Рекомбинантный микроорганизм с контролируемой экспрессией NADH:хинон оксидоредуктазы и способ получения O-фосфосерина, цистеина и его производного с использованием этого микроорганизма Российский патент 2025 года по МПК C12N15/70 C12N9/02 C12N9/10 C12P13/06 C12P13/12 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму с контролируемой экспрессией NADH:хинон-оксидоредуктазы и к способу получения О-фосфосерина, цистеина и производных цистеина с использованием этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

L-цистеин представляет собой аминокислоту, которая играет важную роль в метаболизме серы у всех живых организмов. Его используют в синтезе белков, таких как кератин волос и тому подобные, глутатиона, биотина, метионина и других серосодержащих метаболитов, и также он служит в качестве предшественника для биосинтеза коэнзима А. Известные способы получения L-цистеина с использованием микроорганизмов включают: 1) способ биологического превращения D,L-2-аминотиазолин-4-карбоновой кислоты в L-цистеин с использованием микроорганизмов, 2) способ получения L-цистеина путем прямой ферментации с использованием Е. coli (ЕР 0885962 В; Wada, М. and Takagi, Н., Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006) и 3) способ получения О-фосфосерина путем ферментации с использованием микроорганизмов, и превращения О-фосфосерина в L-цистеин путем проведения реакции между O-фосфосерином и сульфидом при каталитическом действии O-фосфосерин-сульфгидрилазы (US 2012-0190081 А1).

В частности, для продукции цистеина способом 3) с высоким выходом предшественник, О-фосфосерин, необходимо получить в избыточном количестве.

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая задача

Техническая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить рекомбинантный микроорганизм с регулируемой экспрессией NADH:хинон-оксидоредуктазы и способ получения O-фосфосерина, цистеина и производных цистеина с использованием этого микроорганизма.

Техническое решение

Одна задача настоящего изобретения заключается в предоставлении рекомбинантного микроорганизма рода Escherichia, обладающего повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы и O-фосфосерин-продуцирующей способностью.

Другая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа получения O-фосфосерина, включающего культивирование O-фосфосерин-продуцирующего микроорганизма по настоящему изобретению в среде.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа получения цистеина или его производного, включающего:

а) культивирование O-фосфосерин-продуцирующего микроорганизма с повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы в среде с получением О-фосфосерина или среды, содержащей О-фосфосерин; и

б) взаимодействие О-фосфосерина, полученного на стадии (а), или среды, содержащей O-фосфосерин, с сульфидом в присутствии O-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего указанную O-фосфосерин-сульфгидрилазу.

Полезные эффекты изобретения

OPS(O-фосфосерин)-продуцирующий микроорганизм, обладающий повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы, по настоящему изобретению может продуцировать OPS с высокой эффективностью.

Подробное изложение предпочтительных воплощений

Далее настоящее изобретение описано более подробно. Между тем, каждое описание и воплощение, раскрытое здесь, можно применять к каждому другому описанию и воплощению. То есть, объем настоящего изобретения охватывает все комбинации различных элементов, раскрытых здесь. Далее, объем настоящего изобретения не ограничен определенным описанием, раскрытым ниже. Дополнительно, несколько статей и патентных документов процитировано в настоящем описании. Содержание процитированных статей и патентных документов включено сюда посредством ссылки во всей своей полноте, и уровень техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, и содержание настоящей заявки далее описано более подробно.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен O-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм, обладающий повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы.

Как его используют здесь, термин "О-фосфосерин" (здесь и далее, "OPS") относится к сложному эфиру фосфорной кислоты и серина, который служит составным компонентом для многих белков. В частности, OPS представляет собой предшественник L-цистеина и может быть превращен в цистеин путем проведения реакции с сульфидом при каталитическом действии OPS-сульфгидрилазы (здесь и далее, "OPSS"), но не ограничиваясь этим (US 2012-0190081 А1).

Как его используют здесь, термин "NADH:хинон-оксидоредуктаза" (здесь и далее, "Nuo") относится к ферменту, который уменьшает количество хинона в мембране клетки путем окисления NADH в электронно-транспортной цепи микроорганизмов. Белок-фермент также может быть обозначен как NADH-дегидрогеназа-1 (NDH-1). Ген, кодирующий этот белок, может представлять собой, например, кластер генов nuoABCEFGHIJKLMN, но не ограничиваясь этим. Кластер генов nuoABCEFGHIJKLMN составляет оперон nuo, и его экспрессию может регулировать промотор перед опероном и полинуклеотид в сайте связывания с рибосомой. В настоящем изобретении термин "ген nuoABCEFGHIJKLMN" можно использовать взаимозаменяемо с выражением "ген, кодирующий NADH:хинон-оксидоредуктазу", "ген nuoABCEFGHIJKLMN", "оперон nuo" и "ген nuo".

В настоящем изобретении термин "оперон" относится к функциональной единице ДНК, включающей группу генов, экспрессия которых регулируется одной последовательностью регуляции экспрессии, в частности, одним промотором. мРНК, транскрибируемая с оперона, может представлять собой полицистроиную мРНК, в которой одна молекула мРНК кодирует один или более чем один белок, или моноцистронную мРНК, в которой одна молекула мРНК кодирует один белок.

Nuo представляет собой комплекс из 13 белковых субъединиц (NuoA, NuoB, NuoC, NuoE, NuoF, NuoG, NuoH, Nuol, NuoJ, NuoK, NuoL, NuoM, NuoN). Два типа оперонов, nuoABCEFGHIJKL и nuoMN используют в качестве матрицы при трансляции каждой белковой субъединицы. Структуру оперона nuo можно найти в ЕсоСус (www.biocyc.org) (No. доступа EG12082). Известно, что оперон nuo включает структурный ген и область регуляции экспрессии. Термин "область регуляции экспрессии" в отношении оперона nuo относится к области, расположенной выше по ходу транскрипции от структурного гена, составляющего оперон nuo, и, следовательно, способной регулировать экспрессию этого структурного гена. Область регуляции экспрессии оперона nuo может включать промотор (промотор nuoA и/или промотор nuoM), исключая структурный ген и оператор, и, в частности, может включать промотор.

Оперон nuo может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%, или более чем 99% гомологии или идентичности с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 38. В частности, оперон nuo может включать структурный ген, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 - 38 или последовательность, гомологичную или идентичную этой последовательности и проявляющую соответствующую функцию; область регуляции экспрессии, которая регулирует экспрессию последовательности структурного гена. Последовательности SEQ ID NO: 26 - 38 можно подтвердить по известной базе данных NCBI Genbank.

В частности, оперон nuo может представлять собой нуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 1 и/или имеющей 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%, или более чем 99% гомологии или идентичности с SEQ ID NO: 1. Кроме того, очевидно, что любая нуклеотидная последовательность, часть которой делетирована, модифицирована, заменена или добавлена, также может попадать в объем настоящего изобретения при условии, что нуклеотидная последовательность обладает указанной степенью гомологии или идентичности и проявляет функцию, соответствующую функции оперона nuo.

Как его используют здесь, термин "гомология или идентичность" относится к степени соответствия между двумя данными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и она может быть выражена в процентах. Термины "гомология" и "идентичность" часто можно использовать взаимозаменяемо друг с другом.

Гомологию или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов или полипептидов можно определить с помощью стандартных алгоритмов выравнивания и можно использовать штраф за пропуск, установленный используемой программой по умолчанию. По существу, обычно ожидают, что гомологичные или идентичные последовательности гибридизуются по всей длине или по меньшей мере примерно на 50%, 60%, 70%, 80% или 90% всей длины последовательностей в умеренно строгих или очень строгих условиях. Также учитывают полинуклеотиды, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующихся полинуклеотидах.

Степень гомологии или идентичности полипептидных или полинуклеотидных последовательностей можно определить, например, с помощью алгоритма BLAST согласно описанию в литературе (смотрите Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)), или FASTA от Pearson (смотрите Methods Enzymol, 183, 63, 1990). Ha основании алгоритма BLAST разработана программа, известная как BLASTN или BLASTX (смотрите: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Далее, обладают ли какие-либо аминокислотные или полинуклеотидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью друг с другом, можно определить путем сравнения этих последовательностей в эксперименте с гибридизацией по Саузерну в заданных строгих условиях, и заданные подходящие условия гибридизации находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники, и их можно легко определить способом, хорошо известным специалисту в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology).

Микроорганизм по настоящему изобретению не ограничен по типу при условии, что он может продуцировать OPS, и может представлять собой любой прокариотический или эукариотический микроорганизм, в частности прокариотический микроорганизм. Прокариотический микроорганизм может включать штаммы микроорганизмов, принадлежащих роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Cory neb acterium и роду Brevibacterium, в частности штаммы микроорганизма, принадлежащего роду Escherichia, и более конкретно Escherichia coli, но не ограничиваясь ими. В частности, в случае, когда микроорганизм принадлежит роду Escherichia, OPS и L-серин могут продуцироваться с помощью SerA, SerC и SerB, представляющих собой ферменты пути биосинтеза L-серина (Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, Vol.3, 2012 October; Wendisch V. F. et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P. et al, Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1(11):7 139-44).

Термин "О-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм" по настоящему изобретению относится к микроорганизму, обладающему естественной способностью продуцировать О-фосфосерин, или микроорганизму, где способность продуцировать О-фосфосерин придана родительскому штамму, не обладающему способностью продуцировать О-фосфосерин. В частности, микроорганизм может представлять собой О-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм с повышенной активностью Nuo, вызванной природной или искусственной генетической модификацией. Для задач настоящего изобретения О-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, способный продуцировать О-фосфосерин путем повышения активности Nuo способом, раскрытым в настоящем изобретении. В настоящем изобретении термин "О-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "микроорганизм, продуцирующий О-фосфосерин" или "микроорганизм, обладающий способностью продуцировать О-фосфосерин".

В одном воплощении О-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой генетически модифицированный микроорганизм или рекомбинантный микроорганизм, у которого активность Nuo повышена, вследствие чего повышается желаемая О-фосфосерин-продуцирующая способность, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "повышение активности" белка означает, что активность белка увеличена по сравнению с его эндогенной активностью. Термин "эндогенная активность" относится к активности определенного белка, изначально присутствующего у родительского штамма до трансформации или у немодифицированного микроорганизма, когда признак изменен путем генетической модификации, вызванной природными или искусственными факторами, и его можно использовать взаимозаменяемо с термином "активность до модификации". Термин "увеличение" при сравнении активности белка с его эндогенной активностью обозначает, что активность белка повышена по сравнению с активностью определенного белка, изначально присутствующего у родительского штамма до трансформации или у немодифицированного микроорганизма. Например, родительский штамм может представлять собой Escherichia coli АТСС27325. В другом примере родительский штамм может представлять собой штамм, включающий модификацию для увеличения OPS-продуцирующей способности, например, СА07-0012 (КССМ 11212Р; US 2012-0190081 А) или СА07-4821, но не ограничиваясь этим.

"Повышение активности" может быть достигнуто путем введения чужеродного белка или путем повышения активности эндогенного белка и может, в частности, быть достигнуто путем повышения активности эндогенного белка. Повышение активности белка можно подтвердить по повышению уровня активности белка, уровня экспрессии или количества продукта, продуцированного с участием этого белка.

Повышение активности может быть осуществлено различными способами, хорошо известными в данной области техники, и эти способы не ограничены при условии, что они обеспечивают повышение активности белка-мишени по сравнению с этой активностью у микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать хорошо известные специалисту в данной области техники методы генетической инженерии и/или белковой инженерии, представляющие собой общепринятые методы молекулярной биологии, но способ не ограничен ими (например, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и так далее).

В настоящем изобретении белок, направленный на повышение активности, то есть, целевой белок, может представлять собой Nuo, но белок не ограничен этим при условии, что он представляет собой "белок, образующий протон-движущую силу путем потребления NADH" или "белок, потребляющий NADH", и оба белка закодированы опероном nuo.

Повышение активности Nuo по настоящему изобретению может включать повышение активности одной или более чем одной из белковых субъединиц, составляющих белковый комплекс Nuo.

В частности, повышение активности белка по настоящему изобретению может быть достигнуто путем:

1) увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего белок;

2) модификации области регуляции экспрессии гена, кодирующего белок на хромосоме;

3) модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего белок;

4) модификации аминокислотной последовательности, приводящей к повышению активности белка;

5) модификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей белок, приводящей к повышению активности белка (например, модификации последовательности гена, кодирующего белок, приводящей к кодированию белка, модифицированного с повышением активности);

6) введения чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность белка, или кодон-оптимизированного варианта полинуклеотида этого полинуклеотида;

7) кодон-оптимизации полинуклеотида, кодирующего белок;

8) анализа третичной структуры белка и на основе этого анализа выбора и модификации сайта экспозиции или химической модификации этого сайта; или

9) комбинации двух или более чем двух методик, выбранных из вышеизложенных пунктов 1 - 8), но не ограничиваясь этим.

В частности, 1) способ увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего белок, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения вектора, функционально связанного с геном, кодирующим белок, и способного реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина, в клетку-хозяина. Дополнительно, способ можно осуществить путем введения вектора, функционально связанного с геном и способным вставлять этот ген в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "вектор" относится к ДНК-конструкции, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, функционально связанный с подходящей регуляторной последовательностью, так чтобы обеспечить возможность экспрессии целевого белка в подходящей клетке-хозяине. Последовательность регуляции экспрессии может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящую мРНК сайта связывания с рибосомой, и последовательность регуляции терминации транскрипции и трансляции. После трансформации подходящей клетки-хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может интегрировать в геном хозяина.

Вектор, используемый в настоящем изобретении, специально не ограничен при условии, что он может реплицироваться, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A и так далее; и в качестве плазмидного вектора можно использовать векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pSK, pSKH и pET и так далее. В частности можно использовать векторы pCL, pSK, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC.

Вставку полинуклеотида в хромосому можно выполнять любым способом, известным в данной области техники, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "трансформация" относится к введению рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина так, чтобы белок, кодируемый этим полинуклеотидом, мог экспрессироваться в клетке-хозяине. При условии, что полинуклеотид, которым трансформировали, может экспрессироваться в клетке-хозяине, не имеет значения, интегрирован ли полинуклеотид, которым трансформировали, в хромосому клетки-хозяина и расположен на ней, или он расположен экстрахромосомно, и оба случая могут быть включены. Способ трансформации вектором включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку и может быть выбран из подходящих стандартных методов, известных в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, трансформацию можно проводить путем электропорации, осаждения фосфатом кальция (CaPO₄), осаждения хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекции, полиэтиленгликолевым методом (PEG), DEAE-декстрановым методом, катионно-липосомным методом, методом с ацетатом лития-DMSO и так далее, но способ не ограничен этими.

Далее, как его используют здесь, термин "функционально связанный" обозначает, что полинуклеотидная последовательность функционально связана с промоторной последовательностью или областью регуляции экспрессии, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению. Функциональную связь можно выполнять с использованием технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известной в данной области техники, и сайт-специфическое разрезание и сшивание ДНК можно выполнять с использованием ферментов для разрезания и сшивания и так далее, известных в данной области техники, но не ограничиваясь этим.

2) Способ модификации последовательности регуляции экспрессии гена, кодирующего белок на хромосоме, может быть выполнен любым способом, известным в данной области техники, например, путем индуцирования модификации в этой последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в этой последовательности нуклеиновой кислоты или их комбинации для дополнительного повышения активности последовательности регуляции экспрессии, или путем замены этой последовательности на последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую более сильной активностью, или путем вставки такой последовательности. Последовательность регуляции экспрессии может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и так далее, но специально не ограничиваясь этим. В частности, способ может включать вставку сильного гетерологичного промотора ниже по ходу транскрипции от исходного промотора, но не ограничиваясь этим.

Примеры известного сильного промотора могут включать промоторы CJ1 - CJ7 (US 7662943 B2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор фага лямбда PR, промотор PL, промотор tet и промотор rmf и так далее, но не ограничиваясь ими, и может включать все замены на более сильный промотор по сравнению эндогенным промотором.

3) Способ модификации нуклеотидной последовательности инициирующего кодона или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего белок, можно выполнять любым способом, известным в данной области техники, например, путем замены эндогенного инициирующего кодона белка на другой инициирующий кодон, обеспечивающий более высокий уровень экспрессии этого белка по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничиваясь этим.

Способы модификации аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности 4) и 5) можно осуществить любым способом, известным в данной области техники, например, путем индуцирования модификации в этой последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в этой полинуклеотидной последовательности или комбинации вышеперечисленного для дополнительного повышения активности полинуклеотидной последовательности, или путем замены этой последовательности на полинуклеотидную последовательность, модифицированную так, чтобы иметь более сильную активность. Эту замену можно осуществить, в частности, путем вставки гена в хромосому путем гомологичной рекомбинации, но не ограничиваясь этим.

Используемый здесь вектор может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер предназначен для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть, для подтверждения вставки гена, предназначенного для введения, и можно использовать маркеры, обеспечивающие селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных белков, но селектируемый маркер не ограничен этими. Только клетки, экспрессирующие селективный маркер, способны выживать или демонстрировать отличающиеся фенотипы в условиях окружающей среды, обработанной агентом селекции, что позволяет отбирать трансформированные клетки.

