Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости АстINомYсеS KURSSaNoVII 93 Советский патент 1992 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к способам выделения и очистки ферментов хроматографией, конкретно к способам выделения хитинзз из Kurssanovii 93.

Известен способ выделения хитиназ из культуральной жидкости путем сорбции ферментов на хитине с последующим его гидролизом хитиназами. Этот метод приводит к потере более 60% исходной хитиназ- ной активности и не позволяет разделить ферменты, близкие по сродству к хитину.

Наиболее близким к предолженному по технической сущности и достигнутыми результатам является способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Act. Kurssanovii 93 осаждением фермента этиловым спиртом или сульфатом аммония.

Однако, данный способ не позволяет получать ферменты высокой степени очистки. Активность препарата составляет только 18-22 ед/мл.

Целью изобретения является повышение степени очистки хитиназ.

Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Actinomyces Kurssanovii заключается в том, что ее наносят на имино- диуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди и уравновешенную буфером, создающим рН 6,0-7,5, вымывают балластные белки при рН 6,0-7.5. затем последовательно элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижения рН сначала до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, после чего каждую из двух фракций белков

VI

01

о со

СП

Јь

после доведения в них рН до 6,8-/,2, наносят на бутил-Тойоперл 650 М, уравновешенный буфером, создающим рН 6,8-7,2 и содержащим сульфат натрия с концентрацией 1,0-1,5 М, затем примеси первой фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся с 1,0-1,5 до-0,1 М, а хитиназу вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01-0,02 М, примеси второй фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся с 1,0-1,5 до 0,3-0, 4 М, хитиназу с мол.м. 26 кДа вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией 0,1-0,2 М, хитиназу с мол.м, 42 кДа вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01-0,02 М.

Способ осуществляется следующим образом.

На колонку с иминодиуксуснокислой агарозой, заряженной ионами двухвалентной меди и уравновешенной буфером с рН 6,0-7,5, содержащим 0,5-1,0 М хлористого натрия, наносят кулътуральную жидкость Actlnomyces Kurssanovli 93 в объеме, равном объему колонки. Элюцию проводят со скоростью 0,8-1,0 мл/мин при ступенчатой смене буферов следующего состава:

А - 0,1 М натрий-ацетатный буфер. рН 6,0-7,5, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натрия;

Б - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,8-5,6, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натрия;

3 - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 3,8-4,5, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натрия.

При этом на колонке не сорбируются ft -N-ацетилглюкоззминидаза, протеазы (80% протеазной активности культуральной жидкости) и другие примеси. Белки, обладающие хитиназной активностью по коллоидному хитину, которую оценивают по количеству восстанавливающих Сахаров с помощью 3,5- динитросалициловой кислоты, элюируют путем ступенчатого понижения рН сначала буфером Б, а затем буфером В (первая и вторая фракции соответственно).

В каждой из двух фракций белков доводят рН до 6,8-7.2. после чего их наносят на колонку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешенным 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8-7,2, содержащим 1,0-1,5 М сульфата натрия. Элюцию проводят убывающим градиентом концентрации сульфата натрия, задаваемым автоматическим смесителем в течение 2 ч, со скоростью 0,8-1,0 мл/мин. Начальный буфер: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,2, содержащий 1,0-1,5 М сульфата натрия, конечный буфер: 0,01- 0,02 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,2.

Примеси первой фракции элюируют в градиенте концентрации сульфата натрия, хитиназу (XI) вымывают 0,01-0,02 М фосфатным буфером рН 6,8-7,2, примеси второй

5 фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся от 1,0-1,5 до 0,3-0,4 М, хитиназу с мол.м. 26 кДа (XI) вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией 0,1-0,2 М, а хитиназу

0 с мол.м, 42 кДа (XIII) вымывают 0,01-0,02 М фосфатным буфером рН 6,8-7,2, не содержащим сульфата натрия.

Рели иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди,

5 уравновесить буфером, имеющим рН меньше 6,0, и проводить сорбцию белков культуральной жидкости Actlnomyces Kurssanlvii 93 при этом рН, то хитмназа первой фракции не будет задерживаться на колонке, а будет

0 элюировзться вместе с балластными ми, что исключает ее выделение в индивидуальном виде.

Если рН уравновешивающего буфера и буфера А больше 7,5, происходит частичная

5 инактивация ферментов.

Если первую фракцию белков вымывать с иминодиуксуснокислой агарозы при рИ меньше 4,8, не удается ее полностью отделить от второй фракции, при рН больше 5,6,

0 хитиназа не элюируется с сорбента.

Если вторую фракцию белков вымывать с сорбента при рН меньше 3,8, происходит частичная инактивация ферментов, при рЫ больше 4,5, фракция не элюируотся с ими5 нодиуксуснокислой агарозы.

Интервал рН 6,8-7,2 соответствует минимуму потерь хитинззной активности, поэтому данный интервал рН использован для хроматографической очистки первой и вто0 рой фракций белков на бутил-Тойоперле. Уравновешивающий буфер содержит сульфат натрия в концентрации 1,0-1,5 М. При меньшей концентрации наблюдается неполная сорбция хиткчаз, при более высокой

5 концентрации - высаливание белков.

