Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Ящур - острое вирусное заболевание из группы зоонозов, характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа.

В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии возбудитель данного заболевания имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus. Выделяют 7 следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом представители серотипа Азия-1 являются довольно распространенными [1]. Для изготовления вакцин в настоящее время в мире используют штаммы трех следующих генотипов: Asia-1/ASIA/Sindh-08, Asia-1/ASIA/Shamir, Asia-1/G-V.

Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов возбудителя ящура серотипа Азия-1 имеют одинаковую длину около 8450-8500 н.о. [1, 2].

РНК одновременно является матрицей для репликации генома и трансляции вирусных белков. РНК возбудителя ящура включает три отдельные части, а именно длинную 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) (около 1300 н.о.), кодирующую область с одной открытой рамкой считывания (ORF) длиной около 7000 н.о. и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) длиной около 90 н.о. [1, 3, 4].

С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных [4].

Учитывая, что штаммы серотипа Азия-1 вируса ящура применяются для производства вакцинных препаратов, но при этом существенно отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля производственного материала использовать диагностические инструменты, которые могут быстро и специфически дифференцировать геном вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 (генотипов Asia-1/ASIA/Sindh-08, Asia-1/ASIA/Shamir, Asia-1/G-V). Данный этап важен при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования для производства противоящурных вакцин требуемого штамма.

В настоящее время для изготовления вакцин против ящура применяют следующие производственные штаммы вируса ящура серотипа Азия-1: «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08), «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir), «Азия-1/G-V/2006» (генотип Asia-1/G-V).

Штамм «Азия-1 №2356/14/2018» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №176 - деп / 19-66 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» серотипа Азия-1 вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: штамм ВЯ Азия-1 №1946/Шамир 3 / 89.

Штамм «Азия-1/G-V/2006» серотипа Азия-1 вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №443- деп / 22-77 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

В связи с этим целесообразно провести поиск способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома вируса ящура, что даст возможность разработать метод для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию нового поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной ПЦР анализ кривой плавления с высоким разрешением стал важным и перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов, в частности вируса ящура серотипа Азия-1 [5-10].

В 2003 году впервые был представлен метод анализа пиков высокого разрешения температур плавления, который использует сбор данных с высокой плотностью и обнаруживает небольшие различия в последовательностях фрагментов ПЦР только путем прямого плавления. Кривые плавления можно использовать для сканирования мутаций и анализа мультиплексного генотипирования [8, 10].

Анализ плавления ампликонов с высоким разрешением представляет собой количественный анализ кривой плавления ампликона после реакции амплификации. Для данного метода требуется система ПЦР-детекции в режиме реального времени с высокой термостабильностью и чувствительностью. Комбинация улучшенного инструментария количественной детекции продуктов ПЦР и насыщающих ДНК-связывающих красителей позволила идентифицировать генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечного ампликона [9].

Сущность представленного метода заключается в следующем: после проведения ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем смесь постепенно нагревают, и при достижении определенной температуры двухцепочечные молекулы ДНК начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой амплификатора, падает. ПЦР-продукты с разной последовательностью за счет наличия делеций, инсерций и других мутаций «плавятся» при разной температуре. Чувствительность метода достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного анализа можно проводить детекцию даже однонуклеотидных полиморфизмов [10].