6) Способ введения чужеродного полинуклеотида, обеспечивающего активность белка, можно выполнять любым способом, известным в данной области техники, например, путем введения в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего белок, проявляющий такую же активность как указанный белок или близкую активность, или кодон-оптимизированного варианта этого полинулеотида. Чужеродный белок можно использовать без ограничения независимо от его происхождения или последовательности при условии, что он проявляет такую же активность как этот белок или близкую активность. Дополнительно, введенный в клетку-хозяина чужеродный полинуклеотид может быть кодон-оптимизирован, так чтобы обеспечить оптимальную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине. Введение может выполнять специалист средней квалификации в данной области техники путем выбора соответствующего способа трансформации, известного в данной области техники, и экспрессия введенного полинуклеотида в клетке-хозяине обеспечивает возможность продукции белка, тем самым увеличивая его активность.

7) Способ кодон-оптимизации полинуклеотида, кодирующего белок, может быть выполнен путем кодон-оптимизации эндогенного полинуклеотида для повышения уровня транскрипции или трансляции в клетке-хозяине или путем оптимизации его кодонов таким образом, чтобы обеспечить возможность оптимизированной транскрипции и трансляции чужеродного полинуклеотида в клетке-хозяине.

8) Способ анализа третичной структуры белка и на основе этого анализа выбора и модификации сайта экспозиции или химической модификации сайта экспозиции, может быть выполнен, например, путем сравнения информации о последовательности анализируемого полипептида с базой данных, в которой хранится информация об известных белках, для определения образцов белков-кандидатов в соответствии со степенью сходства последовательностей, и, соответственно, подтверждения структуры на основе этой информации, для выбора и трансформации или модификации сайта экспозиции, подлежащего модификации, или его химической модификации.

В одном воплощении повышение активности белка можно выполнить любым одним или более чем одним способом из вышеизложенных пунктов 1) - 2).

В любом из вышеизложенных воплощений повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по настоящему изобретению может представлять собой увеличение экспрессии оперона nuo. В любом из вышеизложенных воплощений повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы может включать последовательность регуляции экспрессии гена с повышенной активностью, находящуюся выше по ходу транскрипции от гена, кодирующего эту NADH:хинон-оксидоредуктазу. В частности, положение "выше по ходу транскрипции от гена, кодирующего NADH:хинон-оксидоредуктазу" может быть выше по ходу транскрипции от гена nuoA. В одном воплощении повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы может представлять собой повышение уровня экспрессии одного или более чем одного структурного гена, присутствующего в опероне, например 2 или более чем 2, 3 или более чем 3 или всей последовательности структурных генов вследствие модификации одной последовательности регуляции экспрессии, присутствующей в опероне nuo, кодирующем белковый комплекс Nuo. В частности, модификация последовательности регуляции экспрессии может представлять собой дополнительную вставку последовательности регуляции экспрессии гена с повышенной активностью между эндогенным промотором оперона nuo и геном nuoA; например, последовательность регуляции экспрессии гена может представлять собой промотор, но не ограничиваясь этим.

Такое повышение активности белка может означать, что активность белка или его концентрация увеличена по сравнению с активностью или концентрацией белка, экспрессируемого у микроорганизма дикого типа или у микроорганизма до модификации, или что количество продукта, продуцированного с участием этого белка, увеличено, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" не исключает штамм, содержащий мутацию, которая может произойти естественным путем у микроорганизма, и может относиться к самому штамму природного типа или штамму до изменения признака вследствие генетической модификации, вызванной природными или искусственными факторами. В настоящем изобретении модификация признаков может представлять собой повышение активности Nuo. Термины "штамм до модификации" или "микроорганизм до модификации" можно использовать взаимозаменяемо с терминами "немутированный штамм", "немодифицированный штамм", "немутированный микроорганизм", "немодифицированный микроорганизм" или "референтный микроорганизм".

Микроорганизм по настоящему изобретению обеспечивает дополнительное повышение способности продуцировать OPS и/или способности выводить OPS из клетки; или может включать модификации, повышающие способность расщеплять и/или потреблять OPS.

Примеры модификаций, повышающих способность продуцировать OPS и/или способность экспортировать OPS из клеток или повышать способность расщеплять и/или потреблять OPS, могут включать понижение активности фосфосерин фосфатазы (SerB), усиление активности фосфосерин-экспортирующего белка (YhhS) или комбинацию этих модификаций, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "понижение" в отношении активности полипептида представляет собой комплексное понятие, включающее как активность, сниженную относительно его эндогенной активности, так и отсутствие активности. Термин "понижение активности" можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, понижение, снижение, уменьшение активности и так далее.

"Понижение активности" также может включать случай, когда собственная активность полипептида уменьшена по сравнению с активностью полипептида, исходно присутствующего у микроорганизма, или устранена вследствие мутации полинуклеотида, кодирующего этот полипептид; случай, когда общий уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) внутриклеточного полипептида понижен(а) по сравнению с природным штаммом вследствие ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего этот полипептид, или ингибирования его трансляции в полипептид и так далее; случай, когда полинуклеотид совсем не экспрессируется; и/или случай, когда активность полипептида не наблюдается даже при экспрессии полинуклеотида. Как его используют здесь, термин "эндогенная активность" относится к активности определенного полипептида, исходно присутствующего у родительского штамма до трансформации, микроорганизма дикого типа или немодифицированного микроорганизма, когда признак изменен вследствие генетической модификации, вызванной природными или искусственными факторами, и его можно использовать взаимозаменяемо с выражением "активность до модификации". Выражение "активность полипептида "подавлена недостаточна, уменьшена, подвержена понижающей регуляции, снижена или ослаблена" при сравнении с эндогенной активностью этого полипептида обозначает, что активность полипептида уменьшена относительно активности определенного полипептида, исходно присутствующего у родительского штамма до трансформации или у немодифицированного микроорганизма.

Понижение активности полипептида можно получить любым способом, известным в данной области техники, но способ не ограничен этим, и его можно достичь путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники (например, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793; Sambrook et al. Molecular Cloning 2012; и так далее).

В частности, понижение активности полипептида по настоящему изобретению можно получить путем:

1) делетирования части гена или всего гена, кодирующего этот полипептид;

2) модификации области регуляции экспрессии (последовательности регуляции экспрессии), с тем чтобы понизить уровень экспрессии гена, кодирующего этот полипептид;

3) модификации аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, с тем чтобы устранить или ослабить активность этого полипептида (например, введения делеции/замены/добавления одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотную последовательность);

4) модификации последовательности гена, кодирующего полипептид, с тем чтобы устранить или ослабить активность этого полипептида (например, введения делеции/замены/добавления одного или более чем одного нуклеотида в нуклеотидную последовательность гена полипептида для кодирования полипептида, модифицированного с устранением или понижением активности полипептида);

5) модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид;

6) введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавления последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно (SD), на переднем конце последовательности SD гена, кодирующего полипептид, для образования вторичной структуры, приводящей к ингибированию присоединения рибосомы;

8) конструирования с помощью обратной транскрипции, посредством которого добавляют промотор, предназначенный для обратной транскрипции, на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид, или

9) комбинации двух или более чем двух способов, выбранных из 1) - 8) выше, но специально не ограничиваясь этим.

Например:

1) Способ делетирования части гена или всего гена, кодирующего полипептид, может быть выполнен путем делетирования всего полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой полипептид, на хромосоме или путем замены этого полинуклеотида на полинуклеотид с делецией части нуклеотидов или на ген-маркер.

2) Способ модификации области регуляции экспрессии (последовательности регуляции экспрессии) может быть выполнен путем введения модификации в область регуляции экспрессии (последовательность регуляции экспрессии) путем введения делеции, инсерции, неконсервативной замены или консервативной замены или их комбинации; или путем замены последовательности на последовательность, обладающую более слабой активностью. Область регуляции экспрессии может включать промотор; последовательность оператора; последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность для регуляции транскрипции и трансляции, но не ограничиваясь ими.

Далее, 5) способ модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид, может быть выполнен, например, путем замены этой нуклеотидной последовательности на нуклеотидную последовательность, кодирующую другой инициирующий кодон, обеспечивающий более низкий уровень экспрессии полипептида, чем эндогенный инициирующий кодон, но не ограничиваясь этим.

3) и 4) Способы модификации аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности могут быть выполнены путем введения модификации в последовательность путем делеции, инсерции, неконсервативной или консервативной замены в аминокислотной последовательности полипептида или полинуклеотидной последовательности, кодирующей этот полипептид, или их комбинации для понижения активности полипептида, или путем замены последовательности на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для понижения активности, или аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для устранения активности, но не ограничиваясь этим. Например, экспрессия гена может быть ингибирована или понижена путем введения мутации в полинуклеотидную последовательность для образования стоп-кодона, но не ограничиваясь этим.

6) Способ введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующим полипептид, можно найти в литературе (Weintraub, Н. et at, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986).

7) Способ добавления последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно (SD) на переднем конце последовательности SD гена, кодирующего полипептид, для образования вторичной структуры, таким образом обеспечивающий ингибирование присоединения рибосомы путем ингибирования трансляции мРНК или уменьшения его скорости.

8) Конструирование с помощью обратной транскрипции (RTE), при котором добавляют промотор, предназначенный для обратной транскрипции, на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид, можно выполнить путем создания антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующему этот полипептид, для понижения его активности.

SerB по настоящему изобретению обладает активностью по превращению OPS в L-серин, и следовательно микроорганизм, модифицированный для ослабления активности SerB, обладает свойством накапливать в себе OPS, таким образом, являясь полезным для продукции OPS. SerB по настоящему изобретению может представлять собой белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, или включающий такую последовательность, или может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, или по существу состоящий из этой последовательности, но не ограничиваясь этим. Дополнительно SerB по настоящему изобретению может иметь или включать аминокислотную последовательность, имеющую 70%, 80%, 90%, 95% или 99% или более чем 99% гомологии или идентичности аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, при условии, что он проявляет активность SerB. Более того, SerB по настоящему изобретению может состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, имеющей 70%, 80%, 90%, 95% или 99% или более чем 99% гомологии или идентичности аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь этим. Дополнительно полинуклеотид, кодирующий SerB, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, или включать такую последовательность. Далее, полинуклеотид, кодирующий SerB, может состоять или по существу состоять из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид, кодирующий SerB, по настоящему изобретению может подвергаться различным модификациям в кодирующей области в объеме, при котором не изменяется аминокислотная последовательность белка SerB вследствие вырожденности генетического кода или с учетом кодонов, предпочтительных для организма, предназначенного для экспрессии белка SerB. Полинуклеотид, кодирующий SerB, по настоящему изобретению может иметь нуклеотидную последовательность, имеющую 70%, 80%, 90%, 95% или 99% или более чем 99% и менее чем 100% гомологии или идентичности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 или включать такую последовательность. Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий SerB, по настоящему изобретению может состоять или по существу состоять из нуклеотидной последовательности, имеющей 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%, или более чем 99% и менее чем 100% гомологии или идентичности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, но не ограничиваясь этим.

YhhS по настоящему изобретению обладает активностью по экспортированию OPS, и следовательно микроорганизм, модифицированный для усиления активности YhhS, обладает свойством экспортировать OPS, таким образом, являясь полезным для продукции OPS. YhhS по настоящему изобретению может представлять собой белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4, или включающий такую последовательность, или может представлять собой белок, состоящий или по существу состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, но не ограничиваясь этим. Дополнительно YhhS по настоящему изобретению может иметь аминокислотную последовательность, имеющую 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%, или более чем 99% гомологии или идентичности аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, или включать такую последовательность при условии, что он проявляет активность YhhS. Более того, YhhS по настоящему изобретению может состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, имеющей 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%, или более чем 99% гомологии или идентичности аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, но не ограничиваясь этим. Дополнительно, полинуклеотид, кодирующий YhhS, может иметь нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4, или включать такую последовательность. Далее, полинуклеотид, кодирующий YhhS, может состоять или по существу состоять из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4. Полинуклеотид, кодирующий YhhS, по настоящему изобретению может претерпевать различные модификации в кодирующей области в объеме, при котором не изменяется аминокислотная последовательность белка YhhS вследствие вырожденности генетического кода или с учетом кодонов, предпочтительных для организма, предназначенного для экспрессии белка YhhS. Полинуклеотид, кодирующий YhhS, по настоящему изобретению может иметь нуклеотидную последовательность, имеющую 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%, или более чем 99% и менее чем 100% гомологии или идентичности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или включать такую последовательность. Дополнительно полинуклеотид, кодирующий YhhS, по настоящему изобретению может состоять или по существу состоять из нуклеотидной последовательности, имеющей 70%, 80%, 90%, 95%, или 99%, или более чем 99% и менее чем 100% гомологии или идентичности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, но не ограничиваясь этим.

В одном воплощении микроорганизм, включающий модификации для усиления способности продуцировать OPS и/или способности экспортировать OPS из клетки; или усиливать способность расщеплять и/или потреблять OPS, может представлять собой СА07-0012 (КССМ11212Р; US 2012-0190081 А) или СА07-4821, но не ограничиваясь этим. Что касается состава OPS-продуцирующего микроорганизма дополнительно к вышеизложенному в настоящем изобретении можно использовать описание патента KR No. 1381048 или заявки US No. 2012-0190081 в качестве ссылки.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения OPS, включающий культивирование OPS-продуцирующего микроорганизма с повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы в среде.

Микроорганизм является таким, как описано выше.

Как его используют здесь, термин "культивирование" обозначает выращивание микроорганизма по настоящему изобретению в подходящим образом контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению можно проводить в подходящей культуральной среде и в условиях культивирования, известных в данной области техники. Специалист в данной области техники легко может наладить такой процесс культивирования в соответствии со штаммом, который нужно выбрать. В частности, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и/или периодическое культивирование с подпиткой, но не ограничиваясь этим.

Среда для культивирования микроорганизма может дополнительно содержать глицин и серии. Глицин может быть представлен в форме очищенного глицина, глицинсодержащего дрожжевого экстракта или триптона. Концентрация глицина, содержащегося в среде, обычно составляет от 0,1 г/л до 10 г/л и, в частности, от 0,5 г/л до 3 г/л. Дополнительно, серии может быть предоставлен в форме очищенного серина, серинсодержащего дрожжевого экстракта или триптона. Концентрация серина, содержащегося в среде, обычно составляет от 0,1 г/л до 5 г/л, и в частности от 0,1 г/л до 1 г/л.

Примеры источника углерода, содержащегося в среде, могут включать сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь ими.

Примеры источника азота, содержащегося в среде, может включать органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт и бобовая мука; и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь ими.

Примеры источников фосфора, содержащихся в среде, могут включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрийсодержащие соли, но не ограничиваясь ими.

Дополнительно культуральная среда может включать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, и может дополнительно включать аминокислоты, витамины и подходящие предшественники. Эти культуральные среды или предшественники можно добавлять в культуру при периодическом культивировании или при непрерывном культивировании, но не ограничиваясь этим.

рН культуры можно регулировать путем добавления такого соединения как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота при культивировании подходящим образом. Дополнительно, образование пены во время культивирования можно предупреждать с помощью пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирных кислот. Далее, газ кислород или кислородсодержащий газ можно вводить в культуру для поддержания аэробных условий в культуре; или газ азот, газ водород или углекислый газ можно вводить или можно не вводить никакой газ для поддержания анаэробных или микроаэробных условий. Температура в культуре может находиться в диапазоне от 25 до 40°С, в частности, от 30 до 35°С. Культивирование можно продолжать до получения нужного количества полезного вещества, и в частности от 10 до 100 часов, но не ограничиваясь этими иллюстративными примерами.

Настоящее изобретение может дополнительно включать стадию получения среды перед стадией культивирования в способе по настоящему изобретению, но не ограничиваясь этим.

Способ может дополнительно включать стадию выделения OPS из культуральной среды или из микроорганизма. Стадию выделения можно дополнительно включать после стадии культивирования.

В способе выделения OPS по настоящему изобретению желаемый OPS можно выделять из культурального раствора с использованием подходящих методов, известных в данной области техники, в зависимости от способа культивирования. Например, можно использовать такие методы как центрифугирование, фильтрование, ионообменная хроматография, кристаллизация и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография), и желаемый OPS можно выделять из среды или из микроорганизма с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.

Далее, стадия выделения может дополнительно включать процесс очистки, который можно выполнять с помощью подходящего способа, известного в данной области техники. Таким образом, выделенный OPS может находиться в очищенном состоянии или в среде ферментации микроорганизмов, содержащей OPS. Дополнительно выделение OPS можно эффективно выполнять путем добавления подходящего способа, известного в данной области техники, до и после стадии культивирования и до и после стадии выделения.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения цистеина или его производного, включающий:

а) культивирование О-фосфосерин-продуцирующего микроорганизма с повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы в среде с получением О-фосфосерина или среды, содержащей О-фосфосерин; и

б) взаимодействие О-фосфосерина, полученного на стадии (а) или среды, содержащей этот О-фосфосерин, с сульфидом в присутствии О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего О-фосфосерин-сульфгидрилазу.

