Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Ящур - острое вирусное заболевание из группы зоонозов, характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа.

В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии возбудитель данного заболевания имеет следующую таксономию: класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus. Выделяют 7 следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом представители серотипа О являются распространенными [1].

Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов возбудителя ящура серотипа О имеют одинаковую длину около 8500 н.о. [1, 2].

РНК одновременно является матрицей для репликации генома и трансляции вирусных белков. РНК возбудителя ящура включает три отдельные части, а именно длинную 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) (около 1300 н.о.), кодирующую область с одной открытой рамкой считывания (ORF) длиной около 7000 н.о. и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) длиной около 90 н.о. [1, 3, 4].

С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Применяемые вакцины включают в свой состав штаммы вируса ящура серотипа О (генотипы O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/PanAsia2, O/ME-SA/Ind-2001e, O/EA-2, O/EA-3, O/SEA/Mya-98), представители которого периодически вызывают вспышки на территории России, в частности, в Забайкальском крае, Амурской области, Приморье и на территории многих государств Азии, Африки, Южной Америки [4].

Учитывая, что штаммы серотипа О вируса ящура используются при производстве вакцинных препаратов, но при этом существенно отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля производственного материала использовать диагностические инструменты, которые могут быстро и специфически дифференцировать геном вируса ящура производственных штаммов серотипа O (генотипов O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/PanAsia2, O/ME-SA/Ind-2001e, O/EA-2, O/EA-3, O/SEA/Mya-98). Данный этап важен при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования для производства противоящурных вакцин требуемого штамма.

В настоящее время для изготовления вакцин против ящура применяют следующие производственные штаммы вируса ящура серотипа О: «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98), «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia), «О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2), «О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e), «О/Кения/2017» (генотип O/EA-2), «О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3).

В связи с этим целесообразно провести поиск способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома вируса ящура, что даст возможность разработать метод для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию нового поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной ПЦР анализ кривой плавления с высоким разрешением стал важным и перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов, в частности вируса ящура серотипа О [5-10].

В 2003 году впервые был представлен метод анализа пиков высокого разрешения температур плавления, который использует сбор данных с высокой плотностью и обнаруживает небольшие различия в последовательностях фрагментов ПЦР только путем прямого плавления. Кривые плавления можно использовать для сканирования мутаций и анализа мультиплексного генотипирования [8, 10].

Анализ плавления ампликонов с высоким разрешением представляет собой количественный анализ кривой плавления ампликона после реакции амплификации. Для данного метода требуется система ПЦР-детекции в режиме реального времени с высокой термостабильностью и чувствительностью. Комбинация улучшенного инструментария количественной детекции продуктов ПЦР и насыщающих ДНК-связывающих красителей позволила идентифицировать генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечного ампликона [9].

Сущность представленного метода заключается в следующем: после проведения ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем смесь постепенно нагревают, и при достижении определённой температуры двухцепочечные молекулы ДНК начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой амплификатора, падает. ПЦР-продукты с разной последовательностью за счет наличия делеций, инсерций и других мутаций «плавятся» при разной температуре. Чувствительность метода достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного анализа можно проводить детекцию даже однонуклеотидных полиморфизмов [10].

