ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей инсулин и глюкагон, и к комплексной композиции, содержащей инсулин и глюкагон.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Поджелудочная железа образует и секретирует глюкагон, когда уровни глюкозы в крови начинают падать вследствие различных причин, таких как лечение лекарственными средствами, заболевания, дефицит гормонов или ферментов и так далее. Секретированный глюкагон действует на печень, способствуя распаду гликогена, индуцируя высвобождение глюкозы и, в конечном счете, приводя к восстановлению нормальных уровней глюкозы в крови.
Аналогично глюкагону, инсулин, являющийся одним из типов гормонов, образуемых поджелудочной железой, представляет собой гормон, секретируемый из поджелудочной железы, и играет роль в поддержании уровней глюкозы в крови на надлежащем уровне в случае их повышения. Дефицит, отсутствие или дисфункция инсулина могут приводить к различным заболеваниям. Поэтому известно, что введение инсулина является ключевой терапией для лечения заболеваний, связанных с инсулином, включая диабет, при которых уровни глюкозы в крови являются высокими.
Широко известно, что глюкагон и инсулин оказывают противоположные действия, то есть антагонистические действия, на глюкозу в крови, и их применяют в качестве терапевтических агентов при различных заболеваниях. В частности, в публикации патента Кореи №10-2017-0023066 раскрыт способ лечения диабета поддерживающим инсулином с одновременным антагонистическим воздействием на действие глюкагона посредством блокировки рецепторов глюкагона антагонистическим антигенным белком.
Иными словами, поскольку инсулин и глюкагон выполняют противоположные функции в организме, не известно примеров лекарственной терапии с их совместным введением.
В то же время, при введении пациенту инсулина, который является терапевтическим агентом при различных заболеваниях, связанных с инсулином, есть риск побочных эффектов, таких как увеличение массы тела, передозировка и гипогликемия.
Соответственно, существует потребность в разработке лекарственного средства, способного уменьшить эти побочные эффекты с сохранением в то же время эффективности введения инсулина.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, содержащую инсулин и глюкагон.
Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащую инсулин и глюкагон.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить композицию для уменьшения побочных эффектов инсулина, содержащую инсулин и глюкагон.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить комплексную композицию для уменьшения гипогликемии у пациента с заболеванием, связанным с инсулином, содержащую инсулин и глюкагон.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить применение указанной композиции в изготовлении лекарственного средства.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, включающий стадию введения композиции или комплексной композиции индивиду.
Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ уменьшения побочных эффектов инсулина, включающий стадию введения указанной композиции или указанной комплексной композиции индивиду.
Техническое решение
Для достижения настоящего изобретения согласно одному аспекту предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон.
Композиция по одному конкретному воплощению характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по указанному выше конкретному воплощению характеризуется тем, что глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что заболевание, связанное с инсулином, выбрано из группы, состоящей из инсулинорезистентного заболевания, диабета, гипергликемии и ожирения.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что она облегчает гипогликемю, представляющую собой побочный эффект инсулина, и подавляет увеличение массы тела.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что она содержит инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат в массовом отношении от 0,1:1 до 100:1.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что глюкагон представляет собой нативный глюкагон или аналог глюкагона, полученный путем изменения одной или более чем одной аминокислоты нативного глюкагона, выбранного из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации и их комбинации.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог глюкагона содержит аминокислотную последовательность следующей общей формулы 1:
X1-X2-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T-X30 (общая формула 1, SEQ ID NO:46),
в общей формуле 1: X1 представляет собой гистидин (Н), дезаминогистидил, диметилгистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имидазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил, триптофан (W) или тирозин (Y) или отсутствует;
Х2 представляет собой альфа-метилглутаминовую кислоту (α-метилглутаминовую кислоту), Aib (аминоизомасляную кислоту), D-аланин, глицин (G), Sar (N-метилглицин), серии (S) или D-серин;
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), аспарагиновую кислоту (D), серии (S), альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин (С) или отсутствует;
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серии (S), цистеин (С) или валин (V) или отсутствует;
Х18 представляет собой аланин (А), аспарагиновую кислоту (D), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R), валин (V) или цистеин (С) или отсутствует;
Х19 представляет собой аланин (А), аргинин (R), серии (S), валин (V) или цистеин (С) или отсутствует;
Х20 представляет собой лизин (K), гистидин (Н), глутаминовую кислоту (Е), глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D), аргинин (R), альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин (С) или отсутствует;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), валин (V) или цистеин (С) или отсутствует;
Х23 представляет собой изолейцин (I), валин (V) или аргинин (R) или отсутствует;
Х24 представляет собой валин (V), аргинин (R), аланин (А), цистеин (С), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), глутамин (Q), альфа-метилглутаминовую кислоту или лейцин (L) или отсутствует;
Х27 представляет собой изолейцин (I), валин (V), аланин (А), лизин (K), метионин (М), глутамин (Q) или аргинин (R) или отсутствует;
Х28 представляет собой глутамин (Q), лизин (K), аспарагин (N) или аргинин (R) или отсутствует; и
X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует (при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 является такой же, как SEQ ID NO: 1, он исключен).
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что в общей формуле 1: XI представляет собой гистидин (Н), триптофан (W) или тирозин (Y) или отсутствует;
Х2 представляет собой серии (S) или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серии (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серии (S), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D), лизин (K) или цистеин (С);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), валин (V) или цистеин (С);
Х23 представляет собой изолейцин (I), валин (V) или аргинин (R);
Х24 представляет собой валин (V), аргинин (R), аланин (А), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), глутамин (Q) или лейцин (L);
Х27 представляет собой изолейцин (I), валин (V), аланин (А), метионин (М), глутамин (Q) или аргинин (R);
Х28 представляет собой глутамин (Q), лизин (K), аспарагин (N) или аргинин (R); и
X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что в общей формуле 1:
X1 представляет собой гистидин (Н), триптофан (W) или тирозин (Y);
Х2 представляет собой серии (S) или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой цистеин (С), треонин (Т) или валин (V);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серии (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), валин (V) или цистеин (С);
Х23 представляет собой валин (V);
Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q);
Х27 представляет собой метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой цистеин (С), треонин (Т) или валин (V);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серии (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой лизин (K), аргинин (R), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) или цистеин (С);
Х23 представляет собой валин (V);
Х24 представляет собой глутамин (Q);
Х27 представляет собой метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что в общей формуле 1:
X1 представляет собой гистидин (Н), триптофан (W) или тирозин (Y) или отсутствует;
Х2 представляет собой серии (S) или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серии (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серии (S), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е);
Х23 представляет собой валин (V);
Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q);
Х27 представляет собой изолейцин (I) или метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин (Т);
Х10 представляет собой тирозин (Y);
Х12 представляет собой лизин (K);
Х13 представляет собой тирозин (Y);
Х14 представляет собой лейцин (L);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серии (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой лизин (K) или аргинин (R);
Х18 представляет собой аргинин (R);
Х19 представляет собой аланин (А);
Х20 представляет собой глутамин (Q), цистеин (С) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), цистеин (С), валин (V) или глутаминовую кислоту (Е);
Х23 представляет собой валин (V) или аргинин (R);
Х24 представляет собой глутамин (Q) или лейцин (L);
Х27 представляет собой метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
X30 отсутствует.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог глюкагона содержит аминокислотную последовательность следующей общей формулы 2:
Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-T-X30 (общая формула 2, SEQ ID NO: 47),
в общей формуле 2:
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е) или серии (S);
Х17 представляет собой лизин (K) или аргинин (R);
Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е);
Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q); и X30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что по меньшей мере одна пара аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24, и Х24 и Х28 общей формулы 1 образует кольцо, соответственно.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что каждая аминокислота по меньшей мере одной пары аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24, и Х24 и Х28 общей формулы 1 заменена на глутаминовую кислоту или лизин, которые способны образовывать кольцо.
Жидкая композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что в длительно действующем конъюгате аналога глюкагона pi аналога глюкагона составляет от 6 до 7 и его активность in vitro, по сравнению с таковой нативного глюкагона, составляет 200% или более. Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог глюкагона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-45.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог глюкагона содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что инсулин представляет собой природный инсулин или аналог инсулина, полученный путем изменения одной или более чем одной аминокислоты нативного инсулина, выбранного из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации и их комбинации.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина представляет собой аналог инсулина, полученный путем замены на другую аминокислоту или делеции одной или более чем одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2, аминокислоты в положении 3, аминокислоты в положении 5, аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 10, аминокислоты в положении 12, аминокислоты в положении 16, аминокислоты в положении 23, аминокислоты в положении 24, аминокислоты в положении 25, аминокислоты в положении 26, аминокислоты в положении 27, аминокислоты в положении 28, аминокислоты в положении 29 и аминокислоты в положении 30 В-цепи природного инсулина и аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2, аминокислоты в положении 5, аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 10, аминокислоты в положении 12, аминокислоты в положении 14, аминокислоты в положении 16, аминокислоты в положении 17, аминокислоты в положении 18, аминокислоты в положении 19 и аминокислоты в положении 21 А-цепи природного инсулина.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина содержит А-цепь с SEQ ID NO: 48, представленную следующей общей формулой 3, и В-цепь с SEQ ID NO: 49, представленную следующей общей формулой 4:
[общая формула 3]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (SEQ ID NO: 48),
в общей формуле 3:
Xaa1 представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа2 представляет собой аланин или изолейцин;
Хаа5 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин или аспарагин;
Xaa12 представляет собой аланин, серии, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин;
Xaa14 представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин;
Xaa16 представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Xaa19 представляет собой аланин, тирозин, серии, глутаминовую кислоту, гистидин, треонин или аспарагин; и
Хаа21 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин;
[общая формула 4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr (SEQ ID NO: 49),
в общей формуле 4:
Xaa8 представляет собой аланин или глицин;
Xaa16 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту, серии, треонин или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
Хаа23 представляет собой глицин или аланин;
Хаа24 представляет собой аланин или фенилаланин;
Хаа25 представляет собой аланин, фенилаланин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или отсутствует;
Хаа27 представляет собой треонин или отсутствует; и
Хаа28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует
(здесь, при условии, что, когда пептид содержит А-цепь с SEQ ID NO: 124 и В-цепь с SEQ ID NO: 125, он исключен).
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина получен путем замены на аланин одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 23, аминокислоты в положении 24 и аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина и аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2 и аминокислоты в положении 19 А-цепи природного инсулина или путем замены на глутаминовую кислоту или аспарагин аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 и 67.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина получен путем замены на глутаминовую кислоту аминокислоты в положении 16, или делеции аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина, или замены на глутаминовую кислоту или аланин аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69 или 71.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина получен путем замены на глутаминовую кислоту, серии, треонин или аспарагиновую кислоту аминокислоты в положении 16 В-цепи природного инсулина, замены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина, или заменой на гистидин, лизин, аланин или аспарагиновую кислоту аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина, или заменой на глутаминовую кислоту, серии или треонин аминокислоты в положении 19 А-цепи природного инсулина.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 и 123.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что аналог инсулина представлен в форме двух полипептидных цепей, состоящих из А-цепи с SEQ ID NO: 48, представленной общей формулой 3, и В-цепи с SEQ ID NO: 49, представленной общей формулой 4.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что А-цепь и В-цепь связаны друг с другом посредством дисульфидной связи.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что конъюгат представлен следующей химической формулой 1:
[химическая формула 1]
X-La-F,
где: X представляет собой инсулин или глюкагон;
L представляет собой линкер;
а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим;
F представляет собой вещество, способное увеличивать период полувыведения X in vivo; и
«-» представляет собой ковалентную или нековалентную связь.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что F выбрано из группы, состоящей из высокомолекулярного полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, полимера из повторяющихся единиц с определенной аминокислотной последовательностью, антитела, фрагмента антитела, вещества, связывающегося с FcRn (неонатальным Fc рецептором), соединительной ткани in vivo, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина и эластина.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что высокомолекулярный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что F представляет собой Fc-область иммуноглобулина.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что F представляет собой Fc-область IgG (иммуноглобулина G).
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что Fc-область иммуноглобулина является агликозилированной.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что Fc-область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из: (а) домена СН1, домена СН2, домена CH3 и домена СН4; (б) домена СН1 и домена СН2; (в) домена СН1 и домена CH3; (г) домена СН2 и домена CH3; (д) комбинации одного, или двух, или более доменов из домена СН1, домена СН2, домена CH3 и домена СН4 и шарнирной области иммуноглобулина или части указанной шарнирной области; и (е) димера каждого домена константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область иммуноглобулина, где удалена область, способная образовывать дисульфидную связь, где удалена часть аминокислот(ы) на N-конце, где к N-концу нативного Fc присоединен метиониновый остаток, где удален сайт связывания комплемента или где удален сайт антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область иммуноглобулина, происходящую из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что Fc-область иммуноглобулина представляет собой гибрид домена, имеющего разное происхождение, происходящего из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что L выбран из группы, состоящей из пептида, жирной кислоты, сахарида, высокомолекулярного полимера, низкомолекулярного соединения, нуклеотида и их комбинации.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что высокомолекулярный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что L представляет собой полиэтиленгликоль.
Для достижения настоящего изобретения согласно другому аспекту предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащая инсулин и глюкагон.
Композиция по одному конкретному воплощению характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по указанному выше конкретному воплощению характеризуется тем, что глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложена композиция для уменьшения побочных эффектов инсулина, содержащая инсулин и глюкагон.
Композиция по одному конкретному воплощению характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по указанному выше конкретному воплощению характеризуется тем, что глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложена комплексная композиция для уменьшения гипогликемии у пациента с заболеванием, связанным с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон.
Комплексная композиция по одному конкретному воплощению характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Комплексная композиция по указанному выше конкретному воплощению характеризуется тем, что глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Комплексная композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата.
Комплексная композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что гипогликемия представляет собой побочный эффект инсулина.
Комплексная композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что она подавляет увеличение массы тела.
Комплексная композиция по любому из указанных выше конкретных воплощений характеризуется тем, что она содержит инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат в массовом отношении от 0,1:1 до 100:1.
Полезные эффекты
Композиция или комплексная композиция, каждая из которых содержит инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат, по настоящему изобретению обеспечивает новую комбинированную терапию, способную облегчать побочные эффекты, вызванные введением инсулина, такие как увеличение массы тела или гипогликемия, оказывая в то же время профилактический или терапевтический эффект на заболевание, связанное с инсулином, например диабет.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ. 1 показаны изменения уровней глюкозы в крови при комбинированном введении длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона;
на ФИГ. 2 показаны изменения (AUC) уровней глюкозы в крови при комбинированном введении длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона; и
на ФИГ. 3 показаны изменения массы тела при комбинированном введении длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона.
НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В то же время, каждое из объяснений и воплощений, раскрытых в настоящем изобретении, может быть применено к другим объяснениям и воплощениям. То есть объем настоящего изобретения включает все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем изобретении. Кроме того, объем настоящего изобретения не следует ограничивать конкретными описаниями, приведенными ниже.
Во всем описании настоящего изобретения использованы не только традиционные однобуквенные коды и трехбуквенные коды аминокислот, присутствующих в природе, но также трехбуквенные коды, обычно используемые для других аминокислот, таких как Aib (α-аминоизомасляная кислота), Sar (N-метилглицин) и альфа-метилглутаминовая кислота (α-метилглутаминовая кислота). Кроме того, аминокислоты, указанные в настоящем изобретении в виде сокращений, описаны в соответствии с номенклатурой IUPAC-IUB.
Для достижения настоящего изобретения согласно одному аспекту предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон.
Конкретно, композиция может содержать:
(1) инсулин и глюкагон;
(2) длительно действующий конъюгат инсулина, где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, и глюкагон;
(3) инсулин и длительно действующий конъюгат глюкагона, где глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo; или
(4) длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат глюкагона.
Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, по настоящему изобретению содержит инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат и может облегчать побочные эффекты, вызванные введением инсулина (например, увеличение массы тела или гипогликемию), оказывая в то же время профилактический или терапевтический эффект на заболевание, связанное с инсулином, вызванное дефицитом, отсутствием или дисфункцией инсулина.
В одном типичном воплощении настоящего изобретения эффекты снижения глюкозы в крови, подавления увеличения массы тела и облегчения гипогликемии были подтверждены у мышей db/db, которым вводили композицию, содержащую инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат, и, таким образом, было продемонстрировано, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может сохранять эффективность инсулина, уменьшая в то же время его побочные эффекты.