Стадии (а) и (б) не обязательно ограничены по порядку, то есть их можно выполнять непрерывно или последовательно, и может отсутствовать промежуток времени между этими стадиями, и эти стадии можно выполнять одновременно или с интервалом в несколько секунд, несколько минут, несколько часов, несколько суток.

В частности, способ может представлять собой способ получения цистеина или его производного: включая культивирование OPS-продуцирующего микроорганизма с повышенной активностью Nuo в среде для получения OPS или в среде, содержащей OPS; и взаимодействие О-фосфосерина, полученного на стадии (а), или среды, содержащей О-фосфосерин, с сульфидом в присутствии О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего эту О-фосфосерин-сульфгидрилазу. Повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы и О-фосфосерин-продуцирующий микроорганизм являются такими, как описано выше.

Как его используют здесь, термин "производное" относится к близкородственным соединениям, полученным путем химической модификации части любого соединения. Обычно этот термин относится к соединениям, в которых атом водорода или определенная группа атомов заменен(а) на другой атом или группу атомов.

Как его используют здесь, термин "производное цистеина" относится к соединениям, в которых атом водорода или определенная группа атомов в молекуле цистеина замещена другим атомом или группой атомов. Например, производные цистеина могут находиться в форме, в которой к атому азота аминогруппы (-NH₂) или атому серы тиольной группы (-SH) в молекуле цистеина присоединен(а) другой атом или группа атомов, и примеры производных цистеина могут включать NAC (N-ацетилцистеин), SCMC (S-карбоксиметилцистеин), Boc-Cys(Me)-OH, (R)-S-(2-амино-2-карбоксиэтил)-L-гомоцистеин, (R)-2-амино-3-сульфопропионовую кислоту, D-2-амино-4-(этилтио)масляную кислоту, 3-сульфино-L-аланин, Fmoc-Cys(Boc-метил)-OH, селено-L-цистеин, S-(2-тиазолил)-L-цистеин, S-(2-тиенил)-L-цистеин, S-(4-толил)-L-цистеин и так далее, но не ограничиваясь ими.

При условии, что цистеин получен в соответствии со способом по настоящему изобретению, превращение в производные цистеина можно легко осуществить путем преобразования в различные производные цистеина способом, хорошо известным в данной области техники.

В частности, способ получения производных цистеина может дополнительно включать превращение цистеина, полученного на стадии (б), в производное цистеина. Например, из цистеина можно синтезировать N-ацтилцистеин (NAC) путем проведения реакции с ацетилирующим агентом или из него можно синтезировать S-карбоксиметилцистеин (SCMC) путем проведения реакции с галогенуксусной кислотой в основных условиях, но не ограничиваясь этим.

Эти производные цистеина используют главным образом в качестве фармацевтических веществ для противокашлевых препаратов; препаратов, облегчающих кашель, и терапевтических агентов для лечения бронхита, бронхиальной астмы, ларингофарингита и так далее, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин "О-фосфосерин-сульфгидрилаза (OPSS)" относится к ферменту, который катализирует реакцию, посредством которой OPS при участии тиольной группы (группа SH) превращается в цистеин. Возможно, этот фермент был впервые обнаружен у Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatics и Trichomonas vaginalis (Mino K. and Ishikawa K., FEBS Letters, 551:133-138, 2003; Bums К. E. et al, J. Am. Chem. Soc, 127:11602-11603, 2005). Дополнительно, OPSS может включать не только белки OPSS дикого типа, но также варианты белков, включающие делецию, замену или добавление в части полинуклеотидной последовательности, кодирующей OPSS, демонстрирующие активность, равную или более высокую, чем биологическая активность белков OPSS дикого типа, и также может включать все белки OPSS, раскрытые в US 2012-0190081 A1 и US 9127324 В2, и их варианты.

Сульфид для использования по настоящему изобретению может представлять собой любой сульфид, предоставленный не только в твердой форме, обычно используемой в данной области техники, но также в жидкой или газообразной форме вследствие различия в рН, давлении и растворимости, и следовательно может быть превращен в тиольную (SH) группу, в форме, например, сульфида (S^2-) или тиосульфата (S₂O₃^2-) без ограничения. В частности, сульфид может включать Na₂S, NaSH, H₂S, (NH₄)₂S, NaSH и Na₂S₂O₃, которые могут предоставлять тиольную группу для OPS, но не ограничиваясь этим. В этой реакции необходима одна тиольная группа на одну активную группу OPS для получения одной молекулы цистеина или его производного. В этой реакции сульфид добавляют, в частности, в количестве от 0,1 до 3 молярных эквивалентов, и в частности от 1 до 2 молярных эквивалентов на основе молярной концентрации OPS, но не ограничиваясь этим.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения OPS-продуцирующего микроорганизма, включающий модификацию микроорганизма рода Escherichia для повышения активности NADH:хинон-оксидоредуктазы.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложено применение микроорганизма, обладающего повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы, для получения О-фосфосерина, цистеина или их производных.

NADH:хинон-оксидоредуктаза, повышение ее активности, микроорганизмы и так далее являются такими, как описано выше.

Примеры

Настоящее изобретение будет описано более подробно посредством Примеров. Однако, специалисту в области техники, к который принадлежит настоящее изобретение, очевидно, что эти Примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей, и не предназначены каким-либо образом ограничивать объем настоящего изобретения.

Пример 1: Оценка OPS-продуцирующей способности штамма с мутированной областью регуляции экспрессии Nuo

В результате более раннего исследования было обнаружено, что средние уровни транскрипции генов nuoA, rmf и idi у OPS-продуцирующего штамма-хозяина составляют 8986, 32205 и 631, соответственно, и конкретные значения для каждого типа культуры представлены в Таблице 1.

Было подтверждено, что среднее значение уровня транскрипции rmf было в 3,6 раза больше этого значения для nuoA, и среднее значение уровня транскрипции idi составляло 0,07-ую часть этого значения для nuoA. Эти результаты показывают, что промотор гена rmf представляет собой сильный промотор, и промотор гена idi представляет собой слабый промотор по сравнению с промотором nuo А.

Следовательно, сравнивали OPS-продуцирующую способность микроорганизмов при регуляции экспрессии NADH:хинон-оксидоредуктазы путем вставки промотора rmf и промотора idi с различной активностью в оперон nuo (SEQ ID NO: 1) у OPS-продуцирующего микроорганизма.

1-1: Конструирование плазмиды для усиления области регуляции экспрессии Nuo

Фрагменты гена в области выше по ходу транскрипции от промотора дикого типа гена nuo получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 14 и 15, и фрагменты гена в области ниже по ходу транскрипции от этого промотора получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 18 и 19, на основе хромосомной ДНК Е. coli АТСС27325 в качестве матрицы. Дополнительно, промоторную область гена rmf получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 16 и 17, на основе хромосомной ДНК.Е. coli АТСС27325 в качестве матрицы.

Для получения этих фрагментов проводили ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Pfu-X Solg™, и ПЦР проводили в следующих условиях ПЦР-амлификации: денатурация при 95°С в течение 2 минут с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 60°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 60 секунд и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Фрагменты выше по ходу транскрипции и фрагменты ниже по ходу транскрипции от промотора nuo и фрагменты промотора rmf, полученные в вышеизложенном процессе, клонировали в вектор pSKH130 (SEQ ID NO: 39, Публикация США No. 2020-0048619) для хромосомной трансформации, расщепленный ферментом рестрикции EcoRV, используя набор для клонирования "in-fusion" (Clontech Laboratories, Inc.) с получением рекомбинантной плазмиды, названной SKH130 Prmf-nuoA.

1-2: Конструирование плазмиды для ослабления области регуляции экспрессии Nuo

Фрагменты гена в области выше по ходу транскрипции промотора дикого типа гена nuo получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 14 и 20, и фрагменты гена в области ниже по ходу транскрипции от этого промотора получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 23 и 19, на основе хромосомной ДНК Е. coli АТСС27325 в качестве матрицы. Дополнительно, область промотора гена idi получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 21 и 22, на основе хромосомной ДНК£". coli АТСС27325 в качестве матрицы.

ПЦР проводили в таких же условиях как в Примере 1-1 для получения фрагментов, и клонирование выполняли таким же образом как в Примере 1-1 с использованием этих фрагментов с получением рекомбинантной плазмиды. Полученная конструкция получила название pSKH130_Pidi-nuoA.

Последовательности праймеров, используемых в Примерах 1-1 и 1-2, показаны в Таблице 2.

1-3: Конструирование штамма, мутантного по области регуляции экспрессии Nuo

pSKH130 Prmf-nuoA, полученной в Примере 1-1, трансформировали СА07-0012 (КССМ 11212Р, Публикация США No. 2012-0190081), обладающий OPS-продуцирующей способностью, методом электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545) и проводили вторичный кроссинговер, таким образом получая штамм СА07-4826, в который вставлена нуклеотидная последовательность промотора гена rmf на конце нуклеотидной последовательности промотора дикого типа гена nuo.

В частности, вектор pSKH130 содержал репликон R6K, зависимый от белка PI (ген pir), ген SacB (Levansucrase) и ген устойчивости к канамицину. После получения желаемого штамма с использованием R6K и канамицина при первом кроссинговере антибиотики удаляли из среды, содержащей сахарозу, для получения штамма.

Вставку нуклеотидной последовательности промотора rmf у СА07-4826 подтверждали методом ПЦР и геномного секвенирования с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 24 и 25.

Таким же образом, pSKH130 Pidi-nuoA, полученной в Примере 1-2, трансформировали методом электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545) и проводили вторичный кроссинговер, таким образом получая штамм СА07-4827, у которого нуклеотидная последовательность промотора гена idi вставлена на конце нуклеотидной последовательности промотора дикого типа гена nuo. Вставку нуклеотидной последовательности промотора idi у СА07-4827 подтверждали путем ПЦР и геномного секвенирования с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 24 и 25. Последовательности используемых праймеров показаны в Таблице 3.

1-4: Сравнение OPS-продгцирующей способности штаммов с усиленным и ослабленным опероном nuo с использованием среды для титрования

Для оценки OPS-продуцирующей способности двух штаммов, СА07-4826 и СА07-4827, полученных в Примере 1-3, и контрольного штамма СА07-0012 использовали следующую среду (Таблица 4).

В частности, каждый из штаммов высевали на твердую среду LB и культивировали в инкубаторе при 33°С в течение ночи. Штаммы, культивированные на твердой среде LB в течение ночи, инокулировали в 25 мл среды для титрования, показанной в Таблице 3 ниже, и затем культивировали в инкубаторе при скорости 200 об/мин в течение 48 часов при 33°С. Концентрация полученного OPS представлена в Таблице 5.

СА07-4826, у которого оперон nuo был усилен промотором rmf, демонстрировал OPS-продуцирующую способность, улучшенную примерно на 12,8% по сравнению с родительским штаммом, и СА07-4827, у которого оперон nuo был ослаблен промотором idi, демонстрировал OPS-продуцирующую способность, пониженную примерно на 79,5% по сравнению с родительским штаммом.

Пример 2: Оценка OPS-продуцирующей способности в соответствии с усилением оперона nuo у штамма с повышенной OPS-продуцирующей способностью

Было проведено исследование того, происходит ли дальнейшее повышение OPS-продуцирующей способности, когда оперон Nuo усилен у штамма с повышенной OPS-экспортирующей способностью. Для этого OPS-продуцирующую способность оценивали при дополнительном усилении оперона nuo у штамма, усиленного белком YhhS (SEQ ID NO: 4, Патент США No. 10323262 В2), обладающего OPS-экспортирующей способностью.

2-1: Конструирование плазмиды для усиления YhhS у OPS-продуцирующего штамма

Фрагменты гена в области выше по ходу транскрипции от промотора дикого типа гена yhhS получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 6 и 7, и фрагменты гена в области ниже по ходу транскрипции от промотора дикого типа гена yhhS получали с помощью пары праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 8 и 9, на основе хромосомной ДНК Е. coli АТСС27325 в качестве матрицы. Дополнительно промотор trc (Ptrc) получали с помощью пары праймеров SEQ ID NO: 8 и 9 на основе pCL_Ptrc-gfp(US 2017-0247727 Al) в качестве матрицы. Последовательности используемых праймеров представлены в Таблице 6 ниже.

Для получения этих фрагментов проводили ПЦР с использованием ДНК полимеразы Pfu-X Solg™, и ПЦР проводили в следующих условиях ПЦР-амлификации: денатурация при 95°С в течение 2 минут с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Фрагменты выше по ходу транскрипции и ниже по ходу транскрипции от промотора yhhS и фрагмент промотора trc, полученные в вышеизложенном процессе, клонировали в вектор для хромосомной трансформации, расщепленный ферментом рестрикции EcoRV, с использованием набора для клонирования "in-fusion" (Clontech Laboratories, Inc.) для получения рекомбинантной плазмиды, и она получила название _PSKH130_Ptrc-yhhS.

2-2: Конструирование штамма, усиленного по YhhS

pSKH130_Ptrc-yhhS, полученной в Примере 2-1, трансформировали СА07-0012 методом электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545) и проводили вторичный кроссинговер, таким образом получая штамм СА07-4821, у которого нуклеотидная последовательность промотора trc вставлена на конце нуклеотидной последовательности промотора дикого типа гена yhhS. Вставку нуклеотидной последовательности промотора trc у штамма СА07-4821 подтверждали методом ПЦР и геномного секвенирования с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 12 и 13 (Таблица 7).

2-3: Оценка OPS-продуцирующей способности штамма, усиленного по YhhS, с использованием среды для титрования

Для оценки OPS-продуцирующей способности штамма СА07-4821, полученного в Примере 2-2, и его родительского штамма, СА07-0012, оценку проводили таким же образом как в Примере 1-4 с использованием среды (Таблица 4).

В результате было подтверждено, что СА07-4821 демонстрирует OPS-продуцирующую способность, улучшенную примерно на 26,7% по сравнению с СА07-0012, и результаты представлены в Таблице 8.

2-4: Конструирование штамма с усиленными YhhS и опероном nuo

pSKH130_Prmf-nuoA, полученным в Примере 1-1, трансформировали СА07-4821, полученный в Примере 2-3, методом электропорации (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541 545) и проводили вторичный кроссинговер, таким образом получая штамм СА07-4828, у которого нуклеотидная последовательность промотора гена rmf вставлена на конце нуклеотидной последовательности промотора дикого типа гена nuo.

Вставку нуклеотидной последовательности промотора rmf у СА07-4828 подтверждали с помощью ПЦР и геномного секвенирования с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 24 и 25.

2-5: Оценка OPS-продуцирующей способности штамма с усиленными Vhhs и опероном nuo с использованием среды для титрования

Для оценки OPS-продуцирующей способности СА07-4828 оценку проводили таким же образом как в Примере 1-4 с использованием СА07-4821 в качестве контроля, и результаты показаны в Таблице 9.

В случае СА07-4828, когда YhhS и оперон nuo одновременно усилены, OPS-продуцирующая способность была усилена примерно на 2,4% по сравнению с СА07-4821, у которого усилен только YhhS. Следовательно, было подтверждено, что усиление оперона nuo дополнительно увеличивает OPS-продуцирующую способность даже у штамма с повышенной OPS-продуцирующей способностью.