Прототипным вариантом проведения дифференциального анализа является постановка полимеразной цепной реакции с электрофорезом с оригинальными праймерами и с последующим секвенированием по Сенгеру [9]. Однако, данный метод является очень дорогостоящим, продолжительным во времени, поскольку предполагает проведение дополнительных этапов работы с последующим расшифровыванием и анализом нуклеотидной последовательности. Исходя из этого, необходимо разработать альтернативный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью молекулярно-биологических методов.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспрессного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О методом анализа максимумов температур плавления продуктов ПЦР с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Суть разработанного способа заключается в следующем: проводится разработка дизайна оригинальных олигонуклеотидных праймеров с тем расчетом, чтобы амплифицировать фрагмент кДНК содержащий мутации, наличие которых имеет место в разных штаммах вируса ящура серотипа О указанных генотипов. ПЦР проводится в присутствии зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE, который встраивается в двуцепочечную кДНК, после чего ее можно обнаружить с помощью считывания флуоресцентного сигнала. Фрагменты анализируемых участков кДНК отличаются друг от друга по нуклеотидному составу. Полученные участки постепенно нагревают в широком диапазоне температур. При достижении температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи. При этом пропадает флуоресцентный сигнал специфичного для нуклеиновой кислоты красителя. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления [7]. Анализируя кривые плавления фрагментов кДНК можно уверенно определять нуклеотидный состав этих фрагментов, а значит - дифференцировать производственные штаммы вируса ящура серотипа О друг от друга.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять зеленый интеркалирующий краситель YO-PRO-1 IODIDE последнего поколения, который обеспечивает максимально возможные для данной системы значения флуоресценции, что позволяет достичь высокую точность и чувствительность проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК вируса ящура серотипа О. Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества вируссодержащего сырья при производстве культуральных противоящурных инактивированных вакцин.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для целевого участка 1D-гена вируса ящура серотипа О; 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE; 3) с помощью анализа точки максимума температур плавления (Tm - Temperature meiting) ампликонов проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа О.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Дизайн олигонуклеотидных праймеров для детекции производственных штаммов вируса ящура серотипа О. Примечание: А - прямой праймер, Б - обратный праймер в двух вариантах: прямом и rev-complement.

Фиг. 2 - Нуклеотидные замены в пределах амплифицируемого участка кДНК 1D-гена вируса ящура в диапазоне 322…539 п. н. Примечание: А - участок в диапазоне 345…451 п. н., Б - участок в диапазоне 450…518 п. н.

Фиг. 3 - Диаграмма пиков плавления ампликонов при анализе производственных штаммов вируса ящура серотипа О генотипов O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/PanAsia2, O/ME-SA/Ind-2001e, O/EA-2, O/EA-3, O/SEA/Mya-98. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя ящура: «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98), «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia), «О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2), «О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e), «О/Кения/2017» (генотип O/EA-2), «О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3).

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура.

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «О №2147/Приморский/2012» вируса ящура;

SEQ ID NO:4 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «О №2147/Приморский/2012» вируса ящура.

SEQ ID NO:5 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура;

SEQ ID NO:6 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура.

SEQ ID NO:7 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура;

SEQ ID NO:8 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «О №2620/Оренбургский/2021» вируса ящура.

SEQ ID NO:9 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «О/Кения/2017» вируса ящура;

SEQ ID NO:10 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «О/Кения/2017» вируса ящура.

SEQ ID N0:11 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК штамма «О №2241/Эфиопия/2011» вируса ящура;

SEQ ID N0: 12 представляет последовательность аминокислот, кодируемых целевым участком кДНК штамма «О №2241/Эфиопия/2011» вируса ящура;

SEQ ГО NO: 13 представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК праймера FMDV-0-1D-F322;

SEQ ГО NO: 14представляет последовательность нуклеотидов целевого участка кДНК праймера FMDV-O-ID- R539

Для отражения полноценных последовательностей N0:1-12 был проведен анализ полного 1 D-гена вируса ящура (642 н.о.) и VPi-белка (214 а.о.).

Сущность изобретения заключается в разработке способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Тт ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагировании РНК вируса ящура серотипа О из культуральных вируссодержащих суспензий; 2) проведении амплификации специфического фрагмента кДНК ID-гена вируса ящура размером 218 п. н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных специфических праймеров FMDV-0-1D-F322

(5'-TACCACAAGGCACCACTCACCCG-3’) и FMDV-0-1D-R539 (S'-CGGTAAAGCAGTTCAGTCACCCG-S¹) (фиг. 1, табл. 1, 2); 3)

проведении плавления ампликонов в разработанном режиме с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE; 4) детекции результатов анализа с помощью анализа точки максимума Тш ампликонов и проведении инструментального дифференциального анализа генома следующих производственных штаммов: «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98),

«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

«О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

«О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e),

«О/Кения/2017» (генотип O/EA-2),

«О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3) вируса ящура серотипа О.