Хитиназа, содержащаяся в первой фракции, элгаируется с бутил-Тойоперла в 0,01-0,02 М фосфатном буфере. Если проводить элюцию буфером с концентрацией

0 больше 0,02 М или меньше 0,01 М, не произойдет полного элюирования фермента, По аналогичным соображениям выбран интервал концентрации сульфата натрия 0,1- 0,2 М для элюированил хитинази второй

5 фракции.

Осуществление способа в объеме изложенных признаков позволяет получать препараты высокоочищенных ферментов, гомогенных по данным электрофореза в полиакриламмдном геле в денатурирующих условиях, имеющих активность; 0,9 ± 0,02 мкМ/мг мин, (XI), 1,59 ± 0,02 мкМ/м мин (XII), 5,13 ± 0,02 мкМ/мг мин (XIII), что превышает активность продукта, получаемого по известному способу в 5, 10 и 32 раза соответственно для ферментов XI, XII и XIII.

Иминодиуксуснокислая агароза, заряженная ионами двухвалентной меди, ранее использовалась для разделения ферментов класса нуклеаз, однако она не использовалась для разделения карбогид- раз, к которым относятся хитинззы; указанная функция носителя не вытекает с очевидностью из его изчстных свойств.

Пример 1. Колонку с иминодиуксус- нокислой агарозой заряжают ионами меди промыванием колонки пятью объемами 0,5 М раствора сульфата меди, уравновешивают 0,1 М натрия - ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М хлористого натрия. На колонку (2,0 4,5 см) наносят 15 мл куль- туральной жидкости. Элюцию проводят со скоростью 0,8 мл/мин при ступенчатой смене буфером следующего состава:

А - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 6,5. содержащий 0,5 М хлористого натрия;

Б - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0, содержащий 0,5 М хлористого натрия,

В - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,0, содержащий 0,5 М хлористого натрия, объем фракций 4 мл.

Хитиназная активность была обнаружена во фракциях белков, элюирующихся буферами Б и В. Каждую из этих фракций после доведения рН до 7,0 наносят на колонку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешенную 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 1,0 М сульфата натрия. Размер колонки (2,5 х 7,5 см), наносят 16 оптических единиц (280 нм). Элюцию проводят линейным градиентом сульфата натрия от 1,0 до О М, задаваемым автоматическим смесителем Ультраград, со скоростью 0,8 МЛ/РШН в течение 2 ч. Начальный буфер: 0,1 М натрий-фосфатный, рН 7,0, содержащий 1,0 М сульфата натрия; конечный буфер: 0,02 М натрий-фосфатный, рН 7,0. После

этого колонку промывают конечным буфером.

Пример 2-9. Способ осуществляется аналогично примеру 1.

Режимы его проведения представлены

в табл.1, активность полученного продукта проведена в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый способ

позволяет повысить степень очистки хитиназ XI, XII, XIII из культуральной жидкости

Actlnomyces Kurssanovll 93 в 5, 10 и 32 разя

соответственно,

ф ормула изобретения

Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Actlnomyces Kurssanovll 93, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки хитиназ. куль- туральную жидкость наносят на иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди и уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером рН 6,0-7,5, содержащим хлористый натрий, отмывают балластные белки, затем последовательно

элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижения рН сначаладо4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, в каждой из двух фракций доводят рН до 6,8-7,2, после чего наносят их на бутил-тойоперл 650 М, уравновешенный 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8-7,2, содержащим 1,0-1,5 моль сульфата натрия, вымывают примеси первой фракции тем же буфером с сульфатом натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5

до 0,1 моль, а элюцию хитиназы осуществляют убывающим от 1,0-1,5 доО мол. градиентом концентрации сульфата натрия в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буфере, при этом примеси второй фракции вымывают

буферным раствором, содержащим сульфат натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1.5 до 0,3-0,4 моль, хитиназу с мол.м. 26 кДа вымывают раствором, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,20,1 моль, а хитиназу с мол.м. 42 кДа вымывают 0,01-0,02 М натрий-фосфатным буфером.

Таблица 1

Изобретение относится к получению ферментов, в частности хитиназ, продуцируемых актиномицетами. Целью изобретения является повышение степени очистки хитиназ. Изобретение заключается в том, что хитиназы (XI, XII, XIII) выделяют непосредственно из культуральной жидкости Actinomyces kurssanovil 93 в две стадии: ли- гандообменной хроматографией на имино- диуксусной агарозе, заряженной ионами двухвалентной меди, путем ступенчатого понижения рН сначала от 6,0-7,5 до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5 (первая и вторая фракции соответственно). После этого фракции подвергают дополнительной очистке с помощью гидрофобной хроматографии на бутил-Тойоперле в градиенте концентрации сульфата натрия от 1,5-1,0 М до 0, хитиназы вымывают фосфатным буфером, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,1-0,2 М и не содержащим сульфат натрия. Степень очисгки до 25. 2 табл. fe