На основании вышеизложенного специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, понимает, что настоящее изобретение может быть воплощено в других определенных формах без изменения технических идей или существенных характеристик настоящего изобретения. В этом отношении раскрытые здесь примеры воплощений предназначены исключительно для иллюстративных целей, и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, объем настоящего изобретения охватывает не только примеры воплощений, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в рамках основной идеи и объема настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ С КОНТРОЛИРУЕМОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ

NADH:ХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ O-ФОСФОСЕРИНА, ЦИСТЕИНА

И ЕГО ПРОИЗВОДНОГО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО МИКРООРГАНИЗМА

<130> OPA22034

<150> KR 10-2021-0081785

<151> 2021-06-23

<160> 39

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 15655

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> оперон nuo

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(630)

<223> промотор nuoA

<220>

<221> misc_feature

<222> (631)..(633)

<223> инициирующий кодон nuoA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1090)..(1092)

<223> инициирующий кодон nuoB

<220>

<221> misc_feature

<222> (1846)..(1848)

<223> инициирующий кодон nuoC

<220>

<221> misc_feature

<222> (3651)..(3653)

<223> инициирующий кодон nuoE

<220>

<221> misc_feature

<222> (4148)..(4150)

<223> инициирующий кодон nuoF

<220>

<221> misc_feature

<222> (5532)..(5534)

<223> инициирующий кодон nuoG

<220>

<221> misc_feature

<222> (8261)..(8263)

<223> инициирующий кодон nuoH

<220>

<221> misc_feature

<222> (9253)..(9255)

<223> nuoI инициирующий кодон

<220>

<221> misc_feature

<222> (9807)..(9809)

<223> nuoJ инициирующий кодон

<220>

<221> misc_feature

<222> (10358)..(10360)

<223> инициирующий кодон nuoK

<220>

<221> misc_feature

<222> (10657)..(10659)

<223> инициирующий кодон nuoL

<220>

<221> misc_feature

<222> (12662)..(12664)

<223> инициирующий кодон nuoM

<220>

<221> misc_feature

<222> (14378)..(14380)