В одном конкретном воплощении настоящего изобретения указанная композиция может обеспечивать терапевтическое применение комбинации инсулина или его длительно действующего конъюгата и глюкагона или его длительно действующего конъюгата.
При использовании здесь «композиция» может быть использована взаимозаменяемо с «комбинацией», включающей инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат. Композиция может быть представлена в форме набора.
При использовании здесь термин «комбинация» может быть использован в значении комбинированного введения инсулина или его длительно действующего конъюгата и глюкагона или его длительно действующего конъюгата, и может подразумеваться, что комбинация имеет то же значение, что «комбинированное применение». Комбинацию можно вводить: (а) в форме смеси, где смешаны (1) инсулин или его длительно действующий конъюгат и (2) глюкагон или его длительно действующий конъюгат; или (б) в раздельной форме, где (1) инсулин или его длительно действующий конъюгат и (2) глюкагон или его длительно действующий конъюгат вводят по отдельности; но без ограничения этим.
Когда инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат представлены в раздельной форме, инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат могут быть приготовлены в виде в отдельных препаратов для введения одновременно, по отдельности, последовательно или в обратном порядке.
В настоящем изобретении комбинированное введение означает не только одновременное введение, и его следует также понимать как лекарственную форму, способную выполнять функцию на уровне, равном природной функции или превышающем природную функцию каждого вещества при совместном действии инсулина или его длительно действующего конъюгата и глюкагона или его длительно действующего конъюгата на индивида. Поэтому при использовании в настоящей заявке термина «комбинированное» следует понимать, что их вводят одновременно, по отдельности, последовательно или в обратном порядке. Когда введение осуществляют последовательно, в обратном порядке или по отдельности, конкретных ограничений относительно порядка введения нет. Тем не менее, интервал до второго введения должен быть таким, чтобы не были утрачены полезные эффекты комбинированного введения.
При использовании здесь термин «композиция» может представлять собой саму комбинацию, включающую инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат, или композицию, содержащую комбинацию, и терапевтическое применение, без ограничения этим. Например, композиция может представлять собой композицию, имеющую профилактическое или терапевтическое применение в отношении заболеваний, связанных с инсулином, без ограничения этим.
Композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для комбинированного введения инсулина или его длительно действующего конъюгата и глюкагона или его длительно действующего конъюгата, и инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат могут быть приготовлены в виде одного препарата или отдельных препаратов. Конкретно, инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат можно вводить одновременно, по отдельности, последовательно или в обратном порядке, но без ограничения этим.
При использовании здесь термин «набор» может включать комбинацию или композицию по настоящему изобретению для комбинированного введения инсулина или его длительно действующего конъюгата и глюкагона или его длительно действующего конъюгата. Конкретно, набор по настоящему изобретению может содержать инсулин или его конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат, приготовленные в виде одного препарата, или инсулин или его конъюгат и глюкагон или его конъюгат, приготовленные в виде отдельных препаратов, и может дополнительно содержать вещество, необходимое для комбинированного введения двух указанных веществ, но без ограничения этим.
Инсулин и глюкагон включают различные вещества со значимым уровнем активности инсулина и глюкагона, например, вещество в форме соединения или пептида.
При использовании здесь термин «заболевание, связанное с инсулином», относится к заболеванию, вызванному отклонениями функции инсулина по контролю глюкозы в крови, такими как дефицит, отсутствие или дисфункция инсулина, и объем настоящего изобретения включает любое заболевание, при условии, что введение инсулина при этом заболевании будет предположительно оказывать профилактический или терапевтический эффект. Конкретно, заболевание, связанное с инсулином, может быть выбрано из группы, состоящей из инсулинорезистентных заболеваний, диабета, гипергликемии и ожирения, но без ограничения этим.
При введении инсулина для лечения заболевания, связанного с инсулином, возникают нежелательные побочные эффекты, такие как гипогликемия или увеличение массы тела, несмотря на возможность получения желаемого терапевтического эффекта, и, таким образом, существует проблема появления у пациента другого заболевания и боли. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, где инсулин и глюкагон использованы в комбинации, может облегчать гипогликемию, представляющую собой побочный эффект инсулина, и может подавлять увеличение массы тела, оказывая в то же время терапевтический эффект на заболевания, связанные с инсулином.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат в количественном соотношении, позволяющем облегчать побочные эффекты, оказывая в то же время терапевтический эффект на заболевания, связанные с инсулином. Конкретно, они могут быть включены в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1 или в молярном соотношении от 1:1 до 30:1, от 1:1 до 20:1, от 1:1 до 16:1, но без ограничения этим.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат в определенном соотношении, демонстрируя посредством этого превосходный эффект контроля глюкозы в крови, в то же время подавляя побочные эффекты. Когда массовое соотношение выходит за пределы указанного выше диапазона, например при включении инсулина или его длительно действующего конъюгата в избыточном количестве, есть высокий риск развития значительных побочных эффектов инсулина, а когда глюкагон или его длительно действующий конъюгат включен в избыточном количестве, есть проблема возможного снижения терапевтического эффекта на заболевания, связанные с инсулином.
При использовании здесь термин «инсулин» относится к разновидности гормона, секретируемого бета-клетками поджелудочной железы, и обычно выполняет в организме функцию регуляции глюкозы в крови путем стимулирования внутриклеточного захвата глюкозы и ингибирования распада жира. Проинсулин в форме предшественника, не имеющего функции контроля глюкозы в крови, претерпевает процессинг с образованием инсулина, имеющего функцию контроля глюкозы в крови. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, то есть А-цепи и В-цепи, содержащих 21 и 30 аминокислотных остатков, соответственно, связанных друг с другом посредством двух дисульфидных связей. А-цепь и В-цепь природного инсулина содержат аминокислотные последовательности, представленные следующими SEQ ID NO: 124 и 125, соответственно.
А-цепь:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 124).
В-цепь:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 125).
При использовании здесь термин «проинсулин» относится к молекуле, являющейся предшественником инсулина. Проинсулин может содержать А-цепь и В-цепь инсулина и С-пептид между ними. Проинсулин может представлять собой человеческий проинсулин.
В настоящем изобретении инсулин может представлять собой природный инсулин или может представлять собой аналог, производное или фрагмент, полученные путем изменения одной или более чем одной аминокислоты природного инсулина, выбранного из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации и их комбинации.
При использовании здесь термин «аналог инсулина» относится к неприродному инсулину, отличному от природного инсулина.
Аналог инсулина включает аналог, полученный путем модификации части аминокислот природного инсулина посредством добавления, делеции или замены. Например, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, полученный посредством замены на другую аминокислоту или делеции одной или более чем одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2, аминокислоты в положении 3, аминокислоты в положении 5, аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 10, аминокислоты в положении 12, аминокислоты в положении 16, аминокислоты в положении 23, аминокислоты в положении 24, аминокислоты в положении 25, аминокислоты в положении 26, аминокислоты в положении 27, аминокислоты в положении 28, аминокислоты в положении 29 и аминокислоты в положении 30 В-цепи природного инсулина и аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2, аминокислоты в положении 5, аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 10, аминокислоты в положении 12, аминокислоты в положении 14, аминокислоты в положении 16, аминокислоты в положении 17, аминокислоты в положении 18, аминокислоты в положении 19 и аминокислоты в положении 21 А-цепи природного инсулина, но без ограничения этим. Аминокислотная замена может обычно быть осуществлена на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатичной природы остатков. Можно ожидать, что консервативные замены на аминокислоты, имеющие сходные свойства, будут демонстрировать такую же или сходную активность.
Аналог инсулина по настоящему изобретению может относиться к описанному в публикации патента Кореи No. 10-2014-0106452 или 10-2017-0026284.
Аналог инсулина, используемый в настоящем изобретении, может быть представлен в форме одной цепи или двух полипептидных цепей и, более предпочтительно, в форме двух полипептидных цепей, но конкретного не ограничен этим. Две полипептидные цепи могут состоять из двух полипептидов, полипептида, соответствующего А-цепи природного инсулина, и полипептида, соответствующего В-цепи природного инсулина. Здесь последовательность пептида, соответствующего А-цепи или В-цепи природного инсулина, может быть по меньшей мере на 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более или 95% или более идентична при сравнении идентичности последовательности любой одной цепи из двух полипептидных цепей с А-цепью или В-цепью природного инсулина, но без ограничения этим, и специалисты в данной области могут легко определить это путем сравнения последовательности, составляющей две полипептидные цепи, с последовательностью А-цепи или В-цепи природного инсулина.
При использовании здесь термин «гомология» предназначен для обозначения степени сходства с аминокислотной последовательностью белка дикого типа или кодирующей его нуклеотидной последовательностью и включает последовательности, имеющие указанный выше или больший процент гомологии аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Гомология может быть определена путем сравнения двух заданных последовательностей невооруженным глазом, но может быть определена с использованием биоинформационного алгоритма, позволяющего анализировать гомологию посредством выравнивания рассматриваемых последовательностей для сравнения. Гомология двух заданных аминокислотных последовательностей может быть указана как процент. Полезный автоматизированный алгоритм доступен для применения в компьютерных программных модулях GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA пакета Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Мэдисон, штат Висконсин, США). Алгоритм выравнивания, автоматизированный в указанных выше модулях, включает алгоритмы выравнивания последовательностей Нидлмана-Вунша (Needleman & Wunsch), Пирсона-Липмана (Pearson & Lipman) и Смита-Уотермана (Smith & Waterman). Другие полезные алгоритмы выравнивания последовательностей и определения гомологии автоматизированы в программном обеспечении, включающем FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST и CLUSTAL W.
Информация о последовательностях инсулина и глюкагона, используемых в настоящем изобретении, и кодирующих их нуклеотидных последовательностях может быть получена из общедоступной базы данных, такой как NCBI и тому подобные.
В одном конкретном типичном воплощении аналог инсулина по настоящему изобретению может представлять собой композицию, содержащую А-цепь с SEQ ID NO: 48, представленную следующей общей формулой 3, и В-цепь с SEQ ID NO: 49, представленную следующей общей формулой 4, но без ограничения этим:
[общая формула 3]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (SEQ ID NO: 48), в общей формуле 3:
Xaa1 представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа2 представляет собой аланин или изолейцин;
Хаа5 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин или аспарагин;
Xaa12 представляет собой аланин, серии, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин;
Xaa14 представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин;
Xaa16 представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Xaa19 представляет собой аланин, тирозин, серии, глутаминовую кислоту, гистидин, треонин или аспарагин; и
Хаа21 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин;
[общая формула 4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr (SEQ ID NO: 49),
и в общей формуле 4:
Хаа8 представляет собой аланин или глицин;
Xaa16 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту, серии, треонин или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
Хаа23 представляет собой глицин или аланин;
Хаа24 представляет собой аланин или фенилаланин;
Хаа25 представляет собой аланин, фенилаланин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или отсутствует;
Хаа27 представляет собой треонин или отсутствует; и
Хаа28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует
(где пептид, содержащий А-цепь с SEQ ID NO: 124 и В-цепь с SEQ ID NO: 125, исключен).
Конкретнее, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, полученный путем замены на аланин одной или более чем одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 23, аминокислоты в положении 24 и аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина и аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2 и аминокислоты в положении 19 А-цепи природного инсулина или замены на глутаминовую кислоту или аспарагин аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина, и, в частности, аналог инсулина может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQIDNO: 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 и 67, или может состоять из такой аминокислотной последовательности, но без ограничения этим.
Кроме того, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, полученный путем замены на глутаминовую кислоту аминокислоты в положении 16 В-цепи природного инсулина, делеции аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина или замены на глутаминовую кислоту или аланин аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина, и, в частности, аналог инсулина может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69 или 71 или может состоять из такой аминокислотной последовательности, но без ограничения этим.
Кроме того, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, полученный путем замены на глутаминовую кислоту, серии, треонин или аспарагиновую кислоту аминокислоты в положении 16 В-цепи природного инсулина, замены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина, замены на гистидин, лизин, аланин или аспарагиновую кислоту аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина или заменой на глутаминовую кислоту, серии или треонин аминокислоты в положении 19 А-цепи природного инсулина, и, в частности, аналог инсулина может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 и 123, или может состоять из такой аминокислотной последовательности, но без ограничения этим.
Несмотря на его описание в настоящем изобретении как «состоящего из определенной SEQ ID NO», при условии, что белок может иметь активность, идентичную или соответствующую активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности соответствующей SEQ ID NO, не исключены добавление бессмысленной последовательности выше или ниже аминокислотной последовательности соответствующей SEQ ID NO, ее природная мутация или молчащая мутация, и очевидно, что варианты, имеющие такое добавление или мутацию последовательности, также включены в объем настоящего изобретения.
Приведенное выше описание может быть применено к другим конкретным воплощениям или аспектам настоящего изобретения, но не ограничено ими.
В то же время, аналог инсулина по настоящему изобретению может быть представлен в форме одноцепочечного инсулина, где С-пептид не удален, и может представлять собой вещество, содержащее А-цепь с SEQ ID NO: 48, представленную общей формулой 3, и В-цепь с SEQ ID NO: 49, представленную общей формулой 4, и имеющую активность и функцию инсулина.
Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может быть получен путем удаления С-пептида из проинсулина, содержащего С-пептид между А-цепью и В-цепью. Удаление С-пептида может быть осуществлено методом, известным в данной области, и, конкретно, оно может быть осуществлено посредством обработки трипсином и карбоксипептидазой В, но без ограничения этим.
Конкретно, аналог инсулина по настоящему изобретению может состоять из А-цепи с SEQ ID NO: 48, представленной общей формулой 3, и В-цепи с SEQ ID NO: 49, представленной общей формулой 4, и, более конкретно, аналог инсулина может быть представлен в форме двух полипептидных цепей, где А-цепь и В-цепь связаны друг с другом посредством двух дисульфидных связей, но без ограничения этим.
Очевидно, что аналог инсулина в форме двух полипептидных цепей, полученный посредством удаления С-пептида из аналога инсулина в форме проинсулина, представленный в настоящем изобретении определенной SEQ ID NO, также включен в объем настоящего изобретения.
Аналог инсулина может включать пептид, имеющий одну или более чем одну последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности природного инсулина, пептид, измененный посредством модификации последовательности природного инсулина, и миметик природного инсулина, регулирующий в живом организме функцию контроля глюкозы в крови, подобно природному инсулину. В настоящем изобретении аналог инсулина может быть использован взаимозаменяемо с производным инсулина. Такое производное природного инсулина может выполнять в живом организме функцию контроля глюкозы в крови.
Конкретно, производное инсулина может быть изменено посредством любого метода замены, добавления, делеции и модификации части аминокислот природного инсулина или посредством комбинации этих методов.
Конкретно, производное инсулина может иметь аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% или более гомологичную аминокислотной последовательности А-цепи или В-цепи природного инсулина, и/или может быть представлено в форме, где часть группы одного аминокислотного остатка инсулина химически замещена (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалена (например, дезаминирование) или модифицирована (например, N-метилирование), но без ограничения этим.
Производное природного инсулина, используемое в настоящем изобретении, может быть получено посредством комбинации различных способов получения производных.
Кроме того, такое изменение для получения производных инсулина может включать все изменения с использованием аминокислот L-типа или D-типа и/или аминокислот ненативных типов и/или модификацию нативной последовательности или посттрансляционную модификацию (например, метилирование, ацилирование, убиквитинирование, образование внутримолекулярных ковалентных связей и тому подобное).
Кроме того, изменение может также включать все изменения с присоединением одной или более чем одной аминокислоты к N- и/или С-концу инсулина.
При замене или добавлении аминокислот могут быть использованы не только 20 аминокислот, обычно обнаруживаемые в человеческих белках, но также атипичные аминокислоты, не встречающиеся в природе. Коммерческие источники атипичных аминокислот могут включать Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. и Genzyme Pharmaceuticals. Пептиды, содержащие эти аминокислоты, и атипичные пептидные последовательности могут быть синтезированы и приобретены у коммерческих поставщиков, например American Peptide Company, Bachem (США) или Anygen (Корея), но без ограничения этим.
При использовании здесь термин «фрагмент природного инсулина, аналога инсулина или производного инсулина» относится к форме, где удалена одна или более чем одна аминокислота с N- и/или С-конца природного инсулина, аналога инсулина или производного природного инсулина. Такой фрагмент может выполнять в организме функцию контроля глюкозы в крови.
Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может быть получен с применением способов получения, применяемых при получении производных и фрагментов природного инсулина, независимо или в комбинации.
Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может содержать изменение определенного аминокислотного остатка А-цепи и В-цепи природного инсулина, и, конкретно, может содержать изменение определенного аминокислотного остатка А-цепи природного инсулина и/или изменение определенного аминокислотного остатка В-цепи природного инсулина.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать (1) природный инсулин, (2) аналог инсулина, (3) производное инсулина, (4) их фрагмент или (5) их комбинацию в качестве инсулина, являющегося одним из активных ингредиентов, при условии, что они выполняют функцию инсулина по контролю глюкозы в крови.
При использовании здесь термин «глюкагон» относится к разновидности гормона, секретируемого альфа-клетками поджелудочной железы, и выполняет в организме функцию стимуляции распада гликогена для повышения уровней глюкозы и повышения глюкозы в крови. Нативный глюкагон может иметь следующую аминокислотную последовательность:
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1).
В настоящем изобретении глюкагон может представлять собой нативный глюкагон или может представлять собой аналог, производное или фрагмент, полученные путем изменения одной или более чем одной аминокислоты природного глюкагона, выбранного из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации и их комбинации.
При использовании здесь термин «аналог глюкагона» относится к неприродному глюкагону, отличному от природного глюкагона.
Аналог глюкагона включает аналог, полученный путем модификации части аминокислот природного глюкагона посредством добавления, делеции или замены.
Последовательность аналога глюкагона по настоящему изобретению может быть по меньшей мере на 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более или 95% или более идентична последовательности нативного глюкагона и не ограничена определенной последовательностью при условии, что он оказывает эффект повышения глюкозы в крови. Аналог глюкагона по настоящему изобретению может относиться к публикациям патентов Кореи №№10-2017-003466, 10-2018-0002544 и 10-2016-0082482.
В одном конкретном аспекте аналог глюкагона может представлять собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность следующей общей формулы 1:
X1-X2-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T-X30 (общая формула 1, SEQ ID NO: 46),
в общей формуле 1:
X1 представляет собой гистидин, дезаминогистидил, диметилгистидил (N-диметилгистидил), бета-гидроксиимидазопропионил, 4-имидазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил, триптофан или тирозин или отсутствует;
Х2 представляет собой альфа-метилглутаминовую кислоту (α-метилглутаминовую кислоту), Aib (аминоизомасляную кислоту), D-аланин, глицин, Sar (N-метилглицин), серии или D-серин;
Х7 представляет собой треонин, валин или цистеин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин или цистеин;
Х13 представляет собой тирозин или цистеин;
Х14 представляет собой лейцин или цистеин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, серии, альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин или отсутствует;
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутамин, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серии, цистеин или валин или отсутствует;
Х18 представляет собой аланин, аспарагиновую кислоту, глутамин, глутаминовую кислоту, аргинин, валин или цистеин или отсутствует;
Х19 представляет собой аланин, аргинин, серии, валин или цистеин или отсутствует;
Х20 представляет собой лизин, гистидин, глутаминовую кислоту, глутамин, аспарагиновую кислоту, аргинин, альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин или отсутствует;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лейцин, валин или цистеин или отсутствует;
Х23 представляет собой изолейцин, валин или аргинин или отсутствует;
Х24 представляет собой валин, аргинин, аланин, цистеин, глутаминовую кислоту, лизин, глутамин, альфа-метилглутаминовую кислоту или лейцин или отсутствует;
Х27 представляет собой изолейцин, валин, аланин, лизин, метионин, глутамин или аргинин или отсутствует;
Х28 представляет собой глутамин, лизин, аспарагин или аргинин или отсутствует; и
X30 представляет собой цистеин или отсутствует (при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 является такой же, как SEQ ID NO: 1, он исключен).
Намного более конкретно, в общей формуле 1:
X1 представляет собой гистидин, триптофан или тирозин или отсутствует;
Х2 представляет собой серии или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин, валин или цистеин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин или цистеин;
Х13 представляет собой тирозин или цистеин;
Х14 представляет собой лейцин или цистеин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту, серии или цистеин;
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серии, цистеин или валин;
Х18 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин или цистеин;
Х19 представляет собой аланин или цистеин;
Х20 представляет собой глутамин, аспарагиновую кислоту, лизин или цистеин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лейцин, валин или цистеин;
Х23 представляет собой изолейцин, валин или аргинин;
Х24 представляет собой валин, аргинин, аланин, глутаминовую кислоту, лизин, глутамин или лейцин;
Х27 представляет собой изолейцин, валин, аланин, метионин, глутамин или аргинин;
Х28 представляет собой глутамин, лизин, аспарагин или аргинин; и X30 представляет собой цистеин или отсутствует (при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 является такой же, как SEQ ID NO: 1, он исключен).
Например, аналог глюкагона может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-45, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-45, но без ограничения этим. Кроме того, аналог глюкагона может иметь pi от 6 до 7 и/или может иметь активность in vitro, составляющую 200% или более по сравнению с активностью нативного глюкагона. Более конкретно, аналог глюкагона может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и, намного более конкретно, он может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, но без ограничения этим.
Конкретно, в общей формуле 1:
X1 представляет собой гистидин, триптофан или тирозин;
Х2 представляет собой серии или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой цистеин, треонин или валин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин или цистеин;
Х13 представляет собой тирозин или цистеин;
Х14 представляет собой лейцин или цистеин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту, серии или цистеин;
Х17 представляет собой глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, цистеин или валин;
Х18 представляет собой аргинин или цистеин;
Х19 представляет собой аланин или цистеин;
Х20 представляет собой глутамин или лизин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, валин или цистеин;
Х23 представляет собой валин;
Х24 представляет собой валин или глутамин;
Х27 представляет собой метионин;
Х28 представляет собой аспарагин или аргинин; и
X30 представляет собой цистеин или отсутствует.
Например, пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 11-17, 19-27, 29, 31, 33 и 35-44, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 11-17, 19-27, 29, 31, 33 и 35-44, но без ограничения этим.
Конкретно, в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин;
Х2 представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой цистеин, треонин или валин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин;
Х13 представляет собой тирозин или цистеин;
Х14 представляет собой лейцин или цистеин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту, серии или цистеин;
Х17 представляет собой лизин, аргинин, цистеин или валин;
Х18 представляет собой аргинин или цистеин;
Х19 представляет собой аланин или цистеин;
Х20 представляет собой глутамин или лизин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или цистеин;
Х23 представляет собой валин;
Х24 представляет собой глутамин;
Х27 представляет собой метионин;
Х28 представляет собой аспарагин или аргинин; и
X30 представляет собой цистеин или отсутствует (при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 является такой же, как SEQ ID NO: l, он исключен).
Например, пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQIDNO: 12, 14, 17, 19-25, 27, 29, 33, 35-38, 40-42 и 44, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 14, 17, 19-25, 27, 29, 33, 35-38, 40-42 и 44, но без ограничения этим.
Конкретно, в общей формуле 1:
X1 представляет собой гистидин, триптофан или тирозин или отсутствует;
Х2 представляет собой серии или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин, валин или цистеин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин или цистеин;
Х13 представляет собой тирозин или цистеин;
Х14 представляет собой лейцин или цистеин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту, серии или цистеин;
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серии, цистеин или валин;
Х18 представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин или цистеин;
Х19 представляет собой аланин или цистеин;
Х20 представляет собой глутамин, аспарагиновую кислоту или лизин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;
Х23 представляет собой валин;
Х24 представляет собой валин или глутамин;
Х27 представляет собой изолейцин или метионин;
Х28 представляет собой аспарагин или аргинин; и
X30 представляет собой цистеин или отсутствует (при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 является такой же, как SEQ ID NO: 1, он исключен).
Например, пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, 15, 17, 20-24, 26-30 и 32-45, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, 15, 17, 20-24, 26-30 и 32-45, но без ограничения этим.
Конкретно, в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин;
Х2 представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин;
Х10 представляет собой тирозин;
Х12 представляет собой лизин;
Х13 представляет собой тирозин;
Х14 представляет собой лейцин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту, серии или цистеин;
Х17 представляет собой лизин или аргинин;
Х18 представляет собой аргинин;
Х19 представляет собой аланин;
Х20 представляет собой глутамин, цистеин или лизин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту, цистеин, валин или глутаминовую кислоту;
Х23 представляет собой валин или аргинин;
Х24 представляет собой глутамин или лейцин;
Х27 представляет собой метионин;
Х28 представляет собой аспарагин или аргинин; и
X30 отсутствует.
Например, пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 16, 18, 19, 25 и 31, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 16, 18, 19, 25 и 31, но без ограничения этим.
Конкретнее, пептид может представлять собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность следующей общей формулы 2:
Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-М-N-Т-X30 (общая формула 2, SEQ ID NO: 47),
в общей формуле 2:
Х7 представляет собой треонин, валин или цистеин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин или цистеин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту или серии;
Х17 представляет собой лизин или аргинин;
Х20 представляет собой глутамин или лизин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;
Х24 представляет собой валин или глутамин; и
X30 представляет собой цистеин или отсутствует.
Например, пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 15 и 36-44, но без ограничения этим. Конкретнее, пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, 20 или 37 или может состоять (по существу) из соответствующей аминокислотной последовательности, но без ограничения этим.
Конкретно, в общей формуле 2:
Х7 представляет собой треонин, валин или цистеин;
Х10 представляет собой тирозин или цистеин;
Х12 представляет собой лизин;
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту;
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту или серии;
Х17 представляет собой лизин или аргинин;
Х20 представляет собой глутамин или лизин;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;
Х24 представляет собой глутамин; и
X30 представляет собой цистеин или отсутствует, но без ограничения этим.
Например, пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 36-38, 40-42 и 44, и, конкретно, может состоять (по существу) из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 36-38, 40-42 и 44, но без ограничения этим.
Описанный выше аналог глюкагона может содержать внутримолекулярную связь (например, ковалентную поперечную сшивку или нековалентную поперечную сшивку) и, конкретно, он может быть представлен в форме, содержащей кольцо. Например, аналог глюкагона может быть представлен в форме, где кольцо образовано между аминокислотами в положениях 16 и 20 производного глюкагона, но без ограничения этим.
Неограничивающие примеры кольца могут включать лактамную поперечную сшивку (или лактамное кольцо).
Кроме того, аналог глюкагона включает все аналоги глюкагона, модифицированные для включения аминокислоты, способной образовывать кольцо, в желаемом месте для образования кольца.
Кольцо может быть образовано между боковыми цепями аминокислот аналога глюкагона, например, в форме лактамного кольца, образованного между боковой цепью лизина и боковой цепью глутаминовой кислоты, но без конкретного ограничения этим.
Например, пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, может представлять собой пептид, где каждая аминокислота в каждой паре аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24 и Х24 и Х28 общей формулы 1 или 2 может быть заменена на глутаминовую кислоту или лизин, соответственно, но без ограничения этим. В Xn (n является натуральным числом) n относится к положению аминокислоты с N-конца представленной аминокислотной последовательности.
Кроме того, пептид, содержащий аминокислотную последовательность общей формулы 1 или 2, может представлять собой пептид, где каждая аминокислота в каждой из пары аминокислот Х12 и Х16, или пары аминокислот Х16 и Х20, или пары аминокислот Х17 и Х21 заменена на глутаминовую кислоту или лизин, соответственно, которые способны образовывать кольцо, но без ограничения этим.
Кроме того, в общей формуле 1 или 2 пептид может представлять собой пептид, в котором между соответствующими аминокислотами в по меньшей мере одной паре аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24 и Х24 и Х28, образовано кольцо (например, лактамное кольцо), но без ограничения этим.
Кроме того, в общей формуле 1 или 2 Х16 может представлять собой глутаминовую кислоту, Х20 может представлять собой лизин, и боковые цепи Х16 и Х20 могут образовывать лактамное кольцо, но без ограничения этим.
При использовании здесь термин «производное глюкагона» включает пептид, аминокислотная последовательность которого имеет одно или более чем одно отличие по сравнению с нативным глюкагоном, пептид, где последовательность нативного глюкагона изменена посредством модификации, и миметик нативного глюкагона, способный активировать рецепторы глюкагона, подобно нативному глюкагону. Такое производное нативного глюкагона может выполнять в живом организме функцию контроля глюкозы в крови. В настоящем изобретении производное глюкагона может быть использовано взаимозаменяемо с аналогом глюкагона.
Аналог глюкагона или производное глюкагона по настоящему изобретению может иметь улучшенные физические свойства, имея измененную pI по сравнению с нативным глюкагоном. Кроме того, аналог глюкагона или производное глюкагона может иметь улучшенную растворимость, обладая в то же время активностью по активации рецепторов глюкагона, но без ограничения этим.
Кроме того, аналог глюкагона или производное глюкагона может представлять собой глюкагон, не встречающийся в природе.
При использовании здесь термин «изоэлектрическая точка» или «pI» относится к значению рН, при котором суммарный заряд молекулы, такой как полипептид или пептид, равен нулю (0). В случае полипептида с различными заряженными функциональными группами, при pI сумма их зарядов равна нулю. При рН выше pI суммарный заряд полипептида будет отрицательным, а при рН ниже pI суммарный заряд полипептида будет положительным.
pI можно определить на геле с фиксированным градиентом рН, состоящем из полиакриламида, крахмала или агарозы, посредством изоэлектрического электрофореза или спрогнозировать, например, по аминокислотной последовательности с использованием инструмента pI/MW (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) на сервере ExPASy.
При использовании здесь термин «измененная pI» относится к pI, отличающейся от pI нативного глюкагона вследствие замены части аминокислотной последовательности нативного глюкагона на аминокислотный остаток, имеющий отрицательный заряд или положительный заряд, то есть к сниженному или повышенному значению pI. Пептид с такой измененной pI может демонстрировать улучшенную растворимость и/или высокую стабильность при нейтральном рН, но без ограничения этим.
Конкретнее, аналог или производное глюкагона может иметь измененное значение pI, а не значение pI (6,8) нативного глюкагона, и, еще более конкретно, значение pI менее 6,8, конкретнее, 6,7 или менее, конкретнее, 6,5 или менее, и, кроме того, значение pI более 6, 8, 7 или более, конкретнее, 7,5 или более, но без ограничения этим, и объем настоящего изобретения включает любое значение pI, отличающееся от значения pI нативного глюкагона. В частности, объем настоящего изобретения включает аналог или производное глюкагона, имеющие значение pI, отличающееся от значения pI нативного глюкагона, и, таким образом, демонстрирующие улучшенную растворимость при нейтральном рН по сравнению с растворимостью нативного глюкагона и, вследствие этого, низкий уровень агрегации.
Конкретнее, аналог или производное глюкагона может иметь значение pI от 4 до 6,5 и/или от 7 до 9,5, конкретно, от 7,5 до 9,5 и, более конкретно, от 8,0 до 9,3, но значение pI не ограничено этим. В данном случае, в силу значения pI выше или ниже значения pI нативного глюкагона, аналог или производное глюкагона может демонстрировать улучшенную растворимость и высокую стабильность при нейтральном рН по сравнению с нативным глюкагоном, но без ограничения этим.
Конкретно, производное глюкагона может быть изменено любым способом замены, добавления, делеции и модификации части аминокислот нативного глюкагона или комбинацией этих способов. Аминокислотную замена можно обычно осуществить на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатичной природы остатков. Можно ожидать, что консервативные замены аминокислотами, имеющими сходные свойства, будут демонстрировать такую же или сходную активность.
Примеры производного глюкагона, полученного комбинацией указанных выше способов, включают пептид, выполняющий функцию активации рецептора глюкагона, аминокислотная последовательность которого имеет одно или более чем одно отличие от аминокислотной последовательности нативного глюкагона, и где N-концевой аминокислотный остаток дезаминирован, но без ограничения этим, и производные нативного глюкагона, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены комбинацией различных способов получения производных.
Кроме того, такое изменение для получения производных нативного глюкагона может включать все модификации с использованием аминокислот L-типа или D-типа и/или ненативных аминокислот и/или модификацию нативной последовательности, например модификацию функциональной группы боковой цепи, образование внутримолекулярных ковалентных связей, например образование кольца между боковыми цепями, метилирование, ацилирование, убиквитинирование, фосфорилирование, аминогексанирование, биотинилирование и так далее. Кроме того, изменение может также включать замены в ненативных соединениях.
Кроме того, изменение может также включать все изменения, где одна или более чем одна аминокислота присоединена к N- и/или С-концу нативного глюкагона.
