Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к онколитическому вирусу простого герпеса, генетически сконструированному для переноса генов, кодирующих по меньшей мере один хемокин и/или по меньшей мере один опухоль-ассоциированный/специфический антиген, и его применению в комбинации с терапевтическим агентом, нацеленным на опухоль, включая CAR-T, BiTE и ADC, для лечения различных опухолей.
Уровень техники
[0002] Адоптивный перенос CAR-T-клеток у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями показал ошеломляющие результаты. Однако этот подход показал незначительный эффект у пациентов с солидными опухолями. Представляется маловероятным, что одной только CAR-T-клеточной терапии будет достаточно для индукции полных ответов при большинстве видов рака. Комбинирование CAR-T-клеток с другими видами лечения рака, которые имеют другие механизмы действия и потенциал синергизма с Т-клетками, может уменьшить «ускользание» опухоли и повысить показатели успеха CAR-T-клеточной терапии.
[0003] Онколитическая виротерапия представляет собой терапевтический подход для лечения рака, в котором используются нативные или генетически модифицированные вирусы, которые селективно реплицируются в раковых клетках. Область онколитической виротерапии вновь стала объектом внимания после одобрения FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) Talimogene laherparepvec (T-VEC) - онколитического вируса простого герпеса 1 типа (HSV-1), модифицированного для экспрессии GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колонне стимулирующий фактор). Кроме того, онколитические вирусы (OV) могут быть дополнительно модифицированы для селективной доставки терапевтических трансгенов в микроокружение опухоли для усиления их противоопухолевой активности или усиления противоопухолевого иммунного ответа. В доклинических исследованиях комбинаций CAR-T-клеток с онколитическими вирусами, вооруженными цитокинами, хемокинами, BiTE или ингибиторами иммунных контрольных точек, были достигнуты улучшенные терапевтические результаты. Например, было показано, что онколитические аденовирусы, модифицированные для экспрессии IL-15 и RANTES или IL-2 и TNF-α, увеличивают накопление и выживаемость CAR-T-клеток в микроокружении опухоли. Вирус осповакцины, экспрессирующий CXCL11 - лиганд CXCR3, применяли для привлечения эффекторных клеток после переноса для усиления внутриопухолевой миграции CAR-T-клеток. В еще одной работе продемонстрировано, что экспрессия онколитическим аденовирусом BiTE, нацеленного на второй опухолевый антиген, может влиять на гетерогенность экспрессии антигена. Как и ожидалось, все эти комбинации CAR-T-клеток и вооруженных OV приводили к усилению контроля над опухолью и продлению выживаемости по сравнению с каждым агентом в качестве монотерапии.
[0004] В недавнем исследовании был сконструирован онколитический вирус для экспрессии несигнального усеченного белка CD19 (CD19t) для опухолеселективной доставки, что позволяет осуществлять нацеливание CD19-CAR-Т-клетками. Инфицирование опухолевых клеток онколитическим вирусом осповакцины, кодирующим CD19t (OV19t), продуцировало de novo CD19 на поверхности клетки перед опосредованным вирусом лизисом опухоли. Совместно культивированные CD19-CAR-T-клетки секретировали цитокины и проявляли мощную цитолитическую активность против инфицированных опухолей. При использовании нескольких мышиных моделей опухоли доставка OV19t способствовала контролю опухоли после введения CD19-CAR-T-клеток. OV19t индуцировал местный иммунитет, характеризующийся инфильтрацией опухоли эндогенными и адоптивно перенесенными Т-клетками. Уничтожение опухоли, опосредованное CAR-Т-клетками, также индуцировало высвобождение вируса из умирающих опухолевых клеток, что способствовало экспрессии CD19t опухолью. В то время как в этом исследовании излечилось более 50% мышей, получавших эту комбинированную терапию, некоторые мыши либо ответили временно, либо не ответили (Park et al., Sci. Transl. Med. 12, eaaz1863 (2020)).
[0005] В US20190233536A1 раскрыт модифицированный аденовирус, в частности, Enadenotucirev (EnAd), вооруженный по меньшей мере двумя биспецифичными рекрутерами Т-клеток (BiTE), каждый из которых содержит по меньшей мере два связывающих домена, причем по меньшей мере один из доменов специфичен к поверхностному антигену на представляющей интерес иммунной клетке, такой как представляющая интерес Т-клетка. Вооружение аденовируса молекулой BiTE позволяет молекуле фрагмента биспецифичного антитела воспользоваться способностью аденовируса селективно инфицировать раковые клетки, тем самым обеспечивая таргетную доставку BiTE в опухолевые клетки. После инфицирования аденовирусами молекулы BiTE синтезируются опухолевыми клетками, секретируются и могут оказывать действие локально, распространяясь за пределы непосредственной области присутствия вируса. Таким образом, это позволяет BiTE распространяться за пределы непосредственного очага инфекции, но в то же время ограничивает распространение вируса слишком далеко за пределы инфицированной совокупности опухолевых клеток. Это сводит к минимуму риск нежелательных нецелевых эффектов.
Краткое описание
[0006] Первый аспект настоящего изобретения относится к генетически модифицированному онколитическому вирусу простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена и (b) по меньшей мере один хемокин, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанного по меньшей мере одного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и где указанный усеченный несигнальный вариант экспрессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки в качестве биомаркера при репликации указанного oHSV в указанной опухолевой клетке, и указанный по меньшей мере один хемокин экспрессируется и высвобождается, индуцируя хемотаксис иммунной клетки к указанной опухолевой клетке.
[0007] Другой аспект настоящего изобретения относится к генетически модифицированному онколитическому вирусу простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и где указанный усеченный несигнальный вариант экспрессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки в качестве биомаркера при репликации указанного oHSV в указанной опухолевой клетке.
[0008] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическому набору для лечения рака, содержащему, по отдельности, генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), описанный в настоящей заявке, и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, где указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака.
[0009] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения рака у субъекта, включающему введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества генетически модифицированного онколитического вируса простого герпеса (oHSV) и терапевтического агента, нацеленного на опухоль, одновременно или последовательно, где в геном указанного oHS V включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, и предпочтительно (b) по меньшей мере один хемокин, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и предпочтительно указанного по меньшей мере одного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и где указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака.
[0010] Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из подробного описания, приведенного ниже со ссылкой на графические материалы.
Краткое описание графических материалов
[0011] На Фиг. 1 показано схематическое изображение oHSV-остовов Т7201, Т7202, Т7203, Т7204, Т7011, Т7012 и Т7013 (в совокупности в дальнейшем именуемых «серией Т7»). (А) Схематическое изображение Т3011, где генетически модифицированный oHSV кодирует антитело к hPD-1 (hPD-1-Ab), ингибитор иммунной контрольной точки и hIL-12, цитокин, причем внутренний инвертированный повтор (b'a' и а'с') заменен полинуклеотидами, кодирующими hIL-12, и между генами UL3 и UL4 фрагмента UL введена кассета экспрессии hPD-1-Ab. Более подробное описание Т3011 содержится в WO 2017/181420 (IMMV503), полное содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки. (В) Схематическое изображение иллюстративных вирусов серии Т7, описанных в настоящей заявке. Эти генетически модифицированные oHSV кодируют hPD-1-Ab, hIL-12, опухоль-ассоциированный антиген и хемокин, причем внутренний инвертированный повтор (b'a' и а'с') заменен полинуклеотидами, кодирующими hIL-12, между генами UL3 и UL4 фрагмента UL введена кассета экспрессии hPD-1-Ab, и между генами UL37 и UL38 фрагмента UL введена кассета экспрессии ТАА+хемокина. (С) Схематическое изображение иллюстративных генетически модифицированных oHSV Т7201, Т7202, Т7203 и Т7204, в которых кассета экспрессии ТАА+хемокина с изображения В реализована в виде одного ТАА (усеченный несигнальный вариант опухоль-ассоциированного антигена (ТАА)) и одного хемокина. (D) Схематическое изображение иллюстративных генетически модифицированных oHSV Т7011, Т7012 и Т7013, в которых кассета экспрессии ТАА+хемокина с изображения В указана как два разных ТАА плюс один хемокин, обозначенные как ТАА1+ТАА2+хемокин. Промотор HSV-IE (предранний) и полиА-хвост расположены против хода транскрипции и по ходу транскрипции от кассеты экспрессии, соответственно.
[0012] На Фиг. 2 показана блок-схема конструирования oHSV серии Т7 (т.е. Т7011-Т7013 и Т7201-Т7204, как описано выше). Конструирование включало несколько этапов клонирования с использованием системы искусственных бактериальных хромосом (ВАС).
[0013] На Фиг. 3 показано высвобождение CCL5 после инфицирования Т7011 в клетках 293Т, Нер-2 и Тса8113. Экспрессия и высвобождение CCL5 были быстрыми и сильными. Секретируемый CCL5 был обнаружен уже через 4 часа после инфицирования и достиг пика, составившего 5000 пг/мл. Секреция была стабильной и сохранялась в течение по меньшей мере 4 дней после инфицирования вирусом Т7011. Таким образом, была продемонстрирована секреция CCL5.