<223> инициирующий кодон nuoN

<400> 1

tcgacggacg atagataatt cctgagacaa tagtgtaaaa aacgagccgc tgggggtgtt 60

ttaaacccca gcggcttttt tttagtaaaa atccttcatc gcatagtgca gaacgtacaa 120

aactgttcat ttttcaacca ccagagattc acgtcccgaa cgcacaaata atcgcctgaa 180

aaaaatcacc tgctacaatg atgttaaaaa atacgtaaat ttgttgctgc gtttttgtta 240

tggaatgaca aaagcgtgtc acagatcaag aaaatactct cttttggggg gaggaatcga 300

cacaaattcc tgtcaaaata gacccgtatt ttttccattg cttcacaacg gacacgattc 360

aacaacatct aattatcctg gagtcgtcaa ggatctgggg tgaaagggca ttaaatgcta 420

atggtgttga tattatgtaa actaatgtga agaaactttt gttaaagttg acaaaaggtt 480

atagaaagga gtaaaaaacc acatcaatta gctgtataaa agaatttcta cagtgattgt 540

aaggtttttt ttattcctcc ccatgaatcg atgtggcgtc catctgccgt gaagagcagt 600

gaatctggcg ctacttttga tgagtaagca atgagtatgt caacatccac tgaagtcatc 660

gctcatcact gggcattcgc tatctttctt atcgttgcca ttggcctgtg ttgcctgatg 720

ctggtaggcg gttggttttt aggcggtcgc gcacgcgcga ggtcgaaaaa cgtgccgttt 780

gaatccggta tcgactcggt cggctccgcc cgcttacgcc tgtccgccaa gttttatctg 840

gtggccatgt tcttcgttat cttcgacgtt gaagcgctgt atctgttcgc atggtcaacc 900

tctatccgcg aaagcggctg ggtaggcttt gtggaagctg caatttttat ttttgtgtta 960

ctggcaggtc tggtttatct ggtgcgtatt ggcgcgctgg actggacgcc cgcgcgttca 1020

cgccgcgagc gtatgaaccc ggaaacgaac agtatcgcta atcgtcaacg ctaaccgcga 1080

ggcattaaga tggattatac gctcacccgc atagatccca acggtgagaa cgaccgttac 1140

cccctgcaaa agcaggagat cgtaaccgac cctctggagc aagaagttaa caaaaacgtg 1200

tttatgggca agctcaatga catggttaac tggggtcgta aaaactcaat ttggccgtat 1260

aacttcggtc tttcctgctg ttacgttgag atggtgactt cgtttaccgc ggtgcatgac 1320

gtggcgcgtt ttggcgcaga agtattgcgt gcttcgccgc gtcaggctga cctgatggtg 1380

gttgcaggaa cctgctttac caaaatggca ccggttattc agcgtctgta tgaccagatg 1440

ctggaaccaa aatgggttat ctcaatgggt gcctgtgcca actctggtgg tatgtacgat 1500

atttattccg ttgtgcaggg cgtcgataaa ttcatcccgg ttgatgtgta tatcccgggc 1560

tgcccgccgc gtcctgaagc gtacatgcag gcactgatgc tgttgcagga atctatcggc 1620

aaagaacgtc gtccgctctc ctgggtggtt ggcgatcagg gcgtttatcg cgccaatatg 1680

caatcagagc gcgaacgcaa gcgcggtgaa cgcattgccg taactaacct gcgtacacct 1740

gacgagattt aatttgcgcc tgtcggcaaa gggatttttc ttcgcttatt cctaaatcta 1800

tttcgcgaag cttactgcgc cgacagtcac cacggaccat ttgcaatggt gaacaatatg 1860

accgacttaa ccgcgcaaga acccgcctgg cagacccgcg atcatcttga tgatccggtg 1920

attggcgaac tgcgcaaccg ttttgggccg gatgccttta ctgttcaggc gactcgcacc 1980

ggggttcccg ttgtgtggat caagcgtgaa caattactgg aagttggcga tttcttaaag 2040

aaactgccga aaccttacgt catgctgttt gacttacacg gcatggacga acgtctgcgc 2100

acacaccgcg aagggttacc tgccgcggat ttttccgttt tctaccatct gatttctatc 2160

gatcgtaacc gcgacatcat gctgaaggtg gcgctggcag aaaacgacct gcacgtaccg 2220

accttcacca aactgttccc gaacgctaac tggtatgagc gtgaaacctg ggatctgttt 2280

ggcattactt tcgacggtca cccgaacctg cgacgcatca tgatgccgca aacctggaaa 2340

ggtcacccgc tgcgtaaaga ttatccggcg cgcgctaccg aattctcgcc gtttgagctg 2400

accaaagcca aacaggatct ggagatggaa gccctgacct tcaaaccgga agagtggggg 2460

atgaagcgcg gcaccgaaaa cgaggacttc atgttcctca acctcggtcc gaaccacccg 2520

tcggcgcacg gggctttccg tatcgttttg caactcgatg gcgaagagat tgtcgactgc 2580

gtaccagaca tcggttacca ccaccgtggt gcggagaaaa tgggcgaacg ccagtcctgg 2640

cacagctaca ttccgtatac tgaccgtatc gaatacctcg gcggctgcgt taacgaaatg 2700

ccttacgtgc tggcggtaga gaaactggcc gggatcaccg tgccggatcg cgttaacgtc 2760

attcgcgtta tgctctccga actgttccgc atcaacagtc acctgctgta tatctcgacc 2820

tttattcagg acgtcggcgc aatgacgcca gtgttcttcg cctttaccga tcgtcagaaa 2880

atttacgatc tggtggaagc aatcactggt ttccgtatgc acccggcgtg gttccgtatt 2940

ggcggcgtag cgcacgacct gccgcgcggc tgggatcgcc tgctgcgtga gttcctcgac 3000

tggatgccga aacgtctggc gtcttacgag aaagcggcgc tgcaaaacac cattctgaaa 3060

ggtcgttccc agggcgttgc cgcctatggc gcgaaagagg cgctggagtg gggcaccact 3120

ggcgcgggcc tgcgtgctac cgggatcgac ttcgacgtgc gtaaggcgcg tccttattct 3180

ggctatgaaa acttcgactt tgaaatcccg gtgggtggtg gcgtttctga ctgctacacc 3240

cgcgtaatgc ttaaagtgga agagctgcgc cagagtctgc gcattcttga gcagtgcctc 3300

aacaacatgc cggaaggccc gttcaaagcg gatcacccgc tgaccacgcc gccgccgaaa 3360

gagcgcacgc tgcaacatat cgaaaccctg atcacccact tcctgcaagt gtcgtggggt 3420

ccggtgatgc ctgccaatga atctttccag atgattgagg cgaccaaagg gatcaacagt 3480

tactacctga ccagcgacgg cagcaccatg agttaccgca cccgtgttcg taccccgagc 3540

tttgcgcatt tgcagcaaat tccggcggcg atccgcggca gcctggtgtc tgacctgatt 3600

gtttatctgg gcagtatcga ttttgttatg tcagatgtgg accgctaatt atgcacgaga 3660

atcaacaacc acaaaccgag gcttttgagc tgagtgcggc agagcgtgaa gcgatcgagc 3720

acgagatgca ccactacgaa gacccgcgtg cggcgtccat tgaagcgctg aaaatcgttc 3780

agaagcagcg tggctgggtg ccggatggtg cgatccacgc gatcgccgat gtgctgggta 3840

ttccggcaag cgacgtcgaa ggtgtggcaa cgttctacag tcagatcttc cgccagccgg 3900

ttggtcgcca tgtgatccgt tattgtgaca gcgtggtctg tcatatcaac ggttatcagg 3960

gtattcaggc ggcgctcgag aaaaagctga acatcaaacc agggcaaacg acatttgatg 4020

gccgctttac gctgctgcca acttgctgcc tggggaactg tgataaaggg ccaaacatga 4080

tgatcgatga ggacactcac gcgcatctga ccccggaagc gatccctgaa ctgctggagc 4140

ggtataaatg aaaaacatta tccgtactcc cgaaacgcat ccgctgacct ggcgtctgcg 4200

cgatgacaaa cagccagtgt ggctggacga ataccgcagc aaaaacggtt acgaaggcgc 4260

gcgtaaggcg ctgaccgggc tgtctccgga cgaaatcgtt aatcaggtaa aagacgctgg 4320

tctgaaaggg cgcggcggcg cgggcttctc gactggcctg aaatggagcc tgatgccgaa 4380

agacgaatcc atgaacatcc gttacctgct gtgtaatgcc gatgaaatgg agccgggcac 4440

ctataaagac cgcctgttga tggagcaact gccgcacctg ctggtggaag gtatgctcat 4500

ctccgcgttt gcgctgaaag cttaccgtgg ctacatcttc ctgcgtggcg aatatatcga 4560

agcggcagtt aatctgcgcc gtgccattgc cgaagccacc gaagcgggtc tgcttggcaa 4620

aaacattatg ggaacaggtt tcgatttcga actgttcgtc cataccgggg cagggcgcta 4680

catctgcggg gaagaaacag cgttaatcaa ctccctggaa ggacgtcgtg ctaacccacg 4740

ctcgaagcca cccttcccgg caacctccgg cgcatggggt aaaccgacct gtgtcaacaa 4800

cgtcgaaacc ctgtgtaacg ttccggcgat cctcgctaac ggcgtggagt ggtatcagaa 4860

catctcgaaa agtaaagatg ctggcaccaa gctgatgggc ttctccggtc gggtgaaaaa 4920

tccgggactg tgggaactgc cgttcggcac caccgcacgc gagatcctcg aagattacgc 4980

cggtggtatg cgtgatggtc tgaaatttaa agcctggcag ccaggcggcg cggggactga 5040

cttcctgacc gaagcgcacc ttgatctgcc gatggaattc gaaagtatcg gtaaagcggg 5100

cagccgtctg ggtacggcgc tggcgatggc ggttgaccat gagatcaaca tggtgtcgct 5160

ggtgcgtaac ctggaagagt ttttcgcccg tgagtcctgc ggctggtgta cgccgtgccg 5220

cgacggtctg ccgtggagcg tgaaaattct gcgtgcgctg gagcgtggtg aaggtcagcc 5280

gggcgatatc gaaacacttg agcaactgtg tcgattctta ggcccgggta aaactttctg 5340

tgcccacgca cctggtgcag tggagccgtt acagagcgcc atcaaatatt tccgcgaaga 5400

atttgaggcg ggaatcaaac agccgttcag caatacccat ttgattaatg ggattcagcc 5460

gaacctgctg aaagagcgct ggtaaccgaa tttcgattaa cgctcagtct ctgactgaga 5520

aaactggaag catgctaatg gctacaattc atgtagacgg caaagaatac gaggtcaacg 5580

gagcggacaa cctgctggaa gcttgtctgt ctctgggcct tgatattcct tacttttgct 5640

ggcatccggc gctgggaagt gtcggtgctt gccgccagtg tgcggtgaag caataccaaa 5700

acgcggaaga cacgcgtggt cgcctggtga tgtcctgtat gacaccggct tccgatggca 5760

cctttatttc cattgacgac gaagaagcga aacagttccg tgaaagcgtg gtcgagtggt 5820

tgatgaccaa ccacccgcac gactgtccgg tatgtgaaga gggcggtaac tgccatcttc 5880

aggatatgac tgtgatgacc ggacacagct tccgtcgcta ccgtttcacc aaacgtaccc 5940

accgtaatca ggatttgggg ccattcatct ctcacgaaat gaaccgctgc atcgcctgct 6000

accgctgtgt gcgttactac aaagattacg ctgacggtac agatctgggc gtttacggtg 6060

cgcacgacaa cgtctacttc ggtcgcccgg aagacggcac gctggaaagc gaattttccg 6120

gtaacctggt cgaaatttgc ccgaccggcg tatttaccga caaaacgcac tccgagcgtt 6180

acaaccgtaa atgggatatg cagtttgcgc cgagcatctg ccagcaatgt tccatcggct 6240

gtaacatcag ccccggtgaa cgttacggcg aactgcgtcg tatcgaaaac cgttacaacg 6300

gtacggtaaa ccactacttc ctctgcgacc gtggtcgttt cggttacggt tacgtcaacc 6360

tgaaggatcg tccgcgtcag ccagtacagc gtcgtggcga tgatttcatt accctcaacg 6420

ccgaacaggc aatgcagggc gcggcagata ttctgcgtca gtcgaagaaa gtgatcggta 6480

ttggttctcc gcgtgccagc gtggaaagca actttgcgct gcgtgaactg gtgggcgaag 6540

aaaacttcta caccggtatc gctcacggtg agcaggaacg tctgcaactg gcgctgaaag 6600

tgctgcgtga aggcggcatt tatactccgg ctctgcgcga aatcgaatct tacgatgcgg 6660

tactggtgct gggcgaagac gttacccaga ccggcgcgcg cgtcgcgctg gcagtgcgtc 6720

aggctgtgaa aggtaaagcg cgcgaaatgg cggcagcaca gaaagtggct gactggcaga 6780

ttgcggcaat cctcaacatc ggtcaacgtg cgaagcatcc gctgtttgtt accaacgttg 6840

atgacacccg tctggatgat atcgcggcgt ggacttaccg cgcaccggtt gaagatcagg 6900

cgcgtttagg ttttgccatc gcccatgcgc tggataactc tgcaccagcg gttgacggta 6960

tcgaacctga gctgcaaagc aaaatcgacg tcatcgtgca ggcactggca ggtgcgaaga 7020

aaccgttgat tatctccggg acgaacgccg gtagcttaga ggtgattcag gcggcggcta 7080

acgtcgcgaa agccctgaaa ggtcgcggcg ctgacgtcgg tatcaccatg attgcccgtt 7140

ccgtcaacag catggggctg ggcattatgg gtggcggttc gcttgaagaa gcgttaaccg 7200

aactggaaac cggacgcgcc gacgcggtgg tggtgttgga aaacgatctg catcgtcacg 7260

cttctgctat ccgcgtgaat gctgcgctgg ctaaagcacc gctggtgatg gtggttgatc 7320

atcaacgcac agcgattatg gaaaacgccc atctggtact ttctgctgcc agctttgctg 7380

aaagcgacgg tacggtgatc aacaacgaag gccgcgccca acgtttcttc caggtttacg 7440

atcctgctta ttacgacagc aaaactgtca tgctggaaag ctggcgctgg ttacactcgc 7500

tgcacagcac cctgctgagc cgtgaagtgg actggacgca gctcgaccat gtgattgacg 7560

ctgttgtggc gaaaatcccg gaactggcag gtatcaaaga tgctgcgccg gatgcgacat 7620

tccgtattcg tgggcagaaa ctggcccgtg aaccgcaccg ttacagcggt cgtaccgcca 7680

tgcgcgccaa tatcagcgtt catgagccgc gtcagccgca ggatattgac accatgttca 7740

ccttctcgat ggaaggtaac aaccagccga ctgcgcaccg ttcgcaagtg ccgtttgcct 7800

gggcgccggg ctggaactcc ccgcaggcgt ggaacaaatt ccaggacgaa gtgggcggca 7860

aactgcgctt tggcgatccg ggcgtgcgtc tgtttgaaac cagcgaaaat ggtctggatt 7920

acttcaccag cgtaccggca cgcttccagc cgcaggacgg gaaatggcgt atcgcgccgt 7980

attaccacct gtttggcagc gatgaattgt cacagcgtgc tccggtcttc cagagccgta 8040

tgccgcagcc gtacatcaaa ctcaacccag cggatgccgc gaagttgggt gtgaacgcag 8100

gtacacgcgt ctcctttagt tacgatggca acacggtcac gctgccggtt gaaatcgccg 8160

aaggactgac ggcagggcag gtgggcttgc cgatgggtat gtccggcatt gctccggtgc 8220

tggctggcgc gcatcttgag gatctcaagg aggcacaaca atgagttgga tatcaccgga 8280

actgattgag atcctgctga ccatcctcaa agcggtggtg atcctgctgg tggttgtcac 8340

ctgcggggca ttcatgagct ttggcgaacg tcgcctgctg ggtctgttcc agaaccgtta 8400

cggacctaac cgtgttggct ggggcggttc gctccagctg gttgcggaca tgatcaaaat 8460

gttctttaaa gaagactgga tcccgaaatt ctcggatcgc gtcatcttta ccctggcacc 8520

gatgattgcc tttacctcgc tgctgctggc ctttgcgatt gtgccagtca gtccgggttg 8580

ggtggttgcc gacctgaaca tcgggatttt gttcttcctg atgatggcag gtctggcggt 8640

ttacgcggtg ctgtttgcgg gctggtcaag taacaacaaa tactcgttgc tgggtgcgat 8700

gcgtgcttct gcgcagaccc tgagctacga agtgttcctc gggctttcct tgatgggcgt 8760

ggtggcgcag gccggttcat tcaacatgac cgacatcgtc aacagccagg cgcatgtgtg 8820

gaacgttatc ccgcaattct ttggttttat tacctttgcc atcgcgggcg tggcggtatg 8880

tcaccgtcac ccgtttgacc agccggaagc cgagcaggaa ctggcggatg gttaccacat 8940

tgaatattcc ggtatgaagt tcggtctgtt cttcgtgggt gagtacatcg ggattgtgac 9000

catctctgca ttgatggtga cgctgttctt cggtggctgg caaggcccgt tgttaccgcc 9060

attcatctgg ttcgcgctga aaaccgcgtt ctttatgatg atgttcattt tgattcgtgc 9120

gtcgttaccg cgtccgcgtt atgaccaggt aatgtccttc ggctggaaaa tctgcctgcc 9180

gctgacgctg atcaacttgc tggtaacggc ggctgtcatt ctctggcagg cgcaataagg 9240

ggcaataaga ccatgacctt aaaagaattg ttagtaggtt tcggcaccca ggttcgtagt 9300

atctggatga tcggcctgca cgcgttcgcc aaacgcgaaa cgcgaatgta cccggaagag 9360

ccggtctatc tgccgccccg ttatcgtggt cgtatcgttc tgacccgcga cccggacggc 9420

gaagagcgtt gcgtagcctg taacctctgc gcggtagcct gcccggtcgg ctgtatctcg 9480

ctgcaaaaag cagaaaccaa agacggtcgc tggtacccgg aatttttccg catcaacttc 9540

tcacgctgca ttttctgtgg tctgtgcgaa gaagcctgtc cgaccacggc gattcagtta 9600

accccggatt tcgaaatggg ggaatacaag cgccaggatc tggtttacga gaaagaggat 9660

ctgctgatct ccggtccggg caaatacccg gaatataact tctaccggat ggcaggtatg 9720

gcaatcgacg gcaaagataa gggcgaagca gagaacgaag ccaagcctat cgacgtcaag 9780

agcctgttac cgtaaggaga ggggcaatgg agttcgcttt ttatatctgt ggcctgatag 9840

ccatacttgc gaccttgcga gtgatcaccc ataccaatcc ggtacacgca ctgctgtacc 9900

tgattatttc gctgctggcg atttccgggg tgttcttctc actgggcgct tacttcgccg 9960

gtgcgctgga aattatcgtc tacgcgggtg ccattatggt gctgttcgtg ttcgtggtga 10020

tgatgctcaa cctgggcggt tcagaaatcg aacaggaacg ccagtggctg aaaccgcagg 10080

tgtggattgg tccggcaatt ttgtcggcca tcatgctggt ggtgattgtt tacgccatcc 10140

tcggtgttaa cgatcagggt atcgacggta cgccaatcag tgctaaagca gtgggtatta 10200

cgctgttcgg gccttacgta ctggcggtgg aactggcttc tatgctgctg ctcgcaggtc 10260

tggttgtggc cttccacgtc ggtcgtgaag agcgtgcggg tgaagtgctg agcaatcgta 10320

aagacgacag cgcgaaaaga aaaacggagg agcacgcatg atccccttac aacatggact 10380

gatcctcgcg gcaatcttat tcgttcttgg cttaaccggt ctggttatcc gtcgcaatct 10440

gctgtttatg ttgattggtc tggaaatcat gattaacgcc tccgcgctgg ccttcgtggt 10500

cgccggaagc tactggggcc agaccgacgg tcaggtgatg tacattctcg ccatcagcct 10560

cgcggcggca gaagcgagta tcggccttgc gctgctgctg caacttcacc gtcgtcgcca 10620

gaacctgaac atcgattcag taagtgagat gcgcggatga acatgcttgc cttaaccatt 10680

attttgccat tgattggctt cgtcctgctg gcattctccc gtgggcgctg gtctgaaaac 10740

gtctcggcga tcgtcggcgt aggctctgtg ggcctggcgg cgctggtaac cgcctttatc 10800

ggcgttgatt tcttcgctaa cggcgagcag acatacagcc agccgctgtg gacgtggatg 10860

tcggtaggcg actttaacat cggttttaac ctggtgctgg acggcctgtc gctgaccatg 10920

ctctcggtgg tcactggtgt gggtttcctt attcacatgt acgcctcctg gtatatgcgc 10980

ggtgaagagg gctactctcg cttcttcgct tacaccaacc tgttcatcgc cagcatggtg 11040

gttctggtgc ttgccgacaa cctgctgctg atgtacctcg gctgggaagg cgtgggcctg 11100

tgctcctatc tgctgatcgg gttctattac accgatccga agaatggcgc agcggcaatg 11160

aaagcgttcg tcgtgacccg tgtgggtgac gtgttcctcg ctttcgcact gttcattctt 11220

tacaacgaac tgggcaccct gaacttccgc gaaatggtgg aactggcacc agcgcacttt 11280

gctgacggca ataacatgct gatgtgggcg acgctgatgc tgctgggcgg tgcggtcggt 11340

aaatctgcgc agttgccgtt gcagacatgg cttgccgacg cgatggcggg cccgacgcct 11400

gtctccgcgc tgatccacgc cgcaaccatg gtaaccgcgg gtgtctacct gatcgcccgt 11460

acccacggcc tgttcctgat gacgccggaa gttctgcatc tggtgggtat tgtcggggcg 11520

gttacgctgc tgctggccgg ttttgccgcg ctggtacaga ccgacatcaa acgtgttctc 11580

gcttactcta ccatgagcca gattggctac atgttcctcg cgcttggcgt gcaggcatgg 11640

gatgcggcga ttttccactt gatgacccac gcgttcttta aagcgctgct gttcctggca 11700

tccggttccg tcattctggc ctgccatcac gaacagaaca tcttcaagat gggcggtctg 11760

cgtaaatcta ttccgctggt ttatctctgc ttcctggtgg gcggcgcagc actgtcggca 11820

ctaccgctgg tcactgcggg cttcttcagt aaggatgaga tcctcgcggg tgcgatggcg 11880

aatggtcata tcaatctgat ggtggcaggt ctggtcggtg cgtttatgac ctcgctctac 11940

accttccgta tgattttcat cgtcttccac ggaaaagaac aaattcacgc tcacgccgtg 12000

aaaggggtaa ctcacagcct gccgctgatt gtgctgctga tcctttccac cttcgttggc 12060

gcactgattg taccgccgct gcagggcgtg cttccgcaaa cgacggaact ggcgcacggc 12120

agcatgttga ccctggaaat tacctctggc gtggtcgcgg tggtcggcat tctgctggca 12180

gcctggctgt ggctgggtaa acgtactctg gtgacctcca tcgccaacag tgcgccgggc 12240

cgtctgctgg gcacctggtg gtacaacgcc tggggatttg actggctgta tgacaaagtg 12300

ttcgtcaagc cgttcctggg tattgcctgg ttgctgaaac gcgatccgct gaactcaatg 12360

atgaacatcc cggctgtcct ttcccgcttt gcaggtaaag gtctgctgtt aagtgagaac 12420

ggctatctgc gctggtatgt ggcatccatg agcatcggtg cggtcgtggt gctggcactg 12480

ttgatggtac tgcgttgagt taaggattgt gggattgccc ctgggcatat aagaacgtag 12540

gtcggataag ccgccttcgc ggtgcatccg acactacccc cagtccgaag agaattttct 12600

gtcgtgagaa ttcgttgaaa atccggtcct gacgggactt ttacaaggaa taaagatcgc 12660

catgttacta ccctggctaa tattaattcc ctttattggc ggcttcctgt gctggcagac 12720

cgaacgcttt ggcgtcaagg tgccacgctg gatcgcgctg atcaccatgg gattgacgct 12780

ggcgctgtcg ctgcaactgt ggttgcaggg cggttattca ctgacgcaat ccgccggaat 12840

tccgcagtgg cagtctgaat tcgacatgcc gtggatcccg cgttttggta tctctattca 12900

tctcgccatt gacgggctgt cgctgctgat ggtcgtgctg accggtctgc tcggtgtgct 12960

ggcggtacta tgttcgtgga aagagatcga aaaatatcag ggcttcttcc acctcaacct 13020

gatgtggatc ctgggcggcg ttatcggcgt gttccttgcc atcgacatgt tcctgttctt 13080

cttcttctgg gaaatgatgc tggtgccgat gtacttcctg atcgcactgt gggggcataa 13140

agcctctgac ggtaaaacgc gtatcacggc ggcaaccaag ttcttcattt acacccaggc 13200

gagtggcctg gtgatgttga ttgccatcct ggcgctggtt tttgttcact acaatgcgac 13260

cggcgtctgg accttcaact atgaagagct gctgaatacg ccaatgtcca gtggtgtgga 13320

atacctgtta atgctgggct tcttcatcgc cttcgcagtc aaaatgccgg tggttccgct 13380

gcatggctgg ctgccggatg cgcactccca ggctccgacc gccggttccg ttgacctcgc 13440

ggggatcttg ctgaaaactg ccgcttacgg tttgctgcgt ttctccctgc cgctgttccc 13500

gaacgcgtcg gcagagttcg cgccaattgc tatgtggctg ggtgttatcg gcatcttcta 13560

cggtgcgtgg atggccttcg cccagaccga tatcaaacgt ctgatcgcct acacctcggt 13620

ttcccacatg ggcttcgtgc tgattgctat ctacaccggc agccagttgg cctaccaggg 13680

cgcggtaatc cagatgattg cgcacggttt gtcggcggcg ggtctgttta ttctttgtgg 13740

tcagctttat gaacgtatcc atacccgcga catgcgcatg atgggcggtc tgtggagcaa 13800

gatgaaatgg ctgccagcac tgtcgctgtt ctttgcggtg gcaacgcttg ggatgcctgg 13860

caccggtaac ttcgtcggcg aatttatgat tctgttcggc agcttccagg ttgtaccggt 13920

gattaccgtt atctctacct ttgggctggt ctttgcatct gtttattcgc tggcgatgtt 13980

acatcgcgct tacttcggta aagcgaaaag ccagattgcc agccaggaac tgccagggat 14040

gtcgctgcgt gagctgttta tgatcctgtt gctggtggtg ctgctggtac tgctgggctt 14100

ctatccgcag ccgattctgg atacctcgca ctccgcgatt ggcaatatcc agcagtggtt 14160

tgttaattcc gttactacta caaggccgta aatcgccatg acaataactc cacaaaacct 14220

gatcgcactg ctaccgttgc tgatcgtcgg cttgacggtg gtggttgtga tgctctccat 14280

tgcgtggcga cgcaatcatt tcctcaacgc tacgctctcg gttattgggc ttaacgcggc 14340

gctggtttcg ctctggtttg ttggccaggc gggcgctatg gacgttacgc cgctgatgcg 14400

cgttgatggt ttcgccatgc tttacaccgg gctggtattg ttggcgagcc tcgccacctg 14460

tactttcgcc tacccgtggc ttgaaggcta taacgacaac aaggatgagt tctacctgtt 14520

ggtgttaatt gccgcgctgg gcgggatcct gctggcgaat gccaaccatc tggcgtctct 14580

gttcctcggt atcgaactga tctctttgcc gctgtttggc ctggtcggtt acgctttccg 14640

ccagaaacgt tcactggaag ccagtatcaa atacaccatc ctttctgccg cagcgtcttc 14700

tttcctgctg tttggtatgg cgctggtgta tgcgcagtct ggcgacctgt cgtttgtcgc 14760

gttgggtaaa aaccttggcg acggtatgct caacgagccg ctgttgctgg caggtttcgg 14820

cctgatgatt gttggcctcg gcttcaaact ctctctggtg ccgttccacc tgtggacgcc 14880

agacgtatac cagggcgcgc ctgcgccggt ttccactttc ctggcgacgg cgagcaaaat 14940

cgctatcttc ggtgtggtga tgcgtctgtt cctctacgca ccggtgggtg acagcgaagc 15000

gattcgcgtg gtgctggcga ttatcgcctt tgcctccatc atcttcggta acctgatggc 15060

gctgagccag accaatatca aacgtctgct cggttactca tctatctctc acctcggcta 15120

tctgctggta gcgctgattg cgctgcaaac cggcgagatg tcgatggaag cggtaggggt 15180

ttacctggcc ggttatctgt tcagcagcct cggcgcgttc ggcgtggtca gcctgatgtc 15240

cagcccgtat cgtggcccgg atgctgattc cctgttctct taccgcggtc tgttctggca 15300

tcgtccgatc ctcgcggcag tgatgacggt gatgatgctg tctctggccg gtatcccgat 15360

gacgctgggc tttatcggta agttctacgt gctggcggtc ggtgtccagg cacacttgtg 15420

gtggctggtg ggtgccgtgg ttgtcggttc ggcaatcggc ctctactact acctgcgcgt 15480

ggcggtgagc ctgtatcttc acgccccgga acaaccgggt cgcgatgcac catcaaactg 15540

gcagtacagc gcgggcggta tcgttgtgct gatctctgca ctgttggtac tggtgctggg 15600

tgtatggcca caaccgctga ttagcattgt gcgtttggca atgccgctga tgtaa 15655

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SerB

<400> 2

Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp

1 5 10 15

Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp

20 25 30

Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp

35 40 45

Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val

50 55 60

Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala

65 70 75 80

Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu

100 105 110

Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp

115 120 125

Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser

145 150 155 160

Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val

165 170 175

Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys

180 185 190

Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr

195 200 205

Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val

210 215 220

Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile

225 230 235 240

Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu

245 250 255

Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp

260 265 270

Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala

275 280 285

Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg

290 295 300

His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn

305 310 315 320

Gln Lys

<210> 3

<211> 969

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> serB

<400> 3

atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60

ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120

ctgctgtatg gtcgtgggct ggataaacaa cgtctgaccc aataccagag caaactgggt 180

gcggcgatgg tgattgttgc cgcctggtgc gtggaagatt atcaggtgat tcgtctggca 240

ggttcactca ccgcacgggc tacacgcctg gcccacgaag cgcagctgga tgtcgccccg 300

ctggggaaaa tcccgcacct gcgcacgccg ggtttgctgg tgatggatat ggactccacc 360

gccatccaga ttgaatgtat tgatgaaatt gccaaactgg ccggaacggg cgagatggtg 420

gcggaagtaa ccgaacgggc gatgcgcggc gaactcgatt ttaccgccag cctgcgcagc 480

cgtgtggcga cgctgaaagg cgctgacgcc aatattctgc aacaggtgcg tgaaaatctg 540

ccgctgatgc caggcttaac gcaactggtg ctcaagctgg aaacgctggg ctggaaagtg 600

gcgattgcct ccggcggctt tactttcttt gctgaatacc tgcgcgacaa gctgcgcctg 660

accgccgtgg tagccaatga actggagatc atggacggta aatttaccgg caatgtgatc 720

ggcgacatcg tagacgcgca gtacaaagcg aaaactctga ctcgcctcgc gcaggagtat 780

gaaatcccgc tggcgcagac cgtggcgatt ggcgatggag ccaatgacct gccgatgatc 840

aaagcggcag ggctggggat tgcctaccat gccaagccaa aagtgaatga aaaggcggaa 900

gtcaccatcc gtcacgctga cctgatgggg gtattctgca tcctctcagg cagcctgaat 960

cagaagtaa 969

<210> 4

<211> 405

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YhhS

<400> 4

Met Pro Glu Pro Val Ala Glu Pro Ala Leu Asn Gly Leu Arg Leu Asn

1 5 10 15

Leu Arg Ile Val Ser Ile Val Met Phe Asn Phe Ala Ser Tyr Leu Thr

20 25 30

Ile Gly Leu Pro Leu Ala Val Leu Pro Gly Tyr Val His Asp Val Met

35 40 45

Gly Phe Ser Ala Phe Trp Ala Gly Leu Val Ile Ser Leu Gln Tyr Phe

50 55 60

Ala Thr Leu Leu Ser Arg Pro His Ala Gly Arg Tyr Ala Asp Ser Leu

65 70 75 80

Gly Pro Lys Lys Ile Val Val Phe Gly Leu Cys Gly Cys Phe Leu Ser

85 90 95

Gly Leu Gly Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Ala Ser Leu Pro Val Ile

100 105 110

Ser Leu Leu Leu Leu Cys Leu Gly Arg Val Ile Leu Gly Ile Gly Gln

115 120 125

Ser Phe Ala Gly Thr Gly Ser Thr Leu Trp Gly Val Gly Val Val Gly

130 135 140

Ser Leu His Ile Gly Arg Val Ile Ser Trp Asn Gly Ile Val Thr Tyr

145 150 155 160

Gly Ala Met Ala Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Val Phe Tyr His Trp

165 170 175

Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu Ile Ile Met Gly Val Ala Leu Val

180 185 190

Ala Ile Leu Leu Ala Ile Pro Arg Pro Thr Val Lys Ala Ser Lys Gly

195 200 205

Lys Pro Leu Pro Phe Arg Ala Val Leu Gly Arg Val Trp Leu Tyr Gly

210 215 220

Met Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe

225 230 235 240

Ile Thr Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Gly Trp Asp Gly Ala Ala Phe Ala