В качестве аминокислот для замены или добавления могут быть использованы не только 20 аминокислот, обычно обнаруживаемые в человеческих белках, но также атипичные аминокислоты или аминокислоты, не встречающиеся в природе. Коммерческие источники атипичных аминокислот могут включать Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. и Genzyme Pharmaceuticals. Пептиды, содержащие эти аминокислоты, и обычные пептидные последовательности могут быть синтезированы и приобретены у коммерческих поставщиков пептидов, например American Peptide Company, Bachem (США) и Anygen (Корея).
Кроме того, таким же образом могут быть получены производные аминокислот. Например, могут быть использованы 4-имидазолуксусная кислота и так далее.
При использовании здесь термин «фрагмент нативного глюкагона, аналога глюкагона или производного глюкагона» относится к форме, где удалена одна или более чем одна аминокислота с N- и/или С-конца природного глюкагона, аналога глюкагона или производного природного глюкагона, в то же время оказывающей в организме эффект повышения глюкозы в крови.
Кроме того, аналог глюкагона по настоящему изобретению может быть получен с применением методов получения, применяемых при получении производных и фрагментов природного глюкагона, независимо или в комбинации.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать (1) природный глюкагон, (2) аналог глюкагона, (3) производное глюкагона, (4) их фрагмент или (5) их комбинацию в качестве глюкагона, являющегося одним из активных ингредиентов, при условии, что они выполняют функцию глюкагона по контролю глюкозы в крови.
Кроме того, пептиды по настоящему изобретению (например, инсулин, аналог инсулина, глюкагон, аналог глюкагона и так далее) могут включать пептиды, у которых с N-конец и/или С-конец не модифицированы. Тем не менее, пептиды по настоящему изобретению также включают модифицированные пептиды, где N-конец и/или С-конец химически модифицирован(ы) или защищен(ы) органическими группами, или к концу пептида присоединена аминокислота, и так далее. Когда С-конец не модифицирован, этот конец пептида по настоящему изобретению может иметь карбоксильную группу, но без конкретного ограничения этим.
В частности, в случае пептида, который химически синтезирован, его N- и С-концы заряжены, и для устранения этого заряда может быть осуществлено N-концевое ацетилирование и/или С-концевое амидирование, но без конкретного ограничения этим.
Конкретно, N- и С-концы инсулина или его аналога или глюкагона или его аналога по настоящему изобретению могут иметь аминогруппу (-NH2) или карбоксильную группу (-СООН), и С-конец глюкагона или его аналога может иметь аминогруппу, но они не ограничены этим.
Если в настоящем изобретении не указано иное, описания, приведенные в подробном описании или формуле изобретения, относящиеся к «пептиду» по настоящему изобретению или «конъюгату», где такой пептид ковалентно связан с биологически совместимым веществом, могут также быть применены к формам, содержащим не только соответствующий пептид или конъюгат, но также соли соответствующего пептида или конъюгата (например, их фармацевтически приемлемые соли) или их сольваты. Соответственно, даже в случае, когда в настоящем изобретении описан «пептид» или «конъюгат», его описание может также быть в равной степени применено к его определенной соли, его определенному сольвату и определенному сольвату его определенной соли. Эти соли могут, например, быть представлены в форме, где использованы любые фармацевтически приемлемые соли. Конкретных ограничений по типу соли нет. Тем не менее, соль предпочтительно представляет собой соль, безопасную и эффективную для индивида, например млекопитающего, но конкретно не ограничена этим.
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к веществу, которое может быть эффективно использовано для предполагаемого применения в рамках фармако-медицинского решения, не индуцируя чрезмерную токсичность, раздражение, аллергические ответы и так далее.
При использовании здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, имеющей происхождение от фармацевтически приемлемых неорганических кислот, органических кислот или оснований. Примеры подходящих кислот могут включать соляную кислоту, бромноватую кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, перхлорную кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, фосфорную кислоту, гликолевую кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, янтарную кислоту, n-толуолсульфоновую кислоту, винную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, метансульфоновую кислоту, муравьиную кислоту, бензойную кислоту, малоновую кислоту, 2-нафталинсульфоновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту и так далее. Примеры солей, имеющих происхождение от подходящих оснований, могут содержать щелочные металлы, такие как натрий, калий и так далее, щелочноземельные металлы, такие как магний, аммоний и так далее.
Кроме того, при использовании здесь термин «сольват» относится к комплексу, образованному пептидом, конъюгатом или их солью по настоящему изобретению и молекулой растворителя.
Кроме того, пептид по настоящему изобретению может быть синтезирован в соответствии с его длиной методом, хорошо известным в данной области, например с использованием автоматического синтезатора пептидов, и может также быть получен с использованием технологий генной инженерии.
В частности, пептид по настоящему изобретению может быть получен посредством стандартного метода синтеза, системы рекомбинантной экспрессии или любым другим методом, известным в данной области. Соответственно, производное глюкагона по настоящему изобретению может быть синтезировано различными способами, включая, например, методы, способы ниже:
(а) способ твердофазного или жидкофазного синтеза пептида, пошаговый или посредством сборки фрагментов, с последующим выделением и очисткой конечного пептидного продукта;
(б) способ экспрессии нуклеиновокислотной конструкции, кодирующей пептид, в клетке-хозяине и выделения продукта экспрессии из культуры клеток-хозяев; или
(в) способ осуществления бесклеточной экспрессии нуклеиновокислотной конструкции, кодирующей пептид, in vitro и выделения продукта экспрессии; или
способ получения пептидных фрагментов любой комбинацией способов (а), (б) и (в), с получением пептида посредством связывания указанных пептидных фрагментов и последующим выделением пептида.
В качестве более конкретного примера, желаемый пептид может быть получен генетической манипуляцией посредством получения слитого гена, кодирующего слитый белок, содержащий партнер по слиянию и инсулин, глюкагон или их аналог, трансформирования клетки-хозяина указанным слитым геном, экспрессии указанного слитого гена в форме слитого белка, и отщепления и выделения инсулина, глюкагона или их аналога из слитого белка с использованием протеазы или соединения. Для этого, например, между партнером по слиянию и полинуклеотидом, кодирующим инсулин, глюкагон или их аналог, может быть введена последовательность ДНК, кодирующая аминокислотные остатки, которые могут быть расщеплены протеазой, такой как фактор Ха или энтерокиназа, CNBr или таким соединением как гидроксиламин.
В одном конкретном воплощении инсулин или глюкагон по настоящему изобретению может быть представлен в форме длительно действующего конъюгата, где с ним связано биологически совместимое вещество, способное увеличивать его период полувыведения in vivo.
При использовании здесь «длительно действующий конъюгат» или «конъюгат» инсулина или глюкагона имеет структуру, где инсулин или глюкагон связан с биологически совместимым веществом и может демонстрировать повышенную продолжительность эффективности по сравнению с инсулином или глюкагоном, не связанным с таким биологически совместимым веществом. В длительно действующем конъюгате биологически совместимое вещество может быть связано с инсулином или глюкагоном посредством ковалентной связи, без ограничения этим. В настоящем изобретении инсулин или глюкагон, являющийся одним из компонентов конъюгата, может представлять собой инсулин или глюкагон, имеющий нативную последовательность, или может представлять собой аналог инсулина или глюкагона или его производное или фрагмент с заменой, добавлением, делецией, модификацией одной или более чем одной аминокислоты нативной последовательности или их комбинацией. Тем не менее, при условии, что он оказывает эффект природного инсулина или глюкагона по снижению/повышению глюкозы в крови, он может быть использован в качестве одного из компонентов конъюгата по настоящему изобретению без ограничения.
При использовании здесь термин «биологически совместимое вещество» относится к веществу, связанному с физиологически активным веществом (например, производным глюкагона, инсулинотропным пептидом и так далее), увеличивая посредством этого продолжительность его эффективности по сравнению с физиологически активным веществом, не связанным с группировкой биологически совместимого вещества или носителем. Биологически совместимое вещество может быть связано с физиологически активным веществом ковалентно, без конкретного ограничения этим.
Конкретно, конъюгат представляет собой конъюгат, представленный следующей химической формулой 1:
[химическая формула 1]
X-La-F,
где: X представляет собой инсулин или глюкагон;
L представляет собой линкер;
а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим; и
F представляет собой вещество, способное увеличивать период полувыведения X in vivo.
Композиция по настоящему изобретению может содержать (1) инсулин и глюкагон, (2) длительно действующий конъюгат инсулина и глюкагон, (3) инсулин и длительно действующий конъюгат глюкагона или (4) длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат глюкагона. Инсулин или глюкагон в форме длительно действующего конъюгата может уменьшать побочные эффекты инсулина, оказывая в то же время превосходный эффект контроля глюкозы в крови на основе улучшенной продолжительности эффективности.
В конъюгате F представляет собой вещество, способное увеличивать период полувыведения X, то есть инсулина или глюкагона, и соответствует одной из структур группировок, составляющих конъюгат по настоящему изобретению.
F и X могут быть связаны друг с другом посредством ковалентной химической связи или нековалентной химической связи, и F и X могут быть связаны друг с другом через L посредством ковалентной химической связи, нековалентной химической связи или их комбинации.
Вещество, способное увеличивать период полувыведения X, может представлять собой биологически совместимое вещество и, например, может быть выбрано из группы, состоящей из высокомолекулярного полимера, жирной кислоты, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, полимера из повторяющихся единиц с определенной аминокислотной последовательностью, антитела, фрагмента антитела, вещества, связывающегося с FcRn, соединительной ткани in vivo, нуклеотида, фибронектина, трансферрина, сахарида, гепарина и эластина, но без ограничения этим.
Эластин может представлять собой человеческий тропоэластин, являющийся водорастворимым предшественником, и может представлять собой полимер из некоторых последовательностей или некоторых повторяющихся единиц, например, включая все полипептиды, подобные эластину, но без ограничения этим.
Примеры высокомолекулярного полимера могут включать полимеры, выбранные из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотидов и их комбинаций, и полисахариды могут представлять собой декстран, но без ограничения этим.
Полиэтиленгликоль является общим термином, включающим все формы гомополимеров этиленгликоля, сополимеры ПЭГ (полиэтиленгликоль, PEG) и монометил-замещенные ПЭГ-полимеры (мПЭГ), но без конкретного ограничения этим.
Кроме того, биологически совместимое вещество может включать полиаминокислоты, такие как полилизин, полиаспарагиновая кислота и полиглутаминовая кислота, но без ограничения этим.
Кроме того, жирная кислота может обладать аффинностью связывания в отношении альбумина in vivo, но без ограничения этим.
В качестве более конкретного примера, вещество, связывающееся с FcRn, может представлять собой Fc-область иммуноглобулина и, более конкретно, Fc-область IgG, но без конкретного ограничения этим.
С биологически совместимым веществом может быть соединена боковая цепь одной или более чем одной аминокислоты пептида по настоящему изобретению для увеличения его растворимости и/или периода полувыведения in vivo и/или повышения его биодоступности. Эти модификации могут снижать клиренс терапевтических белков и пептидов.
Описанное выше биологически совместимое вещество может быть растворимым (амфипатичным или гидрофильным), и/или нетоксичным, и/или фармацевтически приемлемым.
F может быть связано с X напрямую (то есть в химической формуле 1 а представляет собой 0), или F может быть связано с X через линкер (L).
При использовании здесь «Fc-область иммуноглобулина» относится к области, содержащей константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и/или константную область 3 тяжелой цепи (CH3), исключая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина. Fc-область иммуноглобулина может представлять собой одну из структур, составляющих группировку конъюгата по настоящему изобретению.
Fc-область иммуноглобулина может содержать шарнирную область константной области тяжелой цепи, но без ограничения этим. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой расширенную Fc-область, содержащую часть или всю константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), исключая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, при условии, что Fc-область иммуноглобулина оказывает эффект, по существу идентичный или улучшенный по сравнению с нативным типом. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой область, из которой удалена протяженная часть аминокислотной последовательности, соответствующей СН2 и/или CH3.
Например, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой: (1) домен СН1, домен СН2, домен CH3 и домен СН4; (2) домен СН1 и домен СН2; (3) домен СН1 и домен CH3; (4) домен СН2 и домен CH3; (5) комбинацию одного, или двух, или более доменов из домена СН1, домена СН2, домена CH3 и домена СН4 и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области иммуноглобулина); и (6) димер каждого домена константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи; но без ограничения этим.
Кроме того, в одном конкретном воплощении Fc-область иммуноглобулина может быть в димерной форме, и одна молекула X может быть ковалентно связана с Fc-областью димерной формы, где Fc иммуноглобулина и X могут быть связаны друг с другом через непептидный полимер. Более того, две молекулы и X могут также быть конъюгированы симметричным образом с одной Fc-областью димерной формы. В этой связи, Fc иммуноглобулина и X могут быть связаны друг с другом через не пептид ильный линкер, но без ограничения описанным выше воплощением.
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению включает не только нативную аминокислотную последовательность, но также производное этой последовательности. Производное аминокислотной последовательности относится к аминокислотной последовательности, отличающейся от нативной аминокислотной последовательности одним или более чем одним аминокислотным остатком вследствие делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации.
Например, в качестве подходящих сайтов для модификации могут быть использованы аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, важны для связывания Fc IgG.
Кроме того, возможны различные другие производные, включая производные, имеющие делецию области, способной образовывать дисульфидную связь, или делецию некоторых аминокислот на N-конце нативного Fc, или добавление метионинового остатка на N-конце нативного Fc. Кроме того, для устранения эффекторных функций возможна делеция в сайте связывания комплемента, таком как сайт связывания Clq, и сайте антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Методики получения таких производных последовательности Fc-области иммуноглобулина раскрыты в публикациях международных заявок на патенты №№ WO 97/34631, WO 96/32478 и так далее.
В данной области известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые обычно не изменяют активность молекулы (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются аминокислотные остатки Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, в обоих направлениях. При необходимости Fc-область может быть модифицирована посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и так далее.
Описанные выше производные Fc демонстрируют биологическую активность, идентичную биологической активности Fc-области по настоящему изобретению, и имеют улучшенную структурную стабильность при нагревании, изменении рН и так далее.
Кроме того, эта Fc-область может быть получена из нативных форм, выделенных in vivo от людей или животных, таких как коровы, козы, свиньи, мыши, кролики, хомяки, крысы, морские свинки и так далее, или могут представлять собой их рекомбинанты или производные, полученные из трансформированных животных клеток или микроорганизмов. Здесь метод получения Fc-области из нативного иммуноглобулина может представлять собой метод выделения полноразмерного иммуноглобулина из живого организма человека или животного с последующей обработкой выделенного иммуноглобулина протеазой. При обработке папаином происходит расщепление иммуноглобулина на Fab- и Fc-области. При обработке пепсином происходит расщепление иммуноглобулина на pF'c и F(ab)2. Fc или pF'c могут быть выделены с применением эксклюзионной хроматографии и так далее. В более конкретном воплощении Fc-область человеческого происхождения представляет собой рекомбинантную Fc-область иммуноглобулина, полученную из микроорганизма.
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может иметь природные сахарные цепи или повышенные или сниженное содержание сахарных цепей по сравнению с природным типом или может быть представлена в дегликозилированной форме. Увеличение или уменьшение содержания сахарных цепей или удаление сахарных цепей Fc иммуноглобулина может быть достигнуто обычными методами, такими как химический метод, ферментный метод и генно-инженерный метод с использованием микроорганизма. Здесь Fc-область иммуноглобулина, полученная посредством удаления сахарных цепей из Fc-области, демонстрирует существенное снижение аффинности связывания с Clq-частью и снижение или утрату антителозависимой цитотоксичности или комплемент-зависимой цитотоксичности, и, таким образом, она не индуцирует ненужные иммунные ответы in vivo. В этом аспекте дегликозилированная или агликозилированная Fc-область иммуноглобулина может быть более подходящей формой для исходной задачи настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.
При использовании здесь термин «дегликозилирование» относится к ферментативному удалению сахарных группировок из Fc-области, а термин «агликозилирование» относится к негликозилированной Fc-области, полученной в прокариотах, более конкрето в Е. coli.
В то же время, Fc-область иммуноглобулина может иметь происхождение из людей или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок. В более конкретном воплощении она имеет происхождение из людей.