[0014] На Фиг. 4 показана экспрессия усеченных CD19, ВСМА, Trop-2, HER2 на поверхности клетки. Различные усеченные антигены, кодируемые Т7011, Т7012 и Т7013, соответственно, одновременно экспрессировались на поверхностях опухолевых клеток.
[0015] На Фиг. 5 показан противоопухолевый эффект вируса oHSV серии Т7 (Т7011, Т7012 и Т7013). Значения IC50 вируса oHSV серии Т7 сопоставимы с Т3011, что указывает на то, что вирусы серии Т7 имеют аналогичную широкую противоопухолевую активность по сравнению с Т3011.
[0016] На Фиг. 6 показано, что вирус oHSV серии Т7 (Т7011, Т7012 и Т7013) не обладает инфекционной активностью ни в CAR-T-, ни в нормальных Т-клетках.
[0017] На Фиг. 7 показано, что вирус oHSV серии Т7 (Т7011, Т7012 и Т7013) не обладает активностью уничтожения клеток ни в CAR-TCD19-, ни в нормальных Т-клетках.
[0018] На Фиг. 8 показано, что противоопухолевый эффект значительно усиливается при комбинированной обработке Т7011 и CAR-TCD19.
[0019] На Фиг. 9 показано, что инфицирование вирусом Т7011 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-TCD19.
[0020] На Фиг. 10 показано, что противоопухолевый эффект значительно усиливается при комбинированной обработке Т7012 и CAR-TCD19.
[0021] На Фиг. 11 показано, что инфицирование вирусом Т7012 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-TCD19.
[0022] На Фиг. 12 показано, что противоопухолевый эффект значительно усиливается при комбинированной обработке Т7013 и CAR-TCD19.
[0023] На Фиг. 13 показано, что инфицирование вирусом Т7013 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-TCD19.
[0024] На Фиг. 14 показано, что вирус oHSV серии Т7 (Т7011, Т7012 и Т7013) не обладает способностью уничтожать клетки ни в CAR-NKCD19-, ни в NK-клетках.
[0025] На Фиг. 15 показана вирусная репликация HSV-1 (F) и Т7011 в CAR-NKCD19- и NK-клетках
[0026] На Фиг. 16 показано, что Т7011 не оказывает отрицательного влияния на пролиферацию CAR-NKCD19-клеток. * р<0,05, *** р<0,001.
[0027] На Фиг. 17 показано, что Т7011 не оказывает отрицательного влияния на пролиферацию NK-клеток. * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001.
[0028] На Фиг. 18 показано, что противоопухолевый эффект значительно усиливается при комбинированной обработке Т7011 и CAR-NKCD19.
[0029] На Фиг. 19 показано, что инфицирование вирусом Т7011 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-NKCD19.
Подробное описание изобретения
Определение
[0030] Следует отметить, что термин, обозначающий объект в единственном числе, относится к одному или более таким объектам; например, «усеченный несигнальный вариант» следует понимать как относящийся к одному или более усеченным несигнальным вариантам. Таким образом, термины, обозначающие объект в единственном числе, «один или более» объектов и «по меньшей мере один» объект, могут использоваться в настоящей заявке взаимозаменяемо.
[0031] Термины «фрагмент антитела» или «антигенсвязывающий фрагмент» в контексте настоящей заявки представляют собой часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и т.п. Вне зависимости от структуры фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин «фрагмент антитела» включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин «фрагмент антитела» также включает любые синтетические или генетически сконструированные белки, которые функционируют аналогично антителу посредством связывания с определенным антигеном с образованием комплекса.
[0032] Антитела, антигенсвязывающие полипептиды, их варианты или производные согласно изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, поликлональные, моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одно цепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv), фрагменты, содержащие домен VK или VH, фрагменты, полученные в экспрессионной библиотеке Fab, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам LIGHT, раскрытым в настоящей заявке). Молекулы иммуноглобулина или антитела согласно настоящему изобретению могут относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgAn IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекулы иммуноглобулина. Например, антитело к PD-1 может относиться к его антигеневязывающему фрагменту, такому как его Fab-фрагмент или scFv.
[0033] Под «специфично связывается», «специфичный к» или «характеризуется специфичностью к», как правило, подразумевают, что антитело связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание подразумевает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с этим определением говорят, что антитело «специфично связывается» с эпитопом в том случае, если оно связывается с этим эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена легче, чем оно связывалось бы с произвольным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используется в настоящей заявке для оценки относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, может считаться, что антитело «А» обладает более высокой специфичностью к данному эпитопу, чем антитело «В», или можно сказать, что антитело «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем его специфичность к родственному эпитопу «D».
[0034] В контексте настоящей заявки термины «рак» или «опухоль» используются взаимозаменяемо и обозначают группу заболеваний, подлежащих лечению согласно настоящему изобретению, которые сопровождаются патологическим ростом клеток с потенциалом инвазии или распространения в другие части тела. Не все опухоли являются раковыми; доброкачественные опухоли не распространяются в другие части тела. Возможные признаки и симптомы включают, среди прочих: новое уплотнение, аномальное кровотечение, длительный кашель, необъяснимую потерю массы тела и изменение перистальтики кишечника. Существует свыше 100 различных известных видов рака, которые поражают людей. В контексте настоящей заявки термин «рак» включает, не ограничиваясь перечисленным, солидный рак (например, опухоль) и гематологическое злокачественное новообразование. «Гематологическое злокачественное новообразование», также известное как рак крови, представляет собой рак, который возникает в кроветворной ткани, такой как костный мозг или другие клетки иммунной системы. Гематологические злокачественные новообразования включают, не ограничиваясь перечисленным, лейкозы (такие как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), острый промиелоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый лейкоз смешанного фенотипа, хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), волосатоклеточный лейкоз и лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов), миелодиспластический синдром (МДС), миелопролиферативные нарушения (истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз, первичный миелофиброз и хронический миелоидный лейкоз), лимфомы, множественную миелому, моноклональную гаммапатию неопределенного значения (MGUS) и подобные нарушения, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому (НХЛ), первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, трансформированную фолликулярную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, лимфоцитарную лимфому, Т-клеточную лимфому и другие В-клеточные злокачественные новообразования. «Солидные раковые заболевания» включают, не ограничиваясь перечисленным, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак заднепроходной области, рак желудка, рак яичка, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, педиатрические опухоли, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, ангиогенез опухоли, опухоль оси позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркому Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, виды рака, вызванные факторами окружающей среды, включая вызванные асбестом.
[0035] В контексте настоящей заявки термины «лечить» или «лечение» относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как прогрессирование рака. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, не ограничиваясь перечисленным, облегчение симптомов, уменьшение степени выраженности заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) течения заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение течения заболевания и ремиссию (будь то частичную или полную), поддающиеся определению или не поддающиеся определению. «Лечение» может также означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью без получения лечения. Нуждающиеся в лечении субъекты включают субъектов, уже страдающих от состояния или нарушения, а также субъектов, подверженных развитию состояния или нарушения, либо субъектов, у которых состояние или нарушение необходимо предотвратить.
[0036] Под «субъектом», или «индивидуумом», или «животным», или «пациентом», или «млекопитающим» подразумевается любой субъект, в частности, субъект, относящийся к млекопитающему, для которого желательны диагностика, прогноз или терапия. Субъекты, относящиеся к млекопитающим, включают людей, одомашненных животных, сельскохозяйственных животных и животных в зоопарках, спортивных или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и так далее.
[0037] В контексте настоящей заявки такие выражения, как «пациенту, нуждающемуся в лечении» или «субъекту, нуждающемуся в лечении» включают субъектов, таких как субъекты, относящиеся к млекопитающим, которые получили бы пользу от введения oHSV-1 или композиции согласно настоящему изобретению, при применении, например, для выявления, для процедуры диагностики и/или для лечения.
[0038] Специалисту в данной области техники также ясно, что модифицированные геномы, раскрытые в настоящей заявке, могут быть модифицированы таким образом, что их нуклеотидная последовательность отличается от модифицированных полинуклеотидов, из которых они были получены. Например, полинуклеотидная или нуклеотидная последовательность, полученная из обозначенной последовательности ДНК, может быть схожей с исходной последовательностью, например, может характеризоваться определенным процентом идентичности исходной последовательности, например, она может быть на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична исходной последовательности.
[0039] Кроме того, могут быть произведены замены, делеции или вставки нуклеотидов или аминокислот, приводящие к консервативным заменам или изменениям в «несущественных» областях аминокислот. Например, полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из обозначенного белка, может быть идентична исходной последовательности за исключением одной или более замен, вставок или делеций отдельных аминокислот, например, одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, пятнадцати, двадцати или более замен, вставок или делеций отдельных аминокислот. В отдельных вариантах реализации полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из обозначенного белка, содержит от одной до пяти, от одной до десяти, от одной до пятнадцати или от одной до двадцати замен, вставок или делеций отдельных аминокислот по сравнению с исходной последовательностью.
[0040] «Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума, а также способность терапевтического средства или комбинации терапевтических средств вызывать желаемый ответ у индивидуума. Примеры показателей эффективного терапевтического средства или комбинации терапевтических средств включают, например, улучшение самочувствия пациента, снижение опухолевой нагрузки, остановку или замедление роста опухоли и/или отсутствие метастазов раковых клеток в другие места в организме.
