Способ прогнозирования рецидива рака щитовидной железы после радикального хирургического вмешательства Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 G01N33/574 C12Q1/6806 C12Q1/6886 G16H50/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и может быть применено для прогнозирования рецидива рака щитовидной железы в ближайшие два года после радикального хирургического вмешательства.

Рак щитовидной железы (РЩЖ) по темпам годового прироста в последние годы опережает другие злокачественные образования. В Российской Федерации среднегодовой темп прироста РЩЖ за 10 лет с 2011 г. составил 2,98%, что в сумме увеличило показатель заболеваемости на 35,64%. В 2021 г. зарегистрировано 10360 женщин и 2186 мужчин с этой патологией (см. Каприн, А.Д., Злокачественные новообразования в России в 2021 году.. - М., МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2022. - 252 с.).

Участие миРНК в онкогенезе при различных локализациях рака, их диагностическая и прогностическая значимость обсуждаются в большом числе исследований. Сборка миРНК первично происходит в ядре клеток (см. Назипова Н.Н. Разнообразие некодирующих РНК в геномах эукариот // Математическая биология и биоинформатика. 2021 Т. 16 №2 С. 256-298. doi: 10.17537/2021.16.156). Регулируют транскрипционные процессы миРНК путем прямого деградирующего влияния на матричную РНК (см. Аушев В.Н. https://cyberleninka.ru/article/n/mikrornk-malye-molekuly-s-bolshim-znacheniem; см. Луценко А.С. и соавт., 2017). В результате такого воздействия нарушается процесс синтеза соответствующего мРНК белка-мишени. В связи с этим, чем выше экспрессионная активность миРНК, тем ниже уровень тканевой экспрессии соответствующего белка. миРНК находятся как внутриклеточно, так и внеклеточно, попадая в кровь, слюну, мочу, спинномозговую жидкость, суставную жидкость и т.д. (см. Гареев И.Ф., Бейлерли О.А. Циркулирующие микроРНК как биомаркеры: какие перспективы? https://www.mediasphera.ru/issues/profilakticheskaya-meditsina/2018/6/downloads/ru/1230549482018061142).

Дифференциальная экспрессия миРНК опухолевыми клетками давно установленный факт. Но диагностический и прогностический потенциал циркулирующих миРНК при РЩЖ полностью не раскрыт, что ограничивает практическое применение маркеров в данном направлении и объясняет научный интерес к тематике.

Дифференциальная диагностика разных по характеру узловых образований щитовидной железы (ЩЖ) далека от совершенства. Существующие методы современной диагностики позволяют установить наличие локализацию узлового образования ЩЖ и не всегда уточнить характер заболевания. С целью морфологической верификации узловых образований ЩЖ чаще используют тонкоигольную аспирационную биопсию (ТАБ) под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием полученного аспирата, эффективность которого остается невысокой (см. В.А. Белобородов, О.С. Олифирова, С.П. Шевченко, А.Т. Саая, В.А. Маньковский, О.В. Еселевич, Р.В. Модин. Морфологическая верификация рака щитовидной железы // Сибирский онкологический журнал. 2007. №2 (22). С. 69-72).

Известен способ диагностики рака щитовидной железы, заключающийся в выявлении наличия мутаций V600E гена BRAF в дооперационном материале при ТАБ. В исследование были включены 46 пациентов с узловыми образованиями щитовидной железы, которым была проведена ТАБ. ДНК выделялась сорбентным методом из материала ТАБ. Выявление мутации гена BRAF проводилось с помощью ПЦР с праймерами, характерными для дикого и мутант+ ного типа гена. По результатам цитологического исследования все пациенты были разделены на 3 группы: 1+я - больные с узловым коллоидным зобом (УКЗ) (n=9), 2+я - больные папиллярным раком (ПР) (n=19) и 3+я - пациенты с неопределенными результатами ТАБ (n=18). В группе пациентов с ПР все диагнозы были подтверждены гистологически, и мутация ге+ на BRAF была выявлена у 15 (79%) пациентов. В группе с неопределенным цитологическим диагнозом только у одного пациента определена мутация гена BRAF и при гистологическом исследовании был диагностирован фолликулярный рак. У 16 пациентов с гистологическим диагнозом «фолликулярная аденома», у 9 пациентов с УКЗ и у 1 пациента с фолликулярным раком мутации BRAFV600E выявлено не было. Таким образом, мы получили следующие критерии достоверности метода: чувствительность - 76%, специфичность - 100% и диагностическая точность - 89% (см. Д.Ю. Семенов, М.И. Зарайский, М.Е. Борискова и соавт. Значение выявления мутации гена BRAF в дооперационной диагностике рака щитовидной железы // Клиническая и экспериментальная тиреоидология, 2009, том 5, №4. С. 33-37). Однако, данная методика не может быть использована для опеределения прогноза заболевания, когда опухоль уже удалена.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего прогнозировать развитие рецидива рака щитовидной железы в ближайшие два года после радикального хирургического вмешательства на основе исследования миРНК сыворотки крови.