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может иметь происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или их комбинации или гибрида. В более конкретном воплощении она имеет происхождение из IgG или IgM, являющихся наиболее распространенными белками в человеческой крови, а в еще более конкретном воплощении она имеет происхождение из IgG, который, как известно, увеличивает период полувыведения лиганд-связывающих белков. В еще более конкретном воплощении Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область IgG4, а в наиболее конкретном воплощении Fc-область иммуноглобулина представляет собой агликозилированную Fc-область, имеющую происхождение из человеческого IgG4, без ограничения этим.
В то же время, при использовании здесь «комбинация» означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-области иммуноглобулинов одного и того же происхождения, соединены с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. То есть, возможно образование димера или мультимера из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из Fc-фрагмента IgG, Fc-фрагмента IgA, Fc-фрагмента IgM, Fc-фрагмента IgD и Fc-фрагмента IgE.
Кроме того описанный выше конъюгат может иметь повышенную продолжительность эффективности по сравнению с природным инсулином или глюкагоном или по сравнению с X, не модифицированным с использованием F, и конъюгат включает не только форму, описанную выше, но также форму, где конъюгат включен в биоразлагаемые наночастицы.
Кроме того, L представляет собой пептидильный линкер или непептидильный линкер.
Когда L представляет собой пептидильный линкер, он может содержать одну или более чем одну аминокислоту, например от 1 аминокислоты до 1000 аминокислот, но без конкретного ограничения этим. В настоящем изобретении для связывания F и X может быть использовано множество известных пептидильных линкеров, и их примеры могут включать линкер [GS]x, линкер [GGGS]x и линкер [GGGGS]x, где х может представлять собой натуральное число, составляющее 1 или более, но связывание не ограничено этим.
При использовании здесь «непептидильный линкер» включает биологически совместимый полимер, где связаны две или более чем две повторяющиеся единицы. Повторяющиеся единицы связаны друг с другом любой ковалентной связью, не являющейся пептидной связью. Непептидильный линкер может представлять собой одну из структур, составляющих группировку конъюгата по настоящему изобретению, и соответствует L в химической формуле 1. В настоящем изобретении непептидильный линкер может быть использован взаимозаменяемо с «непептидильным полимером».
В настоящем изобретении непептидильный линкер содержит реакционноспособные группы на своих концах, и, таким образом, конъюгат может быть образован при взаимодействии с другими компонентами, составляющими конъюгат. Когда непептидильный полимер, имеющий реакционноспособные функциональные группы на обоих концах, может быть связан с X и F в химической формуле 1 через эти реакционноспособные группы с образованием конъюгата, непептидильный линкер или непептидильный полимер может быть назван не пептид ильной полимерной линкерной группировкой или непептид ильной линкерной группировкой.
В La а может представлять собой 1 или более и, когда а представляет собой 2 или более, каждый L может быть независим.
Кроме того, в одном конкретном воплощении конъюгат может представлять собой конъюгат, где F, конкретно Fc-область иммуноглобулина, и X, конкретно пептидное лекарственное средство, могут быть ковалентно связаны друг с другом посредством не пептид ильного линкера, содержащего реакционноспособные группы, способные взаимодействовать с X и F.
Конкретно, непептидильный линкер может быть выбран из группы, состоящей из жирных кислот, полисахаридов, высокомолекулярных полимеров, низкомолекулярных соединений, нуклеотидов и их комбинаций.
В настоящем изобретении высокомолекулярный полимер может иметь молекулярную массу в диапазоне от более чем 0 кДа до приблизительно 100 кДа, конкретно от приблизительно 1 кДа до приблизительно 100 кДа, и более конкретно от приблизительно 1 кДа до приблизительно 20 кДа, без ограничения этим.
При использовании здесь термин «приблизительно» относится к диапазону, включающему все из плюс/минус 0,5, плюс/минус 0,4, плюс/минус 0,3, плюс/минус 0,2, плюс/минус 0,1 и так далее и включает все значения, эквивалентные значениям, указанным сразу после термина «приблизительно», или значениям, входящим в сходный диапазон, но без ограничения этим.
Полимер может включать, без ограничения, полимеры, выбранные из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотидов и их комбинаций, и полисахариды могут представлять собой декстран. В более конкретном воплощении L может представлять собой полиэтиленгликоль, но без ограничения этим. Кроме того, объем настоящего изобретения может также включать их производные, уже известные в данной области, и производные, которые могут быть легко получены на технологическом уровне данной области.
Непептидильный линкер, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть использован без ограничения, при условии, что он представляет собой полимер, обладающий устойчивостью к протеазам in vivo. Молекулярная масса непептидильного полимера может входить в диапазон от приблизительно 1 кДа до приблизительно 100 кДа и, конкретно, от приблизительно 1 кДа до приблизительно 20 кДа, но без ограничения этим. Кроме того, непептидильный линкер по настоящему изобретению, связанный с полипептидом, соответствующим F, может включать не только один тип полимера, но также комбинацию разных типов полимеров.
При использовании здесь термин «приблизительно» относится к диапазону, включающему все из плюс/минус 0,5, плюс/минус 0,4, плюс/минус 0,3, плюс/минус 0,2, плюс/минус 0,1 и так далее и включает все значения, эквивалентные значениям, указанным сразу после термина «приблизительно», или значениям, входящим в сходный диапазон, но без ограничения этим.
В одном конкретном воплощении оба конца непептидильного линкера могут быть связаны с аминогруппой или тиоловой группой F, то есть Fc-области иммуноглобулина, и с аминогруппой или тиоловой группой X.
Конкретно, непептидильный полимер может содержать реакционноспособные группы на обоих концах, способные связываться с F (то есть Fc-областью иммуноглобулина) и X, соответственно, и, конкретно, реакционноспособные группы, способные связываться с аминогруппой, расположенной на N-конце или лизине, или с тиоловой группой цистеина X или F (то есть Fc-области иммуноглобулина), но без ограничения этим.
Кроме того, реакционноспособные группы непептидильного полимера, способные связываться с F, например Fc-областью иммуноглобулина, и X, могут быть выбраны из группы, состоящей из альдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного, но без ограничения этим.
В приведенном выше примерами альдегидной группы могут быть пропиональдегидная группа или бутиральдегидная группа, но без ограничения этим.
В приведенном выше примерами сукцинимидного производного могут быть сукцинимидилвалерат, сукцинимидилметилбутанонат, сукцинимидилметилпропионат, сукцинимидилбутанонат, сукцинимидилпропионат, N-гидроксисукцинимид, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат, но без ограничения этим.
Непептидильный линкер может быть связан с X и F через эти реакционноспособные группы, но без ограничения этим.
Кроме того, конечный продукт, полученный путем восстановительного аминирования через альдегидную связь, стабильнее продукта, связанного амидной связью. Альдегидная реакционноспособная группа избирательно взаимодействует с N-концом при низком рН, в то время как при высоком рН, например рН 9,0, она может образовывать ковалентную связь с лизиновым остатком.
Кроме того, реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного линкера могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; например, на одном конце может присутствовать малеимидная группа, а на другом конце может присутствовать альдегидная группа, пропиональдегидная группа или бутиральдегидная группа. Тем не менее, если F, конкретно, Fc-область иммуноглобулина, и X могут быть конъюгированы с каждым из концов непептидильного линкера, конкретных ограничений относительно реакционноспособных групп нет.
Например, непептидильный полимер может содержать в качестве реакционноспособных групп, малеимидную группу на одном конце и альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу на другом конце.
При использовании полиэтиленгликоля, имеющего реакционноспособную гидроксигруппу на его обоих концах, в качестве непептидильного полимера гидроксигруппа может быть активирована с образованием различных реакционноспособных групп посредством известных химических реакций, или для получения длительно действующего белкового конъюгата по настоящему изобретению может быть использован полиэтиленгликоль с имеющейся в продаже модифицированной реакционноспособной группой.
В одном конкретном воплощении непептидильный полимер может быть связан с цистеиновым остатком X и, более конкретно, с группой SH цистеина, но без ограничения этим.
Например, непептидильный полимер может быть связан с цистеиновым остатком в положении 10, цистеиновым остатком в положении 13, цистеиновым остатком в положении 15, цистеиновым остатком в положении 17, цистеиновым остатком в положении 19, цистеиновым остатком в положении 21, цистеиновым остатком в положении 24, цистеиновым остатком в положении 28, цистеиновым остатком в положении 29, цистеиновым остатком в положении 30, цистеиновым остатком в положении 31, цистеиновым остатком в положении 40 или цистеиновым остатком в положении 41 пептида, соответствующего X, но без конкретного ограничения этим.
Конкретно, реакционноспособная группа непептидильного полимера может быть связана с группой -SH цистеинового остатка, и описанное выше применимо также к реакционноспособной группе. При использовании малеимид-PEG-альдегида малеимидная группа может быть связана с группой SH X тиоэфирной связью, а альдегидная группа может быть связана с -NH2 F, конкретно, Fc-области иммуноглобулина, посредством восстановительного аминирования, но без ограничения этим, и приведенное выше является лишь типичным воплощением.
Кроме того, в описанном выше конъюгате реакционноспособная группа непептидильного полимера может быть связана с -NH2, расположенной на N-конце Fc-области иммуноглобулина, но это является лишь типичным воплощением.
При использовании здесь термин «предупреждение» относится ко всем типам действий, связанных с ингибированием или задержкой появления заболеваний, связанных с инсулином, посредством введения композиции, а термин «лечение» относится ко всем типам действий, связанных с улучшением или полезными изменениями симптомов заболеваний, связанных с инсулином, вследствие введения композиции.
При использовании здесь термин «введение» относится к введению определенного вещества пациенту подходящим способом. Композицию можно вводить обычным способом, позволяющим осуществлять доставку композиции в целевую ткань in vivo, например внутрибрюшинным, внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрикожным, пероральным, местным, интраназальным, внутрилегочным и интраректальным введением, но без конкретного ограничения этим.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель.
При использовании здесь термин «фармацевтически приемлемый» относится к свойствам присутствия достаточного количества для оказания терапевтического эффекта без нежелательных эффектов и может легко быть определен специалистом в данной области, исходя из факторов, хорошо известных в медицинской области, таких как тип заболевания, возраст, масса тела, состояние здоровья, пол пациента, его чувствительность к лекарственным средствам, путь введения, способ введения, частота введения, продолжительность лечения, лекарственное средство для смешивания или одновременного введения в комбинации и так далее.
Фармацевтически приемлемый носитель может включать: для перорального введения - связывающий агент, скользящий агент, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизирующий агент, диспергирующий агент, стабилизирующий агент, суспендирующий агент, краситель, корригент и так далее; для инъекций - забуферивающий агент, консервант, анальгетик, солюбилизирующий агент, изотонический агент, стабилизирующий агент и так далее, которые можно использовать в комбинации; и, для местного введения - основу, эксципиент, смазывающий агент, консервант и так далее. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена разными способами посредством сочетания с фармацевтически приемлемым носителем, как описано выше. Например, для перорального введения композиция может быть изготовлена в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и так далее. Для инъекций композиция может быть изготовлена в форме однодозовых ампул или многодозовых контейнеров. Композиция может также быть изготовлена в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций с длительным высвобождением и так далее.
В то же время, примеры носителей, эксципиентов и разбавителей, подходящих для композиции, могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и так далее. Кроме того, композиция может дополнительно содержать наполнитель, антикоагулянт, смазывающий агент, увлажнитель, корригент, эмульгатор, консервант и так далее.
Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в любой форме, выбранной из группы, состоящей из таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул, суспензий, жидких лекарственных средств для приема внутрь, эмульсий, сиропов, стерильных водных растворов, неводных растворителей, лиофилизированных композиций и суппозиториев.
Кроме того, конъюгат может быть использован посредством смешивания с различными фармацевтически приемлемыми носителями, такими как физиологический раствор или органические растворители. Для повышения стабильности или всасываемости могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, хелатирующие агенты, низкомолекулярные белки или другие стабилизаторы.
Вводимая доза и частота введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению определяются типом активного(ых) ингредиента(ов) и различными факторами, такими как заболевание, подлежащее лечению, путь введения, возраст, пол и масса тела пациента и тяжесть заболевания.
Общую эффективную доза композиции по настоящему изобретению можно вводить пациенту в виде одной дозы или можно вводить в течение длительного периода времени в виде множества доз в соответствии с протоколом фракционированного введения. Содержание активного(ых) ингредиента(ов) в фармацевтической композиции по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от тяжести заболевания. Конкретно, предпочтительная общая суточная доза конъюгата по настоящему изобретению может составлять приблизительно от 0,0001 мг до 500 мг на 1 кг массы тела пациента. Тем не менее, эффективную дозу конъюгата определяют с учетом различных факторов, включая возраст, массу тела, состояние здоровья и пол пациента, тяжесть заболевания, питание и скорость выведения, наряду с путем и частотой введения фармацевтической композиции. В этой связи, специалисты в данной области могут легко определить эффективную дозу, подходящую для конкретного применения композиции по настоящему изобретению. Для фармацевтической композиции по настоящему изобретению нет конкретных ограничений относительно состава и пути и способа введения, при условии, что она оказывает эффекты по настоящему изобретению.
Применительно к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат можно вводить одновременно, последовательно или в обратном порядке, но введение не ограничено этим.
Как описано выше, комбинированное введение может включать:
(а) введение (1) инсулина или его длительно действующего конъюгата и (2) глюкагона или его длительно действующего конъюгата в одной смеси; или
(б) введение каждого из (1) инсулина или его длительно действующего конъюгата и (2) глюкагона или его длительно действующего конъюгата в раздельной форме, но без ограничения этим.
При введении каждого из инсулина или его длительно действующего конъюгата и глюкагона или его длительно действующего конъюгата в раздельной форме инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат включают в раздельные препараты, которые затем вводят одновременно, по отдельности, последовательно или в обратном порядке.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащая инсулин и глюкагон.
Конкретно, композиция может содержать:
(1) инсулин и глюкагон;
(2) длительно действующий конъюгат инсулина, где инсулин и биологически совместимое вещество, способное увеличивать его период полувыведения in vivo, связаны друг с другом, и глюкагон;
(3) инсулин и длительно действующий конъюгат глюкагона, где глюкагон и биологически совместимое вещество, способное увеличивать его период полувыведения in vivo, связаны друг с другом; или
(4) длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат глюкагона.
Инсулин или глюкагон по настоящему изобретению может представлять собой инсулин или глюкагон, имеющий нативную последовательность, или может представлять собой его аналог, производное или фрагмент, полученные путем замены, добавления, делеции, модификации одной или более чем одной аминокислоты или их комбинации, как описано выше.
Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения гипогликемии по настоящему изобретению может содержать инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат и, таким образом, может оказывать эффект облегчения гипогликемии, возникающей как побочный эффект, вызванный введением инсулина, оказывая в то же время эффект подавления увеличения массы тела.
В одном типичном воплощении настоящего изобретения эффекты снижения глюкозы в крови, подавления увеличения массы тела и облегчения гипогликемии были подтверждены у мышей линии db/db, которым вводили композицию, содержащую инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат, и, таким образом, было продемонстрировано, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может сохранять эффективность инсулина, уменьшая в то же время его побочные эффекты.
Применительно к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат можно вводить в комбинации одновременно, последовательно или в обратном порядке, но без ограничения этим. Комбинированное введение является таким же, как описано выше.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложена композиция для уменьшения побочных эффектов инсулина, содержащая инсулин и глюкагон.
Конкретно, композиция может содержать:
(1) инсулин и глюкагон;
(2) длительно действующий конъюгат инсулина, где инсулин и биологически совместимое вещество, способное увеличивать его период полувыведения in vivo, связаны друг с другом, и глюкагон;
(3) инсулин и длительно действующий конъюгат глюкагона, где глюкагон и биологически совместимое вещество, способное увеличивать его период полувыведения in vivo, связаны друг с другом; или
(4) длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат глюкагона.
Инсулин или глюкагон по настоящему изобретению может представлять собой инсулин или глюкагон, имеющий нативную последовательность, или может представлять собой его аналог, производное или фрагмент, полученные путем замены, добавления, делеции, модификации одной или более чем одной аминокислоты или их комбинации, как описано выше.
Композиция для уменьшения побочных эффектов инсулина по настоящему изобретению может содержать инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат и, таким образом, может оказывать эффект уменьшения побочных эффектов, вызванных введением инсулина (например, гипогликемии или увеличения массы тела).