В целевом участке 1D-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа О в позициях 345…516 п. н. имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из следующих вакцинных штаммов: «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98),

«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

«О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

«О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e),

«О/Кения/2017» (генотип O/EA-2),

«О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3).

По литературным данным, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации изолятов и штаммов вируса ящура с помощью секвенирования, однако, как указано выше, он очень дорогостоящий и трудоемкий. При анализе публикаций способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить контроль сырья при изготовлении вакцинных препаратов против ящура серотипа О. Кроме того, следует отметить, что YO-PRO-1 IODIDE более чувствителен, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II и другие красители, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот [11].

В отличие от прототипа разработанный способ позволил провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК ID-гена производственных штаммов вируса ящура серотипа О длиной 218 п. н. Данный способ предусматривает проведение реакции амплификации специфического фрагмента кДНК ID-гена вируса ящура в диапазоне 322…539 п. н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных специфичных праймеров FMDV-O-1D-F322 и FMDV-O-1D-R539 для амплификации фрагмента размером 218 п. н. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов анализа точки максимума Тm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE, а также детекцию результатов анализа с определением максимального значения температуры плавления и проведением инструментального дифференциального анализа генома указанных штаммов вируса ящура. Таким образом, актуально применять предложенный способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Тm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Ключевым элементом заявляемого способа является применение анализа точки максимума Тm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE для дифференциации генома следующих производственных штаммов вируса ящура серотипа О:

«О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98),

«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

«О №2356/Пакистан/2018» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2),

«О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e),

«О/Кения/2017» (генотип О/ЕА-2),

«О №2241/Эфиопия/2011» (генотип О/ЕА-3).

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении способа ПЦР в режиме реального времени, оригинальных специфичных олигонуклеотидных праймеров FMDV-O-1D-F322 и FMDV-O-1D-R539, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК ID-гена вируса ящура размером 218 п. н. и технологии анализа точки максимума Тm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из культуральных суспензий, содержащих вирус ящура с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис»).

На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартных образцов и проб. Стандартными образцами являются положительные контроли, представляющие собой индивидуальные культуральные суспензии вируса ящура следующих штаммов:

«О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98),

«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

«О №2356/Пакистан/2018» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2),

«О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e),

«О/Кения/2017» (генотип О/ЕА-2),

«О №2241/Эфиопия/2011» (генотип О/ЕА-3).

В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ. Проводят обратную транскрипцию с применением следующих реагентов: деионизированная вода - 19 мкл, буфер 5-кратный - 10 мкл, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты - 5 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 2,5 мкл, MMLV-ревертаза - 1 мкл, элюат РНК - 10 мкл. Общий объем реакционной смеси составляет 50 мкл на одну реакцию.

Для постановки ПЦР в режиме реального времени готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х - 2,5 мкл, хлорид магния 25 мМ - 3 мкл, олигонуклеотидные праймеры - по 1 мкл, краситель YO-PRO-1 IODIDE Iodide - 2 мкл, Taq ДНК-полимераза - 1 мкл, кДНК вируса ящура - 5 мкл, деионизированная вода - 9,5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Обратную транскрипцию осуществляют при температуре 42°С в течение 15 минут. Предварительную денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 3 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 10 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 59°С в течение 35 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Для детекции сигнала устанавливают канал HRM, для которого длина волны источника составляет 460 нм, детектора - 610 нм. В качестве красителя применяется YO-PRO-1 IODIDE. Данный флуорофор можно анализировать также в системе детекции с длиной волны испускания/поглощения 491/509 нм [11].

Исследование кривой плавления ампликонов для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболических функций и детектируют пики высокого разрешения для полученных графиков. Выявляют, какие пики температур плавления характерны для вакцинных штаммов вируса ящура серотипа О, указанных выше, что позволяет судить о принадлежности исследуемого образца к одному из указанных производственных штаммов возбудителей ящура серотипа О.