245 250 255

Leu Thr Leu Phe Ser Cys Ala Phe Val Gly Thr Arg Leu Leu Phe Pro

260 265 270

Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Gly Leu Asn Val Ala Met Ile Cys Phe

275 280 285

Ser Val Glu Ile Ile Gly Leu Leu Leu Val Gly Val Ala Thr Met Pro

290 295 300

Trp Met Ala Lys Ile Gly Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Phe Ser Leu

305 310 315 320

Val Phe Pro Ala Leu Gly Val Val Ala Val Lys Ala Val Pro Gln Gln

325 330 335

Asn Gln Gly Ala Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Val Phe Met Asp Leu Ser

340 345 350

Leu Gly Val Thr Gly Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Ser Trp Ala Gly

355 360 365

Val Pro Val Ile Tyr Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val Ala Ile Ala Leu

370 375 380

Leu Leu Thr Trp Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Glu His Val Pro Glu

385 390 395 400

Ala Ala Ser Ser Ser

405

<210> 5

<211> 1218

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhS

<400> 5

atgcccgaac ccgtagccga acccgcgcta aacggattgc gcctgaattt gcgcattgtc 60

tctatagtca tgtttaactt cgccagctac ctcaccatcg ggttgccgct cgctgtatta 120

ccgggctatg tccatgatgt gatgggcttt agcgccttct gggcaggatt ggttatcagc 180

ctgcaatatt tcgccacctt gctgagccgc cctcatgccg gacgttacgc cgattcgctg 240

ggacccaaaa agattgtcgt cttcggttta tgcggctgct ttttgagcgg tctggggtat 300

ctgacggcag gattaaccgc cagtctgcct gtcatcagcc tgttattact ttgcctgggg 360

cgcgtcatcc ttgggattgg gcaaagtttt gccggaacgg gatcgaccct atggggcgtt 420

ggcgtggttg gctcgctgca tatcgggcgg gtgatttcgt ggaacggcat tgtcacttac 480

ggggcgatgg cgatgggtgc gccgttaggc gtcgtgtttt atcactgggg cggcttgcag 540

gcgttagcgt taatcattat gggcgtggcg ctggtggcca ttttgttggc gatcccgcgt 600

ccgacggtaa aagccagtaa aggcaaaccg ctgccgtttc gcgcggtgct tgggcgcgtc 660

tggctgtacg gtatggcgct ggcactggct tccgccggat ttggcgtcat cgccaccttt 720

atcacgctgt tttatgacgc taaaggttgg gacggtgcgg ctttcgcgct gacgctgttt 780

agctgtgcgt ttgtcggtac gcgtttgtta ttccctaacg gcattaaccg tatcggtggc 840

ttaaacgtag cgatgatttg ctttagcgtt gagataatcg gcctgctact ggttggcgtg 900

gcgactatgc cgtggatggc gaaaatcggc gtcttactgg cgggggccgg gttttcgctg 960

gtgttcccgg cattgggtgt agtggcggta aaagcggttc cgcagcaaaa tcagggggcg 1020

gcgctggcaa cttacaccgt atttatggat ttatcgcttg gcgtgactgg accactggct 1080

gggctggtga tgagctgggc gggcgtaccg gtgatttatc tggcggcggc gggactggtc 1140

gcaatcgcgt tattactgac gtggcgatta aaaaaacggc ctccggaaca cgtccctgag 1200

gccgcctcat catcttaa 1218

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhS UP F

<400> 6

ctgcaggaat tcgatgaagg taaccacttt ttccg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhS UP R

<400> 7

gagttgcagc aagcggagga tcaccacatt tttac 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ptrc F

<400> 8

aatgtggtga tcctccgctt gctgcaactc tctca 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ptrc R

<400> 9

tacgggttcg ggcatgatag ctctcctgtg tgaaa 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhS Down F

<400> 10

cacaggagag ctatcatgcc cgaacccgta gccga 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhS Down R

<400> 11

gtcgactagc gtgatagcgg tttgccttta ctggc 35

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhSP Conf F

<400> 12

agttgagcaa aaacgccagt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> yhhSP Conf R

<400> 13

gccataccgt acagccagac 20

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UP F1

<400> 14

ctgcaggaat tcgatcaacc accagagatt cacgt 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UP R1

<400> 15

gcttcctgac tccagtgctt actcatcaaa agtag 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Prmf F

<400> 16

tttgatgagt aagcactgga gtcaggaagc cgctt 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Prmf R

<400> 17

tgttgacata ctcatgcctc gtttccctca tactg 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Down F1

<400> 18

tgagggaaac gaggcatgag tatgtcaaca tccac 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Down R1

<400> 19

acggtgagaa cgaccgttac atcacgctag tcgac 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UP R2

<400> 20

tcatttttct tcagctgctt actcatcaaa agtag 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pidi F

<400> 21

tttgatgagt aagcagctga agaaaaatga gcatg 35

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pidi R

<400> 22

tgttgacata ctcataattt ctcacatgta attctgatc 39

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Down F2

<400> 23

tacatgtgag aaattatgag tatgtcaaca tccac 35

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoP Conf F

<400> 24

gagagctacc ataatccgtg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoP Conf R

<400> 25

catctcaacg taacagcagg 20

<210> 26

<211> 147

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoA

<400> 26

Met Ser Met Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Ala His His Trp Ala Phe

1 5 10 15

Ala Ile Phe Leu Ile Val Ala Ile Gly Leu Cys Cys Leu Met Leu Val

20 25 30

Gly Gly Trp Phe Leu Gly Gly Arg Ala Arg Ala Arg Ser Lys Asn Val

35 40 45

Pro Phe Glu Ser Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Ala Arg Leu Arg Leu

50 55 60

Ser Ala Lys Phe Tyr Leu Val Ala Met Phe Phe Val Ile Phe Asp Val

65 70 75 80

Glu Ala Leu Tyr Leu Phe Ala Trp Ser Thr Ser Ile Arg Glu Ser Gly

85 90 95

Trp Val Gly Phe Val Glu Ala Ala Ile Phe Ile Phe Val Leu Leu Ala

100 105 110

Gly Leu Val Tyr Leu Val Arg Ile Gly Ala Leu Asp Trp Thr Pro Ala

115 120 125

Arg Ser Arg Arg Glu Arg Met Asn Pro Glu Thr Asn Ser Ile Ala Asn

130 135 140

Arg Gln Arg

145

<210> 27

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoB

<400> 27

Met Asp Tyr Thr Leu Thr Arg Ile Asp Pro Asn Gly Glu Asn Asp Arg

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Gln Lys Gln Glu Ile Val Thr Asp Pro Leu Glu Gln Glu

20 25 30

Val Asn Lys Asn Val Phe Met Gly Lys Leu Asn Asp Met Val Asn Trp

35 40 45

Gly Arg Lys Asn Ser Ile Trp Pro Tyr Asn Phe Gly Leu Ser Cys Cys

50 55 60

Tyr Val Glu Met Val Thr Ser Phe Thr Ala Val His Asp Val Ala Arg

65 70 75 80

Phe Gly Ala Glu Val Leu Arg Ala Ser Pro Arg Gln Ala Asp Leu Met

85 90 95

Val Val Ala Gly Thr Cys Phe Thr Lys Met Ala Pro Val Ile Gln Arg

100 105 110

Leu Tyr Asp Gln Met Leu Glu Pro Lys Trp Val Ile Ser Met Gly Ala

115 120 125

Cys Ala Asn Ser Gly Gly Met Tyr Asp Ile Tyr Ser Val Val Gln Gly

130 135 140

Val Asp Lys Phe Ile Pro Val Asp Val Tyr Ile Pro Gly Cys Pro Pro

145 150 155 160

Arg Pro Glu Ala Tyr Met Gln Ala Leu Met Leu Leu Gln Glu Ser Ile

165 170 175

Gly Lys Glu Arg Arg Pro Leu Ser Trp Val Val Gly Asp Gln Gly Val

180 185 190

Tyr Arg Ala Asn Met Gln Ser Glu Arg Glu Arg Lys Arg Gly Glu Arg

195 200 205

Ile Ala Val Thr Asn Leu Arg Thr Pro Asp Glu Ile

210 215 220

<210> 28

<211> 600

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoC

<400> 28

Met Val Asn Asn Met Thr Asp Leu Thr Ala Gln Glu Pro Ala Trp Gln

1 5 10 15

Thr Arg Asp His Leu Asp Asp Pro Val Ile Gly Glu Leu Arg Asn Arg

20 25 30

Phe Gly Pro Asp Ala Phe Thr Val Gln Ala Thr Arg Thr Gly Val Pro

35 40 45

Val Val Trp Ile Lys Arg Glu Gln Leu Leu Glu Val Gly Asp Phe Leu

50 55 60

Lys Lys Leu Pro Lys Pro Tyr Val Met Leu Phe Asp Leu His Gly Met

65 70 75 80

Asp Glu Arg Leu Arg Thr His Arg Glu Gly Leu Pro Ala Ala Asp Phe

85 90 95

Ser Val Phe Tyr His Leu Ile Ser Ile Asp Arg Asn Arg Asp Ile Met

100 105 110

Leu Lys Val Ala Leu Ala Glu Asn Asp Leu His Val Pro Thr Phe Thr

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Asn Ala Asn Trp Tyr Glu Arg Glu Thr Trp Asp Leu

130 135 140

Phe Gly Ile Thr Phe Asp Gly His Pro Asn Leu Arg Arg Ile Met Met

145 150 155 160

Pro Gln Thr Trp Lys Gly His Pro Leu Arg Lys Asp Tyr Pro Ala Arg

165 170 175

Ala Thr Glu Phe Ser Pro Phe Glu Leu Thr Lys Ala Lys Gln Asp Leu

180 185 190

Glu Met Glu Ala Leu Thr Phe Lys Pro Glu Glu Trp Gly Met Lys Arg

195 200 205

Gly Thr Glu Asn Glu Asp Phe Met Phe Leu Asn Leu Gly Pro Asn His

210 215 220

Pro Ser Ala His Gly Ala Phe Arg Ile Val Leu Gln Leu Asp Gly Glu

225 230 235 240

Glu Ile Val Asp Cys Val Pro Asp Ile Gly Tyr His His Arg Gly Ala

245 250 255

Glu Lys Met Gly Glu Arg Gln Ser Trp His Ser Tyr Ile Pro Tyr Thr

260 265 270

Asp Arg Ile Glu Tyr Leu Gly Gly Cys Val Asn Glu Met Pro Tyr Val

275 280 285

Leu Ala Val Glu Lys Leu Ala Gly Ile Thr Val Pro Asp Arg Val Asn

290 295 300

Val Ile Arg Val Met Leu Ser Glu Leu Phe Arg Ile Asn Ser His Leu

305 310 315 320

Leu Tyr Ile Ser Thr Phe Ile Gln Asp Val Gly Ala Met Thr Pro Val

325 330 335

Phe Phe Ala Phe Thr Asp Arg Gln Lys Ile Tyr Asp Leu Val Glu Ala

340 345 350

Ile Thr Gly Phe Arg Met His Pro Ala Trp Phe Arg Ile Gly Gly Val

355 360 365

Ala His Asp Leu Pro Arg Gly Trp Asp Arg Leu Leu Arg Glu Phe Leu

370 375 380

Asp Trp Met Pro Lys Arg Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Gln

385 390 395 400

Asn Thr Ile Leu Lys Gly Arg Ser Gln Gly Val Ala Ala Tyr Gly Ala

405 410 415

Lys Glu Ala Leu Glu Trp Gly Thr Thr Gly Ala Gly Leu Arg Ala Thr

420 425 430

Gly Ile Asp Phe Asp Val Arg Lys Ala Arg Pro Tyr Ser Gly Tyr Glu

435 440 445

Asn Phe Asp Phe Glu Ile Pro Val Gly Gly Gly Val Ser Asp Cys Tyr

450 455 460

Thr Arg Val Met Leu Lys Val Glu Glu Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ile

465 470 475 480

Leu Glu Gln Cys Leu Asn Asn Met Pro Glu Gly Pro Phe Lys Ala Asp

485 490 495

His Pro Leu Thr Thr Pro Pro Pro Lys Glu Arg Thr Leu Gln His Ile

500 505 510

Glu Thr Leu Ile Thr His Phe Leu Gln Val Ser Trp Gly Pro Val Met

515 520 525

Pro Ala Asn Glu Ser Phe Gln Met Ile Glu Ala Thr Lys Gly Ile Asn

530 535 540

Ser Tyr Tyr Leu Thr Ser Asp Gly Ser Thr Met Ser Tyr Arg Thr Arg

545 550 555 560

Val Arg Thr Pro Ser Phe Ala His Leu Gln Gln Ile Pro Ala Ala Ile

565 570 575

Arg Gly Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile Val Tyr Leu Gly Ser Ile Asp

580 585 590

Phe Val Met Ser Asp Val Asp Arg

595 600

<210> 29

<211> 166

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoE

<400> 29

Met His Glu Asn Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Phe Glu Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ala Glu Arg Glu Ala Ile Glu His Glu Met His His Tyr Glu Asp Pro

20 25 30

Arg Ala Ala Ser Ile Glu Ala Leu Lys Ile Val Gln Lys Gln Arg Gly

35 40 45

Trp Val Pro Asp Gly Ala Ile His Ala Ile Ala Asp Val Leu Gly Ile

50 55 60

Pro Ala Ser Asp Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Tyr Ser Gln Ile Phe

65 70 75 80

Arg Gln Pro Val Gly Arg His Val Ile Arg Tyr Cys Asp Ser Val Val

85 90 95

Cys His Ile Asn Gly Tyr Gln Gly Ile Gln Ala Ala Leu Glu Lys Lys

100 105 110

Leu Asn Ile Lys Pro Gly Gln Thr Thr Phe Asp Gly Arg Phe Thr Leu

115 120 125

Leu Pro Thr Cys Cys Leu Gly Asn Cys Asp Lys Gly Pro Asn Met Met

130 135 140

Ile Asp Glu Asp Thr His Ala His Leu Thr Pro Glu Ala Ile Pro Glu

145 150 155 160

Leu Leu Glu Arg Tyr Lys

165

<210> 30

<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoF

<400> 30

Met Lys Asn Ile Ile Arg Thr Pro Glu Thr His Pro Leu Thr Trp Arg

1 5 10 15

Leu Arg Asp Asp Lys Gln Pro Val Trp Leu Asp Glu Tyr Arg Ser Lys

20 25 30

Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Arg Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Pro Asp

35 40 45

Glu Ile Val Asn Gln Val Lys Asp Ala Gly Leu Lys Gly Arg Gly Gly

50 55 60

Ala Gly Phe Ser Thr Gly Leu Lys Trp Ser Leu Met Pro Lys Asp Glu

65 70 75 80

Ser Met Asn Ile Arg Tyr Leu Leu Cys Asn Ala Asp Glu Met Glu Pro

85 90 95

Gly Thr Tyr Lys Asp Arg Leu Leu Met Glu Gln Leu Pro His Leu Leu

100 105 110

Val Glu Gly Met Leu Ile Ser Ala Phe Ala Leu Lys Ala Tyr Arg Gly

115 120 125

Tyr Ile Phe Leu Arg Gly Glu Tyr Ile Glu Ala Ala Val Asn Leu Arg

130 135 140

Arg Ala Ile Ala Glu Ala Thr Glu Ala Gly Leu Leu Gly Lys Asn Ile

145 150 155 160

Met Gly Thr Gly Phe Asp Phe Glu Leu Phe Val His Thr Gly Ala Gly

165 170 175

Arg Tyr Ile Cys Gly Glu Glu Thr Ala Leu Ile Asn Ser Leu Glu Gly

180 185 190

Arg Arg Ala Asn Pro Arg Ser Lys Pro Pro Phe Pro Ala Thr Ser Gly

195 200 205

Ala Trp Gly Lys Pro Thr Cys Val Asn Asn Val Glu Thr Leu Cys Asn

210 215 220

Val Pro Ala Ile Leu Ala Asn Gly Val Glu Trp Tyr Gln Asn Ile Ser

225 230 235 240

Lys Ser Lys Asp Ala Gly Thr Lys Leu Met Gly Phe Ser Gly Arg Val

245 250 255

Lys Asn Pro Gly Leu Trp Glu Leu Pro Phe Gly Thr Thr Ala Arg Glu

260 265 270

Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Gly Gly Met Arg Asp Gly Leu Lys Phe Lys

275 280 285

Ala Trp Gln Pro Gly Gly Ala Gly Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ala His