Прототипным вариантом проведения дифференциального анализа является постановка полимеразной цепной реакции с электрофорезом с оригинальными праймерами и с последующим секвенированием по Сенгеру [9]. Однако, данный метод является очень дорогостоящим, продолжительным во времени, поскольку предполагает проведение дополнительных этапов работы с последующим расшифровыванием и анализом нуклеотидной последовательности. Исходя из этого, необходимо разработать альтернативный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью молекулярно-биологических методов.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспрессного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Суть разработанного способа заключается в следующем: проводится разработка дизайна оригинальных олигонуклеотидных праймеров с тем расчетом, чтобы амплифицировать фрагмент кДНК содержащий мутации, наличие которых имеет место в разных штаммах вируса ящура серотипа Азия-1 указанных генотипов. ПЦР проводится в присутствии дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3, который встраивается в двуцепочечную кДНК, после чего ее можно обнаружить с помощью считывания флуоресцентного сигнала. Краситель многократно усиливает свою флуоресценцию при связывании с двуцепочечной ДНК. Фрагменты анализируемых участков кДНК отличаются друг от друга по нуклеотидному составу. Полученные участки постепенно нагревают в широком диапазоне температур. При достижении температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи. При этом пропадает флуоресцентный сигнал специфичного для нуклеиновой кислоты красителя. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления [7]. Анализируя кривые плавления фрагментов кДНК можно уверенно определять нуклеотидный состав этих фрагментов, а значит - дифференцировать производственные штаммы вируса ящура серотипа Азия-1 друг от друга.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять дальний красный флуоресцентный краситель TO-TAP-3, который обеспечивает максимально возможные для данной системы значения флуоресценции, что позволяет достичь высокую точность и чувствительность проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК вируса ящура серотипа Азия-1. Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества вируссодержащего сырья при производстве культуральных противоящурных инактивированных вакцин.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для целевого участка 1D-гена вируса ящура серотипа Азия-1; 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применения дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3; 3) с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Дизайн олигонуклеотидных праймеров для детекции производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 и нуклеотидные замены в пределах амплифицируемого участка кДНК 1D-гена вируса ящура в диапазоне 3466…3549 п.н. Примечание: обратный праймер в двух вариантах: прямом и rev-compl (обратный комплементарный).

Фиг. 2 - Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 штаммов «Азия-1 №2356/14/2018», «Азия-1 №1946/Шамир 3/89», «Азия-1/G-V/2006».

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «Азия-1 №2356/14/2018» вируса ящура;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «Азия-1 №2356/14/2018» вируса ящура;

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» вируса ящура;

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» вируса ящура.

SEQ ID NO: 5 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура;

SEQ ID NO: 6 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура.

SEQ ID NO: 7 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера FMDV-Asia-1-DIFF-F.

SEQ ID NO: 8 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера FMDV-Asia-1-DIFF-R.

Сущность изобретения заключается в разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагировании РНК вируса ящура серотипа Азия-1 из культуральных вируссодержащих суспензий;

2) проведении амплификации специфического фрагмента кДНК 1D-гена вируса ящура размером 84 п.н. с применением олигонуклеотидных специфических праймеров FMDV-Asia-1-DIFF-F (5'-TCTGCGACGTACTACTTCTCAGACCTG-3') и FMDV-Asia-1-DIFF-R (5'-TTGGGCGCGCCGTTGGGCAC-3') (фиг. 1, табл. 1 и 2);

3) проведении плавления ПЦР-продуктов в разработанном режиме с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3;

4) детекции результатов анализа с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов и проведении инструментального дифференциального анализа генома следующих производственных штаммов: «Азия-1 №2356/14/2018», «Азия-1 №1946/Шамир 3/89», «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура серотипа Азия-1.

В целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 в позициях 3466…3549 п.н. имеется 4 варианта нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из указанных вакцинных штаммов: T₃₄₉₉ ↔ C₃₄₉₉, C₃₅₀₅ ↔ T₃₅₀₅, C₃₅₁₇ ↔ A₃₅₁₇, G₃₅₂₆ ↔ C₃₅₂₆ ↔ A₃₅₂₆.

По данным проведенного анализа литературных данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации изолятов и штаммов вируса ящура с помощью секвенирования, однако, как указано выше, он очень дорогостоящий и трудоемкий. При анализе публикаций способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить контроль сырья при изготовлении вакцинных препаратов против ящура серотипа Азия-1. Кроме того, следует отметить, что TO-TAP-3 гораздо чувствительнее, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II и другие стандартные красители, для обнаружения двуцепочечных нуклеиновых кислот [11].