[0041] CAR-T-клетка представляет собой Т-клетку экспрессирующую химерный антигенный рецептор. Т-клетка, экспрессирующая молекулу CAR, может представлять собой хелперную T-клетку цитотоксическую Т-клетку, вирус-специфичную цитотоксическую Т-клетку, Т-клетку памяти или гамма-дельта (γδ) Т-клетку. Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой рекомбинантный слитый белок, содержащий: 1) внеклеточный лиганд-связывающий домен, то есть антиген-распознающий домен, 2) трансмембранный домен и 3) передающий сигнал домен. Внеклеточный лиганд-связывающий домен представляет собой олиго- или полипептид, способный связывать лиганд. Предпочтительно внеклеточный лиганд-связывающий домен будет способен взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности, которая может представлять собой антиген, рецептор, пептидный лиганд, белковый лиганд мишени или полипептид мишени. В настоящем изобретении внеклеточный лиганд-связывающий домен будет способен взаимодействовать с усеченным несигнальным вариантом опухоль-ассоциированного антигена или опухоль-специфического антигена.
[0042] Как правило, внеклеточный лиганд-связывающий домен связан с передающим сигнал доменом химерного антигенного рецептора (CAR) транс мембранным доменом I. Трансмембранный домен проходит через клеточную мембрану, прикрепляет CAR к поверхности Т-клетки и соединяет внеклеточный лиганд-связывающий домен с передающим сигнал доменом, влияя на экспрессию CAR на поверхности Т-клетки. Трансмембранный домен может дополнительно содержать шарнирную область между внеклеточным лиганд-связывающим доменом и указанным трансмембранным доменом. Термин «шарнирная область» обычно означает любой олиго- или полипептид, функция которого заключается в связывании трансмембранного домена с внеклеточным лиганд-связывающим доменом. В частности, шарнирную область используют для обеспечения большей гибкости и доступности для внеклеточного лиганд-связывающего домена. Шарнирная область может содержать до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Шарнирная область может быть получена из всех или части встречающихся в природе молекул, таких как CD28,4-1 ВВ (CD137), ОХ-40 (CD134), CD3ζ, α- или β-цепь Т-клеточного рецептора, CD45, CD4, CD5, CD8, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, ICOS, CD154 или из всей или части константной области антитела. В качестве альтернативы, шарнирная область может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в природе шарнирной последовательности, или шарнирная область может представлять собой полностью синтетическую шарнирную последовательность.
[0043] Химерный антигенный рецептор (CAR) дополнительно содержит передающий сигнал домен или внутриклеточный сигнальный домен CAR, который отвечает за внутриклеточную передачу сигнала после связывания внеклеточного лиганд-связывающего домена с мишенью, что приводит к активации иммунной клетки и иммунного ответа. Другими словами, передающий сигнал домен отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется CAR. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или активность хелперных Т-клеток, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «передающий сигнал домен» относится к части белка, которая передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Примерами передающих сигнал доменов для использования в CAR могут быть цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора и корецепторов, которые действуют согласованно, инициируя передачу сигнала после связывания антигенного рецептора, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любая синтетическая последовательность, которая обладает такой же функциональной способностью. Передающий сигнал домен включает два различных класса цитоплазматических сигнальных последовательностей: те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию, и те, которые действуют антигеннезависимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы ITAM. ITAM представляют собой четко определенные сигнальные мотивы, находящиеся во внутрицитоплазматическом хвосте различных рецепторов, которые служат сайтами связывания для тирозинкиназ класса syk/zap70. Неограничивающие примеры ITAM, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут включать полученные из TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CDS, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В одном из вариантов htfkbpfwbb передающий сигнал домен CAR может содержать сигнальный домен CD3ζ с аминокислотной последовательностью, идентичной ему по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 97% или 99%. Настоящее изобретение предусматривает комбинированное применение генетически сконструированных oHSV, описанных в настоящей заявке, с любыми CAR-T, без ограничения.
[0044] Типичные конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) содержат моноклональные антитела, способные связываться с поверхностными специфическими антигенами раковых клеток. Эти антитела включают некоторые белки на поверхности В-клеток и Т-клеток иммунной системы, такие как CD20, CD22 и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 типа (Her2) и простатспецифический мембранный антиген (PSMA). Эти антитела связаны с высокотоксичными лекарственными средствами через расщепляемое линкерное звено. Лекарственные средства предназначены для того, чтобы индуцировать необратимое повреждение ДНК или препятствовать делению клеток, чтобы привести тем самым к апоптозу раковых клеток. ADC содержат моноклональные антитела, способные связываться с поверхностными специфическими антигенами раковых клеток. Эти антитела включают некоторые белки на поверхности В-клеток и Т-клеток иммунной системы, такие как CD20, CD22 и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 типа (Her2) и простатспецифический мембранный антиген (PSMA). Эти антитела связаны с высокотоксичными лекарственными средствами через расщепляемое линкерное звено. Лекарственные средства предназначены для того, чтобы индуцировать необратимое повреждение ДНК или препятствовать делению клеток, чтобы привести тем самым к апоптозу раковых клеток.
[0045] Механизм конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) состоит в том, чтобы распознавать и связываться со специфическим антигеном через антитела, запускать серию реакций, а затем проникать в цитоплазму посредством эндоцитоза, где высокотоксичное лекарственное средство диссоциирует под действием лизосомальных ферментов, уничтожая раковые клетки. По сравнению с традиционной химиотерапией, которая одинаково вызывает повреждение как раковых клеток, так и нормальных тканей, таргетная доставка лекарственного средства может заставить лекарственное средство действовать непосредственно на раковые клетки и уменьшать повреждение нормальных клеток. Типичный конъюгат антитело-лекарственное средство состоит из трех частей: лекарственного средства, линкерного звена и антитела. Выбор конкретного антитела и лекарственного средства зависит от конкретных заболеваний и оказывает важное влияние на безопасность и эффективность конъюгата. Стабильность линкерного звена и способ связывания с антителом играют решающую роль в разработке ADC-лекарственного средства. Факторы, определяющие эффективность конъюгатов антитело-лекарственное средство, включают стабильность и чувствительность линкерного звена к разрушению, интернализацию при возбуждении клеточной поверхности, транспорт и высвобождение цитотоксина. Настоящее изобретение предусматривает комбинированное применение oHSV серии Т7, описанных в настоящей заявке, с любым ADC, без ограничения.
[0046] Биспецифичные рекрутеры Т-клеток (BiTE) представляют собой относительно простые биспецифичные молекулы, специфичные к субъединице CD3E комплекса TCR Т-клетки, а также нацеленные на представляющий интерес антиген, такой как раковый антиген. Поскольку BiTE специфичны к комплексу TCR, это позволяет BiTE активировать резидентные Т-клетки для обеспечения гибели клеток, экспрессирующих определенный антиген-мишень на их клеточной поверхности, например, раковых клеток. Важным свойством BiTE является их способность нацеливать CD4+ и неактивированные CD8+ Т-клетки на раковые клетки. Другими словами, Т-клетки, активированные BiTE, можно заставить уничтожать клетки независимо от экспрессии МНС (главный комплекс гистосовместимости, ГКГС) на поверхности клетки. Это важно, поскольку некоторые опухолевые клетки подавляют МНС, что делает их устойчивыми к таким агентам, как CAR-T-клетки и immTAC. К сожалению, BiTE имеют плохую кинетику в крови по сравнению с полноразмерными антителами. Это означает, что при введении пациенту большая часть BiTE не достигает своих клеток-мишеней. Кроме того, применение высокоаффинного ScFv к CD3 в составе BiTE может привести к сильному связыванию с Т-клетками в крови, что также препятствует доставке в опухоль. В результате BiTE не могут полностью реализовать свой потенциал в качестве противораковой терапии, поскольку они не могут быть эффективно доставлены в опухолевые клетки. Настоящее изобретение предусматривает комбинированное применение oHSV, описанного в настоящей заявке, с любыми BiTE, без ограничения.
[0047] В контексте настоящей заявки термин «опухоль-ассоциированный/специфический антиген» означает опухоль-ассоциированный антиген, опухоль-специфический антиген или и то, и другое. Например, термин «по меньшей мере один опухоль-ассоциированный/специфический антиген» означает по меньшей мере один опухоль-ассоциированный антиген или по меньшей мере один опухоль-специфический антиген и может включать пару опухоль-ассоциированного антигена и опухоль-специфического антигена. Например, подразумевается, что термин «усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена» включает усеченный несигнальный вариант одного опухоль-ассоциированного антигена, усеченные несигнальные варианты двух или более опухоль-ассоциированных антигенов, усеченный несигнальный вариант одного опухоль-специфического антигена, усеченные несигнальные варианты двух или более опухоль-специфических антигенов, усеченные несигнальные варианты одного опухоль-ассоциированного антигена и двух или более опухоль-специфических антигенов и усеченные несигнальные варианты двух или более опухоль-ассоциированных антигенов и одного опухоль-специфического антигена. Например, термин «два опухоль-ассоциированных/специфических антигена» может включать два опухоль-ассоциированных антигена, два опухоль-специфических антигена и комбинацию одного опухоль-ассоциированного антигена и одного опухоль-специфического антигена.