Технический результат достигается тем, что у больных через 6 месяцев после операции осуществляют забор крови из локтевой вены, в сыворотке крови выделяют тотальную микроРНК, определяют экспрессию миРНК-146b, при превышении экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови уровня 1,08 прогнозируют развитие рецидива заболевания в ближайшие два года после после радикального хирургического вмешательства.

Диагностическая чувствительность теста составиляет 85,71%, а диагностическая специфичность 80,36%.

Для лучшего понимания способа приводим фигуры.

Фигура 1. Поэтапное изменение экспрессии миРНК-146b у больных раком щитовидной железы с учетом рецидива заболевания. * - статистически значимые изменения между подгруппами.

Фигура 2. Относительный индекс изменения экспрессии миРНК-146b через 6 и 12 месяцев после операции по сравнению с исходным уровнем (log2 отношения экспрессии миРНК после операции к экспрессии до операции) у больных со злокачественными образованиями ЩЖ с учетом рецидива заболевания. * - статистически значимое отличие по сравнению с исходным уровнем.

Фигура 3. Соотношение диагностической чувствительности и специфичности прогноза развития рецидива рака ЩЖ при изменении экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови

Способ осуществляется следующим образом.

Пациенту с установленным диагнозом - рак щитовидной железы, спустя 6 месяцев после гемитиреоидэктомии осуществляют забор крови из локтевой вены. В сыворотке крови выделяют тотальную микроРНК с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, США). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводят на спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получают кДНК, используя набор компании «Альгимед-Техно» (Беларусь). Экспрессию миРНК-146b определяют методом dCt относительно референсной миРНК-7а (Let-7a) (dCt=2^{(Ct миРНК-Х - Ct миРНК-7а)}). При превышении уровня экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови выше 1,08 через 6 месяцев после операции, прогнозируют развитие рецидива заболевания в ближайшие два года.

В ходе работы авторами установлено, что у 63 пациентов, больных раком щитовидной железы через 6 месяцев после радикального хирургического вмешательства уровень циркулирующей миРНК-146b снижался относительного исходных значений практически в три раза, а к 18 месяцам - удваивался относительно этапа, соответствующего 6 и 12 месяцев (см. Таблица 1).

У больных раком щитовидной железы в зависимости от наличия или отсутствия рецидива заболевания ретроспективно определяли динамику экспрессии миРНК в крови после операции. У больных с рецидивом заболевания через 6, 12 и 18 месяцев экспрессия миРНК-146b была выше относительно исходного уровня. У пациентов без рецидива на всех этапах наблюдения уровни миРНК-146b были ниже дооперационной величины показателя (см. Фиг. 1, Таблица 2).

Оценка относительного изменения экспрессии миРНК в крови после операции по сравнению с исходной величиной, выраженная в процентном соотношении, ненадежна, поскольку зависит от исходного абсолютного значения показателя. В связи с этим, кратность изменения экспрессии маркеров была прологарифмирована, что стандартизировало динамику параметров. Относительный индекс изменения экспрессии миРНК-146b через 6 и 12 месяцев после операции по сравнению с исходным уровнем представлен на Фиг. 2.

По итогам анализа выявлено, что при рецидивировании РЩЖ через 6 месяцев после операции экспрессия миРНК-146b возрастала, а при отсутствии рецидива снижалась по сравнению с дооперационным уровнем. Профилирование экспрессии миРНК имеет не только диагностическую ценность, но и позволяет мониторировать, а также прогнозировать прогрессирование злокачественного процесса в щитовидной железе. Полученные результаты исследования позволяют рекомендовать при наблюдении за больными раком щитовидной железы проведение оценки экспрессии миРНК-146b.

Кроме оценки направленности изменения экспрессии циркулирующих миРНК-146b после операции у больных раком щитовидной железы для формирования прогноза рецидива заболевания методом ROC анализа была найдена разделительная точка, при превышении которой риск прогрессирования болезни резко повышался. Пациенты, у которых развился рецидив РЩЖ, получали ранг 1, а при безрецидивном течении болезни статус ранжировался как 0. С установленным рангом соотносили величины экспрессионной активности циркулирующих миРНК-146b.