290 295 300

Leu Asp Leu Pro Met Glu Phe Glu Ser Ile Gly Lys Ala Gly Ser Arg

305 310 315 320

Leu Gly Thr Ala Leu Ala Met Ala Val Asp His Glu Ile Asn Met Val

325 330 335

Ser Leu Val Arg Asn Leu Glu Glu Phe Phe Ala Arg Glu Ser Cys Gly

340 345 350

Trp Cys Thr Pro Cys Arg Asp Gly Leu Pro Trp Ser Val Lys Ile Leu

355 360 365

Arg Ala Leu Glu Arg Gly Glu Gly Gln Pro Gly Asp Ile Glu Thr Leu

370 375 380

Glu Gln Leu Cys Arg Phe Leu Gly Pro Gly Lys Thr Phe Cys Ala His

385 390 395 400

Ala Pro Gly Ala Val Glu Pro Leu Gln Ser Ala Ile Lys Tyr Phe Arg

405 410 415

Glu Glu Phe Glu Ala Gly Ile Lys Gln Pro Phe Ser Asn Thr His Leu

420 425 430

Ile Asn Gly Ile Gln Pro Asn Leu Leu Lys Glu Arg Trp

435 440 445

<210> 31

<211> 910

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoG

<400> 31

Met Leu Met Ala Thr Ile His Val Asp Gly Lys Glu Tyr Glu Val Asn

1 5 10 15

Gly Ala Asp Asn Leu Leu Glu Ala Cys Leu Ser Leu Gly Leu Asp Ile

20 25 30

Pro Tyr Phe Cys Trp His Pro Ala Leu Gly Ser Val Gly Ala Cys Arg

35 40 45

Gln Cys Ala Val Lys Gln Tyr Gln Asn Ala Glu Asp Thr Arg Gly Arg

50 55 60

Leu Val Met Ser Cys Met Thr Pro Ala Ser Asp Gly Thr Phe Ile Ser

65 70 75 80

Ile Asp Asp Glu Glu Ala Lys Gln Phe Arg Glu Ser Val Val Glu Trp

85 90 95

Leu Met Thr Asn His Pro His Asp Cys Pro Val Cys Glu Glu Gly Gly

100 105 110

Asn Cys His Leu Gln Asp Met Thr Val Met Thr Gly His Ser Phe Arg

115 120 125

Arg Tyr Arg Phe Thr Lys Arg Thr His Arg Asn Gln Asp Leu Gly Pro

130 135 140

Phe Ile Ser His Glu Met Asn Arg Cys Ile Ala Cys Tyr Arg Cys Val

145 150 155 160

Arg Tyr Tyr Lys Asp Tyr Ala Asp Gly Thr Asp Leu Gly Val Tyr Gly

165 170 175

Ala His Asp Asn Val Tyr Phe Gly Arg Pro Glu Asp Gly Thr Leu Glu

180 185 190

Ser Glu Phe Ser Gly Asn Leu Val Glu Ile Cys Pro Thr Gly Val Phe

195 200 205

Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Arg Tyr Asn Arg Lys Trp Asp Met Gln

210 215 220

Phe Ala Pro Ser Ile Cys Gln Gln Cys Ser Ile Gly Cys Asn Ile Ser

225 230 235 240

Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Glu Leu Arg Arg Ile Glu Asn Arg Tyr Asn

245 250 255

Gly Thr Val Asn His Tyr Phe Leu Cys Asp Arg Gly Arg Phe Gly Tyr

260 265 270

Gly Tyr Val Asn Leu Lys Asp Arg Pro Arg Gln Pro Val Gln Arg Arg

275 280 285

Gly Asp Asp Phe Ile Thr Leu Asn Ala Glu Gln Ala Met Gln Gly Ala

290 295 300

Ala Asp Ile Leu Arg Gln Ser Lys Lys Val Ile Gly Ile Gly Ser Pro

305 310 315 320

Arg Ala Ser Val Glu Ser Asn Phe Ala Leu Arg Glu Leu Val Gly Glu

325 330 335

Glu Asn Phe Tyr Thr Gly Ile Ala His Gly Glu Gln Glu Arg Leu Gln

340 345 350

Leu Ala Leu Lys Val Leu Arg Glu Gly Gly Ile Tyr Thr Pro Ala Leu

355 360 365

Arg Glu Ile Glu Ser Tyr Asp Ala Val Leu Val Leu Gly Glu Asp Val

370 375 380

Thr Gln Thr Gly Ala Arg Val Ala Leu Ala Val Arg Gln Ala Val Lys

385 390 395 400

Gly Lys Ala Arg Glu Met Ala Ala Ala Gln Lys Val Ala Asp Trp Gln

405 410 415

Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ile Gly Gln Arg Ala Lys His Pro Leu Phe

420 425 430

Val Thr Asn Val Asp Asp Thr Arg Leu Asp Asp Ile Ala Ala Trp Thr

435 440 445

Tyr Arg Ala Pro Val Glu Asp Gln Ala Arg Leu Gly Phe Ala Ile Ala

450 455 460

His Ala Leu Asp Asn Ser Ala Pro Ala Val Asp Gly Ile Glu Pro Glu

465 470 475 480

Leu Gln Ser Lys Ile Asp Val Ile Val Gln Ala Leu Ala Gly Ala Lys

485 490 495

Lys Pro Leu Ile Ile Ser Gly Thr Asn Ala Gly Ser Leu Glu Val Ile

500 505 510

Gln Ala Ala Ala Asn Val Ala Lys Ala Leu Lys Gly Arg Gly Ala Asp

515 520 525

Val Gly Ile Thr Met Ile Ala Arg Ser Val Asn Ser Met Gly Leu Gly

530 535 540

Ile Met Gly Gly Gly Ser Leu Glu Glu Ala Leu Thr Glu Leu Glu Thr

545 550 555 560

Gly Arg Ala Asp Ala Val Val Val Leu Glu Asn Asp Leu His Arg His

565 570 575

Ala Ser Ala Ile Arg Val Asn Ala Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Val

580 585 590

Met Val Val Asp His Gln Arg Thr Ala Ile Met Glu Asn Ala His Leu

595 600 605

Val Leu Ser Ala Ala Ser Phe Ala Glu Ser Asp Gly Thr Val Ile Asn

610 615 620

Asn Glu Gly Arg Ala Gln Arg Phe Phe Gln Val Tyr Asp Pro Ala Tyr

625 630 635 640

Tyr Asp Ser Lys Thr Val Met Leu Glu Ser Trp Arg Trp Leu His Ser

645 650 655

Leu His Ser Thr Leu Leu Ser Arg Glu Val Asp Trp Thr Gln Leu Asp

660 665 670

His Val Ile Asp Ala Val Val Ala Lys Ile Pro Glu Leu Ala Gly Ile

675 680 685

Lys Asp Ala Ala Pro Asp Ala Thr Phe Arg Ile Arg Gly Gln Lys Leu

690 695 700

Ala Arg Glu Pro His Arg Tyr Ser Gly Arg Thr Ala Met Arg Ala Asn

705 710 715 720

Ile Ser Val His Glu Pro Arg Gln Pro Gln Asp Ile Asp Thr Met Phe

725 730 735

Thr Phe Ser Met Glu Gly Asn Asn Gln Pro Thr Ala His Arg Ser Gln

740 745 750

Val Pro Phe Ala Trp Ala Pro Gly Trp Asn Ser Pro Gln Ala Trp Asn

755 760 765

Lys Phe Gln Asp Glu Val Gly Gly Lys Leu Arg Phe Gly Asp Pro Gly

770 775 780

Val Arg Leu Phe Glu Thr Ser Glu Asn Gly Leu Asp Tyr Phe Thr Ser

785 790 795 800

Val Pro Ala Arg Phe Gln Pro Gln Asp Gly Lys Trp Arg Ile Ala Pro

805 810 815

Tyr Tyr His Leu Phe Gly Ser Asp Glu Leu Ser Gln Arg Ala Pro Val

820 825 830

Phe Gln Ser Arg Met Pro Gln Pro Tyr Ile Lys Leu Asn Pro Ala Asp

835 840 845

Ala Ala Lys Leu Gly Val Asn Ala Gly Thr Arg Val Ser Phe Ser Tyr

850 855 860

Asp Gly Asn Thr Val Thr Leu Pro Val Glu Ile Ala Glu Gly Leu Thr

865 870 875 880

Ala Gly Gln Val Gly Leu Pro Met Gly Met Ser Gly Ile Ala Pro Val

885 890 895

Leu Ala Gly Ala His Leu Glu Asp Leu Lys Glu Ala Gln Gln

900 905 910

<210> 32

<211> 325

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoH

<400> 32

Met Ser Trp Ile Ser Pro Glu Leu Ile Glu Ile Leu Leu Thr Ile Leu

1 5 10 15

Lys Ala Val Val Ile Leu Leu Val Val Val Thr Cys Gly Ala Phe Met

20 25 30

Ser Phe Gly Glu Arg Arg Leu Leu Gly Leu Phe Gln Asn Arg Tyr Gly

35 40 45

Pro Asn Arg Val Gly Trp Gly Gly Ser Leu Gln Leu Val Ala Asp Met

50 55 60

Ile Lys Met Phe Phe Lys Glu Asp Trp Ile Pro Lys Phe Ser Asp Arg

65 70 75 80

Val Ile Phe Thr Leu Ala Pro Met Ile Ala Phe Thr Ser Leu Leu Leu

85 90 95

Ala Phe Ala Ile Val Pro Val Ser Pro Gly Trp Val Val Ala Asp Leu

100 105 110

Asn Ile Gly Ile Leu Phe Phe Leu Met Met Ala Gly Leu Ala Val Tyr

115 120 125

Ala Val Leu Phe Ala Gly Trp Ser Ser Asn Asn Lys Tyr Ser Leu Leu

130 135 140

Gly Ala Met Arg Ala Ser Ala Gln Thr Leu Ser Tyr Glu Val Phe Leu

145 150 155 160

Gly Leu Ser Leu Met Gly Val Val Ala Gln Ala Gly Ser Phe Asn Met

165 170 175

Thr Asp Ile Val Asn Ser Gln Ala His Val Trp Asn Val Ile Pro Gln

180 185 190

Phe Phe Gly Phe Ile Thr Phe Ala Ile Ala Gly Val Ala Val Cys His

195 200 205

Arg His Pro Phe Asp Gln Pro Glu Ala Glu Gln Glu Leu Ala Asp Gly

210 215 220

Tyr His Ile Glu Tyr Ser Gly Met Lys Phe Gly Leu Phe Phe Val Gly

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Gly Ile Val Thr Ile Ser Ala Leu Met Val Thr Leu Phe

245 250 255

Phe Gly Gly Trp Gln Gly Pro Leu Leu Pro Pro Phe Ile Trp Phe Ala

260 265 270

Leu Lys Thr Ala Phe Phe Met Met Met Phe Ile Leu Ile Arg Ala Ser

275 280 285

Leu Pro Arg Pro Arg Tyr Asp Gln Val Met Ser Phe Gly Trp Lys Ile

290 295 300

Cys Leu Pro Leu Thr Leu Ile Asn Leu Leu Val Thr Ala Ala Val Ile

305 310 315 320

Leu Trp Gln Ala Gln

325

<210> 33

<211> 180

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoI

<400> 33

Met Thr Leu Lys Glu Leu Leu Val Gly Phe Gly Thr Gln Val Arg Ser

1 5 10 15

Ile Trp Met Ile Gly Leu His Ala Phe Ala Lys Arg Glu Thr Arg Met

20 25 30

Tyr Pro Glu Glu Pro Val Tyr Leu Pro Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ile

35 40 45

Val Leu Thr Arg Asp Pro Asp Gly Glu Glu Arg Cys Val Ala Cys Asn

50 55 60

Leu Cys Ala Val Ala Cys Pro Val Gly Cys Ile Ser Leu Gln Lys Ala

65 70 75 80

Glu Thr Lys Asp Gly Arg Trp Tyr Pro Glu Phe Phe Arg Ile Asn Phe

85 90 95

Ser Arg Cys Ile Phe Cys Gly Leu Cys Glu Glu Ala Cys Pro Thr Thr

100 105 110

Ala Ile Gln Leu Thr Pro Asp Phe Glu Met Gly Glu Tyr Lys Arg Gln

115 120 125

Asp Leu Val Tyr Glu Lys Glu Asp Leu Leu Ile Ser Gly Pro Gly Lys

130 135 140

Tyr Pro Glu Tyr Asn Phe Tyr Arg Met Ala Gly Met Ala Ile Asp Gly

145 150 155 160

Lys Asp Lys Gly Glu Ala Glu Asn Glu Ala Lys Pro Ile Asp Val Lys

165 170 175

Ser Leu Leu Pro

180

<210> 34

<211> 184

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoJ

<400> 34

Met Glu Phe Ala Phe Tyr Ile Cys Gly Leu Ile Ala Ile Leu Ala Thr

1 5 10 15

Leu Arg Val Ile Thr His Thr Asn Pro Val His Ala Leu Leu Tyr Leu

20 25 30

Ile Ile Ser Leu Leu Ala Ile Ser Gly Val Phe Phe Ser Leu Gly Ala

35 40 45

Tyr Phe Ala Gly Ala Leu Glu Ile Ile Val Tyr Ala Gly Ala Ile Met

50 55 60

Val Leu Phe Val Phe Val Val Met Met Leu Asn Leu Gly Gly Ser Glu

65 70 75 80

Ile Glu Gln Glu Arg Gln Trp Leu Lys Pro Gln Val Trp Ile Gly Pro

85 90 95

Ala Ile Leu Ser Ala Ile Met Leu Val Val Ile Val Tyr Ala Ile Leu

100 105 110

Gly Val Asn Asp Gln Gly Ile Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ala Lys Ala

115 120 125

Val Gly Ile Thr Leu Phe Gly Pro Tyr Val Leu Ala Val Glu Leu Ala

130 135 140

Ser Met Leu Leu Leu Ala Gly Leu Val Val Ala Phe His Val Gly Arg

145 150 155 160

Glu Glu Arg Ala Gly Glu Val Leu Ser Asn Arg Lys Asp Asp Ser Ala

165 170 175

Lys Arg Lys Thr Glu Glu His Ala

180

<210> 35

<211> 100

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoK

<400> 35

Met Ile Pro Leu Gln His Gly Leu Ile Leu Ala Ala Ile Leu Phe Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Thr Gly Leu Val Ile Arg Arg Asn Leu Leu Phe Met Leu

20 25 30

Ile Gly Leu Glu Ile Met Ile Asn Ala Ser Ala Leu Ala Phe Val Val

35 40 45

Ala Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Thr Asp Gly Gln Val Met Tyr Ile Leu

50 55 60

Ala Ile Ser Leu Ala Ala Ala Glu Ala Ser Ile Gly Leu Ala Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gln Leu His Arg Arg Arg Gln Asn Leu Asn Ile Asp Ser Val Ser

85 90 95

Glu Met Arg Gly

100

<210> 36

<211> 613

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoL

<400> 36

Met Asn Met Leu Ala Leu Thr Ile Ile Leu Pro Leu Ile Gly Phe Val

1 5 10 15

Leu Leu Ala Phe Ser Arg Gly Arg Trp Ser Glu Asn Val Ser Ala Ile

20 25 30

Val Gly Val Gly Ser Val Gly Leu Ala Ala Leu Val Thr Ala Phe Ile

35 40 45

Gly Val Asp Phe Phe Ala Asn Gly Glu Gln Thr Tyr Ser Gln Pro Leu

50 55 60

Trp Thr Trp Met Ser Val Gly Asp Phe Asn Ile Gly Phe Asn Leu Val

65 70 75 80

Leu Asp Gly Leu Ser Leu Thr Met Leu Ser Val Val Thr Gly Val Gly

85 90 95

Phe Leu Ile His Met Tyr Ala Ser Trp Tyr Met Arg Gly Glu Glu Gly

100 105 110

Tyr Ser Arg Phe Phe Ala Tyr Thr Asn Leu Phe Ile Ala Ser Met Val

115 120 125

Val Leu Val Leu Ala Asp Asn Leu Leu Leu Met Tyr Leu Gly Trp Glu

130 135 140

Gly Val Gly Leu Cys Ser Tyr Leu Leu Ile Gly Phe Tyr Tyr Thr Asp

145 150 155 160

Pro Lys Asn Gly Ala Ala Ala Met Lys Ala Phe Val Val Thr Arg Val

165 170 175

Gly Asp Val Phe Leu Ala Phe Ala Leu Phe Ile Leu Tyr Asn Glu Leu

180 185 190

Gly Thr Leu Asn Phe Arg Glu Met Val Glu Leu Ala Pro Ala His Phe

195 200 205

Ala Asp Gly Asn Asn Met Leu Met Trp Ala Thr Leu Met Leu Leu Gly

210 215 220

Gly Ala Val Gly Lys Ser Ala Gln Leu Pro Leu Gln Thr Trp Leu Ala

225 230 235 240

Asp Ala Met Ala Gly Pro Thr Pro Val Ser Ala Leu Ile His Ala Ala

245 250 255

Thr Met Val Thr Ala Gly Val Tyr Leu Ile Ala Arg Thr His Gly Leu

260 265 270

Phe Leu Met Thr Pro Glu Val Leu His Leu Val Gly Ile Val Gly Ala

275 280 285

Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Leu Val Gln Thr Asp Ile

290 295 300

Lys Arg Val Leu Ala Tyr Ser Thr Met Ser Gln Ile Gly Tyr Met Phe

305 310 315 320

Leu Ala Leu Gly Val Gln Ala Trp Asp Ala Ala Ile Phe His Leu Met

325 330 335

Thr His Ala Phe Phe Lys Ala Leu Leu Phe Leu Ala Ser Gly Ser Val

340 345 350

Ile Leu Ala Cys His His Glu Gln Asn Ile Phe Lys Met Gly Gly Leu

355 360 365

Arg Lys Ser Ile Pro Leu Val Tyr Leu Cys Phe Leu Val Gly Gly Ala

370 375 380

Ala Leu Ser Ala Leu Pro Leu Val Thr Ala Gly Phe Phe Ser Lys Asp

385 390 395 400

Glu Ile Leu Ala Gly Ala Met Ala Asn Gly His Ile Asn Leu Met Val

405 410 415

Ala Gly Leu Val Gly Ala Phe Met Thr Ser Leu Tyr Thr Phe Arg Met

420 425 430

Ile Phe Ile Val Phe His Gly Lys Glu Gln Ile His Ala His Ala Val

435 440 445

Lys Gly Val Thr His Ser Leu Pro Leu Ile Val Leu Leu Ile Leu Ser

450 455 460

Thr Phe Val Gly Ala Leu Ile Val Pro Pro Leu Gln Gly Val Leu Pro

465 470 475 480

Gln Thr Thr Glu Leu Ala His Gly Ser Met Leu Thr Leu Glu Ile Thr

485 490 495

Ser Gly Val Val Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Ala Ala Trp Leu Trp