[0048] В контексте настоящей заявки «биомаркер», «усеченный несигнальный вариант», «усеченный вариант» или «несигнальный вариант» определенного опухоль-ассоциированного антигена или опухоль-специфического антигена относится к варианту указанного опухоль-ассоциированного антигена или опухоль-специфического антигена, который подвергнут мутации, делеции или иным образом модифицирован для блокирования передачи сигнала, осуществляемой его аналогом дикого типа, в сигнальном пути. Указанный вариант экспонирует по меньшей мере некоторые из эпитопов антигена, так что вариант может быть связан антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (таким как scFv), специфично направленным против антигена дикого типа. Общеизвестный несигнальный вариант опухоль-ассоциированного антигена или опухоль-специфического антигена, в случае, если антиген представляет собой трансмембранный белок, представляет собой внеклеточный домен антигена, внеклеточный-трансмембранный домены антигена или их эквивалент, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична указанному внеклеточному или внеклеточному-трансмембранному доменам. Эквивалент не способен передавать сигнал, но экспонирует по меньшей мере некоторые из эпитопов на внеклеточном домене антигена.
[0049] Например, несигнальный вариант CD19 (также называемый в настоящей заявке несигнальным CD19) представляет собой состоящие из 323 аминокислот внеклеточный-трансмембранный домены (SEQ ID NO: 14) CD19 дикого типа. Несигнальный ВСМА представляет собой состоящие из 77 аминокислот внеклеточный-трансмембранный домены (SEQ ID NO: 15) ВСМА дикого типа. Несигнальный HER2 представляет собой состоящие из 675 аминокислот внеклеточный-трансмембранный домены (SEQ ID NO: 16) HER2 дикого типа. Несигнальный Trop-2 представляет собой состоящие из 297 аминокислот внеклеточный-трансмембранный домены (SEQ ID NO: 17) Trop-2 дикого типа.
[0050] Внеклеточные и трансмембранные домены могут быть получены с помощью рутинной практики в данной области техники без затруднений. Аминокислотные последовательности внеклеточных/трансмембранных доменов различных опухоль-ассоциированных антигенов или опухоль-специфических антигенов доступны из публичных источников, включая NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein). Следует отметить, что несигнальные варианты, однажды экспрессированные на поверхности опухолевой клетки, распознаются и связываются антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, специфичным к опухоль-ассоциированному антигену или опухоль-специфичному антигену. Антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой часть CAR-иммунной клетки (например, CAR-Т-клетки или CAR-NK-клетки) или BiTE. Антитело может быть конъюгировано с химиотерапевтическим лекарственным средством с образованием ADC. Однако несигнальный вариант не будет активировать сигнальный путь, в отличие от его аналога дикого типа. Специалисту в данной области техники будет легко проверить и подтвердить, является ли вариант опухоль-ассоциированного антигена или опухоль-специфического антигена несигнальным. Например, это может быть определено путем обнаружения уровня последующего белка в нормальном сигнальном пути, известного для антигена дикого типа.
[0051] Генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV)
[0052] Согласно настоящему изобретению предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV). Генетически модифицированный oHSV модифицирован таким образом, что он экспрессирует усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного антигена или опухоль-специфического антигена при репликации в восприимчивой клетке, например, клетке солидной опухоли. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали успешную экспрессию различных усеченных опухоль-ассоциированных антигенов или опухоль-специфических антигенов на поверхностях клеток после инфицирования и репликации генетически модифицированных oHSV в опухолевой клетке. Несигнальный опухоль-ассоциированный антиген или опухоль-специфический антиген, экспрессируемый, а затем презентируемый на поверхности опухолевых клеток помечает эту опухолевую клетку как мишень для различных антиген-направленных терапий, таких как CAR-T-терапии. В некоторых вариантах реализации генетически модифицированный oHSV согласно настоящему изобретению дополнительно модифицирован таким образом, что он экспрессирует по меньшей мере один хемокин при репликации в восприимчивой клетке, например, клетке солидной опухоли. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали обнаружение секретируемого хемокина уже через 4 часа после инфицирования, и он сохранялся в течение по меньшей мере 4 дней после инфицирования вирусом oHSV. Экспрессия и высвобождение хемокина индуцирует хемотаксис иммунной клетки, например, Т-клетки или CAR-T-клетки, по отношению к восприимчивой клетке, что облегчает миграцию и инфильтрацию иммунной клетки в опухолевую массу.
[0053] В некоторых вариантах реализации предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта находится под контролем промотора предраннего гена HSV.
[0054] В некоторых вариантах реализации предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена и (b) по меньшей мере один хемокин, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанного по меньшей мере одного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV.
[0055] В некоторых вариантах реализации предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченный несигнальный вариант одного опухоль-ассоциированного антигена или одного опухоль-специфического антигена и (b) один хемокин, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV.
[0056] В некоторых вариантах реализации предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченные несигнальные варианты двух опухоль-ассоциированных/специфических антигенов и (b) один хемокин, где экспрессия указанных усеченных несигнальных вариантов и указанного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают два опухоль-ассоциированных антигена, которые являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают два опухоль-специфических антигена, которые являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают один опухоль-ассоциированный антиген и один опухоль-специфический антиген.
[0057] В некоторых вариантах реализации предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена и (b) два хемокина, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанных хемокинов находится под контролем промотора предраннего гена HSV. В некоторых вариантах реализации указанные два хемокина являются одинаковыми. В некоторых вариантах реализации указанные два хемокина являются разными.
[0058] В некоторых вариантах реализации предложен генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), где в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченные несигнальные варианты двух опухоль-ассоциированных/специфических антигенов и (b) два хемокина, где экспрессия указанных усеченных несигнальных вариантов и указанных хемокинов находится под контролем промотора предраннего гена HSV. В некоторых вариантах реализации указанные два хемокина являются одинаковыми. В некоторых вариантах реализации указанные два хемокина являются разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают два опухоль-ассоциированных антигена, которые являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают два опухоль-специфических антигена, которые являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают один опухоль-ассоциированный антиген и один опухоль-специфический антиген.
[0059] Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, и второй полинуклеотид, который кодирует по меньшей мере один хемокин, где экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанного по меньшей мере одного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV.
[0060] В некоторых вариантах реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант первого опухоль-ассоциированного/специфического антигена, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант второго опухоль-ассоциированного/специфического антигена, и третий полинуклеотид, который кодирует хемокин, где экспрессия указанных усеченных несигнальных вариантов и указанного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV.
[0061] В некоторых вариантах реализации опухоль-ассоциированный/специфический антиген, первый или второй опухоль-ассоциированный/специфический антиген, независимо выбран из группы, состоящей из HER2, PSMA, ВСМА, CD20, CD33, CD19, CD22, CD123, CD30, GPC-3, СЕА, клаудина 18.2, ЕрСАМ, GD2, MSLN, EGFR, MUC1, EGFRVIII, CD38, Trop-2, с-МЕТ, нектина-4, CD79b, CCK4, GPA33, HLA-A2, CLEC12A, р-кадгерина, TDO2, MART-1, Pmel 17, MAGE-1, AFP, СА125, TRP-1, TRP-2, NY-ESO, PSA, CDK4, BCA225, CA 125, MG7-Ag, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TAAL6 и TAG72. В некоторых вариантах реализации опухоль-ассоциированный/специфический антиген выбран из группы, состоящей из HER2, Trop-2, ВСМА и CD19.
[0062] В некоторых вариантах реализации хемокин выбран из группы, состоящей из CXCL1-CXCL17, CCL1-CCL28, XCL1, XCL2 и CX3CL1. В предпочтительных вариантах реализации хемокин выбран из группы, состоящей из CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CCL3, CCL4, CCL5, CCL19, CCL21. В предпочтительных вариантах реализации хемокин представляет собой CCL5.
[0063] В некоторых вариантах реализации промотор предраннего гена HSV представляет собой промотор предраннего гена HSV-1 или HSV-2. В некоторых вариантах реализации промотор предраннего гена HSV выбран из группы, состоящей из IE 1 (промотор ICP0), IE 2 (промотор ICP27), IE 3 (промотор ICP4) и IE 4/5 (промотор ICP22 и ICP47) HSV-1. В предпочтительных вариантах реализации промотор предраннего гена HSV представляет собой промотор предраннего гена IE4/5 HSV-1.
[0064] В некоторых вариантах реализации усеченный несигнальный вариант представляет собой внеклеточный-трансмембранный домены опухоль-ассоциированного/специфического антигена. Например, усеченный несигнальный вариант CD19 представляет собой внеклеточный-трансмембранный домены CD19. Например, усеченный несигнальный вариант ВСМА представляет собой внеклеточный-трансмембранный домены ВСМА. Например, усеченный несигнальный вариант HER2 представляет собой внеклеточный-трансмембранный домены HER2. Например, усеченный несигнальный вариант Trop-2 представляет собой внеклеточный-трансмембранный домены Trop-2. В некоторых вариантах реализации усеченный несигнальный вариант представляет собой внеклеточный домен опухоль-ассоциированного/специфического антигена. В некоторых вариантах реализации усеченный несигнальный вариант представляет собой внеклеточный домен, связанный с частью трансмембранного домена опухоль-ассоциированного/специфического антигена. В некоторых вариантах реализации усеченный несигнальный вариант представляет собой вариант опухоль-ассоциированного/специфического антигена дикого типа, в котором отсутствует часть передающего сигнал домена или весь передающий сигнал домен.