В отличие от прототипа разработанный способ позволил провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК 1D-гена производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 длиной 84 п.н.. Данный способ предусматривает проведение реакции амплификации специфического фрагмента кДНК 1D-гена вируса ящура в диапазоне 3466…3549 п.н. с применением олигонуклеотидных специфических праймеров FMDV-Asia-1-DIFF-F и FMDV-Asia-1-DIFF-R для амплификации фрагмента размером 84 п.н.. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3, а также детекцию результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведением инструментального дифференциального анализа генома указанных штаммов вируса ящура. Таким образом, актуально применять предложенный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Ключевым элементом заявляемого способа является применение анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 для дифференциация генома следующих производственных штаммов: «Азия-1 №2356/14/2018», «Азия-1 №1946/Шамир 3/89», «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура серотипа Азия-1.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении способа ПЦР в режиме реального времени, специфичных олигонуклеотидных праймеров FMDV-Asia-1-DIFF-F и FMDV-Asia-1-DIFF-R, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 84 п.н. и технологии анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из культуральных суспензий, содержащих вирус ящура с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис»).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартных образцов и проб. Стандартными образцами являются положительные контроли, представляющие собой индивидуальные культуральные суспензии вируса ящура следующих штаммов: «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08), «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir), «Азия-1/G-V/2006» (генотип Asia-1/G-V).

В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ. Проводят обратную транскрипцию с применением следующих реагентов: деионизированная вода - 13 мкл, буфер 5-кратный - 10 мкл, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты - 6 мкл, олигонуклеотидные праймеры - два по 5 мкл, MMLV-ревертаза - 1 мкл, элюат РНК - 10 мкл. Общий объем реакционной смеси составляет 50 мкл на одну реакцию.

Для постановки ПЦР в режиме реального времени готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х - 2,5 мкл, хлорид магния 25 мМ - 3 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 1 мкл, краситель TO-TAP-3 - 3 мкл, Taq ДНК-полимераза - 1 мкл, кДНК вируса ящура - 5 мкл, деионизированная вода - 8,5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Обратную транскрипцию осуществляют при температуре 42°С в течение 20 минут. Предварительную денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 2 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 7 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 63°С в течение 30 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды. В качестве красителя применяется TO-TAP-3. Данный флуорофор можно анализировать также в системе детекции с длиной волны свечения 720 нм [11].

Исследование кривой плавления ампликонов для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Выявляют, какие пики температур плавления характерны для вакцинных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, указанных выше, что позволяет судить о принадлежности исследуемого образца к одному из указанных производственных штаммов возбудителей ящура серотипа Азия-1.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Определение пиков высокого разрешения графиков плавления ампликонов для разработки способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию генома вакцинных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из культуральных суспензий, содержащих РНК вируса ящура, с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа использовали культуральные суспензии вируса ящура следующих производственных штаммов: «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08), «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir), «Азия-1/G-V/2006» (генотип Asia-1/G-V).

На следующем этапе проводили обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Постановку реакции проводили в детектирующем амплификаторе марки CFX-96 (Bio-Rad, США).

Исследование кривой плавления с высоким разрешением для анализа данных и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96. Проводили построение кривых плавления в виде параболических функций и детектировали максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов для полученных графиков. Тестировали кДНК вируса ящура указанных производственных штаммов в 30 повторностях для каждого штамма. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Выявили, что для каждого из указанных выше вакцинных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 с помощью разработанного способа характерен свой узкий диапазон температуры плавления. Для производственного штамма «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08) данная температура составила 75,70±0,01°С (n=30, p<0,005), для «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir) - 77,82±0,01°С (n=30, p<0,005), для «Азия-1/G-V/2006» (генотип Asia-1/G-V) - 76,64±0,01°С (n=30, p<0,005) (фиг. 2, табл. 4).