Пример 1. Определение пиков высокого разрешения графиков плавления ампликонов для разработки способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию генома вакцинных штаммов вируса ящура серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из культуральных суспензий, содержащих РНК вируса ящура, с применением твердофазного способа с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа использовали культуральные суспензии вируса ящура следующих производственных штаммов: «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98),

«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

«О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

«О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e),

«О/Кения/2017» (генотип O/EA-2),

«О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3).

На следующем этапе проводили обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Постановку реакции проводили в детектирующем амплификаторе марки CFX-96 (Bio-Rad, США).

Исследование кривой плавления с высоким разрешением для анализа данных и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96. Проводили построение кривых плавления в виде параболических функций и детектировали точки максимума Tm ампликонов для полученных графиков. Тестировали кДНК вируса ящура указанных производственных штаммов в 30 повторностях для каждого штамма. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Выявили, что для каждого из указанных выше вакцинных штаммов вируса ящура серотипа А с помощью разработанного способа характерен свой узкий диапазон температуры плавления. Для производственного штамма «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98) данная температура составила 79,36±0,04°С (n=30, p<0,005), «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia) - 82,33±0,06°С (n=30, p<0,005), «О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2) - 74,22±0,05°С (n=30, p<0,005), «О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e) - 71,12±0,05°С (n=30, p<0,005), «О/Кения/2017» (генотип O/EA-2) - 76,33±0,05°С (n=30, p<0,005), «О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3) - 83,26±0,04°С (n=30, p<0,005) (фиг. 1, табл. 4).

Таким образом, для каждого из указанных производственных штаммов вируса ящура серотипа О характерен индивидуальный пик температуры плавления. Это указывало на возможность применения разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Специфичность анализа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE оценивали путем тестирования 6 экстрактов РНК вируса ящура серотипов А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и вируса бешенства вакцинного штамма «ВНИИЗЖ». В качестве положительных контролей использовали следующие вакцинные штаммы вируса ящура: «О №2383/Приморский/2019», «О №2147/Приморский/2012», «О №2356/Пакистан/2018», «О №2620/Оренбургский/2021», «О/Кения/2017», «О №2241/Эфиопия/2011».

Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов не была обнаружена.

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту вируса ящура именно серотипа О, и отрицательного контроля не формировали графики плавления и не были обнаружены точки максимума Tm ампликонов. При исследовании положительных контролей получены следующие значения температур плавления: для производственного штамма «О №2383/Приморский/2019» данная температура составила 79,36°С, «О №2147/Приморский/2012» - 82,33°С, «О №2356/Пакистан/2018» - 74,22°С, «О №2620/Оренбургский/2021» - 71,12°С, «О/Кения/2017» - 76,33°С, «О №2241/Эфиопия/2011» - 83,26°С. Полученные результаты контролей подтверждают данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE.

Для исследования разработанного способа дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения диагностической чувствительности разработанной тест-системы анализировали 450 культуральных суспензий вируса ящура следующих производственных штаммов: «О №2383/Приморский/2019» (n = 75), «О №2147/Приморский/2012» (n = 75), «О №2356/Пакистан/2018» (n = 75), «О №2620/Оренбургский/2021» (n = 75), «О/Кения/2017» (n = 75), «О №2241/Эфиопия/2011» (n = 75), с титрами инфекционной активности не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые являлись заведомо положительными.

Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени с последующим плавлением ампликонов проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 450 исследуемых культуральных суспензий вируса ящура указанных выше штаммов все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности способа тестировали 150 суспензий вируса ящура других серотипов. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что 105 проб содержали геном вируса ящура всех серотипов, но не серотипа О. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,18-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 97,57-100,0%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc)-99,39-100,00%.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) дифференциацию генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Тm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE. Определили, что в целевом участке ID-гена кДНК вируса ящура производственных штаммов серотипа О в позициях 322…539 п. н. имеется множество нуклеотидных мутаций, уникальных для каждого из следующих вакцинных штаммов: «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98), «О №2147/ Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia), «О №2356/Пакистан/2018» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2), «О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e), «О/Кения/2017» (генотип О/ЕА-2), «О №2241/ Эфиопия/2011» (генотип О/ЕА-3), что позволило разработать специфические олигонуклеотидные праймеры FMDV-O-1D-F322 и FMDV-O-1D-R539, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК ID-гена вируса ящура размером 218 п. н. и благодаря технологии анализа точки максимума Тm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа О. Впервые представлена дифференциация генома указанных вакцинных штаммов вируса ящура с помощью разработанного способа.