[0065] В предпочтительных вариантах реализации генетически модифицированный oHSV происходит от HSV 1 типа (HSV-1) или HSV 2 типа (HSV-2). В предпочтительных вариантах реализации генетически модифицированный oHSV происходит от штамма F HSV-1.
[0066] В предпочтительных вариантах реализации полинуклеотид, описанный в настоящей заявке, кодирует (i) усеченный несигнальный вариант CD19 и (ii) CCL5. В предпочтительных вариантах реализации указанный полинуклеотид кодирует (i) усеченный несигнальный вариант Trop-2 и (ii) CCL5. В предпочтительных вариантах реализации указанный полинуклеотид кодирует (i) усеченный несигнальный вариант HER2 и (ii) CCL5. В предпочтительных вариантах реализации указанный полинуклеотид кодирует (i) усеченный несигнальный вариант ВСМА и (ii) CCL5.
[0067] В предпочтительных вариантах реализации полинуклеотид, описанный в настоящей заявке, кодирует (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант ВСМА и (iii) CCL5. В предпочтительных вариантах реализации указанный полинуклеотид кодирует (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант Trop-2 и (iii) CCL5. В предпочтительных вариантах реализации указанный полинуклеотид кодирует (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант HER2 и (iii) CCL5.
[0068] В некоторых вариантах реализации опухолевая клетка представляет собой клетку солидной опухоли. В некоторых вариантах реализации опухолевая клетка не экспрессирует опухоль-ассоциированный антиген или опухоль-специфический антиген, кодируемый полинуклеотидом. В некоторых вариантах реализации опухолевая клетка экспрессирует опухоль-ассоциированный антиген или опухоль-специфический антиген, кодируемый полинуклеотидом.
[0069] В некоторых вариантах реализации генетически модифицированный oHSV, описанный выше, дополнительно модифицирован для удаления фрагмента нуклеиновой кислоты генома oHSV, так что определенные свойства oHSV, нежелательные для его предполагаемого применения, ослаблены или устранены. В одном из вариантов реализации в генетически модифицированном oHSV удалены внутренние инвертированные повторы, фрагмент, кодирующий вирусный ген, или и то, и другое. В одном из вариантов реализации удаленный фрагмент нуклеиновой кислоты oHSV находится в положениях с 117005 по 132096 в геноме прототипа Р штамма F HSV-1. В одном из вариантов реализации фрагмент, кодирующий вирусный ген, представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий γ34.5. В одном из вариантов реализации обе копии гена γ34.5 удалены.
[0070] В некоторых вариантах реализации генетически модифицированный oHSV, описанный выше, дополнительно модифицирован для кодирования иммуностимулирующего агента, иммунотерапевтического агента или и того, и другого. В одном из вариантов реализации иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В одном из вариантов реализации иммунотерапевтический агент представляет собой антитело к PD-1, антитело к CTLA4 или их антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов реализации генетически модифицированный oHSV кодирует IL-12. В одном из вариантов реализации генетически модифицированный oHSV кодирует антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов реализации генетически модифицированный oHSV кодирует как IL-12, так и антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[0071] Следует отметить, что необходимо, чтобы экспрессия усеченного(ых) несигнального(ых) варианта(ов) опухоль-ассоциированного/специфического антигена и хемокина находилась под контролем предраннего промотора HSV, например, промотора IE4/5, чтобы опухоль-ассоциированный/специфический антиген экспрессировался вскоре после инфицирования вирусом и до лизиса опухолевых клеток посредством репликации вируса. Полинуклеотид, кодирующий усеченный несигнальный вариант, и полинуклеотид, кодирующий хемокин, могут быть функционально связаны с одним и тем же предранним промотором. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий усеченный несигнальный вариант, и полинуклеотид, кодирующий хемокин, могут быть функционально связаны с разными предранними промоторами. Когда oHSV дополнительно вооружен иммуностимулирующим агентом, иммунотерапевтическим агентом или и тем, и другим, таким как IL-12 и антитело к PD-1, экспрессия иммуностимулирующего агента и/или иммунотерапевтического агента не обязательно находится под контролем предраннего промотора, но предпочтительно под контролем другого и относительно позднего промотора, такого как промотор CMV или промотор Egr-1. В одном из вариантов реализации полинуклеотид, кодирующий IL-12, функционально связан с промотором Egr-1. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий scFv к hPD1, функционально связан с промотором CMV.
[0072] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, и второй полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального CD19 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0073] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный ВСМА, и второй полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального ВСМА и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0074] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный Trop-2, и второй полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального Trop-2 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0075] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный HER2, и второй полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального HER2 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0076] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный не сигнальный ВСМА, и третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального CD19, усеченного несигнального ВСМА и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0077] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный Тrор-2, и третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального CD19, усеченного несигнального Trop-2 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0078] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный HER2, и третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, где экспрессия усеченного несигнального CD19, усеченного несигнального HER2 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0079] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант любого из группы, состоящей из CD19, ВСМА, Trop-2 и HER2, второй полинуклеотид, который кодирует CCL5, третий полинуклеотид, который кодирует антитело к PD-1, и четвертый полинуклеотида, который кодирует IL-12, где экспрессия усеченного несигнального CD19 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1, и где внутренний инвертированный повтор oHSV удален.
[0080] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант любого из группы, состоящей из ВСМА, Trop-2 и HER2, третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, четвертый полинуклеотид, который кодирует антитело к PD-1, и пятый полинуклеотид, который кодирует IL-12, где экспрессия усеченного несигнального CD19 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1.
[0081] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант любого из группы, состоящей из ВСМА, Trop-2 и HER2, третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, четвертый полинуклеотид, который кодирует антитело к PD-1, и пятый полинуклеотид, который кодирует IL-12, где экспрессия усеченного несигнального CD19 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1, и где внутренний инвертированный повтор oHSV удален.
[0082] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант любого из группы, состоящей из ВСМА, Trop-2 и HER2, третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, четвертый полинуклеотид, который кодирует антитело к PD-1, и пятый полинуклеотид, который кодирует IL-12, где экспрессия усеченного несигнального CD19 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1, где внутренний инвертированный повтор oHSV удален, и где все однокопийные гены oHSV сохранены.
[0083] В одном из вариантов реализации в геном генетически модифицированного oHSV включен первый полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный CD19, второй полинуклеотид, который кодирует усеченный несигнальный вариант любого из группы, состоящей из ВСМА, Trop-2 и HER2, третий полинуклеотид, который кодирует CCL5, четвертый полинуклеотид, который кодирует антитело к PD-1, и пятый полинуклеотид, который кодирует IL-12, где экспрессия усеченного несигнального CD19 и CCL5 находится под контролем промотора IE4/5 HSV-1, где внутренний инвертированный повтор oHSV и обе копии γ34.5 удалены, и где все однокопийные гены oHSV сохранены.
[0084] В одном из вариантов реализации ниже по ходу транскрипции от полинуклеотида, кодирующего усеченный антиген и хемокин, расположен полиА-хвост. Например, полинуклеотиды, кодирующие усеченные несигнальные варианты и хемокин, расположены следующим образом: 5'-CD19-CCL5-полиА-3', 5'-ВСМА-CCL5-полиА-3', 5'-HER2-CCL5-полиА-3', 5'-CD19-ВСМА-CCL5-полиА-3', 5'-CD19-Trop-2-CCL5-полиА-3' или 5'-CD19-HER2-CCL5-полиA-3'.
[0085] В одном из вариантов реализации включение в геном oHSV любого из полинуклеотидов, кодирующих усеченные несигнальные варианты, иммунотерапевтический агент и хемокин, не нарушает функцию вирусных генов. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводят между генами UL3 и UL4 вируса, а полинуклеотиды, кодирующие усеченный(ые) несигнальный(ые) варианты) и хемокин(ы), вводят между генами UL37 и UL38 вируса. Кроме того, в одном из вариантов реализации полинуклеотид, кодирующий IL2, заменяет внутренний инвертированный повтор генома вируса.
[0086] В настоящем изобретении опухоль-ассоциированный/специфический антиген, кодируемый oHSV, может быть гетерологичным или гомологичным опухолевой клетке, инфицированной oHSV. В одном из вариантов реализации опухолевая клетка экспрессирует опухоль-ассоциированный/специфический антиген, который отличается от опухоль-ассоциированного/специфического антигена, кодируемого oHSV. Например, опухолевая клетка сверхэкспрессирует CD22, в то время как генетически модифицированный oHSV согласно настоящему изобретению экспрессирует CD19, HER2 или и то, и другое. В другом варианте реализации опухолевая клетка экспрессирует такой же опухоль-ассоциированный/специфический антиген, что и опухоль-ассоциированный/специфический антиген, кодируемый oHSV. Например, опухолевая клетка экспрессирует HER2 на низком уровне, и генетически модифицированный oHSV согласно настоящему изобретению экспрессирует HER2. В другом варианте реализации в опухолевой клетке не обнаружен известный опухоль-ассоциированный/специфический антиген.