Применительно к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат можно вводить в комбинации одновременно, последовательно или в обратном порядке, но без ограничения этим. Комбинированное введение является таким же, как описано выше.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложена комплексная композиция для уменьшения гипогликемии у пациента с заболеванием, связанным с инсулином, содержащая:
(1) инсулин и глюкагон;
(2) длительно действующий конъюгат инсулина и глюкагон;
(3) инсулин и длительно действующий конъюгат глюкагона; или
(4) длительно действующий конъюгат инсулина и длительно действующий конъюгат глюкагона.
В одном конкретном воплощении комплексная композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель.
При использовании здесь термины «фармацевтически приемлемый» и «фармацевтически приемлемый носитель» являются такими же, как описано выше.
Комплексная композиция по настоящему изобретению может представлять собой комплексную композицию для лечения заболевания, связанного с инсулином, и может оказывать эффект облегчения побочных эффектов, вызванных введением инсулина (например, гипогликемии или увеличения массы тела). Конкретно, комплексная композиция может уменьшать гипогликемию, являющуюся побочным эффектом инсулина, и может также подавлять увеличение массы тела.
Комплексная композиция по настоящему изобретению может содержать инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат в массовом отношении от 0,1:1 до 100:1 или в молярном отношении от 1:1 до 30:1, от 1:1 до 20:1 или от 1:1 до 16:1, но без ограничения этим.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложен способ предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, включающий стадию введения (1) инсулина и глюкагона, (2) длительно действующего конъюгата инсулина и глюкагона, (3) инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона или (4) длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона индивиду с риском развития заболевания, связанного с инсулином, или с заболеванием, связанным с инсулином.
Стадию введения можно осуществлять посредством комбинированного введения (1) инсулина и глюкагона, (2) длительно действующего конъюгата инсулина и глюкагона, (3) инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона или (4) длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона. Вещества можно вводить одновременно, последовательно или в обратном порядке и вводить совместно в виде комбинации подходящих эффективных количеств, без ограничения конкретным способом или порядком введения. Кроме того, способ предупреждения или лечения по настоящему изобретению может представлять собой введение индивиду композиции или комплексной композиции, содержащих любое из (1)-(4), без ограничения этим. Инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат могут представлять собой отдельные композиции или комплексную композицию.
Композиция или комплексная композиция, содержащая инсулин или его длительно действующий конъюгат и глюкагон или его длительно действующий конъюгат, по настоящему изобретению может дополнять активность или функцию инсулина для существенного снижения глюкозы в крови, подавляя в то же время побочные эффекты инсулина, такие как увеличение массы тела и гипогликемия, оказывая посредством этого превосходные терапевтические эффекты на заболевания, связанные с инсулином.
Кроме того, композиция или комплексная композиция может быть изготовлена в виде однодозовой формы, подходящей для организма пациента, и, конкретно, в виде препарата, применимого для введения белковых лекарственных средств, способом, обычным для фармацевтической области, и можно вводить с применением способа введения, обычно применяемого в данной области, пероральным или парентеральным путем, таким как чрескожный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, интравентрикулярный, легочный, трансдермальный, подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, интрагастральный, местный, сублингвальный, вагинальный или ректальный, но без ограничения этим.
Способ по настоящему изобретению может включать введение фармацевтической композиции, содержащей пептид, в фармацевтически эффективном количестве. Общая суточная доза должна быть определена врачом в рамках надлежащей медицинской логики и введена за один раз или несколько раз в виде дробных доз. Применительно к задачам настоящего изобретения, у каждого конкретного пациента конкретную терапевтически эффективную дозу можно предпочтительно применять по-разному в зависимости от различных факторов, хорошо известных в области медицины, включая тип и степень ответа, которого необходимо достичь, конкретные композиции, в том числе периодическое совместное применение других агентов, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента, время и путь введения, скорость выведения композиции, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретной композицией, и сходные факторы, хорошо известные в медицинской области.
Для достижения настоящего изобретения согласно еще одному аспекту предложен способ уменьшения побочных эффектов инсулина, включающий стадию введения (1) инсулина и глюкагона, (2) длительно действующего конъюгата инсулина и глюкагона, (3) инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона или (4) длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона индивиду с риском развития заболевания, связанного с инсулином, или с заболеванием, связанным с инсулином.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение композиции или комплексной композиции в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с инсулином.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры. Тем не менее, следующие Примеры приведены лишь в целях наглядности, и объем настоящего изобретения не ограничен приведенными Примерами.
Пример 1: Получение аналогов глюкагона
Авторы настоящего изобретения имели намерение подтвердить терапевтические эффекты на диабет при комбинированном введении инсулина и глюкагона, а также определить возможность снижения риска гипогликемии, являющейся побочным эффектом инсулина, посредством такого комбинированного введения.
Соответственно, были получены нативный глюкагон и аналоги глюкагона, обладающие активностью, эквивалентной активности нативного глюкагона, как описано в Таблице 1 ниже. Аналоги глюкагона были синтезированы, как описано в публикациях патентов Кореи №№10-2016-0082482, 10-2017-003466 и 10-2018-0002544, и было проведено измерение их pI и активности in vitro.
В последовательностях, описанных в Таблице 1, аминокислота, представленная как X, представляет собой ненативную аминокислоту, аминоизомасляную кислоту (Aib), подчеркнутые аминокислотные остатки соответствуют образованию лактамного кольца между боковыми цепями соответствующих подчеркнутых аминокислот и «-» указывает на отсутствие аминокислотного остатка в соответствующем положении. Кроме того, в столбце, относящемся к образованию кольца, «-» указывает на отсутствие образования кольца в соответствующих последовательностях.
Пример 2: Получение аналогов инсулина
Авторы настоящего изобретения имели намерение получить аналоги инсулина для комбинированного введения с глюкагоном или его длительно действующим конъюгатом. Конкретно, аналоги, приведенные в Таблице 2 ниже, были получены, как описано в публикации патента Кореи №10-2014-0106452.
Изменение аминокислотной последовательности А-цепи или В-цепи и названия аналогов показаны в Таблице 2 ниже. То есть аналог 1 означает, что глицин в положении 1 А-цепи был заменен на аланин, а аналог 4 означает, что глицин в положении 8 В-цепи был заменен на аланин.
Последовательности ДНК и белковые последовательности каждого из аналогов инсулина 1-9 показаны в Таблице 3 ниже.
Кроме того, авторы настоящего изобретения получили аналоги инсулина, приведенные в Таблице 4 ниже, как описано в публикации патента Кореи №10-2017-0026284.
Последовательности ДНК и белковые последовательности каждого из аналогов инсулина 10 и 11 показаны в Таблице 5 ниже.
Кроме того, авторы настоящего изобретения получили аналоги инсулина, приведенные в Таблице 6 ниже. В подробностях, синтезировали прямые и обратные олигонуклеотиды (Таблица 7) для получения аналогов инсулина с одной модифицированной аминокислотой А-цепи или В-цепи с использованием вектора экспрессии природного инсулина в качестве матрицы и осуществляли ПЦР (полимеразную цепную реакцию), чтобы амплифицировать гены каждого из аналогов.
Праймеры для амплификации аналогов инсулина показаны в Таблице 7 ниже.
Для амплификации аналогов инсулина ПЦР осуществляли при условиях 18 циклов при 95°С в течение 30 сек, 55°С в течение 30 сек и 68°С в течение 6 мин. Фрагменты аналогов инсулина, полученные в описанных выше условиях, вводили в вектор pET22b для экспрессии в форме внутриклеточных телец включения, и полученные векторы экспрессии были названы pET22b-аналоги инсулина 12-24. Векторы экспрессии содержали нуклеотиды, кодирующие аминокислотные последовательности каждого из аналогов инсулина 12-24, под контролем промотора Т7. Белок каждого из аналогов инсулина экспрессировали в форме телец включения в клетках-хозяевах, содержащих вектор экспрессии.
Последовательности ДНК и белковые последовательности каждого из аналогов инсулина 12-24 показаны в Таблице 8 ниже.
Каждое изменение в последовательностях анализировали посредством секвенирования ДНК, и в результате было подтверждено, что последовательность каждого из аналогов инсулина была изменена предполагаемым образом.
Пример 3: Экспрессия рекомбинантного слитого пептида аналога инсулина
Экспрессию рекомбинантных аналогов инсулина осуществляли под контролем промотора Т7. Е. coli BL21-DE3 (Е. coli В F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3; Novagen) трансформировали каждым из рекомбинантных векторов экспрессии аналогов инсулина. Методику трансформации осуществляли в соответствии с рекомендациями Novagen. Каждую из отдельных колоний, трансформированных каждым из рекомбинантных векторов экспрессии, собирали, засевали в 2Х жидкую среду Лурия (Luria Broth, LB), содержащую ампициллин (50 мкг/мл), и инкубировали при 37°С в течение 15 часов. Культуральную жидкость рекомбинантного штамма смешивали с 2Х средой LB, содержащей 30% глицерина, в отношении 1:1 (об./об.), и каждый 1 мл указанной смеси вносили в криопробирки и хранили при 140°С, используя их затем в качестве исходных клеток для получения рекомбинантных слитых белков.
Для экспрессии рекомбинантных аналогов инсулина по 1 пробирке каждых исходных клеток размораживали, вносили в 500 мл 2Х жидкой среды Лурия (LB) и затем инкубировали с покачиванием при 37°С в течение 14-16 часов. Когда значение OD600 (оптическая плотность при 600 им) достигало 5,0 или более, культивирование прекращали и эту культуральную жидкость использовали в качестве посевной культуры. Посевную культуру засевали в 17 л ферментационной среды с использованием ферментера объемом 50 л (MSJ-U2, В.Е. MARUBISHI, Япония) и начинали первую периодическую ферментацию. Поддерживали следующие условия культивирования: температура 37°С, скорость потока воздуха 20 л/мин (1 об./об./мин), скорость покачивания 500 об/мин и рН 6,70 с использованием 30%-го раствора аммиака. Ферментацию осуществляли в режиме подпитки, добавляя подпитывающий раствор при уменьшении содержания питательных веществ в культуральной жидкости. Осуществляли мониторинг роста штамма по значению OD. При значении OD более 100 вносили IPTG в конечной концентрации 500 мкМ. После внесения культивирование осуществляли в течение еще 23-25 часов. После завершения культивирования рекомбинантные штаммы собирали с использованием центрифуги и хранили при -80°С до использования.
Пример 4: Выделение и рефолдинг рекомбинантных аналогов инсулина
Для перевода рекомбинантных аналогов инсулина, экспрессированных в Примере 3, в растворимые формы, осуществляли разрушение клеток с последующим рефолдингом. 100 г (влажная масса) клеточного осадка ресуспендировали в 1 л лизирующего буфера (50 мМ трис-HCl (рН 9,0), 1 мМ EDTA (рН 8,0), 0,2 М NaCl и 0,5% Triton Х-100). Клетки разрушали с использованием микрофлюидизатора (Microfluidic Corp., модель М-110ЕН-30) при рабочем давлении 15000 psi (103,4 МПа). Лизат разрушенных таким образом клеток центрифугировали при 7000 об/мин и 4-8°С в течение 20 минут. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 3 л промывочного буфера (0,5% Triton Х-100 и 50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 0,2 М NaCl, 1 мМ EDTA). После центрифугирования при 7000 об/мин и 4-8°С в течение 20 минут клеточный осадок ресуспендировали в дистиллированной воде с последующим центрифугированием таким же образом. Осадок отбирали и ресуспендировали в буфере (1 М L-глицин, 3,78 г L-цистеина-HCl, рН 10,6) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Для выделения ресуспендированного таким образом рекомбинантного аналога инсулина добавляли 8 М мочевину с последующим перемешиванием в течение 3-5 часов. Для рефолдинга солюбилизированых рекомбинантных аналогов инсулина осуществляли центрифугирование при 7000 об/мин и 4-8°С в течение 30 минут, получали супернатант и обрабатывали его восстанавливающим агентом (15 мМ L-цистеин-HCl) в течение 1 часа. К нему добавляли предопределенный множественный эквивалент дистиллированной воды с использованием перистальтического насоса с перемешиванием при 4-8°С в течение 12 часов или более.
Пример 5: Очистка посредством катионообменной хроматографии
Образец, подвергнутый рефолдингу, загружали на колонку SP FF (GE Healthcare), уравновешенную буфером с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащим 45% этанола, и затем белки аналогов инсулина элюировали в 10 объемов колонки линейным градиентом от 0% до 100%, используя буфер с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащий 0,5 М хлорида калия и 45% этанола.
Пример 6: Обработка трипсином и карбоксипептидазой В
Из элюированных образцов удаляли соли с использованием мембраны для ультрафильтрации и заменяли буфер на другой буфер (10 мМ трис-HCl, рН 8,0). В полученный образец белка добавляли трипсин в соответствии с молярным отношением приблизительно 30000 и карбоксипептидазу В в соответствии с молярным отношением приблизительно 30000, после чего это перемешивали при 4-8°С в течение 16 часов или более.
Пример 7: Очистка посредством катионообменной хроматографии
Образец, полученный в результате такого взаимодействия, загружали на колонку SP HP (GE Healthcare), уравновешенную буфером с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащим 45% этанола, и затем белки аналогов инсулина элюировали в 10 объемов колонки линейным градиентом от 0% до 100%, используя буфер с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащий 0,5 М хлорида калия и 45% этанола.
Пример 8: Очистка посредством хроматографии с обращенной фазой Для выделения чистого аналога инсулна из образца, полученного в Примере 7 образец загружали на Source 30RPC для хроматографии с обращенной фазой (GE Healthcare, США), уравновешенную буфером, содержащим фосфат натрия и изопропанол, и затем белки аналогов инсулина элюировали линейным градиентом, используя буфер, содержащий фосфат натрия и изопропанол.
Пример 9: Получение длительно действующих конъюгатов инсулина и глюкагона
Длительно действующие конъюгаты инсулина и глюкагона получали путем связывания инсулина и аналога глюкагона, полученного в Примерах, с Fc-областью иммуноглобулина с использованием полиэтиле игл иколя в качестве линкера, соответственно. Глюкагон, использованный при получении длительно действующего конъюгата глюкагона, представлял собой аналог, имеющий pI от 6 до 7 и активность in vitro, составляющую 200% или более по сравнению с активностью нативного глюкагона. Инсулин, использованный при получении длительно действующего конъюгата инсулина, представлял собой природный инсулин или аналог, полученный путем замены одной аминокислоты А-цепи природного инсулина.
В подробностях, для пегилирования N-конца В-цепи инсулина (Biocon, Индия) с использованием 3.4 K propion-ALD(2) PEG (ПЭГ с молекулярной массой 3,4 кДа, имеющий по одной пропиональдегидной группе на обоих концах, NOF, США) осуществляли взаимодействие инсулина и ПЭГ в молярном отношении 1:4 при концентрации инсулина 5 мг/мл и 4°С в течение приблизительно 2 часов. В данном случае взаимодействие осуществляли в смешанном растворителе из 50 мМ цитрата натрия (рН 5,0) и 45%-го изопропанола с добавлением 3 мМ цианборгидрида натрия (NaCNBH3) в качестве восстанавливающего агента. Реакционный раствор очищали на колонке SP-HP (GE Healthcare) с использованием буфера, содержащего цитрат натрия (рН 3,0) и 45% EtOH, и градиента концентрации KCl.
Затем для связывания инсулна-ПЭГ с N-концом Fc-фрагмента иммуноглобулина осуществляли взаимодействие очищенного монопегилированного инсулина с Fc-фрагментом иммуноглобулина в молярном отношении 1:1,2 при 25°С в течение 15 часов при общей концентрации белка 20 мг/мл. В данном случае в реакционный раствор добавляли 100 мМ HEPES-буфера (рН 8,2) с хлоридом натрия и 20 мМ цианборгидрида натрия в качестве восстанавливающего агента.
После завершения взаимодействия реакционный раствор загружали на колонку Q HP (GE, США) с градиентом концентрации буфера с трис-HCl (рН 7,5) и NaCl и загружали на Source 15ISO (GE, США) с градиентом концентрации сульфата аммония и трис-HCl (рН 7,5) для очистки конъюгата «инсулин - 3.4K PEG - Fc иммуноглобулина».
Далее, для получения длительно действующего конъюгата глюкагона, для пегилирования цистеинового остатка аналога глюкагона с использованием ПЭГ с молекулярной массой 10 кДа, имеющего малеимидную группу и альдегидную группу на обоих концах, то есть малеимид-ПЭГ-альдегида (10 кДа, NOF, Япония), осуществляли взаимодействие при молярном отношении аналога глюкагона к малеимид-ПЭГ-альдегиду от 1:1 до 1:5 и концентрации пептида от 3 мг/мл до 10 мг/мл в течение 1-3 часов при низкой температуре. В данном случае взаимодействие осуществляли в среде, в которую были добавлены 50 мМ трис-буфер (рН 7,5) и от 20% до 60% изопропанола. После завершения взаимодействия реакционный раствор загружали на SP Sepharose HP (GE Healthcare, США) для очистки производного глюкагона, монопегилированного по цистеину.