Таким образом, для каждого из указанных производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 характерен индивидуальный пик температуры плавления. Это указывало на возможность применения разработанного способа для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Специфичность способа дифференциации (предлагаемое изобретение) оценивали путем тестирования 6 экстрактов РНК вируса ящура серотипов А, С, О, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и вируса бешенства вакцинного штамма «РВ-97». В качестве положительных контролей использовали следующие вакцинные штаммы вируса ящура: «Азия-1 №2356/14/2018», «Азия-1 №1946/Шамир 3/89», «Азия-1/G-V/2006».

Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов не была обнаружена.

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса ящура именно серотипа Азия-1, и отрицательного контроля не формировались графики плавления и не были обнаружены максимальные пики точки плавления ПЦР-продуктов. При исследовании положительных контролей получены следующие значения температур плавления: для производственного штамма «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08) данная температура составила 75,70±0,01°С (n=4, p<0,005), для «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir) - 77,82±0,01°С (n=4, p<0,005), для «Азия-1/G-V/2006» (генотип Asia-1/G-V) - 76,64±0,01°С (n=4, p<0,005). Полученные результаты контролей подтверждают данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа (предлагаемое изобретение).

Для определения диагностической чувствительности разработанного способо анализировали 372 культуральных суспензий вируса ящура следующих производственных штаммов: «Азия-1 №2356/14/2018» (n=124), «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (n=124), «Азия-1/G-V/2006» (n=124) с титрами инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые являлись заведомо положительными.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с последующим плавлением ампликонов проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 372 исследуемых культуральных суспензий вируса ящура указанных выше штаммов все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности метода тестировали 195 суспензий вируса ящура других серотипов. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 195 пробы содержали геном вируса ящура всех серотипов, но не серотипа Азия-1. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,01-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,13-100,0%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,35-100,00%.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) дифференциацию генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3. Определили, что в целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 в позициях 3466…3549 п.н. имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из следующих вакцинных штаммов: «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08), «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir), «Азия-1/G-V/2006» (генотип Asia-1/G-V), что позволило разработать специфические олигонуклеотидные праймеры FMDV-Asia-1-DIFF-F и FMDV-Asia-1-DIFF-R, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 84 п.н. и благодаря технологии анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1. Впервые представлена дифференциация генома указанных вакцинных штаммов вируса ящура с помощью разработанного способа.

Разработанный способ характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,01-100,00%, диагностическая специфичность - 98,13-100,0%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3»:

1. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21; 7: 477. doi: 10.3389/fvets.2020.00477. PMID: 32974392; PMCID: PMC7473413.

2. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug; 85(1): 50-8. doi: 10.1016/j.yexmp.2008.03.012. Epub 2008 Apr 13. PMID: 18502416; PMCID: PMC2606052.

3. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug; 175(2): 236-45. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.05.023. Epub 2011 May 19. PMID: 21620898.

4. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

5. GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=FMDV. (Дата обращения: 10.06.2023).

6. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct; 51(10): 1770-7. doi: 10.1373/clinchem.2005.054924. PMID: 16189378.

7. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct; 236: 258-265. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.08.005. Epub 2016 Aug 6. PMID: 27506582; PMCID: PMC7119729.

8. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct; 64(5): 1610-1623. doi: 10.1111/tbed.12554. Epub 2016 Sep 3. PMID: 27589902; PMCID: PMC7169878.

9. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct; 24(5): 250-5. doi: 10.1016/j.mcp.2010.04.004. Epub 2010 Apr 28. PMID: 20433917.

10. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31; 62(4): 431-437. doi: 10.2478/jvetres-2018-0064. PMID: 30729199; PMCID: PMC6364153.

11. TO-TAP-3, дальний красный флуоресцентный краситель для нуклеиновых кислот. URL: https://ru.lumiprobe.com/p/to-pro-3-nucleic-acid-stain (Дата обращения: 11.10.2023).