[0087] Опухолевая клетка, инфицированная генетически модифицированным oHSV согласно настоящему изобретению, представляет собой клетку опухоли крови или клетку солидной опухоли.
[0088] Предпочтительно, презентация несигнального опухоль-ассоциированного/специфического антигена на поверхности опухолевой клетки превращает опухолевую клетку из отрицательной клетки в положительную клетку в отношении этого конкретного опухоль-ассоциированного/специфического антигена и, таким образом, делает опухоль восприимчивой к терапии, нацеленной на этот конкретный опухоль-ассоциированный/специфический антиген или опухоль-специфический антиген. Экспрессию гетерологичных полинуклеотидов контролируют с помощью промотора предраннего гена, такого как IE4/5 HSV-1, так что транслируемые продукты продуцируются на чрезвычайно ранней стадии после проникновения oHSV в опухолевую клетку и репликации в ней. Например, oHSV может быть модифицирован таким образом, что он экспрессирует усеченный несигнальный CD19 - трансмембранный белок, который специфично экспрессируется на нормальных и большинстве опухолевых В-клеток. Затем усеченный несигнальный CD19 презентируется на поверхности опухолевых клеток перед лизисом клеток путем инфицирования oHSV и служит мишенью для СВ19-направленной CAR-T-терапии, такой как Kymriah®, Yescarta® или Tecartus®. То есть экспрессия несигнального CD19 превращает опухолевую клетку, которая обычно не восприимчива к CD19-направленной CAR-T-терапии из-за отсутствия антигена CD19 на опухолевой клетке, в опухолевую клетку, восприимчивую к CD19-направленной CAR-T. В этом случае опухоль будет восприимчива к CD19-направленной CAR-T-терапии.
[0089] Ключевое преимущество генетически модифицированного oHSV, кодирующего более одного несигнального опухоль-ассоциированного/специфического антигена, заключается в обеспечении универсального инструмента для комбинированного применения с терапиями, нацеленными на разные опухолевые антигены, без необходимости повторного конструирования, испытаний и производства oHSV для терапии, нацеленной на каждой опухолевый антиген. Было показано, что когда два разных несигнальных опухоль-ассоциированных/специфических антигена кодируются одним и тем же oHSV, они могут быть успешно экспрессированы и презентированы на поверхности опухолевой клетки одновременно до лизиса опухолевой клетки из-за инфицирования вирусом. Презентация двух или более разных несигнальных опухоль-ассоциированных/специфических антигенов превращала бы опухолевую клетку в дважды или даже трижды положительную опухолевую клетку, что позволяло бы различным терапиям, нацеленным на опухоль, быть эффективными в отношении опухолевых клеток. Это способствовало бы повышению специфичности и эффективности соответствующей терапии, нацеленной на опухоль, такой как CAR-Т-клеточная терапия.
[0090] Дополнительное преимущество некоторых из генетически модифицированных oHSV, раскрытых в настоящей заявке, заключается в том, что помимо опухоль-ассоциированных/специфических антигенов они кодируют по меньшей мере один хемокин, экспрессия и высвобождение которого дополнительно способствует миграции и инфильтрации иммунной клетки к опухолевой клетке. Таким образом, особенно предпочтительно, когда CAR-T, CAR-NK или тому подобное используют в комбинации с oHSV, описанным в настоящей заявке. Однако, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что генетически модифицированный oHSV, раскрытый в настоящей заявке, может быть использован независимо, и секреция хемокина будет индуцировать хемотаксис иммунных клеток организма, таких как Т-клетки, к опухоли и уничтожать опухолевые клетки вместе с противоопухолевым эффектом вируса.
[0091] Комбинация oHSV и терапии, нацеленной на опухоль
[0092] Другой аспект изобретения относится к комбинации любого из генетически модифицированных oHSV, описанных выше, с терапевтическим агентом, нацеленным на опухоль, для лечения различных видов рака. Как описано выше, генетически модифицированный oHSV, раскрытый в настоящей заявке, экспрессирует несигнальный опухоль-ассоциированный/специфический антиген, а затем презентирует этот антиген на поверхности опухолевой клетки. Это дает возможность терапевтическому агенту, предназначенному для нацеливания на указанный опухоль-ассоциированный/специфический антиген, нацеливаться на опухолевую клетку, инфицированную oHSV.
[0093] В настоящем изобретении терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, кодируемого oHSV, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки рака. Нацеливающий фрагмент обладает специфичностью к несигнальному опухоль-ассоциированному/специфическому антигену, экспрессируемому на поверхности опухолевой клетки после проникновения oHSV в опухолевую клетку и репликации в ней. Например, нацеливающий фрагмент представляет собой антигенсвязывающий домен антитела к опухоль-ассоциированному/специфическому антигену, такого как антитело, scFv, Fab или фрагмент химерного антигенного рецептора CAR-T-клетки. Эффекторный фрагмент пригоден для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки рака. Например, эффекторный фрагмент представляет собой иммунную клетку, включающую Т-клетки и естественных киллеров, часть BiTE, которая может взаимодействовать с Т-клеткой, или фрагмент лекарственного средства конъюгата антитело-лекарственное средство.
[0094] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-T), NK-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-NK), биспецифичного рекрутера Т-клеток (BiTE) и конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-Т-клетку. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-NK-клетку. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой BiTE. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой ADC.
[0095] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-T-клетку нацеленную на CD19. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой BiTE, нацеленный на CD19 или ЕрСАМ. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой ADC, нацеленный на HER2, Trop-2, нектин-4, ВСМА, CD33, CD30, CD22 или CD79b.
[0096] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-T-клетку нацеленную на CD19. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, JWCAR-029, IM19CAR-T, CNCT19, BZ019, HD CD19 CAR-T, pCAR-19B, CD19-CART, CT032, iPD1 CD19 eCAR-T, LCAR-B38M, CT103A, CAR-BCMAT, AU-101, 4SCAR-PSMA, PSMA-CART, P-PSMA-101, C-CAR066, MB-CART20.1, PBCAR20A, LB1095, LB1901, PRGN-3006, AMG553, CT041, CD30.CAR-T и CAR-GPC3 Т.
[0097] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой BiTE, нацеленный на CD19 или ЕрСАМ. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Blincyto®, AMG420, PF-3135 и GBR1302.
[0098] В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой ADC, нацеленный на HER2, Trop-2, нектин-4, ВСМА, CD33, CD30, CD22 или CD79b. В некоторых вариантах реализации терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Kadcyla®, Enhertu®, SHR-A1811, ТАА013, RC-48, ВАТ8001, ARX788, А166, Trodelvy®, BAT8003, DAC-002, DS-1062, SKB264, RC-108, TR1801-ADC, Padccv®, Polivy®, Adcetris®, Mylotarg®, Blenrep®, ADC к PSMA, ADCT-402, PTK7-ADC и TRS005.
[0099] В предпочтительном варианте реализации генетически модифицированный oHSV для комбинированного применения с любым из терапевтических агентов, нацеленных на опухоль, описанных выше, представляет собой генетически модифицированный oHSV, в котором в геном указанного oHSV включен полинуклеотид, кодирующий (а) усеченные несигнальные варианты двух опухоль-ассоциированных/специфических антигенов и (b) хемокин, где экспрессия указанных усеченных несигнальных вариантов и указанного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают два опухоль-ассоциированных антигена, которые являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают два опухоль-специфических антигена, которые являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации указанные два опухоль-ассоциированных/специфических антигена включают один опухоль-ассоциированный антиген и один опухоль-специфический антиген.
[0100] В предпочтительном варианте реализации генетически модифицированный oHSV для комбинированного применения с терапевтическим агентом, нацеленным на опухоль, представляет собой генетически модифицированный oHSV, экспрессирующий усеченные несигнальные варианты как CD19, так и ВСМА, и CCL5, и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-Т-клетку, нацеленную на CD19, такую как Kymriah®, Yescarta® или Tecartus®, BiTE, нацеленный на CD19, такой как блинатумомаб, ADC, нацеленный на ВСМА, такой как Blenrep®, или любую их комбинацию.
[0101] В предпочтительном варианте реализации генетически модифицированный oHSV для комбинированного применения с терапевтическим агентом, нацеленным на опухоль, представляет собой генетически модифицированный oHSV, экспрессирующий усеченные несигнальные варианты как CD19, так и HER2, и CCL5, и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-Т-клетку, нацеленную на CD19, такую как Kymriah®, Yescarta® или Tecartus®, BiTE, нацеленный на CD19, такой как блинатумомаб, ADC, нацеленный на HER2, такой как Kadcyla® или Enhertu®, или любую их комбинацию.
