CPG АМФИФИЛЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/70 

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Указанная копия ASCII, созданная ______________, имеет название __________________________ и имеет размер _______ байт.

Предпосылки создания изобретения

Рак, связанный с вирусом папилломы человека (HPV), является одним из самых быстрорастущих онкологических заболеваний в мире. В целом 5% всех онкологических заболеваний в мире можно отнести к инфекциям HPV. По-прежнему существует потребность в новых и более эффективных способах лечения рака.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает соединения, которые можно использовать в терапевтических способах.

Соответственно, в первом аспекте изобретение обеспечивает соединение, состоящее из нуклеотидной последовательности 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:1), которая, на ее 5'-конце, связана или соединена при помощи линкера со следующим липидом:

,

или его солью,

где Х представляет собой О или S.

В одном варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения нуклеотидная последовательность связана с липидом.

В другом варианте осуществления первого аспекта настоящего изобретения все межнуклеозидные группы, соединяющие нуклеозиды в 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:1), представляют собой фосфоротиоаты.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает способ лечения рака у пациента-человека. Этот способ включает введение пациенту соединения в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2), и белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3).

В одном варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения рак является папилломавирус человека(HPV)-положительным (например, HPV 16 типа-положительным).

В другом варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения рак представляет собой плоскоклеточный рак головы или шеи.

В дополнительном варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения пациент получает или получал химиотерапию препаратами платины. В следующем варианте осуществления пациенту вводят анти-PD-1 антитело (например, пембролизумаб или ниволумаб).

В другом варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения соединение первого аспекта изобретения и белки, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, вводят одновременно.

В следующем варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения соединение первого аспекта изобретения и белки, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, вводят последовательно.

В другом аспекте изобретение обеспечивает другой способ лечения рака у пациента-человека. Этот способ включает введение пациенту соединения в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2), белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3), и

анти-PD-1 антитела (например, пембролизумаба или ниволумаба).

В третьем аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую соединение первого аспекта настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления третьего аспекта фармацевтическая композиция дополнительно включает белок, включающий аминокислотную последовательность: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2), и белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3).

В четвертом аспекте изобретение обеспечивает набор, включающий (i) соединение первого аспекта настоящего изобретения или композицию второго аспекта настоящего изобретения и (ii) белок, включающий аминокислотную последовательность: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2), и белок, включающий аминокислотную последовательность: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3).

Определения

“Линкер” в контексте настоящей заявки относится к одновалентной или двухвалентной группе, в которой одна валентность ковалентно связана с одной биологически функциональной группой, а другая валентность ковалентно связана с другой биологически функциональной группой. В одном примере линкер соединяет нуклеотидную последовательность, например CpG олигонуклеотида, с липидом (например, -P(X)(OH)-O-CH(CH₂NHCO-(CH₂)₁₆-CH₃)₂, или его солью, где Х представляет собой О или S, как описано в настоящей заявке). Такие линкеры могут необязательно включать один или несколько нуклеотидов, например динуклеотид (например, GG)

“Фармацевтически приемлемый носитель” в контексте настоящей заявки относится к носителю, способному суспендировать или растворять активное соединение и который является нетоксичным и не вызывает воспаление у пациента. Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может включать фармацевтически приемлемую добавку, такую как консервант, антиоксидант, ароматизатор, эмульгатор, краситель или эксципиент, известную или используемую в области формулирования лекарственных препаратов, которая не оказывает значительного влияния на терапевтическую эффективность биологической активности активного вещества и которая нетоксична для пациента.

Термины “лечить”, “лечение” и “лечащий” относятся к терапевтическим подходам, цель которых устранить, облегчить, нормализовать, подавить, замедлить или остановить прогрессирование или тяжесть состояния, связанного с заболеванием или расстройством, например раком. Эти термины включают уменьшение или облегчение по меньшей мере одного неблагоприятного эффекта или симптома состояния, заболевания или расстройства. Лечение обычно является “эффективным”, если один или несколько симптомов или клинических маркеров уменьшаются, или если индуцируется желаемый ответ (например, специфический иммунный ответ). Альтернативно, лечение является “эффективным”, если прогрессирование заболевания замедляется или останавливается.