Таблица 1

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 (предлагаемое изобретение)

Наименование олигонуклеотидного праймера Нуклеотидная последовательность (5'→3') FMDV-Asia-1-DIFF-F TCT GCG ACG TAC TAC TTC TCA GAC CTG FMDV-Asia-1-DIFF-R TTGGGCGCGCCGTTGGGCAC

Таблица 2

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 (предлагаемое изобретение)

Параметры олигонуклеотидов Характеристики олигонуклеотидов FMDV-Asia-1-DIFF-F FMDV-Asia-1-DIFF-R Длина олигонуклеотида, н.о. 27 20 Молекулярный вес (Mw) 8186,4 6073,0 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 221,4 191,3 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 37,1 33,6 Дифференциал энтальпии (dS), кал/°К×моль 577,9 492,4 Температура плавления (T_m), °С:
- метод ближайших соседей 62 63 Примечание: термодинамические параметры олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М,
температура 25°С,
водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 3

Временные и температурные режимы обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с применением дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 (предлагаемое изобретение)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, °С Время реакции Кол-во циклов Обратная транскрипция - 42 20 мин 1 Предварительный прогрев - 95 2 мин. 1 ПЦР в режиме реального времени Денатурация 95 7 с 40 Отжиг праймеров 63 30 с Элонгация Плавление Удержание на шаге 1 65 90 с 1 Удержание на шагах 2 - 250 65,1-90,0 2 с 1 на каждый шаг Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С.

Таблица 4

Средние показания температур плавления, при которых достигались пиковые значения для исследуемых ампликонов производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 (предлагаемое изобретение)

(n=30, p<0,005)

Название штамма/генотипа вируса ящура Температура пика при использовании разработанного способа, °С «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Asia-1/ASIA/Sindh-08) 75,70±0,01°С «Азия-1 №1946/Шамир 3/89» (генотип Asia-1/ASIA/Shamir) 77,82±0,01°С «Азия-1/G-V/2006»
(генотип Asia-1/G-V) 76,64±0,01°С Примечание: анализ проводили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США), отражены средние значения пиков температур и среднеквадратичное отклонение.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV-Asia-1-DIFF

2024-06-04.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-06-04">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-31</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>551</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-31</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации генома

вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью

анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов с

применением дальнего красного флуоресцентного красителя

TO-TAP-3</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>633</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..633</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaccaccactggcgagtcggcagacccagtcacaaccacggttgaga

actacggaggagagacccagacggctagacggctccacaccgacgtcggttttgttcttgacaggtttgt

gagactcacgcaacctaaggccacccagactcttgacctcatgcagatccccccatacacgttggttggg

gcgttgcttcggtctgcgacgtactacttctcagacctggaggttgcgctcgtccacacaggcccggtca

cgtgggtgcccaacggcgcgcccaagaccgccttggactgccagaccaacccaactgcttaccagaagca

gcccatcacacgcctggccctcccttacaccgccccccaccgtgtgctggcgacagtgtacaacgggaaa

acagcctacggggcggaggccccaaggcgcggtgaccttgcagccattgcgcagagggtgagcgccagct

tgcctacttccttcaactacggcgcagttaaggccgaaaacatcactgagctgttgatccgcatgaaacg

cgcggagacatactgccccaggcctttgctggctcttgacaccacccaagaccgccgcaagcaggagatc

attgcacctgaaaagcaggtgtta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTTGESADPVTTTVENYGGETQTARRLHTDVGFVLDRFVRLTQPKATQ

