Способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

На протяжении столетий ящур является опасным и самым контагиозным заболеванием животных. В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии возбудитель данного заболевания имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus (FMDV) [1].

На сегодняшний день известно 7 следующих серотипов FMDV: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом представители серотипа SАT-2 широко распространены на Африканском континенте, Ближнем Востоке и периодически фиксируются в странах Азии [2]. Для серотипа SAT-2 выделяют 14 топотипов (I - XIV) [1-3].

Геном FMDV представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов возбудителя ящура серотипа SАT-2 имеют одинаковую длину около 8500 н.о., но при этом для них характерных индивидуальные уникальные мутации в 1D-гене [2].

С целью профилактики и борьбы с ящуром в Российской Федерации применяется система мероприятий, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Иммунизация животных проводится вакцинными препаратами, в которые включены штаммы FMDV серотипа SАT-2 [4, 5].

Учитывая, что вакцинные штаммы серотипа SАT-2 FMDV применяются для производства инактивированных культуральных препаратов, но при этом отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля вируссодержащего материала использовать способы, которые могут быстро проводить генотипирование или диффиринцирование вакцинных штаммов FMDV серотипа SAT-2 [5]. Данный этап крайне необходим при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования требуемого штамма при изготовлении противоящурных вакцин в рамках крупномасштабного процесса.

Учитывая, что в настоящее время для изготовления вакцин широко применяются производственные штаммы генотипа SAT-2/XIV, целесообразно провести разработку способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. По полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома возбудителя при наличии одной или нескольких уникальных замен можно проводить дифференциацию генетических форм вирусов друг от друга даже внутри одного вида [6-15]. Это форма генотипирования - представляющая собой измерение более общей генетической изменчивости [8].

Анализ максимальных значений температур плавления для различных изолятов/штаммов вирусов и других микроорганизмов представляет собой исследование кривой плавления ПЦР-продуктов, содержащих аллель-специфичные мутации, в широком диапазоне температур с узким шагом. Сочетание улучшенного инструментария количественной детекции ампликонов и флуоресцирующих красителей последнего поколения позволила выявлять генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечных молекул ДНК [12, 14, 15].

Сущность представленного метода заключается в том, что после проведения реакции амплификации целевого участка генома с применением флуоресцирующего красителя смесь постепенно нагревают, и при достижении определённой температуры ампликоны начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, уровень флуоресценция (Fl), которая детектируется оптической системой термоциклера, снижается. Чувствительность анализа достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного метода можно достичь высокой общей точности разработанного способа.

Прототипным вариантом проведения дифференциации генотипа
SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV является секвенирование методом Фредерика Сенгера [16]. Указанный метод является дорогостоящим, трудоемким и продолжительным во времени проводимого исследования.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, быстрого способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Сущность разработанного способа заключается в следующем:
1) создание дизайна олигонуклеотидных прямого и обратного праймеров для синтеза фрагмента кДНК с мутациями, уникальными для генотипа SAT-2/XIV; 2) проведение реакций обратной транскрипции и ПЦР с применением SYBR Gold; 3) постепенно нагревание полученных ПЦР-продуктов в широком диапазоне температур (при достижении пика температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи, что вызывает яркий флуоресцентный сигнал, специфичный для красителя SYBR Gold). Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления. Анализируя кривые плавления ПЦР-продуктов, возможно проводить дифференциацию генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять SYBR Gold, который не ингибирует реакцию и характеризующийся яркой флуоресценцией после встраивания в продукты реакции амплификации, что позволяет достичь высокую точность и чувствительность проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК генома FMDV генотипа SAT-2/XIV (размер ПЦР-продукта составляет 81 п.н.). Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества сырья при производстве вакцин против ящура генотипа SAT-2/XIV.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения праймеров SAT-2/XIV-F с дизайном 3'-TCG GCC ACA TTA CCG CCG AC-5' и SAT-2/XIV-R с дизайном 3'-AGA AGT GGC CTG GGG CAG TAT AG-5', рассчитанных для амплификации ПЦР-продукта размером 81 п.н.; 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению SYBR Gold; 3) по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома FMDV и температуре плавления ампликонов провести дифференциацию генотипа SAT-2/XIV от других генотипов возбудителя данного заболевания.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 – Спектр красителя SYBR Gold.