Настоящее изобретение обеспечивает несколько преимуществ. Например, при включении липидных фрагментов и, необязательно, линкера некоторые соединения по настоящему изобретению связываются с эндогенным альбумином у субъектов, которым их вводят, что усиливает доставку соединений к лимфатическим узлам субъектов. Это облегчает индукцию терапевтического иммунного ответа против, например, белков HPV, вводимых субъекту, что приводит к эффективному лечению рака.

Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет график, показывающий иммунный ответ против HPV16 E6.

Фиг. 2 представляет график, показывающий иммунный ответ против HPV16 E7.

Фиг. 3 представляет график, показывающий анализ тетрамерного окрашивания для HPV16 E7.

Фиг. 4 представляет серию графиков, показывающих, что введение E6 HPV16 и E7 HPV16 с амфифильным CpG (aCpG) уменьшало размер опухоли по сравнению с одним aCpG или отсутствием обработки (No Tx).

Фиг. 5 представляет график, показывающий превосходный ответ тетрамера HPV при использовании aCpG вакцины по сравнению с вакциной с растворимым CpG в различные моменты времени.

Фиг. 6 представляет график, показывающий устойчивые ответы тетрамера HPV с течением времени при введении aCpG один раз в неделю или один раз в две недели.

Фиг. 7 представляет график, показывающий изменение размера опухоли как ответ на обработку E7 вакциной.

Фиг. 8 представляет график, показывающий улучшенную выживаемость обработанных E7 вакциной мышей C57BL6, которым были имплантированы опухолевые клетки TC-1.

Фиг. 9 представляет серию графиков, показывающих изменения уровня цитокинов в сыворотке после введения дозы.

Фиг. 10 представляет график, показывающий ответы тетрамера в течение некоторого времени для вакцины HPV16 E7/aCpG.

Фиг. 11 представляет график, показывающий рост опухоли как ответ на HPV16 E7/aCpG вакцинацию плюс или минус введение анти-PD-1 антитела.

Фиг. 12 представляет график, показывающий эффекты HPV16 E7/aCpG вакцинации плюс или минус введение анти-PD-1 антитела на выживаемость мышей с опухолью TC-1.

Фиг. 13 представляет график, показывающий анализ тетрамера для увеличения дозы aCpG.

Фиг. 14 показывает структуру амфифильного CpG-7909; 5'-( Диациллипид) TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (SEQ ID NO:1). Все основания представляют собой ДНК. Все связи являются фосфорамидитными, включая связь между диациллипидом и олигодезоксинуклеотидом.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает соединения, которые можно использовать в терапевтических способах. Соединения включают CpG олигодезоксинуклеотиды (ODN) (например, CpG ODN, имеющий последовательность 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:1)). CpG ODN связан на своем 5'-конце с липидом, таким как следующий:

,

или его соль,

где Х представляет собой О или S. Предпочтительно, X представляет собой S. CpG олигонуклеотид может быть непосредственно связан с липидом. Альтернативно, CpG может быть связан с липидом через линкер, такой как GG. В CpG олигонуклеотиде все межнуклеозидные группы представляют собой фосфоротиоаты (например, все межнуклеозидные группы в соединении могут быть фосфоротиоатами).

CpG ODN может функционировать как адъювант для индукции иммунного ответа у субъекта, такого как иммунный ответ против ракового антигена (например, HPV антигена). Таким образом, соединения и композиции по настоящему изобретению можно использовать в терапевтических способах. В частности, если соединение, содержащее CpG ODN, вводят в сочетании с одним или несколькими белками HPV, соединение может индуцировать иммунный ответ на HPV-положительные раковые клетки. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения рака у субъекта (например, пациента-человека) путем введения субъекту одного или нескольких соединений или композиций по изобретению. В различных примерах рак является HPV-положительным (например, HPV 16 типа-положительным) раком.