Разработанный способ характеризуется аналитической специфичностью, равной 100%. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,18-100,00%, диагностическая специфичность - 97,57-100,0%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE»:

1. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477.

2, Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(1):50-8.

3. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45.

4. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

5. GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=FMDV. (Дата обращения: 10.06.2023).

6. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10):1770-7.

7. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265.

8. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5):1610-1623.

9. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5.

10. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437.

11. Invitrogen™ YO-PRO™-1 Iodide (491/509) URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Y3603 (Дата обращения: 01.09.2023).

Таблица 1

Дизайн оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE (предлагаемое изобретение)

Наименование олигонуклеотидного праймера Нуклеотидная последовательность (5´→3´) FMDV-O-1D-F322 TACCACAAGGCACCACTCACCCG FMDV-O-1D-R517 CGGTAAAGCAGTTCAGTCACCCG

Таблица 2

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE (предлагаемое изобретение)

Параметры олигонуклеотидов Характеристики олигонуклеотидов FMDV-O-1D-F322 FMDV-O-1D-R517 Длина олигонуклеотида, н.о. 23 23 Молекулярный вес (Mw) 6907,5 7055,6 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 201,4 197,0 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 33,2 32,3 Дифференциал энтальпии (dS), кал/°К×моль 526,5 514,9 Температура плавления (T_m), °С:
- метод ближайших соседей 59 59

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М, температура 25°С, водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 3

Временные и температурные режимы обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени для дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE (предлагаемое изобретение)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, °С Время реакции Кол-во циклов Обратная транскрипция - 42 15 мин 1 Предварительный прогрев - 95 3 мин. 1 ПЦР в режиме реального времени Денатурация 95 10 с 40 Отжиг праймеров 59 35 с Элонгация Плавление Удержание на шаге 1 65 90 с 1 Удержание на шагах 2 - 250 65,1-90,0 2 с 1 на каждый шаг

Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С.

Таблица 4

Средние показания температур плавления, при которых достигались пиковые значения для исследуемых ампликонов производственных штаммов вируса ящура серотипа О (предлагаемое изобретение)

(n = 30, p<0,005)

Название штамма вируса ящура Температура пика при использовании разработанного способа, °С «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98) 79,36±0,04°С «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia) 82,33±0,06°С «О №2356/Пакистан/2018» (генотип O/ME-SA/PanAsia2) 74,22±0,05°С «О №2620/Оренбургский/2021» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e) 71,12±0,05°С «О/Кения/2017»
(генотип O/EA-2) 76,33±0,05°С «О №2241/Эфиопия/2011» (генотип O/EA-3) 83,26±0,04°С

Примечание: анализ проводили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США), отражены средние значения пиков температур и среднеквадратичное отклонение.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV-O.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-10-01">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-09-07</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>541</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-09-07</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации генома

вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа

точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего

красителя YO-PRO-1 IODIDE</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>14</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccacaggtgagtcagctgaccccgtgaccgccactgttgaaa