TLDLMQIPPYTLVGALLRSATYYFSDLEVALVHTGPVTWVPNGAPKTALDCQTNPTAYQKQPITRLALPY

TAPHRVLATVYNGKTAYGAEAPRRGDLAAIAQRVSASLPTSFNYGAVKAENITELLIRMKRAETYCPRPL

LALDTTQDRRKQEIIAPEKQVL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>633</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..633</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccaccactggcgaatcagcagatccagtcacaaccacggttgaga

actatggaggagagactcagacagccagacggcttcacactgacgtcgccttcattcttgacaggtttgt

gaaactcactgctcccaagaacatccaaaccctcgatctcatgcagatcccctcacacacgctggttgga

gcactacttcgttctgcgacgtactacttctcagacctggaggtcgcgcttgtccacacaggcccggtca

cctgggtgcccaacggcgcgcccaaggatgctctaaacaaccagaccaacccaactgcctatcagaagca

acccatcacccgcctggcactcccctacaccgccccccatcgtgtgctggcaacagtgtacaacgggaag

acggcgtacggggaaacgacctcaaggcgcggcgacatggcggccctcgcacaaaggttgagcgctcggc

tgcccacctccttcaactacggcgccgtgaaggccgacaccatcactgagcttttgatccgcatgaagcg

cgcggagacatattgccctaggcctttactagcccttgacaccactcaggaccgccgcaaacaggagatc

attgcacctgagaagcaggttttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTTGESADPVTTTVENYGGETQTARRLHTDVAFILDRFVKLTAPKNIQ

TLDLMQIPSHTLVGALLRSATYYFSDLEVALVHTGPVTWVPNGAPKDALNNQTNPTAYQKQPITRLALPY

TAPHRVLATVYNGKTAYGETTSRRGDMAALAQRLSARLPTSFNYGAVKADTITELLIRMKRAETYCPRPL

LALDTTQDRRKQEIIAPEKQVL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>633</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..633</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaccaccactggcgagtccgcggacccagtcaccaccacggttgaga

actacggaggagagacccagacggcccgacggcttcacactgatgtcgccttcgttctcgacaggttcgt

gaaactcacccagcccaagagcacccaaacccttgatctcatgcagatcccttcacacacactggtcggg

gcgcttctccggtctgcgacgtactacttctcagacctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtca

catgggtgcccaacggcgcgcccaagaccgccttgaacaaccacaccaacccgactgcctaccagaagca

gcccatcacccgcttggcactcccctacactgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgtacaacgggaag

acaacgtacggagaagaatcctcgcggcgtggtgatcttgccgcccttgcacacagagtgaacaaccggc

tgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacggagctgttgatccgcatgaagcg

tgcggaaacatactgccccaggcctctgctggctcttgacaccacacaagaccgccgtaaacaggagatc

attgcacctgagaaacagactttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTTGESADPVTTTVENYGGETQTARRLHTDVAFVLDRFVKLTQPKSTQ

TLDLMQIPSHTLVGALLRSATYYFSDLEVALVHTGPVTWVPNGAPKTALNNHTNPTAYQKQPITRLALPY

TAPHRVLSTVYNGKTTYGEESSRRGDLAALAHRVNNRLPTSFNYGAVKADTITELLIRMKRAETYCPRPL

LALDTTQDRRKQEIIAPEKQTL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tctgcgacgtactacttctcagacctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttgggcgcgccgttgggcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области вирусологии. Описан способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов, включающий применение дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 и подобранных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат заключается в повышении чувствительности и специфичности анализа, повышении достоверности проводимого анализа. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа Азия-1 с помощью анализа максимального пика точки плавления ПЦР-продуктов, включающий применение дальнего красного флуоресцентного красителя TO-TAP-3 и олигонуклеотидных праймеров со следующим дизайном: FMDV-Asia-1-DIFF-F - 5'-TCTGCGACGTACTACTTCTCAGACCTG-3' и FMDV-Asia-1-DIFF-R - 5'-TTGGGCGCGCCGTTGGGCAC-3', для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 84 п.н., и при этом для производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 температуры плавления имеют значения: «Азия-1 № 2356/14/2018» – 75,70±0,01°С, для «Азия-1 № 1946/Шамир 3/89» – 77,82±0,01°С, для «Азия-1/G-V/2006» – 76,64±0,01°С при n для каждого, равном 30, и p<0,005.

2. Способ по п. 1, где аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале – 99,01-100,00%, диагностическая специфичность – 98,13-100,0%.