HPV-положительный рак может представлять собой плоскоклеточный рак головы или шеи, рак шейки матки, рак анального канала, рак вульвы, рак головы или шеи, рак ротоглотки, рак полового члена, рак влагалища, вирус-индуцированный рак, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак печени, рак яичников, рак толстой кишки, рак желудка, нейробластому, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почек, лейкоз, саркому, карциному, базальноклеточную карциному, немелкоклеточную карциному легкого, неходжкинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфолейкоз (CLL), B-клеточный хронический лимфолейкоз (B-CLL), множественную миелому (MM), эритролейкоз, почечно-клеточную карциному, саркому, меланому, астроцитому, олигоастроцитому, рак желчных путей, хориокарциному, рак ЦНС, рак гортани, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), аденокарциному, гигантоклеточную (или мелкоклеточную) карциному, плоскоклеточную карциному, рак полости рта, рак кожи, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак, тестикулярный рак, рак щитовидной железы, рак матки, рак прямой кишки, рак дыхательной системы или рак мочевыделительной системы.

Необязательно, способы по изобретению могут дополнительно включать введение соединения или композиции по настоящему изобретению в комбинации со вторым (или дополнительным) другим подходом к лечению.

Настоящее изобретение также обеспечивает наборы, каждый из которых содержит, например, первый сосуд, который включает одно или несколько соединений по изобретению, необязательно вместе со вторым сосудом, который включает раковый антиген, такой как белок HPV, описанный в настоящей заявке.

CpG

CpG ODN представляют собой короткие синтетические одноцепочечные молекулы ДНК, содержащие неметилированные CpG динуклеотиды в определенных контекстах последовательностей. CpG ODN обладают частично или полностью фосфоротиоатным (PS) остовом, в отличие от природного фосфодиэфирного (PO) остова в молекулах ДНК. Идентифицированы три основных класса стимулирующих CpG ODN на основании структурных характеристик и активности на мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) человека, в частности В-клетках и плазматических дендритных клетках (pDC). Эти три класса представляют собой класс A (тип D), класс B (тип K) и класс C.

CpG1826 и CpG7909 оба принадлежат к CpG класса B. CpG ODN класса B содержат полный PS остов с одним или несколькими CpG динуклеотидами. Они сильно активируют В-клетки и TLR9-зависимую передачу сигналов NF-κB, но слабо стимулируют секрецию IFN-α.

Мутированный HPV

Точечные мутации в C70G, C113G и I135G (подчеркнуты ниже) могут быть введены в вирусный белок Е6 HPV16 дикого типа для предотвращения стереохимического взаимодействия с человеческим p53. Действие этого компонента в качестве антигена определяется последовательностью белка, при этом структура белка не имеет существенного значения для этой предполагаемой функции.

mHPV 16 E6 (158 aa; SEQ ID NO:2)

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL

Точечные мутации в C24G и E26G (подчеркнуты ниже) могут быть введены в вирусный белок HPV16 E7 дикого типа для предотвращения стереохимического взаимодействия с человеческим Rb1. Опять же, действие этого компонента в качестве антигена продиктовано последовательностью белка, при этом структура белка не имеет существенного значения для этой предполагаемой функции.

mHPV 16 E7 (98 aa; SEQ ID NO:3)

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP.

CpG ODN могут быть связаны непосредственно или при помощи линкера с липидом. Эти соединения могут быть получены с использованием обычной фосфорамидитной химии, известной в данной области. В некоторых примерах CpG ODN или CpG ODN-GG могут взаимодействовать со следующим соединением:

с получением промежуточного соединения, которое после окисления (например, методами фосфитного окисления, известными в данной области, например, с использованием сульфирующего агента, такого как 3-((N, N-диметиламинометилиден)амино)-3H-1,2,4-дитиазол-5-тиона) и гидролиза цианоэтильной группы может дать соединение по настоящму изобретению.

Следующие примеры представлены для более полного понимания настоящего изобретения. Эти примеры предназначены только для иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Белки E6 HPV16 и E7 HPV16 в сочетании с CpG амфифильным адъювантом вызывают иммунный ответ

Мышей иммунизировали профилактически и генерированный иммунный ответ регистрировали при помощи E7-тетрамерного окрашивания и IFNγ-внутриклеточного цитокинового окрашивания (ICS) при HPV16 E6 и HPV16 E7 (E6/E7) стимуляции.

План эксперимента включал следующие 6 групп мышей (n=10 для каждой группы)

1. Без иммунизации

2. E6/E7+растворимый CpG1826

3. E6/E7+амфифильный CpG1826 (aCpG1826)

4. E6/E7+растворимый CpG7909

5. E6/E7+амфифильный CpG7909 (aCpG7909; Фиг. 14)

6. E6/E7+polyIC (pIC)

pIC использовали как эталонный адъювант в качестве контроля.

