость поросят. Эффективное количество может варьироваться в зависимости от факторов, таких как масса свиноматки.

Под «введением» подразумевается введение терапевтически эффективного количества соединений и композиций, содержащих указанные соединения. Например, без ограничений, введение может быть внутримышечным (i.m) или подкожным (s.c.).

Термин «приблизительно» будет понятен специалистам в данной области и будет варьироваться в некоторой степени в зависимости от контекста, в котором его используют. Как применяют в настоящем документе, «приблизительно» означает вариации ±10%, ±5% или ±1% (т.е. ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% или ±1%).

Варианты pG-СSF по настоящему изобретению можно легко производить в ряде клеток, в том числе в клетках млекопитающих, бактериальных клетках, таких как E. coli, Bacillus subtilis или Pseudomonas fluorescence, и/или в грибковых или дрожжевых клетках. Клетки-хозяева можно культивировать с использованием способов, хорошо известных в данной области. Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес (например, варианты pG-СSF и последовательности для контроля экспрессии), можно перемещать в клетку-хозяина хорошо известными способами, которые варьируются в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, способ трансформации хлоридом кальця обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно использовать для других эукариотических клеток-хозяев. Можно использовать различные способы очистки белка, и такие способы известны в данной области и описаны, например, в Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, (1994)

Пегилированные варианты pG-СSF можно формулировать в соответствии с известными способами получения фармацевтически полезных композиций. В некоторых аспектах состав представляет собой стабильный лиофилизированнный продукт, который восстанавливают с помощью соответствующего разбавителя или водного раствора высокой чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, консервантами, эксципиентами или стабилизаторами (см. Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, 1995).

Пегилированный вариант pG-СSF можно формулировать с помощью фармацевтически приемлемого буфера, а рН корректировать для обеспечения приемлемой стабильности и рН, приемлемого для введения. В некоторых неограничивающих примерах приемлемый для введения рН может находиться в диапазоне приблизительно от 5 до приблизительно 8 (т.е. приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7 или приблизительно 8). Кроме того, композиции пегилированного pG-СSF могут быть помещены в контейнер, такой как флакон, картридж, устройство для доставки в виде ручки, шприц, систему для внутривенных инфузий или пакет для внутривенного введения.

Следующие экспериментальные примеры иллюстрируют варианты pG-СSF и их применение для лечения бактериальных инфекций у свиней, таких как синдром ММА у свиноматки в околородовой период. Снижение заболеваемости бактериальными инфекциями у свиноматки также снижает смертность у поросят. Следует понимать, что другие варианты осуществления и применения будут очевидны специалистам в данной области, и что изобретение не ограничено этими конкретными иллюстративными примерами или предпочтительными вариантами осуществления.

ПРИМЕР 1

Различные варианты свиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (pG-СSF) кДНК (номер доступа в GeneBank U68481,1) получали путем введения стоп-кодона TAG в выбранных положениях путем сайт-направленного мутагенеза при помощи ПЦР. Кроме того, часть кДНК, кодирующей сигнальную последовательность, заменяли одним кодоном метионина (т.е. ATG). Например, кДНК, кодирующая зрелый pG-СSF дикого типа с измененной сигнальной последовательностью, может представлять собой:

1 atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag

61 caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac

121 aagctgtgcc acccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct

181 tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat

241 ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg

301 gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg

361 cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc

421 ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc

481 ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga

(SEQ ID NO: 5). Этот вариант будет кодировать полипептид:

1 MAPLSPASSL PQSFLLKCLE QVRKIQADGA ELQERLCATH KLCHPQELVL LGHSLGLPQA

61 SLSSCSSQAL QLTGCLNQLH GGLVLYQGLL QALAGISPEL APALDILQLD VTDLATNIWL

121 QMEDLRMAPA SLPTQGTVPT FTSAFQRRAG GVLVVSQLQS FLELAYRVLR YLAEP

(SEQ ID NO: 1). Если желательно, чтобы стоп-кодон TAG замещал остаток H43, последовательность кДНК может быть:

1 atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag

61 caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac

121 aagctgtgct agccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct

181 tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat

241 ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg

301 gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg

361 cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc

421 ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc

481 ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga

(SEQ ID NO: 6). Полученный полипептид будет:

1 MAPLSPASSL PQSFLLKCLE QVRKIQADGA ELQERLCATH KLCxPQELVL LGHSLGLPQA

61 SLSSCSSQAL QLTGCLNQLH GGLVLYQGLL QALAGISPEL APALDILQLD VTDLATNIWL

121 QMEDLRMAPA SLPTQGTVPT FTSAFQRRAG GVLVVSQLQS FLELAYRVLR YLAEP

(SEQ ID NO: 2), где «x» указывает на остаток H43, замещенный синтетической аминокислотой, как описано ниже.

Плазмидами, кодирующими варианты, трансформировали клетки E. coli, содержащие компоненты системы расширенного генетического кода для включения синтетической аминокислоты пара-ацетилфенилаланина (pAF). Трансформированные клетки выращивали в средах с добавлением pAF и индуцировали экспрессию pG-СSF с включением pAF в указанные сайты. Экспрессирующая система была описана, например, в WO 2010/011735 (включен в настоящее описание в качестве ссылки), и, в основном, известна в данной области.

Экспрессию трансфицированных вариантов кДНК индуцировали арабинозой, клетки собирали, а целевые варианты pG-СSF с сайтами pAF выделяли и очищали жидкостной хроматографией высокого давления с обратной фазой (ОД-ВЭЖХ). Активированный линейный аминоокси-ПЭГ массой 30 кДа конъюгировали сайт-специфическим образом со встроенным pAF. Конъюгаты PEG-pG-СSF очищали от избытка PEG и неконъюгированных вариантов pG-СSF при помощи хроматографии.

ПРИМЕР 2

Биологическую активность пегилированных вариантов pG-СSF (PEG-pG-СSF) in vitro измеряли по способности вариантов индуцировать пролиферацию клеток M-NSF-60 (ATCC CRL-1838). Концентрацию вариантов, способных влиять на 50% максимальной пролиферации (EC50), определяли путем сравнения со стандартной кривой, полученной от pG-СSF дикого типа (WT). На основании результатов экспрессии, представленных в Примере 1 и биологических анализов, описанных в настоящем документе, варианты PEG-pG-СSF были выбраны для дальнейшего изучения.

Активность отобранных кандидатных вариантов PEG-pG-СSF in vivo тестировали на модели грызунов. Крысы Sprague Dawley (3/группу) получали 0,25 мг/кг массы тела варианта PEG-pG-СSF. Образцы крови брали в точке 0 (предварительное дозирование), через 1, 3, 6, 24, 48, 56, 72, 96, 144, 192 и 264 часа для фармакокинетического (ФК) анализа, а образцы брали через 24, 48, 72, и 96 часов для полного анализа крови (анализ CBC). Первичным измерением в анализе CBC является количество присутствующих нейтрофилов. Вариант H43 стимулировал более высокий уровень развития нейтрофилов, чем другие протестированные варианты. Все варианты имеют похожие профили ФК.

ПРИМЕР 3

PEG-pG-СSF H43pAF получали следующим образом. Как и в примере 1, экспрессию трансфицированных вариантов кДНК индуцировали арабинозой, клетки собирали, а вариант pG-СSF с сайтом H43pAF выделяли, денатурировали и повторно сворачивали, и очищали катионообменной жидкостной хроматографией (CEX) с использованием CAPTO Adhere Impres (GE Healthcare Lifesciences). В кратком изложении, не пегилированный вариант pG-СSF H43pAF загружали на колонку до концентрации 1-5 мг мл смолы. Колонку отмывали пятью колоночными объемами (CV) 30 мМ ацетата натрия при pH 4,5. Элюцию варианта pG-СSF H43pAF проводили с помощью линейного градиента буфера для элюции (30 мМ ацетат натрия, 0,5 М NaCl, pH 4,5), путем промывания буфером для элюции 0-100% в количестве свыше 20 CV.