[0102] В предпочтительном варианте реализации генетически модифицированный oHSV для комбинированного применения с терапевтическим агентом, нацеленным на опухоль, представляет собой генетически модифицированный oHSV, экспрессирующий усеченные несигнальные варианты как CD19, так и Trop-2, и CCL5, и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой CAR-Т-клетку, нацеленную на CD19, такую как Kymriah®, Yescarta® или Tecartus®, BiTE, нацеленный на CD19, такой как блинатумомаб, ADC, нацеленный на Trop-2, такой как Trodelvy®, или любую их комбинацию.
[0103] Комбинация oHSV и терапий, нацеленных на опухоль, может быть реализована, например, в виде фармацевтического набора. Таким образом, в одном из аспектов предложен фармацевтический набор для лечения рака, который содержит, по отдельности, генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), описанный в настоящей заявке, и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, где указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака.
[0104] В некоторых вариантах реализации фармацевтический набор для лечения рака содержит, по отдельности, генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), кодирующий (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант ВСМА и (iii) CCL5; и CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или ВСМА. В некоторых вариантах реализации CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или ВСМА, выбраны из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, ADCT-402 (ADC Therapeutics), блинатумомаба, JNJ-68284528 (JNJ-4528, Legend Biotech), Blenrep (или GSK2857916), AMG420 (Amgen) и PF-3135 (Pfizer).
[0105] В некоторых вариантах реализации фармацевтический набор для лечения рака содержит, по отдельности, генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), кодирующий (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант Trop-2 и (iii) CCL5; и CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или Trop-2. В некоторых вариантах реализации CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или Trop-2, выбраны из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, ADCT-402 (ADC Therapeutics), блинатумомаба и Trodelvy® (Immunomedics).
[0106] В некоторых вариантах реализации фармацевтический набор для лечения рака содержит, по отдельности, генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), кодирующий (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант HER2 и (iii) CCL5; и CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или HER2. В некоторых вариантах реализации CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или HER2, выбраны из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, ADCT-402 (ADC Therapeutics), блинатумомаба, AU-101 (Aurora Biopharma), Kadcyla® (Roche), Enhertu® (Daiichi Sankyo) и GBR1302 (Ichnos Sciences SA).
[0107] Способы лечения
[0108] Еще один аспект изобретения относится к способу лечения рака у субъекта. Указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества генетически модифицированного oHSV, описанного в настоящей заявке, и терапевтических средств, нацеленных на опухоль, описанных в настоящей заявке. Введение как oHSV, так и терапевтических средств, нацеленных на опухоль, осуществляют одновременно или последовательно.
[0109] В одном из вариантов реализации субъекту сначала вводят терапевтически эффективное количество генетически модифицированного oHSV, описанного в настоящей заявке, а затем терапевтические средства, нацеленные на опухоль, описанные в настоящей заявке. В этом варианте реализации интервал между введениями находится в диапазоне 0,5-12 часов, например, 0,5-9 часов, 0,5-8 часов, 0,5-7 часов, 0,5-6 часов, 0,5-5 часов, 0,5-4 часа, 0,5-3 часа, 0,5-2 часа, 0,5-2,5 часа, 0,5-1,5 часа или 0,5-1 час. Например, введение oHSV осуществляют за 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов до введения терапевтических средств, нацеленных на опухоль.
[0110] В некоторых вариантах реализации способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества генетически модифицированного онколитического вируса простого герпеса (oHSV), кодирующего (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант ВСМА и (iii) CCL5; и CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или ВСМА. В некоторых вариантах реализации CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или ВСМА, выбраны из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, ADCT-402 (ADC Therapeutics), блинатумомаба, JNJ-68284528 (JNJ-4528, Legend Biotech), Blenrep (или GSK2857916), AMG420 (Amgen) и PF-3135 (Pfizer).
[0111] В некоторых вариантах реализации способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества генетически модифицированного онколитического вируса простого герпеса (oHSV), кодирующего (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант Trop-2 и (iii) CCL5; и CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или Trop-2. В некоторых вариантах реализации CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или Trop-2, выбраны из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, ADCT-402 (ADC Therapeutics), блинатумомаба и Trodelvy® (Immunomedics).
[0112] В некоторых вариантах реализации способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества генетически модифицированного онколитического вируса простого герпеса (oHSV), кодирующего (i) усеченный несигнальный вариант CD19, (ii) усеченный несигнальный вариант HER2 и (iii) CCL5; и CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или HER2. В некоторых вариантах реализации CAR-T, ADC или BiTE, нацеленные на CD19 или HER2, выбраны из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, ADCT-402 (ADC Therapeutics), блинатумомаба, AU-101 (Aurora Biopharma), Kadcyla® (Roche), Enhertu® (Daiichi Sankyo) и GBR1302 (Ichnos Sciences SA).
[0113] Комбинированное применение oHSV, описанного в настоящей заявке, и CAR-T-клеток, ADC или BiTE, направленных против различных опухолевых антигенов, обеспечивает значительно усиленные противоопухолевые эффекты против различных опухолей. oHSV непосредственно разрушает барьеры и изменяет микроокружение опухоли путем прямого лизиса опухолевых клеток. oHSV, вооруженный полезной нагрузкой, такой как хемокин и цитокин, дополнительно улучшает миграцию и инфильтрацию Т-клеток к опухолевой массе. Кроме того, высоко опухоль-специфичный антиген (например, CD19, ВСМА), доставляемый oHSV на поверхность клеток солидной опухоли, также улучшает специфичность и безопасность терапии, нацеленной на опухоль, такой как CAR-T-терапия, за счет снижения специфической в отношении мишени внеопухолевой токсичности.
Последовательности
[0114] Последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот, описанные в настоящем описании, приведены ниже в Таблице 1.
[0115]
Примеры
[0116] Конструкции oHSV-1 Т7201, Т7202, Т7203, Т7204, Т7011, Т7012 и Т7013
[0117] Онколитический вирус простого герпеса (oHSV-1) Т7201, Т7202, Т7203 и Т7204 несет кодирующие последовательности IL-12, антитела к PD-1, CCL5 и одного усеченного несигнального варианта опухоль-ассоциированных антигенов (ТАА), служащего в качестве биомаркера. Усеченный несигнальный вариант биомаркера, экспрессируемого Т7201, Т7202, Т7203 и Т7204, представляет собой CD19, ВСМА, Trop-2 и HER2, соответственно. На Фиг. 1С показано схематическое изображение вирусных остовов Т7201-Т7204.
[0118] Онколитический вирус простого герпеса (oHSV-1) Т7011, Т7012 и Т7013 несет кодирующие последовательности IL-12, антитела к PD-1, CCL5 и двух усеченных несигнальных вариантов опухоль-ассоциированных антигенов (ТАА), служащих в качестве биомаркеров. Усеченный несигнальный вариант биомаркеров, экспрессируемых Т7011, Т7012 и Т7013, представляет собой CD19 плюс ВСМА, CD19 плюс Trop-2 и CD19 плюс HER2, соответственно. На Фиг. 1D показано схематическое изображение вирусных остовов Т7011, Т7012 и Т7013. На Фиг. 2 показана блок-схема конструирования oHSV серии Т7.
[0119] Указанные два биомаркера и кодирующие последовательности CCL5, связанные последовательностью саморасщепляющегося пептида Т2А (SEQ ID NO: 1), транслируются в одной открытой рамке считывания под контролем промотора предраннего гена HSV-1 (промотор IE4/5). Кассету экспрессии вставляют между генами UL37 и UL38.
[0120] Кроме того, Т7201, Т7202, Т7203, Т7204, Т7011, Т7012 и Т7013 содержат вставку кассеты экспрессии антитела к PD-1 человека между UL3 и UL4 и модифицированную область внутреннего повтора (IR), замененную кассетой экспрессии IL-12. Рекомбинантный вирус конструировали в несколько этапов с использованием системы искусственных бактериальных хромосом (ВАС). Подробности конструирования вируса описаны ниже.
[0121] Кассету экспрессии IL-12, фланкированную против хода транскрипции от нуклеотида 117005 и по ходу транскрипции от нуклеотида 132096 в контексте генома дикого типа, подвергали ПЦР-амплификации из вирусного генома HSV-1 с двумя наборами праймеров соответственно (SEQ ID NO:2-3) и (SEQ ID NO:4-5), и вставляли в плазмиду для замещения генов pKO5 с получением pKO1407. Затем pKO1407 трансфицировали в Escherichia coli с ВАС дикого типа путем электропорации с получением ВАС-Т2010. Затем кассету промотора CMV, управляющего геном антитела к PD-1, фланкированную против хода транскрипции от нуклеотида 11658 и по ходу транскрипции от нуклеотида 11659 в контексте генома дикого типа, подвергали ПЦР-амплификации из вирусного генома HSV-1 с двумя наборами праймеров соответственно (SEQ ID NO:6-7) и (SEQ ID NO:8-9), и лигировали в pKO5 по сайтам BglII и PacI с получением плазмиды pKOE1002. Затем плазмиду pKOE1002 трансфицировали в Escherichia coli, несущие ВАС-Т2010, путем электропорации с получением ВАС-Т3011. Кассету экспрессии, содержащую один или два биомаркера (т.е. опухоль-ассоциированный/специфический антиген) и гены CCL5, фланкировали против хода транскрипции от нуклеотидов 84220 и по ходу транскрипции от нуклеотидов 84221 в контексте генома дикого типа. Расположенные против хода транскрипции и по ходу транскрипции фланкирующие последовательности подвергали ПЦР-амплификации из вирусного генома HSV-1 с двумя наборами праймеров, соответственно (SEQ ID NO:10-11) и (SEQ ID NO:12-13). Фрагмент ДНК, содержащий биомаркеры, CCL5 и фланкирующие последовательности, лигировали в pKO5 по сайтам XbaI и PacI с получением плазмид pKO7201, pKO7202, pKO7203, pKO7204, pKO7011, pKO7012 и pKO7013. Плазмиды pKO7201, pKO7202, pKO7203, pKO7204, pKO7011, pKO7012 и pKO7013 затем трансфицировали в Escherichia coli, несущие ВАС-Т3011, путем электропорации с получением ВАС-Т7201, ВАС-Т7202, ВАС-Т7203 ВАС-Т7204, ВАС-Т7011, ВАС-Т7012, ВАС-Т7013, соответственно. Вирусы Т7201, Т7202, Т7203, Т7204, Т7011, Т7012 и Т7013 получали путем трансфекции соответствующих ВАС-плазмид с последующими несколькими этапами очистки бляшек и амплификации в клетках Vero.