Исходные растворы белков растворяли в 8 М растворе мочевины. Исходные растворы адъюванта растворяли в H₂O. Конечные инъекции разбавляли 1X фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (C_F мочевины <1M).

Для aCpG1826 используемая последовательность представляла собой последовательность растворимого CpG1826 (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO:4) с двумя гуанинами, добавленными на 5'-конце (5'-gg tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO:5). Концентрацию 5 нмоль для каждой 100 мкл инъекции использовали как для растворимого CpG1826, так и для aCpG1826. CpG1826 является оптимальной мышиной последовательностью, в то время как CpG7909 оптимальна для людей и малоактивна у мышей. CpG1826 и CpG7909 относятся к одному и тому же классу CpG (класс B) и обычно имеют сходные профили активности у своих соответствующих видов.

Как для aCpG7909, так и для растворимого CpG7909, используемая последовательность представляла собой 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO:6) при концентрации 5 нмоль для каждой 100 мкл инъекции.

Мутированный Е6 HPV16 с точечными мутациями в C70G, C113G и I135G (подчеркнуты ниже) использовали для иммунизации. Используемая аминокислотная последовательность представлена ниже.

mHPV 16 E6 (158 aa; SEQ ID NO:2)

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL

Мутированный HPV16 E7 с точечными мутациями в C24G и E26G (подчеркнуты ниже) использовали для иммунизации. Используемая аминокислотная последовательность представлена ниже.

mHPV 16 E7 (98 aa; SEQ ID NO:3)

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP

Для E6/E7 использовали по 10 мкг каждого из мутированного E6 HPV16 и мутированного E7 HPV16 на 100 мкл инъекцию.

Самок мышей C57BL/6J (B6) иммунизировали подкожно (п/к) примирующей дозой (E6/7+aCpG) и одной бустерной дозой через 2 недели.

Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO:7) осуществляли через 7 дней после бустерной дозы (Фиг. 3).

Анализ внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) для определения IFNγ осуществляли на периферической крови через 7 дней после бустерной дозы для анализа иммунных ответов на E6/E7.

Для E6 стимуляции использовали следующие пептиды: (E6-10: EVYDFAFRDL (SEQ ID NO:8); E6 49-57: VYDFAFRDL (SEQ ID NO:9); E6 37-45: CVYCKQQLL; (SEQ ID NO:10); E6 72-80: KCLKFYSKI (SEQ ID NO:11); и E6 100-108: NKPLCDLLI (SEQ ID NO:12) для получения данных, показанных на Фиг. 1.

Деконволюция E6 стимулов показала, что E49-57 был единственным пептидом, который приводил к стимуляции.

Для E7 стимуляции использовали следующий пептид: RAHYNIVTF (SEQ ID NO:13). Этот пептид использовали для получения данных, показанных на Фиг. 2.

Как показано на Фиг. 1 и 2, использование aCpG1826 вызывало сильный иммунный ответ как против мутантного HPV16 E6, так и против мутантного HPV16 E7.

Как также показано на Фиг. 1 и 2, использование aCpG7909, который является оптимальным для людей и обычно плохо работает у мышей, неожиданно вызвало сильный иммунный ответ как против мутантного HPV16 E6, так и против мутантного HPV16 E7.

E6/E7+aCpG снижал рост опухоли по сравнению с использованием только aCpG или с группой без обработки, с соответствующим увеличением процента выживаемости (Фиг. 4).

Пример 2: Определение схемы введения для HPV 16 E7 и aCPG

Для определения оптимальной схемы введения для E7+aCpG, с точки зрения противоопухолевой эффективности у самок мышей C57BL/6U (B6) с имплантированными опухолями TC-1, еженедельное введение сравнивали с введением раз в 2 недели и с исходным уровнем (только прайм). E7+aCpG сравнивали с E7+растворимый CpG. Все вакцины вводили 3 раза (прайм и 2 буст-дозы).

Самкам мышей C57BL/6J (B6) инокулировали 50000 клеток TC-1 подкожно в бок в День 0 и 12 дней спустя; мышей разделяли на группы обработки и обрабатывали, как указано в Таблице 1.