На основании масс-спектроскопического (MS) анализа pG-СSF H43pAF, выделенные пептиды включают основной пик, представленный SEQ ID NO: 2, и несколько различных загрязнителей. Загрязнения включают потерю N-концевого метионина (SEQ ID NO: 4), потерю и N -концевого метионина, и аланина (SEQ ID NO: 8), и замену норлейцином N-концевого метионина (SEQ ID NO: 7). Известно, что норлейцин неправильно включается вместо аминокислоты метионина в ферментации высокой плотности с E. coli. Включение норлейцина уменьшают с помощью одного или нескольких из следующих этапов: подача ферментационных растворов с метионином; ферментация со сложной средой вместо сред определенного состава (в сложной среде содержится один или несколько непоименованных компонентов, включая, но не ограничиваясь ими, экстракты глицерина, соли, аминокислоты, витамины, дрожжи, гидролизаты растений и животных, пептоны и триптоны); и/или понижение температуры брожения реакционной смеси после индукции.

Вариант pG-СSF H43pAF захватывается из общего объема катионообменной хроматографии после использования хроматографии с Capto SP Impres, и буфер заменяют на 30 мМ ацетат натрия, 4% сахарозу, pH 4,0 с использованием фильтрационной кассеты тангенциального потока MWCO 10 кДа. Затем вариант pG-СSF H43pAF концентрируют приблизительно до 8,0 мг/мл с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra по инструкциям производителя. После концентрирования, 30К линейный ПЭГ (ПЭГ можно приобрести коммерчески от NOF America Corporation или EMD Merck, например) добавляют в молярном соотношении ПЭГ к pG-СSF H43pAF 6:1. Затем смесь PEG/вариант pG-СSF инкубируют приблизительно при 28°С в течение 21 часа. Этот способ приводит к тому, что >98% варианта pG-СSF конъюгируется с ПЭГ. Пегилированный вариант можно затем очищать CEX, как указано выше. При тестировании в биоанализе с клетками M-NSF-60 (Пример 2) вариант PEG-pG-СSF H43pAF имеет EC50 по меньшей мере 0,40 нг/мл, демонстрируя хорошие характеристики связывания и активности.

Образцы замораживают и размораживают в течение пяти циклов путем замораживания при 0°С в 1,5 мл пробирках и оттаивания на водяной бане при комнатной температуре. Не наблюдали никакого значительного воздействия на профиль белка с высокой молекулярной массой (HMW) в течение пяти циклов замораживания-оттаивания, что свидетельствует о стабильности варианта в растворе.

Получали два дополнительных варианта pG-СSF H43pAF в попытке улучшить эффективность рефолдинга и термостабильность варианта при 50°C. Цистеин 17 заменяли либо на аланин (C17A), либо на серин (C17S, SEQ ID NO: 9-12). Эти мутации не улучшают выход рефолдинга, но C17A снизила термостабильность. PEG-pG-СSF H43pAF C17S все же имеет слегка улучшенный EC50 0,26 нг/мл.

ПРИМЕР 4

Вариант PEG-pG-СSF H43pAF вводили свиноматкам, чтобы характеризовать изменения в нейтрофилах крови. Шести свиноматкам 1,5-5 лет со средней массой тела 269,7 кг давали 40 мкг/кг варианта PEG-pG-СSF H43pAF путем внутримышечной инъекции сбоку в шею. Вариант PEG-pG-СSF H43pAF суспендировали в 30 мМ цитрата натрия, 250 мМ аргинина, pH 6,0 при концентрации 8,2 мг/мл. Животные не получали никаких сопутствующих лекарств после начала лечения. Побочных явлений не наблюдали.

Кровь брали на сутки 0 до введения дозы и в дни 2, 7, 10, 14, 17 и 21 после введения дозы. Число нейтрофилов определяли для каждой свиноматки, а среднее значение для лечения определяли для каждых суток. Лечение однократной дозой варианта PEG-pG-СSF H43pAF приводит к измеримому увеличению количества нейтрофилов в крови за трехнедельный период (Таблица 1). Ожидается, что дополнительные дозы будут стимулировать поддержание более высоких уровней нейтрофилов.