Фиг. 2 – Карта нуклеотидных замен для участка генома FMDV четырнадцати генотипов серотипа SAT-2. Примечание: представлены референтные участки генома I-XIV генотипов возбудителя ящура.

Фиг. 3 – Диаграмма максимумов температур плавления ПЦР-продуктов при анализе участка генома FMDV четырнадцати генотипов серотипа SAT-2.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов участка кДНК FMDV генотипа SAT-2/XIV (81 п.н.);

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых последовательностью нуклеотидов участка кДНК FMDV генотипа SAT-2/XIV (27 а.о.).

SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера SAT-2/XIV-F;

SEQ ID NO:4 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера SAT-2/XIV-R.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагирование РНК FMDV из образца; 2) проведение обратной транскрипции и ПЦР специфического фрагмента кДНК генома FMDV генотипа SAT-2/XIV размером 81 п.н. с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров SAT-2/XIV-F с дизайном 3'-TCG GCC ACA TTA CCG CCG AC-5' и SAT-2/XIV-R с дизайном 3'-AGA AGT GGC CTG GGG CAG TAT AG-5' и SYBR Gold (фиг. 1, таблицы 1 и 2); 3) проведение дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов возбудителя ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома FMDV и температуре плавления ампликонов (фиг. 2, 3).

По результатам анализа опубликованных в научной литературе данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации штаммов и изолятов FMDV с помощью секвенирования по Ф. Сенгеру [16], однако, как указано выше, он очень дорогостоящий, трудоемкий и продолжительный по времени проводимого исследования. При анализе публикаций способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой, легкостью и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить анализ. SYBR Gold более чувствителен своих аналогов, в частности, чем бромистый этидий, SYBR Green I и SYBR Green II, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот. Максимум возбуждения для красителя SYBR Gold отмечается при длине волны 496 нм, а максимум излучения – при 539 нм (фиг. 1).

В отличие от прототипа разработанный способ позволяет провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК генома FMDV генотипа SAT-2/XIV. Разработанный способ предусматривает проведение ПЦР специфического фрагмента генома с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров для амплификации фрагмента размером 81 п.н. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетов пиков температур плавления двуцепочечных ДНК и применение SYBR Gold, а также детекцию результатов анализа с определением максимальных значений температур плавления для решения задачи по дифференциации изолятов и штаммов генотипа SAT-2/XIV от других штаммов и полевых изолятов FMDV. Таким образом, разработан способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Обоснованием выбранного участка генома возбудителя ящура является наличие уникальных аллель-специфичных мутаций, характерных для генотипа SAT-2/XIV в сравнении со штаммами и изолятами FMDV других тринадцати генотипов серотипа SAT-2, а именно в позиции 525 п.н. замена A, C на T, 528 п.н. – T, C на G, 531 п.н. – T, C на G, 540 п.н. – T, C на A, 549 п.н. – G, A на C (фиг. 2).

Ключевым элементом заявляемого способа является применение олигонуклеотидных праймеров SAT-2/XIV-F с дизайном 3'-TCG GCC ACA TTA CCG CCG AC-5' и SAT-2/XIV-R с дизайном 3'-AGA AGT GGC CTG GGG CAG TAT AG-5' и SYBR Gold для проведения дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов возбудителя ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома FMDV и температуры плавления ампликонов.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении олигонуклеотидных праймеров SAT-2/XIV-F и SAT-2/XIV-R, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК генома возбудителя ящура размером 81 п.н. и дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других тринадцати генотипов вируса ящура серотипа SAT-2 по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома FMDV и температуры плавления ампликонов.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале – «Диаграмма максимумов температур плавления ПЦР-продуктов при анализе участка генома FMDV четырнадцати генотипов серотипа SAT-2» (фиг. 3).

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из образцов с использованием набора «РНК-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис», РФ).

На следующем этапе проводят обратную транскрипцию и ПЦР с применением высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и SYBR Gold для исследования стандартного образца и проб. Стандартным образцом является культуральная суспензия FMDV генотипа SAT-2/XIV, которая изначально исследована с помощью секвенирования по Ф. Сенгеру для подтверждения наличия именно требуемого штамма в стандарте (n = 5). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз Milli Q.