Таблица 1 Испытываемое вещество Доза^a Интервал дозирования Объем инъекции (ROA) N Конечные критерии оценки NA 0 Необработанный контроль NA 10 Цитокины в сыворотке
Анти-Е7 сывороточные антитела
Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7
Размер опухоли
Выживаемость E7 +
aCpG 10 мкг E7
1,24 нмоль aCpG- 1826^b Разовая доза 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 10 Цитокины в сыворотке
Анти-Е7 сывороточные антитела
Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7
Размер опухоли
Выживаемость Еженедельно 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 20 Раз в 2 недели 100 мкл, раздельными дозами
(п/к) 20 E7+CpG 10 мкг E7
1,24 нмоль CpG-1826 Разовая доза 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 10 Анти-Е7 сывороточные антитела
Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7
Размер опухоли
Выживаемость Еженедельно 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 20 Раз в 2 недели 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 20 ^a Исходные растворы белков растворяли в 8 М растворе мочевины. Исходные растворы адъюванта растворяли H₂O. Конечные инъекции разбавляли 1X PBS (C_F мочевины <1M).
^b эквивалент 8 мкг
NA=не определен; PBS=фосфатно-солевой буферный раствор; ROA=путь введения; п/к=подкожно

• На протяжении всего исследования размеры опухолей измеряли через день до Дня 40 после инокуляции и отслеживали выживаемость животных. Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7 (RAHYNIVTF) осуществляли через 7 дней после каждого введения вакцины.

• Образцы сыворотки отбирали через 1 час и 4 часа после каждого введения вакцины для групп aCpG и анализировали на экспрессию цитокинов (IFNγ, TNFα, IL-6, IL-10, IL-12p70, MCP-1) с использованием тест-системы для определения цитокинов в биологических жидкостях.

• Титры сывороточных анти-E7 антител анализировали через 14 дней после первоначальной вакцинации. Планшеты для ELISA покрывали цельным белком E7, после чего сывороточные антитела улавливали и осуществляли детекцию с использованием анти-Fc антитела.

HPV-тетрамер-специфический Т-клеточный ответ на включающую белок/амфифильный CpG вакцину был лучше, чем ответ на включающую белок/растворимый CpG вакцину, как после однократной, так и после повторных доз (Фиг. 5). HPV-тетрамерный ответ на белок/aCpG еще больше усиливался после введения бустерных вакцинаций, и это усиление продолжалось до Дней 28 и 35 (Фиг. 6) для схем введения один раз в неделю и один раз в две недели, соответственно. Сильный HPV-тетрамерный ответ в группах aCpG коррелировал с уменьшением размера опухоли по сравнению с животными, вакцинированными растворимым CpG (Фиг. 7), и улучшением выживаемости (Фиг. 8). Связанные с лечением повышения уровней системных цитокинов были сопоставимы между группами обработки растворимыми и aCpG, за исключением IL-10, уровень которого был ниже для aCpG по сравнению с растворимым CpG, и IFNγ, уровень которого был выше для aCpG по сравнению с растворимым CpG (Фиг. 9).

Пример 3: Противоопухолевая эффективность белка E7 в сочетании с либо растворимым, либо амфифильным CpG и с добавлением или без добавления анти-PD-1 антитела

Для оценки противоопухолевой эффективности белка E7 в комбинации с растворимым или амфифильным CpG и с добавлением или без добавления анти-PD-1 антитела самкам мышей C57BL/6J (B6) инокулировали в бок при исходном уровне 50000 клеток TC-1. Через 11 дней после инокуляции мышей разделяли на 5 групп, как показано в Таблице 2. Группа сравнения была необработанной.