500 505 510

Leu Gly Lys Arg Thr Leu Val Thr Ser Ile Ala Asn Ser Ala Pro Gly

515 520 525

Arg Leu Leu Gly Thr Trp Trp Tyr Asn Ala Trp Gly Phe Asp Trp Leu

530 535 540

Tyr Asp Lys Val Phe Val Lys Pro Phe Leu Gly Ile Ala Trp Leu Leu

545 550 555 560

Lys Arg Asp Pro Leu Asn Ser Met Met Asn Ile Pro Ala Val Leu Ser

565 570 575

Arg Phe Ala Gly Lys Gly Leu Leu Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Leu Arg

580 585 590

Trp Tyr Val Ala Ser Met Ser Ile Gly Ala Val Val Val Leu Ala Leu

595 600 605

Leu Met Val Leu Arg

610

<210> 37

<211> 509

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoM

<400> 37

Met Leu Leu Pro Trp Leu Ile Leu Ile Pro Phe Ile Gly Gly Phe Leu

1 5 10 15

Cys Trp Gln Thr Glu Arg Phe Gly Val Lys Val Pro Arg Trp Ile Ala

20 25 30

Leu Ile Thr Met Gly Leu Thr Leu Ala Leu Ser Leu Gln Leu Trp Leu

35 40 45

Gln Gly Gly Tyr Ser Leu Thr Gln Ser Ala Gly Ile Pro Gln Trp Gln

50 55 60

Ser Glu Phe Asp Met Pro Trp Ile Pro Arg Phe Gly Ile Ser Ile His

65 70 75 80

Leu Ala Ile Asp Gly Leu Ser Leu Leu Met Val Val Leu Thr Gly Leu

85 90 95

Leu Gly Val Leu Ala Val Leu Cys Ser Trp Lys Glu Ile Glu Lys Tyr

100 105 110

Gln Gly Phe Phe His Leu Asn Leu Met Trp Ile Leu Gly Gly Val Ile

115 120 125

Gly Val Phe Leu Ala Ile Asp Met Phe Leu Phe Phe Phe Phe Trp Glu

130 135 140

Met Met Leu Val Pro Met Tyr Phe Leu Ile Ala Leu Trp Gly His Lys

145 150 155 160

Ala Ser Asp Gly Lys Thr Arg Ile Thr Ala Ala Thr Lys Phe Phe Ile

165 170 175

Tyr Thr Gln Ala Ser Gly Leu Val Met Leu Ile Ala Ile Leu Ala Leu

180 185 190

Val Phe Val His Tyr Asn Ala Thr Gly Val Trp Thr Phe Asn Tyr Glu

195 200 205

Glu Leu Leu Asn Thr Pro Met Ser Ser Gly Val Glu Tyr Leu Leu Met

210 215 220

Leu Gly Phe Phe Ile Ala Phe Ala Val Lys Met Pro Val Val Pro Leu

225 230 235 240

His Gly Trp Leu Pro Asp Ala His Ser Gln Ala Pro Thr Ala Gly Ser

245 250 255

Val Asp Leu Ala Gly Ile Leu Leu Lys Thr Ala Ala Tyr Gly Leu Leu

260 265 270

Arg Phe Ser Leu Pro Leu Phe Pro Asn Ala Ser Ala Glu Phe Ala Pro

275 280 285

Ile Ala Met Trp Leu Gly Val Ile Gly Ile Phe Tyr Gly Ala Trp Met

290 295 300

Ala Phe Ala Gln Thr Asp Ile Lys Arg Leu Ile Ala Tyr Thr Ser Val

305 310 315 320

Ser His Met Gly Phe Val Leu Ile Ala Ile Tyr Thr Gly Ser Gln Leu

325 330 335

Ala Tyr Gln Gly Ala Val Ile Gln Met Ile Ala His Gly Leu Ser Ala

340 345 350

Ala Gly Leu Phe Ile Leu Cys Gly Gln Leu Tyr Glu Arg Ile His Thr

355 360 365

Arg Asp Met Arg Met Met Gly Gly Leu Trp Ser Lys Met Lys Trp Leu

370 375 380

Pro Ala Leu Ser Leu Phe Phe Ala Val Ala Thr Leu Gly Met Pro Gly

385 390 395 400

Thr Gly Asn Phe Val Gly Glu Phe Met Ile Leu Phe Gly Ser Phe Gln

405 410 415

Val Val Pro Val Ile Thr Val Ile Ser Thr Phe Gly Leu Val Phe Ala

420 425 430

Ser Val Tyr Ser Leu Ala Met Leu His Arg Ala Tyr Phe Gly Lys Ala

435 440 445

Lys Ser Gln Ile Ala Ser Gln Glu Leu Pro Gly Met Ser Leu Arg Glu

450 455 460

Leu Phe Met Ile Leu Leu Leu Val Val Leu Leu Val Leu Leu Gly Phe

465 470 475 480

Tyr Pro Gln Pro Ile Leu Asp Thr Ser His Ser Ala Ile Gly Asn Ile

485 490 495

Gln Gln Trp Phe Val Asn Ser Val Thr Thr Thr Arg Pro

500 505

<210> 38

<211> 425

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NuoN

<400> 38

Met Asp Val Thr Pro Leu Met Arg Val Asp Gly Phe Ala Met Leu Tyr

1 5 10 15

Thr Gly Leu Val Leu Leu Ala Ser Leu Ala Thr Cys Thr Phe Ala Tyr

20 25 30

Pro Trp Leu Glu Gly Tyr Asn Asp Asn Lys Asp Glu Phe Tyr Leu Leu

35 40 45

Val Leu Ile Ala Ala Leu Gly Gly Ile Leu Leu Ala Asn Ala Asn His

50 55 60

Leu Ala Ser Leu Phe Leu Gly Ile Glu Leu Ile Ser Leu Pro Leu Phe

65 70 75 80

Gly Leu Val Gly Tyr Ala Phe Arg Gln Lys Arg Ser Leu Glu Ala Ser

85 90 95

Ile Lys Tyr Thr Ile Leu Ser Ala Ala Ala Ser Ser Phe Leu Leu Phe

100 105 110

Gly Met Ala Leu Val Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Leu Ser Phe Val Ala

115 120 125

Leu Gly Lys Asn Leu Gly Asp Gly Met Leu Asn Glu Pro Leu Leu Leu

130 135 140

Ala Gly Phe Gly Leu Met Ile Val Gly Leu Gly Phe Lys Leu Ser Leu

145 150 155 160

Val Pro Phe His Leu Trp Thr Pro Asp Val Tyr Gln Gly Ala Pro Ala

165 170 175

Pro Val Ser Thr Phe Leu Ala Thr Ala Ser Lys Ile Ala Ile Phe Gly

180 185 190

Val Val Met Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Pro Val Gly Asp Ser Glu Ala

195 200 205

Ile Arg Val Val Leu Ala Ile Ile Ala Phe Ala Ser Ile Ile Phe Gly

210 215 220

Asn Leu Met Ala Leu Ser Gln Thr Asn Ile Lys Arg Leu Leu Gly Tyr

225 230 235 240

Ser Ser Ile Ser His Leu Gly Tyr Leu Leu Val Ala Leu Ile Ala Leu

245 250 255

Gln Thr Gly Glu Met Ser Met Glu Ala Val Gly Val Tyr Leu Ala Gly

260 265 270

Tyr Leu Phe Ser Ser Leu Gly Ala Phe Gly Val Val Ser Leu Met Ser

275 280 285

Ser Pro Tyr Arg Gly Pro Asp Ala Asp Ser Leu Phe Ser Tyr Arg Gly

290 295 300

Leu Phe Trp His Arg Pro Ile Leu Ala Ala Val Met Thr Val Met Met

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ala Gly Ile Pro Met Thr Leu Gly Phe Ile Gly Lys Phe

325 330 335

Tyr Val Leu Ala Val Gly Val Gln Ala His Leu Trp Trp Leu Val Gly

340 345 350

Ala Val Val Val Gly Ser Ala Ile Gly Leu Tyr Tyr Tyr Leu Arg Val

355 360 365

Ala Val Ser Leu Tyr Leu His Ala Pro Glu Gln Pro Gly Arg Asp Ala

370 375 380

Pro Ser Asn Trp Gln Tyr Ser Ala Gly Gly Ile Val Val Leu Ile Ser

385 390 395 400

Ala Leu Leu Val Leu Val Leu Gly Val Trp Pro Gln Pro Leu Ile Ser

405 410 415

Ile Val Arg Leu Ala Met Pro Leu Met

420 425

<210> 39

<211> 4695

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSKH130

<400> 39

tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 60

gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 120

gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 180

agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 240

cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 300

gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 360

ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 420

caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 480

aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg 540

gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 600

ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 660

atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 720

tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 780

ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg 840

gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt gaaggatcag atcacgcatc 900

ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt caaaatcacc aactggtcca 960

cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt ctggctggat gatggggcga 1020

ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg cagacctcag cgctcaaaga 1080

tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca tccggcagtt caacagatcg 1140

ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt gatgtcattc tggtgaagaa 1200

gctcgaccgt cttggccgcg acaccgccga catgatccaa ctgataaaag agtttgatgc 1260

tcagggtgta gcggttcggt ttattgacga cgggatcagt accgacggtg atatggggca 1320

aatggtggtc accgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattggagct ccaccgcggt 1380

ggcggccgct ctagacttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 1440

cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgctagagga tcgatccttt 1500

ttaacccatc acatatacct gccgttcact attatttagt gaaatgagat attatgatat 1560

tttctgaatt gtgattaaaa aggcaacttt atgcccatgc aacagaaact ataaaaaata 1620

cagagaatga aaagaaacag atagattttt tagttcttta ggcccgtagt ctgcaaatcc 1680

ttttatgatt ttctatcaaa caaaagagga aaatagacca gttgcaatcc aaacgagagt 1740

ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgataaa gcaggcaaga 1800

cctaaaatgt gtaaagggca aagtgtatac tttggcgtca ccccttacat attttaggtc 1860

tttttttatt gtgcgtaact aacttgccat cttcaaacag gagggctgga agaagcagac 1920

cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag tttgcaaaac 1980

aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg 2040

cgaaagaaac gaaccaaaag ccatataagg aaacatacgg catttcccat attacacgcc 2100

atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtt cctgaattcg 2160

attcgtccac aattaaaaat atctcttctg caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc 2220

cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat 2280

tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta catgttctat caaaaagtcg 2340

gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat 2400

tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat 2460

ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct acactgattt ctccggtaaa cattacggca 2520

aacaaacact gacaactgca caagttaacg tatcagcatc agacagctct ttgaacatca 2580

acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac 2640

agcagttcat cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc 2700

actacgtaga agataaaggc cacaaatact tagtatttga agcaaacact ggaactgaag 2760

atggctacca aggcgaagaa tctttattta acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat 2820

tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag 2880

caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga 2940

aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa 3000

tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca 3060

ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa ttctttaact ggcccataca 3120

agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct 3180

ttacttactc acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct 3240

atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac gtttgcgcca agcttcctgc 3300

tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag catccttgaa caaggacaat 3360

taacagttaa caaataaaaa cgcaaaagaa aatgccgatg ggtaccgagc gaaatgaccg 3420

accaagcgac gcccaacctg ccatcggatc ccccgggctg caggaattcg atatcacgct 3480

agtcgaccta gctagcatat ggggagatct actagtaaag catgccaatt ggtattctat 3540

agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt 3600

ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg tagcatctgg cttactgaag cagaccctat 3660

catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg 3720

gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 3780

catggctaat tcccatgtca gccgttaagt gttcctgtgt cactcaaaat tgctttgaga 3840

ggctctaagg gcttctcagt gcgttacatc cctggcttgt tgtccacaac cgttaaacct 3900

taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt tttttcttat aaaacttaaa accttagagg 3960

ctatttaagt tgctgattta tattaatttt attgttcaaa catgagagct tagtacgtga 4020

aacatgagag cttagtacgt tagccatgag agcttagtac gttagccatg agggtttagt 4080

tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag 4140

cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatcttca gatcctctac gccggacgca 4200

tcgtggccgg atcttgcggc cgcaaaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 4260

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca ccaataactg 4320

ccttaaaaaa actagcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 4380

gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 4440

ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 4500

tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 4560

cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 4620

acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 4680

cgggaaacgt cttgc 4695

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено применение рекомбинантного микроорганизма рода Escherichia для получения O-фосфосерина, где указанный микроорганизм обладает повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью, и где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo. Также предложены способы получения О-фосфосерина, цистеина и производного цистеина с использованием указанного микроорганизма. Также предложены рекомбинантные микроорганизмы рода Escherichia, обладающие повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью и обладающие O-фосфосерин-продуцирующей способностью, где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo, в которых дополнительно понижена активность фосфосеринфосфатазы (SerB) по сравнению с ее эндогенной активностью или повышена активность O-фосфосерин-экспортирующего белка (YhhS) по сравнению с его эндогенной активностью. Изобретение обеспечивает высокопродуктивное продуцирование О-фосфосерина. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 табл., 2 пр.

1. Применение рекомбинантного микроорганизма рода Escherichia для получения O-фосфосерина, где указанный микроорганизм обладает повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью, и где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo.

2. Применение по п. 1, где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем включения последовательности регуляции экспрессии гена с повышенной активностью по сравнению с ее эндогенной активностью, находящейся выше по ходу транскрипции от гена, кодирующего NADH:хинон-оксидоредуктазу.

3. Применение по п. 1, где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем включения промотора гена с повышенной активностью по сравнению с его эндогенной активностью, находящейся выше по ходу транскрипции от гена, кодирующего NADH:хинон-оксидоредуктазу.

4. Применение по п. 2, где выше по ходу транскрипции от гена, кодирующего NADH:хинон-оксидоредуктазу, представляет собой выше по ходу транскрипции от гена nuoA.

5. Рекомбинантный микроорганизм рода Escherichia, обладающий повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью и обладающий O-фосфосерин-продуцирующей способностью,

где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo,

где в указанном микроорганизме дополнительно понижена активность фосфосеринфосфатазы (SerB) по сравнению с ее эндогенной активностью.

6. Рекомбинантный микроорганизм рода Escherichia, обладающий повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью и обладающий O-фосфосерин-продуцирующей способностью,

где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo,

где в указанном микроорганизме дополнительно повышена активность O-фосфосерин-экспортирующего белка (YhhS) по сравнению с его эндогенной активностью.

7. Применение по п. 1, где микроорганизм представляет собой Escherichia coli.

8. Способ получения O-фосфосерина, включающий культивирование рекомбинантного микроорганизма рода Escherichia в среде,

где указанный микроорганизм обладает повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью и обладает O-фосфосерин-продуцирующей способностью, и

где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo.

9. Способ по п. 8, дополнительно включающий выделение O-фосфосерина из культуральной среды или из микроорганизма.

10. Способ получения цистеина, включающий:

а) культивирование O-фосфосерин-продуцирующего микроорганизма с повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью в среде с получением O-фосфосерина или среды, содержащей O-фосфосерин,

где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo; и

б) взаимодействие O-фосфосерина, полученного на стадии (а), или среды, содержащей O-фосфосерин, с сульфидом в присутствии O-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего O-фосфосерин-сульфгидрилазу.

11. Способ получения производного цистеина, включающий:

а) культивирование O-фосфосерин-продуцирующего микроорганизма с повышенной активностью NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью в среде с получением O-фосфосерина или среды, содержащей O-фосфосерин,

где повышение активности NADH:хинон-оксидоредуктазы по сравнению с ее эндогенной активностью достигнуто путем увеличения экспрессии оперона nuo;

б) взаимодействие O-фосфосерина, полученного на стадии (а), или среды, содержащей O-фосфосерин, с сульфидом в присутствии O-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего O-фосфосерин-сульфгидрилазу; и

в) превращение цистеина, полученного на стадии (б), в производное цистеина.

12. Способ по п. 10 или 11, где сульфид представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S и Na2S2O3.