Таблица 1. Воздействие варианта PEG-pG-СSF H43pAF на среднее ежедневное число нейтрофилов в крови

Сутки 0 2 7 10 14 17 21 Нейтрофилы (1000/мкл) 4,65 43,68 25,08 30,1 18,53 15,14 9,83

ПРИМЕР 5

Вариант PEG-pG-СSF H43pAF вводили свиноматкам в околородовой период, чтобы охарактеризовать его влияние на синдром мастита, метрита и агалактии (ММА) и выживаемость поросят.

Свиноматок на 95-100 сутки беременности помещали в станки для опороса, и следовали гигиеническим способам ведения хозяйства до суток 107 беременности для каждой свиноматки. На сутки 107 собирали кровь, после чего свиноматки (по 25 на группу) получали либо 40 мкг/кг варианта PEG-pG-СSF H43pAF, как в примере 4, либо раствор хлорида натрия в качестве отрицательного контроля. Затем свиноматок помещали в антисанитарные условия для стимуляции развития ММА. Антисанитарные условия включали в себя размещение мата на решетчатом полу в станке для опороса, чтобы позволить скопиться подстилке и отходам. Также для загрязнения станков применяли смесь воды, фекалий и сосновых опилок (2:1:1). Свиноматкам не давали никаких лекарственных средств с окситоцином или кортикостероидами. Клинические наблюдения и измерение ректальной температуры проводили у каждой свиноматки один раз в сутки утром, начиная с суток 107 беременности, и продолжали до установления диагноза ММА, когда все образцы для свиноматки были собраны, а затем свиноматку удаляли из исследования, обеспечивали лечение и возвращали гигиенические условия. Собанные образцы включали в себя кровь, ректальную температуру и мазки с инфицированных желез.

Опорос, как правило, происходит на сутки 114 беременности. Поросят взвешивают и помечают в течение 12 часов после рождения. Клинические наблюдения за поросятами производят два раза в день, а вес также измеряют в дни 3, 7 и 21 после рождения.

С использованием протокола определения заболевания между двумя группами наблюдали незначительные различия. Однако когда выделения из вульвы удаляли из определения заболевания, частота заболеваемости снижалась более чем на 50% в группе, получавшей PEG-pG-СSF. Обработанная группа также имела большее количество поросят, отлученных от вскармливания, по сравнению с контрольной группой (Таблица 2).

Таблица 2. Влияние PEG-pG-СSF на заболеваемость MMA и выживаемость поросят.

Переменная Контроль PEG-pG-СSF Значение P Свиноматки (число/группа) MMA 36% (9/25) 32% (8/35) 1,0000 MMA, исключая влагалищные выделения 28% (7/25) 12% (3/25) 0,2890 Поросята (стандартная ошибка среднего) Число новорожденных/на помет 13,3 (0,78) 13,1 (0,72) 0,8567 Число отнятых от вскармливания/на помет 8,3 (0,61) 9,4 (0,61) 0,2056 Процент выживаемости 65,3 (4,5) 72,4 (4,3) 0,2590 Интервал выживаемости/помет 0-100% 38-100% n/a Масса при отъеме 5,9 (0,21) 5,7 (0,19) 0,5944

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Elanco US Inc.

Ambrx Inc.

<120> ВАРИАНТЫ СВИНОГО G-CSF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> X21439_WO

<150> US 62/570,877

<151> 2017-10-11

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 175

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<400> 1

Met Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1 5 10 15

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys His Pro Gln Glu Leu

35 40 45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser

50 55 60

Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His

65 70 75 80

Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile

85 90 95

Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr

100 105 110

Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala

115 120 125

Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala

130 135 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser

145 150 155 160

Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170 175

<210> 2

<211> 175

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (44)..(44)

<223> Xaa = pAF

<400> 2

Met Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1 5 10 15

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu

35 40 45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser

50 55 60

Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His

65 70 75 80

Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile

85 90 95

Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr

100 105 110

Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala

115 120 125

Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala

130 135 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser

145 150 155 160

Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170 175

<210> 3

<211> 174

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Природная

<400> 3

Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys His Pro Gln Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly

65 70 75 80

Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp

100 105 110

Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro

115 120 125

Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170

<210> 4

<211> 174

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (43)..(43)

<223> Xaa = pAF

<400> 4

Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly

65 70 75 80

Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp

100 105 110

Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro

115 120 125

Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170

<210> 5

<211> 528

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кДНК (искусственная) кодирует SEQ ID NO: 1&3

<400> 5

atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag 60

caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac 120

aagctgtgcc acccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct 180

tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat 240

ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg 300

gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg 360

cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc 420

ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc 480

ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga 528

<210> 6

<211> 528

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кДНК (искусственная) кодирует SEQ ID NO: 2&4

<400> 6

atggcccctc tcagccctgc cagctccctg ccccagagct tcctgctcaa gtgcttagag 60

caagtgagga aaatccaggc tgatggcgcc gagctgcagg agaggctgtg tgccacccac 120

aagctgtgct agccccagga gctggtgctg ctcgggcact ctctgggcct cccccaggct 180

tccctgagca gctgctccag ccaggccctg cagctgactg gctgcctgaa ccaactgcat 240

ggcggcctcg tcctctacca gggcctcctg caggccctgg cgggcatctc cccagagctg 300

gcccccgccc tggacatact gcagctggat gtcaccgact tagccaccaa catctggctg 360

cagatggaag acctgaggat ggccccggcc tcgcttccca cccagggcac cgtgccgacc 420

ttcacctcgg ccttccagcg ccgggcagga ggggtcctgg ttgtctccca gctgcagagc 480

ttcctggagc tggcgtaccg tgtcctgcgc tacctcgccg agccctga 528

<210> 7

<211> 175

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = норлейцин или метионин

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (44)..(44)

<223> Xaa = pAF

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (122)..(122)

<223> Xaa = норлейцин или метионин

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (127)..(127)

<223> Xaa = норлейцин или метионин

<400> 7

Xaa Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1 5 10 15

Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu

35 40 45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser

50 55 60

Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His

65 70 75 80

Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile

85 90 95

Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr

100 105 110

Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Xaa Glu Asp Leu Arg Xaa Ala

115 120 125

Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala

130 135 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser

145 150 155 160

Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170 175

<210> 8

<211> 173

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (42)..(42)

<223> Xaa = pAF

<400> 8

Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys

1 5 10 15

Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln Glu

20 25 30

Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val Leu

35 40 45

Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys Ser

50 55 60

Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly Gly

65 70 75 80

Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro

85 90 95

Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp Leu

100 105 110

Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro Ala

115 120 125

Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe Gln

130 135 140

Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe Leu

145 150 155 160

Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170

<210> 9

<211> 175

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (44)..(44)

<223> Xaa = pAF

<400> 9

Met Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1 5 10 15

Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu

35 40 45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser

50 55 60

Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His

65 70 75 80

Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile

85 90 95

Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr

100 105 110

Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala

115 120 125

Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala

130 135 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser

145 150 155 160

Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170 175

<210> 10

<211> 175

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = норлейцин или метионин

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (44)..(44)

<223> Xaa = pAF

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (122)..(122)

<223> Xaa = норлейцин или метионин

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (127)..(127)

<223> Xaa = норлейцин или метионин

<400> 10

Xaa Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu

1 5 10 15

Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu

35 40 45

Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser

50 55 60

Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His

65 70 75 80

Gly Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile

85 90 95

Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr

100 105 110

Asp Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Xaa Glu Asp Leu Arg Xaa Ala

115 120 125

Pro Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala

130 135 140

Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser

145 150 155 160

Phe Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170 175

<210> 11

<211> 174

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (43)..(43)

<223> Xaa = pAF

<400> 11

Ala Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly

65 70 75 80

Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp

100 105 110

Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro

115 120 125

Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170

<210> 12

<211> 173

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (42)..(42)