Затем очищенный таким образом монопегилированный аналог глюкагона и Fc иммуноглобулина подвергали взаимодействию в молярном отношении от 1:2 до 1:10 при концентрации белка от 10 мг/мл до 50 мг/мл и 4-8°С в течение 12-18 часов. Взаимодействие осуществляли в среде, где в буфер со 100 мМ фосфатом калия (рН 6,0) были добавлены от 10 мМ до 50 мМ цианборгидрида натрия в качестве восстанавливающего агента и от 10% до 20% изопропанола. После завершения взаимодействия реакционный раствор загружали на колонку для очистки Butyl Sepharose FF (GE Healthcare, США) и колонку для очистки Source ISO (GE Healthcare, США), чтобы очистить конъюгат, содержащий аналог глюкагона и Fc иммуноглобулина.
Пример 10: Изучение эффекта снижения глюкозы в крови при комбинированном введении глюкагона и инсулина крысам DIO/STZ
Длительно действующие конъюгаты глюкагона и природного инсулина, полученные в Примере 9, вводили крысам DIO/STZ, являющимся известной моделью ожирения и диабета 2-го типа. Для изучения эффекта снижения глюкозы в крови при комбинированном введении длительно действующих конъюгатов глюкагона и природного инсулина исследуемые группы были разделены на контроль с носителем, введение длительно действующего конъюгата инсулина самого по себе (53,9 нмоль/кг (2997 мкг/кг), один раз в 3 суток (Q3D)) и комбинированное введение длительно действующего конъюгата инсулина (53,9 нмоль/кг, Q3D) и длительно действующего конъюгата глюкагона (3,4 нмоль/кг (182 мкг/кг), Q3D), и каждое из соответствующих веществ вводили многократно подкожно в течение 2 недель. При многократном введении в течение 2 недель у каждой крысы брали кровь из хвостовой вены и затем измеряли изменения глюкозы в крови с использованием глюкометра (OneTouch® Ultra®).
В результате многократного введения длительно действующего конъюгата инсулина в течение 2 недель высокие уровни глюкозы в крови, отмеченные в группе контроля с носителем, снижались до нормальных и гипогликемических уровней (70 мг/дл или менее) (ФИГ. 1). Эти результаты показывают, что высокие дозы инсулина оказывали эффект снижения глюкозы в крови, но могли приводить к гипогликемии. В отличие от этого, при комбинированном введении длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона глюкоза в крови нормализовалась без стойкой гипогликемии.
Кроме того, изменения глюкозы в крови в течение периода введения оценивали количественно по площади под кривой (AUC) и анализировали, как показано на ФИГ. 2. В результате, при комбинированном введении длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона комбинированное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона не оказывало существенного влияния на общий эффект длительно действующего конъюгата инсулина по снижению глюкозы в крови, в то же время предупреждая гипогликемию, являющуюся побочным эффектом введения длительно действующего конъюгата инсулина (ФИГ. 2). Эти результаты показывают, что комбинированное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона может поддерживать эффективность снижения глюкозы в крови, в то же время снижая риск гипогликемии, вызванной длительно действующим конъюгатом инсулина.
Пример 11: Эффект уменьшения побочных эффектов инсулина при комбинированном введении глюкагона и инсулина крысам DIO/STZ
Длительно действующий конъюгат природного инсулина, использованный в Примере 10, также имеет побочный эффект увеличения массы тела, наряду с гипогликемией, как и другие длительно действующие инсулины.
Действительно, как показано на ФИГ. 3, при многократном введении длительно действующего конъюгата инсулина мышам DIO/STZ в течение 2 недель было отмечено существенное увеличение массы тела по сравнению с группой контроля с носителем. Тем не менее, при комбинированном введении длительно действующего конъюгата глюкагона и длительно действующего конъюгата инсулина увеличение массы тела было нейтрализовано и было отмечено уменьшение массы тела по сравнению с группой контроля с носителем. Эти результаты показывают, что комбинированное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона может облегчать гипогликемию и увеличение массы тела, являющиеся побочными эффектами введения длительно действующего конъюгата инсулина.
Описанные выше типичные воплощения подтвердили, что комбинированное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона может подавлять побочные эффекты (гипогликемию и увеличение массы тела), вызванные введением инсулина, обеспечивая в то же время эффект снижения глюкозы в крови. Таким образом, было подтверждено, что комбинированное введение длительно действующего конъюгата инсулина и длительно действующего конъюгата глюкагона по настоящему изобретению может не только оказывать терапевтический эффект на заболевания, связанные с инсулином, но также уменьшать гипогликемию и побочные эффекты инсулина.
На основании приведенного выше описания специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в различных конкретных формах без изменения его технической идеи или основных признаков. В этой связи, следует понимать, что во всех аспектах описанные выше воплощения приведены для наглядности и не являются ограничивающими. Объем изобретения определен в приложенной формуле изобретения, но не в предшествующем описании, и поэтому подразумевают, что формула изобретения включает все изменения и модификации, не выходящие за рамки границ и пределов формулы изобретения или эквивалентов таких границ и пределов.
--->
<110> HANMI PHARM. CO., LTD.
<120> A pharmaceutical composition comprising insulin and glucagon
<130> OPA19305
<150> KR 10-2018-0167798
<151> 2018-12-21
<160> 125
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<400> 2
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys
1 5 10 15
Asp Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<400> 3
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys
1 5 10 15
Glu Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<400> 4
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<400> 5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Glu Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<400> 6
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Glu Ala Asp Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 7
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<400> 7
Tyr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Glu Ala Asp Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 8
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 8
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Ile Asn Thr
20 25
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 9
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ala Gln Asp Phe Val Val Trp Leu Ile Asn Thr
20 25
<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 10
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ala Asp Asp Phe Val Val Trp Leu Ile Asn Thr
20 25
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 11
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Cys Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 12
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 13
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 13
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Cys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 14
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 14
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 15
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 15
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Cys Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Gln Asp Phe Val Val Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 16
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Val Phe Val Gln Trp Leu Met Arg Thr
20 25
<210> 17
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 17
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys
1 5 10 15
Val Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Arg Thr
20 25
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 18
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Cys Asp Phe Arg Leu Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 19
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Cys Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 20
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 21
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Cys Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 22
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Cys Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 23
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Cys Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 24
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 25
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 25
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Cys Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 26
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 26
Trp Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 27
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Val Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 28
Trp Xaa Gln Gly Thr Phe Val Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Cys Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 29
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 29
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 30
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 30
Trp Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 31
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(21)
<223> аминокислоты в положениях 17 и 21 образуют кольцо
<400> 31
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 32
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(19)
<223> аминокислоты в положениях 15 и 19 образуют кольцо
<400> 32
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Cys
1 5 10 15
Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 33
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 33
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 34
Trp Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Cys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 35
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 35
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Cys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 36
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 37
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 38
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Cys Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 39
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 39
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Val Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 40
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Val Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 41
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо
<400> 41
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Cys Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 42
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 42
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Cys Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 43
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 43
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 44
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 45
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<400> 45
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Cys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa представляет собой гистидин, дезаминогистидил,
N-диметилгистидил, бета-гидроксиимидазопропионил,
4-имидазоацетил, бета-карбоксиимидазопропионил, триптофан или
тирозин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой альфа-метилглутаминовую кислоту,
аминоизомасляную кислоту (Aib), D-аланин, глицин,
Sar (N-метилглицин), серин или D-серин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> Xaa представляет собой треонин, валин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)
<223> Xaa представляет собой тирозин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa представляет собой лизин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)
<223> Xaa представляет собой тирозин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa представляет собой лейцин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)
<223> Xaa представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую
кислоту или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa представляет собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую
кислоту, серин, альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин или
отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)
<223> Xaa представляет собой аспарагиновую кислоту, глутамин,
глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, серин, цистеин или
валин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)
<223> Xaa представляет собой аланин, аспарагиновую кислоту, глутамин,
глутаминовую кислоту, аргинин, валин или цистеин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa представляет собой аланин, аргинин, серин, валин или цистеин
или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)
<223> Xaa представляет собой лизин, гистидин, глутаминовую кислоту,
глутамин, аспарагиновую кислоту, аргинин,
альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa представляет собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую
кислоту, лейцин, валин или цистеин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)
<223> Xaa представляет собой изолейцин, валин или аргинин или
отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)
<223> Xaa представляет собой валин, аргинин, аланин, цистеин,
глутаминовую кислоту, лизин, глутамин, альфа-метилглутаминовую
кислоту или лейцин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa представляет собой изолейцин, валин, аланин, лизин,
метионин, глутамин или аргинин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa представляет собой глутамин, лизин, аспарагин или аргинин
или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa представляет собой цистеин или отсутствует
<400> 46
Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Trp Leu Xaa Xaa Thr Xaa
20 25 30
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> производное глюкагона
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> Xaa представляет собой треонин, валин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)
<223> Xaa представляет собой тирозин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa представляет собой лизин или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)
<223> Xaa представляет собой аспарагиновую кислоту или цистеин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa представляет собой глутаминовую кислоту или серин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)
<223> Xaa представляет собой лизин или аргинин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)
<223> Xaa представляет собой глутамин или лизин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую
кислоту
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)
<223> Xaa представляет собой валин или глутамин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa представляет собой цистеин или отсутствует
<400> 47
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Xaa Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Arg Ala Xaa Xaa Phe Val Xaa Trp Leu Met Asn Thr Xaa
20 25 30
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог инсулина, A-цепь
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин,
глутаминовую кислоту или аспарагин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa представляет собой аланин или изолейцин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин,
гистидин или аспарагин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa представляет собой аланин, серин, глутамин, глутаминовую
кислоту, гистидин или аспарагин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту,
гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин,
глутаминовую кислоту или аспарагин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa представляет собой аланин, тирозин, серин, глутаминовую
кислоту, гистидин, треонин или аспарагин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин
<400> 48
Xaa Xaa Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Xaa
20
<210> 49
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог инсулина, B-цепь
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)
<223> Xaa представляет собой аланин или глицин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту, серин,
треонин или аспарагиновую кислоту или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)
<223> Xaa представляет собой глицин или аланин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)
<223> Xaa представляет собой аланин или фенилаланин
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)
<223> Xaa представляет собой аланин, фенилаланин, аспарагиновую
кислоту или глутаминовую кислоту или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa представляет собой треонин или отсутствует
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или
аспарагиновую кислоту или отсутствует
<400> 49
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Xaa Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 1
<400> 50
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtgcgat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 51
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 1
<400> 51
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Ala Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 52
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 2
<400> 52
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcgc ggtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 53
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 2
<400> 53
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ala Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 54
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 3
<400> 54
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaacg cgtgcaac 258
<210> 55
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 3
<400> 55
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Ala Cys Asn
85
<210> 56
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 4
<400> 56
ttcgttaacc aacacttgtg tgcgtcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 57
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 4
<400> 57
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Ala Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 58
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 5
<400> 58
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgagcgt tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 59
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 5
<400> 59
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Ala Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 60
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 6
<400> 60
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggcg cgttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 61
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 6
<400> 61
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 62
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 7
<400> 62
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgcgtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 63
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 7
<400> 63
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 64
<211> 261
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 8
<400> 64
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaacag 240
ctggagaact actgcaactg a 261
<210> 65
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 8
<400> 65
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 66
<211> 261
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 9
<400> 66
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaaccag 240
ctggagaact actgcaactg a 261
<210> 67
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 9
<400> 67
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 68
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 10
<400> 68
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag 120
gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180
ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct cgaacagctg 240
gagaactact gcaactga 258
<210> 69
<211> 85
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 10
<400> 69
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu
20 25 30
Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly
35 40 45
Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
50 55 60
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
65 70 75 80
Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 70
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 11
<400> 70
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag 120
gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180
ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct cgcccagctg 240
gagaactact gcaactga 258
<210> 71
<211> 85
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 11
<400> 71
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu
20 25 30
Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly
35 40 45
Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
50 55 60
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln Leu
65 70 75 80
Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 72
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 72
cagcatctgc tccctccatc agctggagaa ctac 34
<210> 73
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 73
gtagttctcc agctgatgga gggagcagat gctg 34
<210> 74
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 74
cagcatctgc tccctcaagc agctggagaa ctac 34
<210> 75
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 75
gtagttctcc agctgcttga gggagcagat gctg 34
<210> 76
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 76
ctaccagctg gagaacgagt gcaactgagg atcc 34
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 77
ggatcctcag ttgcactcgt tctccagctg gtag 34
<210> 78
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 78
ctaccagctg gagaactcct gcaactgagg atcc 34
<210> 79
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 79
ggatcctcag ttgcaggagt tctccagctg gtag 34
<210> 80
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 80
ctaccagctg gagaacacct gcaactgagg atcc 34
<210> 81
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 81
ggatcctcag ttgcaggtgt tctccagctg gtag 34
<210> 82
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 82
ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg gaac 34
<210> 83
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 83
gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34
<210> 84
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 84
ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg gaac 34
<210> 85
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 85
gttccccgca cactagggag agagcttcca ccag 34
<210> 86
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 86
ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg gaac 34
<210> 87
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 87
gttccccgca cactagggtg agagcttcca ccag 34
<210> 88
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 88
cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34
<210> 89
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 89
gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34
<210> 90
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 90
cagcatctgc tccctcgacc agctggagaa ctac 34
<210> 91
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 91
gtagttctcc agctggtcga gggagcagat gctg 34
<210> 92
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 92
ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg gaac 34
<210> 93
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 93
gttccccgca cactaggtcg agagcttcca ccag 34
<210> 94
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 94
ggggaacgag gcttcgacta cacacccaag acc 33
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 95
ggtcttgggt gtgtagtcga agcctcgttc ccc 33
<210> 96
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 96
ggggaacgag gcttcgagta cacacccaag acc 33
<210> 97
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 97
ggtcttgggt gtgtactcga agcctcgttc ccc 33
<210> 98
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 12
<400> 98
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctccatcag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 99
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 12
<400> 99
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu His Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 100
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 13
<400> 100
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaagcag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 101
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 13
<400> 101
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Lys Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 102
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 14
<400> 102
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaacg agtgcaac 258
<210> 103
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 14
<400> 103
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Glu Cys Asn
85
<210> 104
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 15
<400> 104
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact cctgcaac 258
<210> 105
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 15
<400> 105
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Ser Cys Asn
85
<210> 106
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 16
<400> 106
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaaca cctgcaac 258
<210> 107
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 16
<400> 107
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Thr Cys Asn
85
<210> 108
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 17
<400> 108
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 109
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 17
<400> 109
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 110
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 18
<400> 110
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 111
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 18
<400> 111
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 112
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 19
<400> 112
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcaccct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 113
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 19
<400> 113
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 114
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 20
<400> 114
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgcccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 115
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 20
<400> 115
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 116
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 21
<400> 116
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 117
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 21
<400> 117
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asp Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 118
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 22
<400> 118
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 119
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 22
<400> 119
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 120
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 23
<400> 120
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgactacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 121
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 23
<400> 121
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Asp Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 122
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 24
<400> 122
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcgagtacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaac 258
<210> 123
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аналог 24
<400> 123
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 124
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 125
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ИММУНОЦИТОКИНЫ НА ОСНОВЕ IL-15 И IL-15Rα ДОМЕНА SUSHI | 2012 |
|
RU2763298C2 |
| Комплекс аналога инсулина со сниженной аффинностью к инсулиновому рецептору и его применение | 2018 |
|
RU2779462C2 |
| ЭЛЕМЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ИЛ-1 БЕТА | 2013 |
|
RU2711118C2 |
| Композиция для лечения гиперлипидемии, содержащая производное оксинтомодулина | 2013 |
|
RU2768853C1 |
| Аналоги инсулина с пониженной аффинностью к рецептору инсулина и их применение | 2017 |
|
RU2764197C1 |
| ПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, НАРУШЕНИЙ ИЛИ СОСТОЯНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С МУТАНТНЫМ р53 | 2017 |
|
RU2762089C2 |
| АНТИТЕЛА К C10ORF54 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2819627C1 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ОБЪЕДИНЯЮЩАЯ АНТИ-CD26 АНТИТЕЛО И ДРУГОЕ ПРОТИВОРАКОВОЕ СРЕДСТВО | 2016 |
|
RU2742953C2 |
| Конъюгат, содержащий оксинтомодулин и фрагмент иммуноглобулина, и его применение | 2012 |
|
RU2733544C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ О-АЦЕТИЛИРОВАННОГО ГАНГЛИОЗИДА GD2 ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ | 2017 |
|
RU2771173C2 |
Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической комбинации, композиции для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином. Фармацевтическая комбинация для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон, где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата, где конъюгат представлен следующей химической формулой 1: X-La-F, где X представляет собой инсулин или глюкагон; L представляет собой полиэтиленгликоль; а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим; F представляет собой Fc-область иммуноглобулина, способную увеличивать период полувыведения X in vivo; и «-» представляет собой ковалентную или нековалентную связь, и где указанная комбинация содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1. Фармацевтическая комбинация для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащая инсулин и глюкагон, где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата, где конъюгат представлен химической формулой 1 (см. выше) и где указанная фармацевтическая комбинация содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1. Комбинация для уменьшения побочных эффектов инсулина, содержащая инсулин и глюкагон, где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата, где конъюгат представлен химической формулой 1 (см. выше) и где указанная комбинация содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1. Комплексная композиция для уменьшения гипогликемии у пациента с заболеванием, связанным с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон, где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата, где конъюгат представлен химической формулой 1 (см. выше) и где указанная комплексная композиция содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1. Вышеописанные комбинации и композиция эффективно облегчают гипогликемию, подавляют увеличение массы тела, оказывая в то же время терапевтический эффект на заболевания, связанные с инсулином, уменьшают побочные эффекты конъюгата инсулина длительного действия. 4 н. и 35 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 11 пр.