actacggcggtgagacacaggtccagaggcgccaacacacggacgtctcattcattttggacagatttgt

aaaagtgacgccaaaagaccaaattaatgtactggacctgatgcaaacccccgctcacactctggtggga

gcgctccttcgtactgccacttactatttcgctgacttagaagtggcagtgaaatacgagggaaacctca

cttgggtcccgaatggggcgcctgaaaacgcgttggataacaccaccaacccaacggcataccacaaggc

accactcacccggcttgcattgccgtacacggcaccacaacgtgtgttggcaaccgtttacaacgggaac

tgcaagtacggtgatggttcggtgaccaacataagaggtgacctacaagtgttggcccagaaggcggcga

gaacgctgcctacctccttcaactacggtgccatcaaagctactcgggtgactgaactgctttaccgcat

gaagagggctgagacgtactgcccccggcctcttttggccattcacccgaacgaggccagacacaaacag

aagattgtggcacctgtgaagcagctcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKYEGNLTWVPNGAPENALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPQRVLATVYNGNCKYGDGSVTNIRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPNEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctctgcgggtgagtcagctgaccccgtgaccgccaccgttgaga

actacggtggtgagacacaggtccagagacgccaacatacggacgtctcgttcatattagatagatttgt

gaaagtgacaccaaaagaccaaattaatgtgttggacctgatgcaaacccctgcacacactctggtgggc

gcactcctccgcactgccacctactacttcgcagacttagaagtggcggtgaaacacgaggggaacctca

cctgggtcccgaacggggcgcccgagacagcgttggacaataccaccaacccaacggcctaccacaaggc

accactcacccggcttgcactgccttacacggcaccacaccgtgtcttggccactgtttacaacggtaac

tgcaggtatggcgagggccccgtgaccagtgtgagaggtgacctgcaagtgttggcccagaaggcggcaa

gaacgctgcctacctccttcaattacggtgccatcaaagccactcgggtgactgaactgttataccgcat

gaagagggccgaaacatactgcccccggcctcttttggccatccacccaagtgaagctagacacaaacaa

aagattgtggcacctgtgaaacagcttttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCRYGEGPVTSVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actacctccacaggtgagtcggctgaccccgtgactgccactgttgaga

actacggtggcgagacgcaggtccagaggcgccagcacacggacgtctcgttcatattggacagatttgt

gaaagtgacaccaaaagaccaaattaatgtgttggacctgatgcaaacccccgcccacactttggtaggc

gcgctcctccgcaccgccacctactactttgcagatctagaggtggcagtgaaacacgaagggaacctca

cctgggtcccgaacggggcgcccgagacagcgttggacaacaccaccaatccaacggcttaccacaaggc

accactcacccggcttgcgctgccttacacagcaccacaccgtgtcttggccaccgtgtacaacgggagc

tgcaggtatggcgagagccaaacaaacaatgtgagaggtgacctgcaggtgttggcccggaaggcggcga

gaacgctgcctacctctttcaactacggtgccatcaaagcaacccgggtgactgaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccggcctcttttggccattcacccgaatgaggcaagacacaaacaa

aagatagtggcacctgtgaagcagctcttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGSCRYGESQTNNVRGDLQVLARKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPNEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actacctccacaggtgagtccgctgatcccgtgaccaccaccgttgaga

actacggtggagaaacacaggtccagagacgtcagcacactgacgtttctttcatcttggacagatttgt

gaaagtaacaccaaaagaccaaatcaatgtgttggacctgatgcaaacccctgctcacactttggtaggc

gcgctcctccgcaccgccacctactacttcgcagatttagaagtggcagtgaagcacgagggcaacctca

cctgggtcccaaacggggcgcccgaggcggcgctggataacaccaccaacccgacggcctaccacaaggc

accactcacccgtcttgctttgccttacacagcaccacaccgtgttttggctaccgtttacaacgggaac

tgcaagtacggcgagggcgccgtgaccaacgtgaggggtgacctccaagtcttggcccagaaagcagcaa

gaacgctgcccacctccttcaactacggtgccattaaggccacccgggtgactgaactgctttaccgcat

gaagagggccgaaacatactgcccccggcccctgctggccattcacccggaacaagctagacacaagcag

aagattgtggcacctgtcaaacagttgttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYGEGAVTNVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPEQARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccccgggtgagtcggctgaccctgtgactgccactgtggaga