<223> Xaa = pAF

<400> 12

Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser

1 5 10 15

Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln Glu

20 25 30

Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val Leu

35 40 45

Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys Ser

50 55 60

Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly Gly

65 70 75 80

Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro

85 90 95

Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp Leu

100 105 110

Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Arg Met Ala Pro Ala

115 120 125

Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe Gln

130 135 140

Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe Leu

145 150 155 160

Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170

<210> 13

<211> 174

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (1)..(1)

<223> Xaa может быть природной аминокислотой

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (17)..(17)

<223> Xaa может быть природной аминокислотой

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (43)..(43)

<223> Xaa = pAF

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (121)..(121)

<223> Xaa может быть природной аминокислотой

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (126)..(126)

<223> Xaa может быть природной аминокислотой

<400> 13

Xaa Pro Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1 5 10 15

Xaa Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Arg Leu Cys Ala Thr His Lys Leu Cys Xaa Pro Gln Glu Leu Val

35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ser Cys

50 55 60

Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly

65 70 75 80

Gly Leu Val Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser

85 90 95

Pro Glu Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ile Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp

100 105 110

Leu Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Xaa Glu Asp Leu Arg Xaa Ala Pro

115 120 125

Ala Ser Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe

130 135 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Val Ser Gln Leu Gln Ser Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Val Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro

165 170

<---

Изобретение относится к вариантам свиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (pG-СSF) и их применению. Варианты pG-СSF могут быть использованы для лечения синдрома мастита, метрита и агалактии (ММА) у свиньи, лечения бактериальной инфекции у свиноматки в околородовом периоде, повышения уровня нейтрофилов у свиноматки в околородовом периоде или снижения смертности у поросят. 10 н. и 27 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

1. Свиной гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (pG-СSF) для применения у животного, состоящий из последовательности:

X₁PLSPASSLPQSFLLKX₂LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTG

CLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX₃EDLRX₃APASLPTQGTVPTFTSAFQRRA

GGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 13);

где X₁ представляет собой метионин-аланин;

где X₂ представляет собой цистеин;

где X₃ представляет собой метионин; и

где синтетическая аминокислота пара-ацетил фенилаланин (pAF), присутствующая в положении 43, ковалентно присоединена к полиэтиленгликолю (ПЭГ),

где применение у животного выбрано из группы, состоящей из лечения синдрома ММА у свиньи, лечения бактериальной инфекции у свиноматки в перинатальном периоде, повышения уровня нейтрофилов у свиноматки в перинатальном периоде или снижения смертности у поросят.

2. pG-СSF по п. 1, в котором ПЭГ имеет молекулярную массу от 20 до 50 кДа.

3. pG-СSF по п. 1 или 2, в котором ПЭГ имеет молекулярную массу 30 кДа.

4. pG-СSF по любому из пп. 1-3, в котором ПЭГ является линейным.

5. Свиной гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (pG-СSF) для применения у животного, состоящий из аминокислотной последовательности:

MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)

PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQ

ALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQA

LAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIW

LQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP (SEQ ID NO: 2),

где синтетическая аминокислота пара-ацетил фенилаланин (pAF), присутствующая в положении 43, ковалентно присоединена к полиэтиленгликолю (ПЭГ) массой 30 кДа,

где применение у животного выбрано из группы, состоящей из лечения синдрома ММА у свиньи, лечения бактериальной инфекции у свиноматки в перинатальном периоде, повышения уровня нейтрофилов у свиноматки в перинатальном периоде или снижения смертности у поросят.

6. Композиция, включающая pG-СSF по любому из пп. 1-5 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, или эксципиент, для применения у животного,

где применение у животного выбрано из группы, состоящей из лечения синдрома ММА у свиньи, лечения бактериальной инфекции у свиноматки в перинатальном периоде, повышения уровня нейтрофилов у свиноматки в перинатальном периоде или снижения смертности у поросят.

7. Способ лечения синдрома мастита, метрита и агалактии (MMA) у свиньи, включающий введение нуждающейся в этом свинье терапевтически эффективного количества pG-СSF по пп. 1-5 или композиции по п. 6.

8. Способ по п. 7, в котором свинья представляет собой свиноматку в околородовой период.