Для экспрессии циркулирующей миРНК-146b через 6 месяцев после операции разделительная точка cut-off по итогам ROC анализа составила 1,08. При превышении экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови уровня 1,08 через 6 месяцев после операции риск рецидива заболевания в ближайшие два года после тиреоидэктомии повышался. Диагностическая чувствительность теста составила 85,71%, а диагностическая специфичность 80,36%. Площадь под ROC кривой (AUC) соответствовала 0,807±0,116 (доверительный интервал 95% 0,689-0,896). ROC кривая статистически значимо отличалась от опорной диагональной линии с доверительной вероятностью р=0,0081 (z=2,649) (см. Фиг 3).

При достижении экспрессионной активности миРНК-146b в сыворотке крови уровня 1,08 и выше через 6 месяцев после операции риск развития рецидива болезни повышался в 4,36 раз (отношение шансов 4,36, доверительный интервал 95% 3,87-6,92, р=0,0081) (см. Таблица 3).

Сроки развития рецидива заболевания РЩЖ за двухлетний срок наблюдения варьировали в диапазоне от 11 мес.до 23 мес.после операции.

Итак, у больных раком щитовидной железы через 6 месяцев после радикального хирургического вмешательства превышение экспрессии миРНК-146b более 1,08 сопряжено с высоким риском развития рецидива болезни в ближайшие два года.

Приводим клинические примеры применения способа.

Клинический пример 1.

Пациентка О., 59 лет обратилась в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России после поликлинического приема в общей лечебной сети и планового ежегодного обследования. Жалоб нет. При ультразвуковом исследовании в щитовидной железе выявлен узел.

В НМИЦ онкологии при выполнении ТАБ под контролем ультразвукового сканирования после цитологического исследования получено заключение - папиллярная карцинома.

Выполнена гемитиреоидэктомия. Для прогноза заболевания, через 6 месяцев после операции сыворотка крови больной направлена на молекулярно-генетическое исследование. Выделена тотальная микроРНК с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, США). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получали кДНК, используя набор компании «Альгимед-Техно» (Беларусь). Экспрессию миРНК-146b определяли методом dCt относительно референсной миРНК-7а (Let-7a) (dCt=2^{(Ct миРНК-Х - Ct миРНК-7а)}). В результате проведенного исследования установлен уровень экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови 1,6, что свидетельствует о высоком риске развития рецидива заболевания в ближайшие два года. Через 1 год и 3 мес.после операции у больной при МРТ исследовании был диагностирован рецидив.

Клинический пример 2.

Пациент К., 68 лет, обратился в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. При ультразвуковом исследовании в щитовидной железе выявлен узел. В НМИЦ онкологии при выполнении ТАБ под контролем ультразвукового сканирования после цитологического исследования получено заключение - папиллярная карцинома.

Выполнена гемитиреоидэктомия.

Для прогноза заболевания, через 6 месяцев после операции сыворотка крови больной направлена на молекулярно-генетическое исследование. Выделена тотальная микроРНК с помощью набора реагентов PureLink RNA Mini Kit (Thermo Scientific, США). Общую концентрацию и оценку качества выделенной РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, США). Путем обратной транскрипции получали кДНК, используя набор компании «Альгимед-Техно» (Беларусь). Экспрессию миРНК-146b определяли методом dCt относительно референсной миРНК-7а (Let-7a) (dCt=2^{(Ct миРНК-Х - Ct миРНК-7а)}). В результате проведенного исследования установлено низкая экспрессия миРНК-146b в сыворотке крови - 0,6, что свидетельствует о низком риске рецидива заболевания в ближайшие два года. На контрольном исследовании через 2 года после операции у больной рецидив не развился.

Данным способом был рассчитан прогноз 25 пациентам.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволяет спустя 6 месяцев после радикального хирургического вмешательства по поводу рака щитовидной железы прогнозировать развитие рецидива заболевания в ближайшие два года.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидива рака щитовидной железы после радикального хирургического вмешательства. Через 6 месяцев после операции осуществляют забор крови из локтевой вены. Из сыворотки крови выделяют тотальную микроРНК. Определяют экспрессию миРНК-146b. При превышении уровня 1,08 экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови прогнозируют развитие рецидива заболевания в ближайшие два года после радикального хирургического вмешательства. Способ позволяет прогнозировать развитие рецидива рака щитовидной железы в ближайшие два года после радикального хирургического вмешательства за счет определения уровня экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови. 3 ил., 3 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования рецидива рака щитовидной железы после радикального хирургического вмешательства, заключающийся в том, что у больных через 6 месяцев после операции осуществляют забор крови из локтевой вены, из сыворотки крови выделяют тотальную микроРНК, определяют экспрессию миРНК-146b, при превышении экспрессии миРНК-146b в сыворотке крови уровня 1,08 прогнозируют развитие рецидива заболевания в ближайшие два года после радикального хирургического вмешательства.