1. Фармацевтическая комбинация для предупреждения или лечения заболевания, связанного с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон,
где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата,
где конъюгат представлен следующей химической формулой 1:
[химическая формула 1]
X-La-F,
где в химической формуле 1:
X представляет собой инсулин или глюкагон;
L представляет собой полиэтиленгликоль;
а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим;
F представляет собой Fc-область иммуноглобулина, способную увеличивать период полувыведения X in vivo; и
«-» представляет собой ковалентную или нековалентную связь, и
где указанная комбинация содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1.
2. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где заболевание, связанное с инсулином, выбрано из группы, состоящей из инсулинорезистентного заболевания, диабета, гипергликемии и ожирения.
3. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где глюкагон представляет собой нативный глюкагон или глюкагон, полученный путем изменения одной или более чем одной аминокислоты нативного глюкагона, выбранного из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации и их комбинации.
4. Фармацевтическая комбинация по п. 3, где глюкагон содержит аминокислотную последовательность следующей общей формулы 1:
X1-X2-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T-X30 (общая формула 1, SEQ ID NO: 46), где в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой альфа-метилглутаминовую кислоту (α-метилглутаминовую кислоту), Aib (аминоизомасляную кислоту), D-аланин, глицин (G), Sar (N-метилглицин), серин (S) или D-серин;
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), аспарагиновую кислоту (D), серин (S), альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин (С) или отсутствует;
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серин (S), цистеин (С) или валин (V) или отсутствует;
Х18 представляет собой аланин (А), аспарагиновую кислоту (D), глутамин (Q), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R), валин (V) или цистеин (С) или отсутствует;
Х19 представляет собой аланин (А), аргинин (R), серин (S), валин (V) или цистеин (С) или отсутствует;
Х20 представляет собой лизин (K), гистидин (Н), глутаминовую кислоту (Е), глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D), аргинин (R), альфа-метилглутаминовую кислоту или цистеин (С) или отсутствует;
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), валин (V) или цистеин (С) или отсутствует;
Х23 представляет собой изолейцин (I), валин (V) или аргинин (R) или отсутствует;
Х24 представляет собой валин (V), аргинин (R), аланин (А), цистеин (С), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), глутамин (Q), альфа-метилглутаминовую кислоту или лейцин (L) или отсутствует;
Х27 представляет собой изолейцин (I), валин (V), аланин (А), лизин (K), метионин (М), глутамин (Q) или аргинин (R) или отсутствует;
Х28 представляет собой глутамин (Q), лизин (K), аспарагин (N) или аргинин (R) или отсутствует; и
Х30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует (при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 1 является такой же, как SEQ ID NO: 1 или 12, он исключен).
5. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой серин (S) или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серин (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серин (S), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D), лизин (K) или цистеин (С);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), валин (V) или цистеин (С);
Х23 представляет собой изолейцин (I), валин (V) или аргинин (R);
Х24 представляет собой валин (V), аргинин (R), аланин (А), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), глутамин (Q) или лейцин (L);
Х27 представляет собой изолейцин (I), валин (V), аланин (А), метионин (М), глутамин (Q) или аргинин (R);
Х28 представляет собой глутамин (Q), лизин (К), аспарагин (N) или аргинин (R); и
Х30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
6. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой серин (S) или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой цистеин (С), треонин (Т) или валин (V);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серин (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), валин (V) или цистеин (С);
Х23 представляет собой валин (V);
Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q);
Х27 представляет собой метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
Х30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
7. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой цистеин (С), треонин (Т) или валин (V);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серин (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой лизин (K), аргинин (R), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (К);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) или цистеин (С);
Х23 представляет собой валин (V);
Х24 представляет собой глутамин (Q);
Х27 представляет собой метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
Х30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
8. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой серин (S) или Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х13 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х14 представляет собой лейцин (L) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серин (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), лизин (K), аргинин (R), серин (S), цистеин (С) или валин (V);
Х18 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аргинин (R) или цистеин (С);
Х19 представляет собой аланин (А) или цистеин (С);
Х20 представляет собой глутамин (Q), аспарагиновую кислоту (D) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е);
Х23 представляет собой валин (V);
Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q);
Х27 представляет собой изолейцин (I) или метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
Х30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует.
9. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где в общей формуле 1:
X1 представляет собой тирозин (Y);
Х2 представляет собой Aib (аминоизомасляную кислоту);
Х7 представляет собой треонин (Т);
Х10 представляет собой тирозин (Y);
Х12 представляет собой лизин (K);
Х13 представляет собой тирозин (Y);
Х14 представляет собой лейцин (L);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е), серин (S) или цистеин (С);
Х17 представляет собой лизин (K) или аргинин (R);
Х18 представляет собой аргинин (R);
Х19 представляет собой аланин (А);
Х20 представляет собой глутамин (Q), цистеин (С) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D), цистеин (С), валин (V) или глутаминовую кислоту (Е);
Х23 представляет собой валин (V) или аргинин (R);
Х24 представляет собой глутамин (Q) или лейцин (L);
Х27 представляет собой метионин (М);
Х28 представляет собой аспарагин (N) или аргинин (R); и
Х30 отсутствует.
10. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где глюкагон содержит аминокислотную последовательность следующей общей формулы 2:
Y-Aib-QGTF-X7-SD-X10-S-X12-Y-L-X15-X16-X17-R-A-X20-X21-F-V-X24-W-L-M-N-T-X30 (общая формула 2, SEQ ID NO: 47),
где в общей формуле 2:
Х7 представляет собой треонин (Т), валин (V) или цистеин (С);
Х10 представляет собой тирозин (Y) или цистеин (С);
Х12 представляет собой лизин (K) или цистеин (С);
Х15 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или цистеин (С);
Х16 представляет собой глутаминовую кислоту (Е) или серин (S);
Х17 представляет собой лизин (K) или аргинин (R);
Х20 представляет собой глутамин (Q) или лизин (K);
Х21 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е);
Х24 представляет собой валин (V) или глутамин (Q); и
Х30 представляет собой цистеин (С) или отсутствует,
при условии, что, когда аминокислотная последовательность общей формулы 2 является такой же, как SEQ ID NO: 12, он исключен.
11. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где каждая из одной или более чем одной пары аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24 и Х24 и Х28 общей формулы 1 образует кольцо между соответствующими аминокислотами.
12. Фармацевтическая комбинация по п. 11, где каждая аминокислота одной или более чем одной пары аминокислот из пар аминокислот Х10 и Х14, Х12 и Х16, Х16 и Х20, Х17 и Х21, Х20 и Х24 и Х24 и Х28 общей формулы 1 заменена на глутаминовую кислоту или лизин, которые способны образовывать кольцо.
13. Фармацевтическая комбинация по п. 4, где глюкагон содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-11, 25, 27, 29, 31, 33 и 35-45.
14. Фармацевтическая комбинация по п. 13, где глюкагон содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
15. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где инсулин представляет собой нативный инсулин или инсулин, полученный путем изменения одной или более чем одной аминокислоты нативного инсулина, выбранного из группы, состоящей из замены, добавления, делеции, модификации и их комбинации.
16. Фармацевтическая комбинация по п. 15, где инсулин представляет собой инсулин, полученный путем замены на другую аминокислоту или делеции одной или более чем одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2, аминокислоты в положении 3, аминокислоты в положении 5, аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 10, аминокислоты в положении 12, аминокислоты в положении 16, аминокислоты в положении 23, аминокислоты в положении 24, аминокислоты в положении 25, аминокислоты в положении 26, аминокислоты в положении 27, аминокислоты в положении 28, аминокислоты в положении 29 и аминокислоты в положении 30 В-цепи природного инсулина и аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2, аминокислоты в положении 5, аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 10, аминокислоты в положении 12, аминокислоты в положении 14, аминокислоты в положении 16, аминокислоты в положении 17, аминокислоты в положении 18, аминокислоты в положении 19 и аминокислоты в положении 21 А-цепи природного инсулина.
17. Фармацевтическая комбинация по п. 15, где инсулин содержит А-цепь с SEQ ID NO: 48, представленную следующей общей формулой 3, и В-цепь с SEQ ID NO: 49, представленную следующей общей формулой 4:
[общая формула 3]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (SEQ ID NO: 48),
где в общей формуле 3:
Xaa1 представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа2 представляет собой аланин или изолейцин;
Хаа5 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин или аспарагин;
Хаа12 представляет собой аланин, серин, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин;
Хаа14 представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин;
Хаа16 представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа19 представляет собой аланин, тирозин, серин, глутаминовую кислоту, гистидин, треонин или аспарагин; и
Хаа21 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин;
[общая формула 4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr (SEQ ID NO: 49),
где в общей формуле 4:
Хаа8 представляет собой аланин или глицин;
Хаа16 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту, серин, треонин или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
Хаа23 представляет собой глицин или аланин;
Хаа24 представляет собой аланин или фенилаланин;
Хаа25 представляет собой аланин, фенилаланин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или отсутствует;
Хаа27 представляет собой треонин или отсутствует; и
Хаа28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует (при условии, что, когда пептид содержит А-цепь с SEQ ID NO: 124 и В-цепь с SEQ ID NO: 125, он исключен).
18. Фармацевтическая комбинация по п. 17, где инсулин получен путем замены на аланин одной или более чем одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты в положении 8, аминокислоты в положении 23, аминокислоты в положении 24 и аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина и аминокислоты в положении 1, аминокислоты в положении 2 и аминокислоты в положении 19 А-цепи природного инсулина, или замены на глутаминовую кислоту или аспарагин аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина.
19. Фармацевтическая комбинация по п. 18, где инсулин содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 и 67.
20. Фармацевтическая комбинация по п. 17, где инсулин получен путем замены на глутаминовую кислоту аминокислоты в положении 16 В-цепи природного инсулина, делеции аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина или замены на глутаминовую кислоту или аланин аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина.
21. Фармацевтическая комбинация по п. 20, где инсулин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69 или 71.
22. Фармацевтическая комбинация по п. 17, где инсулин получен путем замены на глутаминовую кислоту, серин, треонин или аспарагиновую кислоту аминокислоты в положении 16 В-цепи природного инсулина, замены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту аминокислоты в положении 25 В-цепи природного инсулина, замены на гистидин, лизин, аланин или аспарагиновую кислоту аминокислоты в положении 14 А-цепи природного инсулина или замены на глутаминовую кислоту, серин или треонин аминокислоты в положении 19 А-цепи природного инсулина.
23. Фармацевтическая комбинация по п. 22, где инсулин содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 и 123.
24. Фармацевтическая комбинация по п. 17, где инсулин представлен в форме двух полипептидных цепей, состоящих из А-цепи с SEQ ID NO: 48, представленной общей формулой 3, и В-цепи с SEQ ID NO: 49, представленной общей формулой 4.
25. Фармацевтическая комбинация по п. 24, где А-цепь и В-цепь связаны друг с другом посредством дисульфидной связи.
26. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где F представляет собой Fc-область IgG (иммуноглобулина G).
27. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где Fc-область иммуноглобулина является агликозилированной.
28. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где Fc-область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из: (а) домена СН1, домена СН2, домена СН3 и домена СН4; (б) домена СН1 и домена СН2; (в) домена СН1 и домена СН3; (г) домена СН2 и домена СН3; (д) комбинации одного, или двух, или более доменов из домена СН1, домена СН2, домена СН3 и домена СН4 и шарнирной области иммуноглобулина или части указанной шарнирной области; и (е) димера каждого домена константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.
29. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область иммуноглобулина, где удалена область, способная образовывать дисульфидную связь, где удалена часть аминокислот(ы) на N-конце нативного Fc, где к N-концу нативного Fc присоединен метиониновый остаток, где удален сайт связывания комплемента или где удален сайт антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
30. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина, происходящий из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.
31. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где Fc-область иммуноглобулина представляет собой гибрид домена, имеющего разное происхождение, происходящего из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.
32. Фармацевтическая комбинация по п. 1, где инсулин и глюкагон вводят в комбинации одновременно, последовательно или в обратном порядке.
33. Фармацевтическая комбинация для предупреждения или лечения гипогликемии, содержащая инсулин и глюкагон,
где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата,
где конъюгат представлен следующей химической формулой 1:
[химическая формула 1]
X-La-F,
где в химической формуле 1:
X представляет собой инсулин или глюкагон;
L представляет собой полиэтиленгликоль;
а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим;
F представляет собой Fc-область иммуноглобулина, способную увеличивать период полувыведения X in vivo; и
«-» представляет собой ковалентную или нековалентную связь,
где указанная фармацевтическая комбинация содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1.
34. Фармацевтическая комбинация по п. 33, где инсулин и глюкагон вводят в комбинации одновременно, последовательно или в обратном порядке.
35. Комбинация для уменьшения побочных эффектов инсулина, содержащая инсулин и глюкагон,
где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата,
где конъюгат представлен следующей химической формулой 1:
[химическая формула 1]
X-La-F,
где в химической формуле 1:
X представляет собой инсулин или глюкагон;
L представляет собой полиэтиленгликоль;
а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим;
F представляет собой Fc-область иммуноглобулина, способную увеличивать период полувыведения X in vivo; и
«-» представляет собой ковалентную или нековалентную связь,
где указанная комбинация содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1.
36. Комбинация по п. 35, где инсулин и глюкагон вводят в комбинации одновременно, последовательно или в обратном порядке.
37. Комплексная композиция для уменьшения гипогликемии у пациента с заболеванием, связанным с инсулином, содержащая инсулин и глюкагон,
где инсулин связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон связан с биологически совместимым веществом, способным увеличивать его период полувыведения in vivo, в форме длительно действующего конъюгата,
где конъюгат представлен следующей химической формулой 1:
[химическая формула 1]
X-La-F,
где в химической формуле 1:
X представляет собой инсулин или глюкагон;
L представляет собой полиэтиленгликоль;
а представляет собой 0 или натуральное число, при условии, что, когда а представляет собой 2 или более, каждый L независим;
F представляет собой Fc-область иммуноглобулина, способную увеличивать период полувыведения X in vivo; и
«-» представляет собой ковалентную или нековалентную связь,
где указанная комплексная композиция содержит инсулин в форме длительно действующего конъюгата и глюкагон в форме длительно действующего конъюгата в массовом соотношении от 0,1:1 до 100:1.
38. Комплексная композиция по п. 37, где гипогликемия представляет собой побочный эффект инсулина.
39. Комплексная композиция по п. 37, подавляющая увеличение массы тела.
| WO 2004060387 A1, 22.07.2004 | |||
| WO 2017003191 A1, 05.01.2017 | |||
| WO 2018143729 A1, 09.08.2018 | |||
| WO 2018165294 A1, 13.09.2018 | |||
| WO 2006004696 A2, 12.01.2006 | |||
| WO 2018004283 A2, 04.01.2018. |