actacggtggcgcaactcaggcccagagacgccaacacacggatgtctcgttcattctggacagatttgt

gaaggttacaccccaagaccaaatcaatgttctggacctgatgcagatccctgcccacacactggtgggc

gcgctcttgcgcgcatccacttactactttgctgatttggaagtggcagtgaaacacgagggcaacctca

cttgggtcccgaacggagcacccgaagttgcactggataacaccaccaacccaacagcataccacaaggc

accactcacccgccttgcattgccttacacggcaccacaccgcgtgttggcaaccgtgtacaacgggaac

tgcaagtacagtggctcctcagtgactaacgtgaggggtgaccttcaagtgttggcccagaaggctgcga

gagcgctgcccacctccttcaactacggtgccgtcaaggccactcgggtgacagaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccggcccctcttggccatccacccgagtgatgctagacacaaacaa

aagattgtggcacctgtcaaacaactccta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSPGESADPVTATVENYGGATQAQRRQHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN

VLDLMQIPAHTLVGALLRASTYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEVALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYSGSSVTNVRGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAVKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSDARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctctccaggcgaatcggccgaccctgtgactgccaccgtcgaga

actacggcggtgagacacaggtccagaggcgccaacacacggacgtctcgttcattcttgatagatttgt

gaaagtgacaccacaagaccaaattaatgtgttggacctgatgcagacccctgcccacacgctggttgga

gcgctcctccgcacttccacttactatttcgcagatttagaagtggcggtgaaacacgaggggaacctca

cgtgggtccccaatggagcgcctgaatcagctttggacaacaccaccaatccaacagcctaccacaaggc

accactcacccgacttgccttgccctacacggcaccacatcgcgtgttggcaaccgtttacaacggtaac

tgcaagtatggtgagacaccggtgaccaacgtgaggggcgatctccaggtgttggcccagaaggtggcga

gaacgctgcccacctctttcaactacggcgccatcaaggctacgcgggtgactgaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccggcccctgttggccattcacccaagtgaagccaggcacaaacag

aagatagtggcgcctgtgaaacaactcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSPGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTSTYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPESALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYGETPVTNVRGDLQVLAQKVARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taccacaaggcaccactcacccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggtaaagcagttcagtcacccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE. Способ включает проведение полимеразной цепной реакции с применением специфичных олигонуклеотидных праймеров, проведение процесса плавления ампликонов и определение температуры их плавления для дифференциации производственных штаммов вируса ящура серотипа О. Разработанный способ дает возможность: повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров, рассчитанных для целевого участка 1D-гена вируса ящура серотипа О, повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE, а также с помощью анализа точки максимума температур плавления (Tm - Temperature meiting) ампликонов проводить дифференциацию производственных штаммов вируса ящура серотипа О. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ дифференциации генома вируса ящура производственных штаммов серотипа О с помощью анализа точки максимума Tm ампликонов с применением зеленого интеркалирующего красителя YO-PRO-1 IODIDE, включающий следующие стадии:

- проведение полимеразной цепной реакции с применением специфичных олигонуклеотидных праймеров FMDV-O-1D-F322 с дизайном 5'-TACCACAAGGCACCACTCACCCG-3' и FMDV-O-1D-R539 с дизайном 5'-CGGTAAAGCAGTTCAGTCACCCG-3', рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК 1D-гена вируса ящура размером 218 п.н.,

- проведение процесса плавления ампликонов и определение температуры их плавления для дифференциации производственных штаммов вируса ящура серотипа О по следующим значениям точки максимума Tm ампликонов: для «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 данная температура составляет 79,36±0,04°С, «О №2147/Приморский/2012» генотипа O/ME-SA/PanAsia – 82,33±0,06°С, «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2 – 74,22±0,05°С, «О №2620/Оренбургский/2021» генотип O/ME-SA/Ind-2001e – 71,12±0,05°С, «О/Кения/2017» генотипа O/EA-2 – 76,33±0,05°С, «О №2241/Эфиопия/2011» генотипа O/EA-3 – 83,26±0,04°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале – 99,18-100,00%, диагностическая специфичность – 97,57-100,0%.