Для постановки реакции готовят смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10х – 2,5 мкл, хлорид магния 25 мМ – 3,2 мкл, олигонуклеотидные праймеры – по 5 мкл, краситель SYBR Gold – 1 мкл, Taq ДНК-полимераза – 1 е.а. (0,1 мкл), MMLv-ревертаза – 1 е.а. (0,1 мкл), элюат кДНК – 5 мкл, деионизированная вода – 3,1 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Постановку ПЦР осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США), или аналоге при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Обратную транскрипцию проводят при температуре 50°С в течение 20 мин. Предварительную денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 3 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 98°С в течение 10 секунд, отжиг олигонуклеотидов – при температуре 58°С в течение 25 секунд, элонгацию – при температуре 72°С в течение 20 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Исследование кривой плавления двуцепочечных фрагментов кДНК представленных выше генотипов возбудителя ящура серотипа SAT-2 для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболы и детектируют пики температур плавления для полученных графиков. Выявляют, какие максимумы температур плавления характерны для указанных выше генотипов вируса ящура серотипа SAT-2, что позволяет проводить дифференциацию генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Пример 1. Разработка способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из вируссодержащего образца, как указано выше.

На следующем этапе осуществляли обратную транскрипцию и ПЦР для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Проведение анализа осуществляли, как отражено выше.

Исследование профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96, или аналога. Проводили построение кривых плавления и детектировали максимумы температур плавления для полученных графиков. Тестировали кДНК FMDV указанных генотипов в 32 повторностях для каждого образца для получения результатов с высокой степенью достоверности (табл. 4).

Выявили, что для серотипа SAT-2 данная температура составила:
SAT-2/I73,81±0,02-2 данная температура составила:
SAT-2/I73,81±0,02 -2 данная температура составила:
SAT-2/I73,81±0,02°С, SAT-2/II73,42±0,02 SAT-2/II73,42±0,02°С, SAT-2/III73,66±0,02 SAT-2/III73,66±0,02°С, SAT-2/IV73,41±0,02 SAT-2/IV73,41±0,02°С, SAT-2/V73,37±0,01 SAT-2/V73,37±0,01°С, SAT-2/VI73,28±0,01 SAT-2/VI73,28±0,01°С, SAT-2/VII73,21±0,04 SAT-2/VII73,21±0,04°С, SAT-2/VIII73,95±0,02 SAT-2/VIII73,95±0,02°С, SAT-2/IX73,49±0,04 SAT-2/IX73,49±0,04°С, SAT-2/X73,98±0,02 SAT-2/X73,98±0,02°С, SAT-2/XI74,15±0,03 SAT-2/XI74,15±0,03°С, SAT-2/XII73,77±0,02 SAT-2/XII73,77±0,02°С, SAT-2/XIII73,72±0,01 SAT-2/XIII73,72±0,01⁰С, SAT-2/XIV72,36±0,01 SAT-2/XIV72,36±0,01°С (n=32, p<0,001) (фиг. 3, табл. 4).

Следовательно, для каждого из исследуемых штаммов/изолятов возбудителя ящура характерен индивидуальный пик температуры плавления. При этом значительно отличается именно генотип SAT-2/XIV FMDV. Таким образом, разработан способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Специфичность анализа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома оценивали при исследовании суспензий серотипа SAT-1 вируса ящура, штамма «РВ-97» вируса бешенства, штамма «Рич» возбудителя коронавирусного энтерита собак, штамма «Мира» калицивируса кошек. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ или 6,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

В качестве положительного контроля использовали суспензию вируса ящура генотипа SAT-2/XIV. Отрицательным контролем служила деионизированная вода. Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов графики не были сформированы, что подтверждало высокую специфичность компонентов реакционной смеси данного способа для возбудителя ящура генотипа SAT-2.

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту возбудителя ящура, и отрицательного контроля не формировали графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительного контроля получены следующие значения температур плавления: 72,36±0,01°С (n = 3, p<0,005). Результаты анализа контролей подтверждают стандартные данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома.

Для исследования разработанного способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 312 заведомо положительных проб суспензий возбудителя ящура генотипа SAT-2/XIV с титрами инфекционной активности не ниже 6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведение анализа осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 312 исследуемых проб FMDV все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того генотипа SAT-2/XIV, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности метода тестировали 250 суспензий возбудителя ящура генотипов SAT-2/I-XIII, за исключением генотипа SAT-2/XIV. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 250 проб содержали геном возбудителя ящура серотипа SAT-2 (генотипы SAT-2/I-XIII), но не генотипа SAT-2/XIV. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,82-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) – 98,54-100,0%, k-критерий – 1,000; общая точность (DAc) – 99,35-100,00% (табл. 5).