Таблица 2 Испытываемое вещество Доза^a Интервал дозирования Объем инъекции (ROA) N Конечные критерии оценки NA 0 Необработанный контроль NA 10 E7+CpG 10 мкг E7
1,24 нмоль CpG-1826 Раз в 2 недели 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 10 E7+aCpG 10 мкг E7
1,24 нмоль aCpG- 1826 Раз в 2 недели 100 мкл, раздельными дозами (п/к) 10 Размер опухоли через день до Дня 40
Выживаемость
Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7
(RAHYNIVTF пептид; SEQ ID NO:13) через 7 дней после каждого введения вакцины E7+CpG+анти-PD-
1 антитело 10 мкг E7
1,24 нмоль CpG-1826
230 мкл анти-PD-1 Раз в 2 недели
как для вакцины, так и для антитела 100 мкл, раздельными дозами (п/к)
Антитело и/п (100
мкл раздельными дозами) 10 E7+aCpG
+ анти- PD-1 антитело 10 мкг E7
1,24 нмоль aCpG- 1826 Раз в 2 недели
как для вакцины, так и для антитела 100 мкл, раздельными дозами (п/к)
Антитело и/п (100
мкл раздельными дозами) 10 230 мкл анти-PD-1 ^a Исходные растворы белков растворяли в 8 М растворе мочевины. Исходные растворы адъюванта растворяли H₂O. Конечные инъекции разбавляли 1X PBS (C_F мочевины <1M).
и/п=интраперитонеально; NA=не определен; PBS=фосфатно-солевой буферный раствор; ROA=путь введения; п/к=подкожно

На протяжении всего исследования размеры опухолей измеряли через день до Дня 40 после инокуляции и отслеживали выживаемость животных. Тетрамерный анализ на H-2Db HPV16 E7 (RAHYNIVTF) осуществляли через 7 дней после каждого введения вакцины.

Введение вакцины E7/Amph-CpG, с или без анти-PD-1 антитела, вызывало устойчивое увеличение количества HPV Тетрамер+ CD8-клеток, специфических к HPV16 E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO:13) пептиду (Фиг. 10). Эти ответы были четко видны уже после первой дозы, достигли пика после введения 2-й дозы и сохранялись до 3-й дозы (в отличие от более низких ответов, наблюдаемых с E7/CpG, которые, хотя и усиливались при одновременном введении анти-PD-1, были неустойчивыми.

В соответствии с этими сильными HPV Тетрамер+ CD8 ответами, рост опухоли был остановлен примерно к Дню 24, и наблюдалась регрессия после первой дозы E7/Amph-CpG (с или без анти-PD-1), и размер опухоли оставался небольшим и стабильным до конца исследования, в отличие от других групп, где рост прогрессировал (Фиг. 11).

Кроме того, в соответствии с эффектами на размер опухоли, обработка вакциной E7/aCpG (с или без анти-PD-1 антитела) имела существенный эффект на выживаемость и привела к излечению 6/7 (85%) для E7/aCpG без антитела и излечению 8/10 (80%) для E7/aCpG плюс анти-PD-1 антитело (Фиг. 12).

Пример 4: исследование с повышением дозы aCpG

Для определения дозы aCpG, которая вызывает самый высокий антиген-специфический Тетрамер+ CD8 ответ в течение курса из 6 доз, осуществляли исследование с повышением дозы, используя фиксированную дозу 10 мкг овальбумина (OVA) в качестве антигена. Растворимый CpG использовали в качестве препарата сравнения. Также оценивали переносимость (на основании массы тела и общих наблюдений). План исследования представлен в Таблице 3.

Таблица 3 Антиген/Доза Адъювант Доза адъюванта (нмоль) ROA (объем дозы) OVA 10 мкг Amph-CpG-1826 0,12 п/к (100 мкл, раздельными дозами) 0,60 1,2 6 12 Растворимый CpG-1826 1,2 6 12 60 ROA=путь введения; п/к=подкожно

До 6 доз вакцины вводили с 2-недельными интервалами, общая продолжительность исследования составляла 11 недель.

Образцы периферической крови собирали через 7 дней после каждой инъекции и использовали метод проточной цитометрии для анализа тетрамера на CD8+ клетках с использованием H-2Kb OVA (SIINFEKL; SEQ ID NO:14).

Значительное увеличение количества тетрамер+ CD8+ клеток наблюдали только в группах, обработанных aCpG+OVA, при этом наибольший фармакологический эффект достигался с 6 нмоль (Фиг. 13). Не наблюдали никакой потери массы, потери интереса/аппетита или ран/поражений.

