Способ дифференциальной диагностики хронического пиелонефрита, хронического гломерулонефрита и мочекаменной болезни у больных с гематурией Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

буфере до концентрации

клеток/мп„..

Готовят две инкубационные среды, содержащие в конечной концентрации, мМ: На 125, К 10, ЭДТА 0,5, АТФ динатриевая соль .; буфер рН 7,6 50 „ Первая инкубационная среда содержит также 6 -мМ MgCl2, вторая 12 мМ MgCl2.

Берут две суспензии эритроцитов по 0,1 мл (2 .10 -2HOW кл/0,1 мл), к первой добавляют 0,3 мл первой инкубационной среды с 6 мМ MgClj, к второй 0,3 мл второй инкубацион- ной среды с 12 мМ MgCl2. Обе пробы инкубируют в водяной бане при 44еС я течение 40 мин. Реакцию останавливают добавлением в пробы по 0,2 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты.

Активность Na, К-АТфазы в обеих пробах определяют по приросту неорганического фосфора (Фц) t т.е. по разнице между активностью АТфазы в присутствии и в отсутствии 0,2 мМ уабаина. Для этого к 1,8 мл дистиллированной воды приливают 0,2 мл супернатанта инкубационной среды после остановки ферментативной реакции трихлоруксусной кислотой. Далее пробу смешивают с 1,6 мл реактива А (10N HftSO +FgO+5%-Hbtfi раствор ( К 4Н40 в ;; соотношении 1:2:1) и через t-2 мин при непрерывном помешивании добавляют 0,4 мл реактива В (0,2%-ный раствор аскорбиновой кислоты в 0,2%-ный раствор SnCl в концентрированной НС1). Через 15 мин окрашенную смесь анализируют спектро фотометрически при длине волны 720 нм. Активность Na, К-АТфазы определяют по разнице экстинкций в пробе без уабаина и в пробе с уабаином, выраженной в мкмоль/мл/ч0

Формула расчета активности Na,.K- АТфазы:

А«(Ец-Е)-К,

где А - активность Na, К-АТфазы в

мкмоль/мл/ч;

Е| - экстинкция при 720 нм в пробе без уабаина;

Ей - экстинкция при 720 нм в пробе с уабаином; К - коэффициент пересчета:

К-0,, «1,1 ir10,

где 0,23 - коэффициент пересчета экстинкций , мкмоль;

д

5

3 - пересчет на общий объем инкубационной смеси с 0,2 на 0,6 мл;

1,5 - пересчет времени инкубации на 1 ч;

5 - пересчет на конечное разведение эритроцитов в 5 раз; 1,1 - коэффициент по гематокри- ту;

10 - пересчет активности фермента с 0,1 на 1 мл эритроцитов.

При активности Na, К-АТфазы в первой пробе суспензии эритроцитов с 6 мМ MgCl2 0,16-0,66 мкмоль/мл/ч диагностируют хронический гломеруло- нефрит, а при активности фермента в первой пробе 1,16-1,65 мкмоль/мл/ч диагностируют хронический пиелонефрит, а при активности Аермента во второй пробе с 12 мМ MgCl2 0,16- 0,46 мкмоль/мл/ч диагностируют мочекаменную болезнь.

Пример. У больного при исследовании активности фермента Na, К- АТфазы в первой пробе с 6 мМ MgCl2 нашли, что разница экстинкций между пробой без уабаина и пробой с уабаином составила 0,003, откуда активность Na, К-АТфазы . 0,, 1,,,17 мкмоль/мл/ч, а во второй пробе с 12 мМ MgCl2 разница экстинкций составила 0,025, откуда активность Na-K-АТфазы 0,025 0, к1,5 к5 «1,,42 мкмоль/мл/ч. Поскольку в первой пробе с 6 мМ MgCl2 выявлена активность Na, К-АТфазы 0,17 мкмоль/мл/ч данному больному ставится диагноз хронического гломеру- лонефрита.

Способ работоспособен только в указанных значениях количества эритроцитов и концентрациях хлористого магния.

Зависимость активности Na, К-АТфазы от количества эритроцитов в пробе приведена в табл. 1.

Зависимость активности Na, K- АТфазы в эритроцитах больного гломе- рулонефритом от концентрации MgCl2 приведена в табл. 2„

На основании представленных в табл. 1 видно, что для сохранения прямолинейности ферментативной реакции необходимо использовать концентрацию эритроцитов в пределах 2 МО 2-101 клеток/мл, чтобы количество разрушенного Субстрата АТФ не превышало 20%. При последующем увеличении количества эритроцитов в пробе, в частности, 1«10 , 1,, возможно искажение характера прямой, так как избыточное количество клеток будет разрушать большее количество субстрата, что снижает концентрацию последнего в пробе и соответственно приводит к уменьшению ферментативной активности.

Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что наиболее информативными концентрациями MgCl2 являются 6 и 12 мМ.

Пример 1. Больной М.П., 50 лет, поступил в клинику на обследование по поводу болей в спине, повышения артериального давления (АД) до 200/120 мм рт,ст. максимально и выявленной гематуриИо При объективном осмотре выявлена небольшая болезненность справа при поколачивании области почек, повышение АД до 150/ /90 мм рт.ст. В моче: удельный вес 1021, 1,5 - 0,228%о, в осадке: лейкоциты до 12 в поле зрения (п.зр.) эритроциты до 30 в п.зр. Описанная клиническая картина не позволила поставить диагноз причины гематурии.

Был предположен дифференциальный диагноз - хронический пиелонефрит, хронический гломерулонефрит и мочекаменная болезнь. При исследовании крови выявили: в первой пробе суспензии эритроцитов (2 клеток/мл) с 6 мМ MgCl2 активность Na, К-АТфазы, 0,16 мкмоль/мл/ч, что и позволило установить диагноз хронического гло- мерулонефрита, во второй пробе с 12 мМ MgCl2 активность фермента составила 1,40 мкмоль/мл/ч.

Таким образом, больному был установлен диагноз хронического гломеру- лонефрита. Дальнейшее морфологическое исследование препарата почечной ткани после пункционной биопсии почки достоверно подтвердило наличие у больного хронического мезангиально-профи- леративного гломерулонефрита.

Пример 2. Больной Ч.Я., 16 лет, поступил в клинику с жалобами на боли в спине„ Заболел на 1,5 года до поступления с повторными макроге-, матуриями, которые сопровождались повышением температуры и дизурией. В течение последующего года в ана0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

лизах мочи сохранялась гематурия до 30 эритроцитов в п.эр. При поступлении объективно-незначительная болезненность справа при поколачивании области почек. В анализах мочи: уд. вес 1020, белок 0,167%о, в осадке: до 12 лейкоцитов в п„зр. и до 30 свежих и выщелоченных эритроцитов в п.зр„

Таким образом, у больного возник дифференциальный диагноз между хроническим пиелонефритом, хроническим гломерулонефритом и мочекаменной болезнью. Проведенные цистоскопия и внутривенная урография также не дали возможности установить диагноз причины гематурии. При исследовании крови выявили: активность Na, К-АТфа- зы в первой пробе суспензии эритроцитов ( клеток/мл) с 6 мМ MgCl2 составила 0,66 мкмоль/мл/ч, что и позволило поставить больному диагноз хронического гломерулонефрита. Одновременное исследование Аермента во второй пробе с 12 мМ MgCl2 выявило активность 1,16 мкмоль/мл/ч. Таким образом, по активности фермента Na, К-АТфазы в первой пробе был установлен диагноз хронического гломеруло- нефрита. Проведенная биопсия почки и гистологическое исследование препарата выявило наличие хронического мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита, что достоверно подтвердило диагноз.

П р и м е р 3. Больная Г„И,, 27 лет, поступила в клинику с жалобами на тупые боли в пояснице, головные боли и пастозность лица по утрам. Такие жалобы появились у больной 5 лет тому назад, а в течение последнего года повышалось также АД до 150/100 мм рт.сто При объективном осмотре: бледность, пастозность лица, небольшое повышение АД до 140/ /80 мм рт0ст., чувствительность при поколачивании в области обеих почек. В моче: уд. вес 1022, лейкоциты до 45 в п. зр., свежие эритроциты до 6 в п.эро, выщелоченные эритроциты до 15 в п.эр. На основании вышеизложенного у больной были предположены следующие дифференциальные диагнозы: хронический пиелонефрит, хронический гломерулонефрит и мочекаменная болезнь. При исследовании крови выявили: активность фермента Na, К-АТфазы в первой пробе суспензии эритроцитов

с 6 мМ MgCl2 составила 1,1бмкмоль/мл/ что и позволило установить диагноз . хронического пиелонефрита Активность фермента во второй пробе с 12 мМ

MgCl2 также составила 1, 16 мкмоль/мл/ч при постановке диагноза не учитывалась, поскольку диагноз хронического пиелонефрита устанавливается при соответствующей активности фермента в первой пробе Последующее проведение внутривенной пиелографии выявило расширение чашечек и лоханок, более выраженное справа, что свидетельствовало о хроническом пиелонефрите. Снижение гематурии после проведенной уроантисептической терапии также свидетельствовало о хроническом пиелонефрите с

Таким образом, исследование крови больной предлагаемым способом позволило поставить достоверный диагноз хронического пиелонефрита до проведения рентгеноконтрастного исследования почек.