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) дифференциацию генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в целевом участке генома кДНК возбудителя ящура имеется несколько нуклеотидных мутаций, уникальных для генотипа SAT-2/XIV, что позволило использовать олигонуклеотидные праймеры, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК генома возбудителя ящура размером 81 п.н. и по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома проводить дифференциацию.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома»:

1. Wong CL, Yong CY, Ong HK, Ho KL, Tan WS. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Front Vet Sci. 2020 Aug 21;7:477. doi: 10.3389/fvets.2020.00477. PMID: 32974392; PMCID: PMC7473413.

2. Hussein HA, El Nashar RM, El-Sherbiny IM, Hassan RYA. High selectivity detection of FMDV- SAT-2 using a newly-developed electrochemical nanosensors. Biosens Bioelectron. 2021 Nov 1;191:113435. doi: 10.1016/j.bios.2021.113435. Epub 2021 Jun 24. PMID: 34175651.

3. Woldemariyam F, Paeshuyse J. Viral Protein 1 (VP1) Sequence-Based Genetic Diversity of SAT 2 FMDV Circulating in Ethiopia from 1990 to 2015. Vet Med (Auckl). 2023 May 25;14:91-101. doi: 10.2147/VMRR.S408352. PMID: 37256222; PMCID: PMC10226516.

4. Вакцины против ящура. URL: https://shop.arriah.ru/catalog/vaktsiny/vaktsiny-protiv-yashchura/vaktsina-protiv-yashchura-kulturalnaya-inaktivirovannaya-emulsionnaya-arriakh-vak. (дата обращения: 12.12.2023).

5. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24^th Ed. - Paris, 2022 – Vol. 1, Chapter 2.1.5. – P. 166-169.

6. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug;85(1):50-8. doi: 10.1016/j.yexmp.2008.03.012. Epub 2008 Apr 13. PMID: 18502416; PMCID: PMC2606052.

7. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug;175(2):236-45. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.05.023. Epub 2011 May 19. PMID: 21620898.

8. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct;51(10):1770-7. doi: 10.1373/clinchem.2005.054924. PMID: 16189378.

9. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G, Xu L, Sun Q, Peddireddi L, Jia W, Liu Y, Anderson G, Bai J, Shi J. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct;236:258-265. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.08.005. Epub 2016 Aug 6. PMID: 27506582; PMCID: PMC7119729.

10. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct;64(5):1610-1623. doi: 10.1111/tbed.12554. Epub 2016 Sep 3. PMID: 27589902; PMCID: PMC7169878.

11. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5. doi: 10.1016/j.mcp.2010.04.004. Epub 2010 Apr 28. PMID: 20433917.

12. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437. doi: 10.2478/jvetres-2018-0064. PMID: 30729199; PMCID: PMC6364153.

13. Estrada-Rivadeneyra D. Sanger sequencing. FEBS J. 2017 Dec;284(24):4174. doi: 10.1111/febs.14319. Epub 2017 Nov 24. PMID: 29171728.

14. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct;24(5):250-5. doi: 10.1016/j.mcp.2010.04.004. Epub 2010 Apr 28. PMID: 20433917.

15. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, He JJ, Ma WM, Lv JL, Ma XY, Ou YW, Wang J, Liu YS, Chang HY, Wang YL, Zhang Q, Liu XT, Zhang YG, Zhang J. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31;62(4):431-437. doi: 10.2478/jvetres-2018-0064. PMID: 30729199; PMCID: PMC636415.

16. Pareek CS, Smoczynski R, Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. J Appl Genet. 2011 Nov;52(4):413-35. doi: 10.1007/s13353-011-0057-x. Epub 2011 Jun 23. PMID: 21698376; PMCID: PMC3189340.