9. Способ по п. 7 или 8, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 10-100 мкг/кг массы тела животного.

10. Способ по п. 7 или 8, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 30-50 мкг/кг массы тела животного.

11. Способ по п. 7 или 8, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 40 мкг/кг массы тела животного.

12. Способ по любому из пп. 7-11, в котором введение производят по меньшей мере однократно в течение 7 суток до опороса.

13. Способ по любому из пп. 7-12, в котором введение происходит при опоросе.

14. Способ по любому из пп. 7-13, дополнительно включающий второе введение не позже чем через 14 суток после опороса.

15. Способ снижения смертности поросят, включающий введение свиноматке в околородовом периоде терапевтически эффективного количества pG-СSF по пп. 1-5 или композиции по п. 6.

16. Способ по п. 15, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 10-100 мкг/кг массы тела животного.

17. Способ по п. 15, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 30-50 мкг/кг массы тела животного.

18. Способ по п. 15, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 40 мкг/кг массы тела животного.

19. Способ по любому из пп. 15-18, в котором введение производят по меньшей мере однократно в течение 7 суток до опороса.

20. Способ по любому из пп. 15-19, в котором введение происходит при опоросе.

21. Способ по любому из пп. 15-20, дополнительно включающий второе введение не позже чем через 14 суток после опороса.

22. Способ стимуляции врожденного иммунного ответа у свиней, включающий введение нуждающейся в этом свинье терапевтически эффективного количества pG-СSF по пп. 1-5 или композиции по п. 6, в котором врожденный иммунный ответ включает модификацию одной или более антибактериальной функции нейтрофилов, уровня цитокинов, уровней дендритных клеток, уровней лимфоцитов, уровней миелоцитов, или любую их комбинацию.

23. Способ по п. 22, в котором свинья представляет собой свиноматку в околородовой период.

24. Способ по п. 22 или 23, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 10-100 мкг/кг массы тела животного.

25. Способ по п. 22 или 23, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 30-50 мкг/кг массы тела животного.

26. Способ по п. 22 или 23, в котором терапевтически эффективное количество pG-СSF составляет 40 мкг/кг массы тела животного.

27. Способ по любому из пп. 22-26, в котором введение производят по меньшей мере однократно в течение 7 суток до опороса.

28. Способ по любому из пп. 22-27, в котором введение происходит при опоросе.

29. Способ по любому из пп. 22-28, дополнительно включающий второе введение не позже чем через 14 суток после опороса.

30. Применение pG-СSF по любому из пп. 1-5 для лечения синдрома мастита, метрита и агалактии (MMA) у свиньи.

31. Применение pG-СSF по любому из пп. 1-5 для лечения бактериальной инфекции у свиноматки в околородовой период, причем бактериальная инфекция вызвана видом, выбранным из родов, состоящих из Achromobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bordatella, Brucella, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Leptospira, Listeria, Mycoplasma, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sphaerophorus, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio и любой их комбинации.

32. Применение pG-СSF по любому из пп. 1-5 для повышения уровней нейтрофилов у свиноматки в околородовой период.

33. Применение pG-СSF по любому из пп. 1-5 для снижения смертности у поросят, причем pG-СSF вводят свиноматке в околородовой период для лечения бактериальной инфекции, причем бактериальная инфекция вызвана видом, выбранным из родов, состоящих из Achromobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bordatella, Brucella, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Leptospira, Listeria, Mycoplasma, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sphaerophorus, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio и любой их комбинации.

34. Применение по любому из пп. 30-33, причем pG-СSF вводят в количестве 10-100 мкг/кг массы тела животного, 30-50 мкг/кг массы тела животного или 40 мкг/кг массы тела животного.

35. Применение по любому из пп. 30-34, причем pG-СSF вводят по меньшей мере однократно в течение 7 суток до опороса.

36. Применение по любому из пп. 30-34, причем pG-СSF вводят при опоросе.

37. Применение по любому из пп. 30-36, причем вторую дозу pG-СSF вводят не позже чем через 14 суток после опороса.