П р и м е р 4. Больная И.А., 57 лет, поступила в клинику по поводу повторной макрогематурии за несколько дней до госпитализации. Жалобы на тянущие боли в пояснице с иррадиацией в паховую область и в бедро, болезненное мочеиспускание. При объективном осмотре выявилась небольшая болезненность справа при поколачивании области почек. В ана- лизах мочи: уд. вес 1017, белок 0,137%о, лейкоциты до 30 в п.зр., эритроциты до 60 в ПоЗр. У больной был предположен дифференциальный диагноз между хроническим гломеруло- нефритом, хроническим пиелонефритом и мочекаменной болезнью. Исследование крови выявило: активность фермента Ма, К-АТфазы в первой пробе суспензии эритроцитов с 6 мМ MgCl2 сое- 1 тавила 1,65 мкмоль/мл/ч, во второй пробе с использованием 12 мМ концентрации MgCl2 активность фермента была 1,16 мкмоль/мл/ч, на основании выявленной в первой пробе активности фермента На, К АТфазы 1,65 мкмоль/мл/ч был поставлен диагноз хронического пиелонефрит а.

Проведенное в дальнейшем параклиническое обследование больной - отрицательные данные цистоскопии, наличие расширенной гипотоничной лоханки справа на фоне нефроптоза, а также одновременное снижение эритроцитурии

и лейкоцитурии после проведения уроантисептической терапии позволило достоверно подтвердить диагноз хронического пиелонефрита. Таким образом, исследование крови позволило до проведения цистоскопии и рентгеноконтрастного исследования почек достоверно поставить диагноз хронического пиелонефрита„

П р и м-е р 5„ Больная М.А., 29 лет, поступила в клинику с жалобами на сильные боли в правой части живота, болезненное мочеиспускание, тошноту. Указанные жалобы появились впервые. При объективном осмотре выявлена болезненность справа при поколачивании области почек, болезненность средней точки мочеточника справа. В анализах мочи: уд„ вес 1024, белок 1,26%о, лейкоциты до 80 в п.зр. эритроциты до 30 в п.зро G учетом изложенных данных были предложены следующие дифференциальные диагнозы: хронический гломерулонефрит, обострение хронического пиелонефрита и мочекаменная болезнь. Исследование крови выявило: активность Na, К-АТФазы в первой пробе суспензии эритроцитов с использованием 6 мМ концентрации MgClz составила 0,99 мкмоль/мл/ч, а во второй пробе суспензии эритроцитов с 12 мМ MgCl2 0,16 мкмоль/мл/ч. Выявление активности фермента 0,16 мкмоль/мл/ч во второй пробе позволило поставить диагноз мочекаменной болезни. Проведенная затем цитоскопия выявила: мелкий уратный песок в мочевом пузыре и камень в отверстии правого мочеточника, что достоверно подтвердило диагноз мочекаменной болезни. Таким образом, исследование крови позволило еще до проведения цистоскопии поставить диагноз мочекаменной болезни.

Прим ер 6„ Больной Г.А„, 19 лет, поступил в клинику с жалобами на боли в правой половине живота, дизурию, повышение температуры тела до 37,6°С с ознобом. Объективный ос1- мотр не выявил существенных отклонений от нормы В анализах мочи: уд вес 1020, лейкоциты до 60 в п.зр0, эритроциты до 60 в п.зр. Учитывая клиническую картину и данные лабораторного исследования, возникло предположение о наличии у больного мочекаменной болезни с дифференциальным диагнозом - обострение хронического

пиелонефрита и хронический гломеру- лонефрит. Исследование крови выявило: активность фермента Na, К-АТфа- зы в первой пробе суспензии эритроцитов с 6 мМ MgClj составила 1,40 мкмоль/мл/ч, а активность фермента во второй пробе суспензии эритроцитов с использованием 12 мМ MgCl2 составила 0,41 мкмоль/мл/ч, а именно выявление активности фермента 0,41 мкмоль/мл/ч во второй пробе дало возможность поставить диагноз мочекаменной болезни Таким образом, исследование крови позволило еще до появления таких выраженных проявлений болезни, как отхождение камня, поставить диагноз мочекаменной болезни о