Таблица 1

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома (предлагаемое изобретение)

Наименование олигонуклеотидного праймера Нуклеотидная последовательность (5´→3´) SAT-2/XIV-F TCG GCC ACA TTA CCG CCG AC SAT-2/XIV-R AGA AGT GGC CTG GGG CAG TAT AG

Таблица 2

Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома (предлагаемое изобретение)

Параметры праймеров Характеристики олигонуклеотидов SAT-2/XIV-F SAT-2/XIV-R Длина, н.о. 20 23 Молекулярный вес (Mw) 6022,9 6895,5 Содержание GC, % 65 57 Дифференциал энтропии (dH), ккал/моль 182,4 187,5 Дифференциал энергии Гиббса (dG), ккал/моль 30,3 31,1 Дифференциал энтальпии (dS), кал/K×моль 474,4 488,2 Температура плавления (T_m), °С:
- статистический метод ближайших соседей 58 58

Примечание: термодинамические параметры разработанных олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М,

температура 25°С,

водородный показатель (рН) 7,0.

Таблица 3

Временные и температурные режимы обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 FMDV (предлагаемое изобретение)

Этап реакции Подэтап реакции Температура, ⁰С Время реакции Кол-во циклов Обратная транскрипция - 50 20 1 Предварительный прогрев - 95 3 мин. 1 ПЦР Денатурация 98 10 с 40 Отжиг праймеров 58 25 с Элонгация 72 20 с Плавление Удержание на шаге 1 65 90 с 1 Удержание на шагах 2 – 250* 65,1-90,0 2 с 1 на каждый шаг

Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С,

* - детекция сигнала.

Таблица 4

Средние показания температур плавления, при которых достигались пиковые значения для исследуемых ампликонов штаммов и изолятов возбудителя ящура (предлагаемое изобретение)

(n = 32, p<0,001)

Наименование генотипа вируса ящура серотипа SAT-2 Максимум температуры плавления
ампликона при использовании разработанного способа, °С SAT-2/I 73,81±0,02°С SAT-2/II 73,42±0,02°С SAT-2/III 73,66±0,02°С SAT-2/IV 73,41±0,02°С SAT-2/V 73,37±0,01°С SAT-2/VI 73,28±0,01°С SAT-2/VII 73,21±0,04°С SAT-2/VIII 73,95±0,02°С SAT-2/IX 73,49±0,04°С SAT-2/X 73,98±0,02°С SAT-2/XI 74,15±0,03°С SAT-2/XII 73,77±0,02°С SAT-2/XIII 73,72±0,01°С SAT-2/XIV 72,36±0,01°С

Примечание: анализ проводили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США), отражены средние значения пиков температур и среднеквадратичное отклонение.

Таблица 5

Пределы диагностических возможностей способа дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома (предлагаемое изобретение)

Диагностические показатели Результаты обработки данных
(95%-ный доверительный интервал) DSe 98,82-100,00% DSp 98,54-100,00% k-критерий 1,000 DAc 99,35-100,00%

Примечание: DSe – диагностическая чувствительность,

DSp – диагностическая специфичность,

k-критерий - индекс Каппа Коэна,

DAc - общая точность.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-08-07"

softwareVersion="2.1.2" softwareName="WIPO Sequence" fileName="FMDV

SAT-2 XIV.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-26</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>567</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-26</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации генотипа

SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по

полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной

амплификации целевого участка генома</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>81</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcggccacattaccgccgacgcacctgtggaggtgtactaaaggatgaaccg

cgctgagctatactgccccaggccacttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>SATLPPTHLWRCTKGGTALSYTAPGHF</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcggccacattaccgccgac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agaagtggcctggggcagtatag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома, предполагающий применение олигонуклеотидных праймеров. Технический результат заключается в повышенной чувствительности и специфичности дифференциации SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура. 1 з.п. ф-лы, 3 пр., 3 ил., 5 табл.

1. Способ дифференциации генотипа SAT-2/XIV от других генотипов серотипа SAT-2 вируса ящура по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома, включающий применение олигонуклеотидных праймеров SAT-2/XIV-F с дизайном 3'-TCG GCC ACA TTA CCG CCG AC-5' и SAT-2/XIV-R с дизайном 3'-AGA AGT GGC CTG GGG CAG TAT AG-5', рассчитанных для амплификации ПЦР-продукта размером 81 п.н., и красителя SYBR Gold; анализа по полиморфизму единичных нуклеотидов с помощью аллель-специфичной амплификации целевого участка генома FMDV, при проведении которого определено, что для генотипа SAT-2/XIV вируса ящура пик температуры плавления составляет 72,36±0,01°С.

2. Способ по п. 1, где время анализа сокращается до 2,5 ч, аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале – 98,82-100,00%, диагностическая специфичность – 98,54-100,0%.