Другие варианты осуществления

Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, следует понимать, что оно допускает дальнейшие модификации, и настоящая заявка предназначена для охвата любых вариаций, применений или адаптаций изобретения, следуя, в целом, принципам изобретения, и включение таких отступлений от настоящего раскрытия входит в известную или обычную практику в области техники, к которой относится изобретение, и может применяться к существенным признакам, описанным выше.

Все публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте в той степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки во всей полноте.

Некоторые варианты осуществления изобретения представлены в виде следующих отдельных пронумерованных параграфов.

1. Соединение, состоящее из нуклеотидной последовательности 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:1), которая, на ее 5'-конце, связана или соединена при помощи линкера со следующим липидом:

,

или его солью,

где Х представляет собой О или S.

2. Соединение по пункту 1, где нуклеотидная последовательность связана с липидом.

3. Соединение по пункту 1 или 2, где все межнуклеозидные группы, соединяющие нуклеозиды в 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:1), представляют собой фосфоротиоаты.

4. Способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту соединения по любому из пунктов 1-3, белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2),

и белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3).

5. Способ по пункту 4, где рак является папилломавирус человека(HPV)-положительным.

6. Способ по пункту 5, где рак является HPV 16 типа-положительным.

7. Способ по любому из пунктов 4-6, где рак представляет собой плоскоклеточный рак головы или шеи.

8. Способ по любому из пунктов 4-7, где пациент получает или получал химиотерапию препаратами платины.

9. Способ по пункту 4, где соединение по пункту 1 и белки, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, вводят одновременно.

10. Способ по пункту 4, где соединение по пункту 1 и белки, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, вводят последовательно.

11. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пунктов 1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

12. Фармацевтическая композиция по пункту 11, где композиция дополнительно включает белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2),

и белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3).

13. Набор, включающий (i) соединение по любому из пунктов 1-3 или композицию по пункту 11 и (ii) белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2),

и белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3).

Другие варианты осуществления находятся в пределах следующей формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> VEDANTRA PHARMACEUTICALS, INC.

<120> CPG АМФИФИЛЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 51026-027WO2

<140> PCT/US19/20398

<141> 2019-03-01

<150> US 62/637,824

<151> 2018-03-02

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 2

<211> 158

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Gly Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Gly Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

145 150 155

<210> 3

<211> 98

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 5

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

ggtccatgac gttcctgacg tt 22

<210> 6

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 7

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть применимо в медицинской практике. Изобретение раскрывает соединения, включающие CpG олигодезоксинуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1), на 5'-конце связанную с липидом при помощи линкера. Изобретение может быть использовано в качестве адъюванта в композиции терапевтических белков (SEQ ID NO: 2 и 3) при лечении папилломавирус человека (HPV)-положительного рака у пациента. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 14 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Соединение для использования в качестве адъюванта, вызывающего иммунный ответ у пациента, состоящее из нуклеотидной последовательности 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1), которая, на ее 5'-конце, непосредственно связана со следующим липидом или соединена при помощи линкера со следующим липидом:

,

или его солью,

где Х представляет собой О или S.

2. Соединение по п.1, где нуклеотидная последовательность непосредственно связана с липидом.

3. Соединение по п.1 или 2, где все межнуклеозидные группы, соединяющие нуклеозиды в 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1), представляют собой фосфоротиоаты.

4. Способ лечения папилломавирус человека (HPV)-положительного рака у пациента, являющегося человеком, включающий введение пациенту соединения по п.1 или 2, белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO: 2),

и белка, включающего аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).

5. Способ по п.4, где рак является HPV 16 типа-положительным.

6. Способ по п.4, где рак представляет собой плоскоклеточный рак головы или шеи.

7. Способ по п.4, где пациент получает или получал химиотерапию препаратами платины.

8. Способ по п.4, где соединение и белки, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, вводят одновременно.

9. Способ по п.4, где соединение и белки, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, вводят последовательно.

10. Фармацевтическая композиция для использования в качестве адъюванта, вызывающего иммунный ответ у пациента, включающая эффективное количество соединения по п.1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что композиция дополнительно включает белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO: 2),

и белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).

12. Набор для генерации иммунного ответа против HPV-положительного рака, включающий

(i) эффективное количество соединения по п.1 или 2 и

(ii) белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO: 2),

и белок, включающий аминокислотную последовательность:

MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).