У 27 больных (93% случаев) пред- лагаемым способом по активности Na, К-АТфазы в пробе эритроцитов с 6 мМ MgCl2 установлен диагноз хронического гломерулонефритао (ХГН). Активность фермента в пробе эритроцитов с добавлением 6 мМ MgCl2 составила у этих больных 0,16-0,66 мкмоль/мл/ч Диагноз ХГН у всех 27 больных был в дальнейшем достоверно подтвержден: у 8 больных при морфологическом ис- следовании биоптата почек был установлен хронический мезангиально- пролиферативный гломерулонефрит, у 2 больных - хронический мембранозно- пролиферативный гломерулонефрит; у остальных больных диагноз ХГН был установлен на основании типичной клинической картины - возникновение заболевания после перенесенных вирусных и бактериальных инфекций, стойкая эритроцитурия в течение не менее двух лет, а подробное лабораторное и инструментальное исследование не выявило других причин гематурии.

У 33 больных с гематурией по ис- следованию активности Na, К-АТфазы в пробе эритроцитов с 6 мМ MgCl2 был установлен диагноз хронического пиелонефрита (94% случаев)„ Активность фермента Na, К-АТфазы в пробе с 6 мМ MgCl2 у этих больных составила 1,16- 1,65 мкмоль/мл/ч. В дальнейшем диагноз хронического пиелонефрита у этих больных был достоверно подтвержден рентгенологическим исследованием почек с обнаружением органических изменений в чашечно-лоханочной системе У 7 больных диагноз хронического пиелонефрита подтвердился и клиническими данными - исчезновением гематури после проведенной уроантисептической терапии,

У 26 больных (89% случаев) по активности фермента Na, К-АТфазы в пробе эритроцитов с 12 мМ MgCl2 был установлен диагноз мочекаменной болезни. Активность Na, К-АТфазы в пробе с 12 мМ MgCl2 у этих больных составила 0,16-0,41 мкмоль/мл/ч. Наличие мочекаменной болезни у всех больных было в дальнейшем достоверно подтверждено: рентгенологически у 21 больного, при ультрасонографии почек у 5 больных и клинически по отхожде- нию камней мочеточника у 3 больных.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики хронического пиелонефрита, хронического гломерулонефрита и мочекаменной болезни у больных с гематурией путем исследования крови, о т л и чающийся тем, что, с целью повышения точности способа, готовят две пробы суспензии эритроцитов, содержащие 2 -10 клеток в 1 мл, добавляют магний хлористый в конечной концентрации 6- мМ и 12 мМ соответственно, и определяют активность К, Na - АТфазы и при активности фермента в первой пробе от 0,16 до 0,66 мкМу диагностируют хронический гломерулонефрит, от 1,16 до 1,65 - хронический пиелонефрит, а при активности фермента во второй пробе от 0,16 до 0,41 - мочекаменную болезнь.

Таблица 1

Таблица 2

Изобретение относится к медицине, а именно нефрологии„ Цель изобретения - повышение точности способа. Для этого у пациента с выявленной гематурией берут 9-10 мл крови, готовят 2 пробы суспензии эритроцитов, добавляют хлористый магний до конечной концентрации 6 мМ и 12 мМ соответственно, а затем определяют активность К, Na-АТфазы по приросту неорганического фосфата При активности фермента в первой пробе от 0,16 до 0,66 мкм-см -ч диагностируют хронический гломерулонефрит, от 1,16 до 1,65 - хронический пиелонефрит, а при активности фермента во второй пробе от 0,16 до 0,41 - мочекаменную болезнь При этом точность диагностики хронического гломерулонефрита составляет 93%, хронического пиелонефрита - 94%, а мочекаменной болезни - 89%. верхний слой эритроцитов, содержащий лейкоциты, удаляют Оставшиеся эритроциты 3 раза отмывают охлажденным 0,145 М раствором NaCl в 0,02 М трис- НС1 буфера (рН 7,6) с последующим каждый раз центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Отмытые эритроциты инкубируют при комнатной температуре в течение 40 мин с равным объемом 1%-ного раствора Твин-20 в 0,145 М NaCl в 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,6). Эритроциты разводят 0,145 М раствором NaCl в 0,02 М трисО 4 Ј О 00 1C

Активность Na К-АТфазы, мкмоль

Фч/ч мл/клеток 1,5 1,1 0,71 0,41 0,50 0,7 0,82 1,0 1,2 1,32