[0122] Титрование вирусов
[0123] Титр вируса измеряли с помощью анализа образования бляшек. Вкратце, исходный вирусный материал последовательно разводили, а затем инокулировали монослой клеток Vero в колбе Т25. После абсорбции в течение 2 часов среду заменяли средой DMEM с добавлением 1% FBS плюс 0,05% (мас./об.) объединенного иммуноглобулина человека на 72 часа. Клетки фиксировали абсолютным метанолом в течение 5 минут, промывали дистиллированной водой и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Бляшки подсчитывали для расчета титра инфекционных вирусных частиц. Титры Т7011, Т7012 и Т7013 приведены ниже в Таблице 2, а титры Т7201, Т7202, Т7203 и Т7204 приведены в Таблице 4.
[0124]
[0125] Обнаружение секреции CCL5 после инфицирования вирусом
[0126] Клетки эмбриональной почки человека 293Т, рака гортани человека Нер-2 и плоскоклеточного рака языка человека Тса8113 высевали в колбу Т25 с плотностью 1×106 клеток на колбу. После инкубации в течение ночи клетки подвергали имитации инфицирования или инфицированию при 1 БОЕ (бляшкообразующих единиц) Т7011 на клетку. После 2-часовой инкубации инокулят заменяли свежей культуральной средой. Клеточный супернатант собирали через 0, 4, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после инфицирования для анализа методом ELISA для количественной оценки секреции CCL5. На Фиг. 3 показано высвобождение CCL5 после инфицирования Т7011 в клетках 293Т, Нер-2 и Тса8113. Экспрессия и высвобождение CCL5 были быстрыми и сильными. Секретируемый CCL5 был обнаружен уже через 4 часа после инфицирования и достиг пика, составившего 5000 пг/мл. Секреция была стабильной и сохранялась в течение по меньшей мере 4 дней после инфицирования вирусом Т7011. Таким образом, была продемонстрирована секреция CCL5.
[0127] Экспрессия IL-12, антитела к PD-1 и CCL5 с помощью анализа методом ELISA
[0128] Клетки Vero высевали в колбу Т150 с плотностью 6×106 клеток на колбу. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали при 0,01 БОЕ Т7201, Т7202, Т7203, Т7204, Т7011, Т7012 и Т7013 на клетку. Клеточные супернатанты, собранные через 48 часов после инфицирования, использовали для анализа методом ELISA для определения уровня экспрессии IL-12, антитела к PD-1 и CCL5. Результаты приведены в Таблице 3 и Таблице 4. Как показано в Таблице 3, экспрессия CCL5 находилась на высоком уровне и была очень стабильной для всех протестированных вирусов. Экспрессия IL-12 и Ab к PD-1 была по существу одинаковой для Т7011 и Т7013, в то время как Т7012 продемонстрировал самую высокую экспрессию IL-12 и самую низкую экспрессию Ab к PD-1.
[0129]
[0130]
[0131] Экспрессия и презентация усеченных CD19, ВСМА, Trop-2, HER2 на поверхности клетки с помощью иммунофлуоресцентного анализа
[0132] Клетки Нер-2 (4×105) высевали на покровное стекло в отдельных лунках 6-луночного планшета и инкубировали в течение 24 часов, чтобы дать клеткам прикрепиться. Затем клетки подвергали имитации инфицирования или по отдельности подвергали воздействию 5 БОЕ вируса Т7011, Т7012 и Т7013 на клетку в течение 1 часа. Инокулят заменяли свежей культуральной средой. Клетки промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре в указанные моменты времени с последующим блокированием 5% обезжиренным молоком. Клетки, инфицированные Т7011, совместно окрашивали антителом к CD19 (кат. №302204, Biolegend), а также антителами к ВСМА (кат. №NBP1-97637, Novus); клетки, инфицированные Т7012, совместно окрашивали антителом к CD19 (кат. №302204, Biolegend) и антителами к Trop-2 (кат. №РА5-47030, Invitrogen); клетки, инфицированные Т7013, окрашивали антителом к CD19 (кат. №302204, Biolegend) и первичным антителом к HER2 (кат. №МАВ1129-100, R&D systems) в течение ночи при 4°С, соответственно. Затем клетки инкубировали с конъюгированным с Alexa Fluor 488 антимышиным (кат. №А32766, Invitrogen), конъюгированным с Alexa Fluor 568 антикроличьим (кат. №А11036, Invitrogen) и конъюгированным с Alexa Fluor 568 антикозьим (кат. №А11057, Invitrogen) вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем клетки промывали PBS и помещали в заливочную среду (кат. №8961S, Cell Signaling Technology). Изображения были сняты и обработаны с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon (HD25, 120-кратное увеличение) и показаны на Фиг. 4. Как можно видеть на Фиг. 4, различные усеченные антигены, кодируемые Т7011, Т7012 и Т7013, соответственно, одновременно экспрессировались на поверхностях опухолевых клеток.
[0133] Исследование нейровирулентности
[0134] 6-недельным самкам мышей BALB/c давали наркоз, а затем интракраниально вводили 50 мкл 10-кратных последовательных разведений в группах по 8 мышей на разведение вирусов HSV-1 (F), Т3011, Т7011, Т7012 или Т7013. Тот же объем DPBS, содержащий 10% глицерина, инокулировали в качестве контрольной группы, подвергшейся имитации вмешательства. Мышей наблюдали в течение 14 дней и рассчитывали 50% летальную дозу (LD50) на основе данных о смертности методом Рида-Мюнха.
[0135] Как показано ниже в Таблице 5, значение LD50 для Т7011, Т7012, Т7013 и Т3011 в 158 раз, 316 раз, 100 раз и 268 раз выше, чем для HSV-1 (F), соответственно, что указывает на то, что, как и для вируса Т3011, нейротоксичность Т7011, Т7012 и Т7013 значительно снижена по сравнению с HSV-1 (F).
[0136]
[0137] Противоопухолевая активность вируса oHSV серии Т7
[0138] Опухолевые клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 10000 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки в трех повторностях инфицировали Т3011, Т7011, Т7012 и Т7013 при 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 33,33 и 100 БОЕ на клетку. Через 48 часов инфицирования (п. инф.) определяли жизнеспособность клеток с помощью CellTiter-Glo. Степень ингибирования роста клеток рассчитывали в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию (БОЕ/клетка), приводящую к 50% ингибированию роста клеток (IC50) вирусной инфекцией, рассчитывали путем аппроксимации данных с получением кривых доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.
[0139] Как показано на Фиг. 5, значения IC50 серии Т7 сопоставимы с Т3011, что указывает на то, что вирусы серии Т7 имеют аналогичную широкую противоопухолевую активность по сравнению с Т3011. Между тем значения IC50 на клетках НСТ116, Нер-2, РС-3, MDA-MB-231 и A375 немного выше, чем в других линиях опухолевых клеток, что указывает на то, что эти линии клеток относительно устойчивы к инфицированию вирусами серии Т7, и поэтому выбраны для дальнейших комбинированных исследований.
[0140] Инфекционная активность вируса oHSV серии Т7
[0141] Клетки Нер-2, нетрансдуцированные нормальные Т-клетки и CD19 CAR-T-(CAR-Т-) клетки высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 5×105 клеток на лунку и инфицировали HSV-1 (F), Т7011, Т7012 и Т7013 при 1 БОЕ на клетку. Клеточные осадки собирали через 24 и 48 часов (ч) после инфицирования, а затем промывали с помощью PBS. Затем клеточные осадки ресуспендировали в DPBS+10% глицерина и проводили три цикла замораживания-размораживания. Потомство вируса титровали на клетках Vero.
[0142] Как показано на Фиг. 6, выходы вируса во всех инфицированных вирусом клетках Нер-2 значительно выше, чем в нормальных Т-клетках и CAR-Т-клетках. В частности, выходы вирусов серии Т7 как в нормальных Т-клетках, так и в CAR-T-клетках составляют не более 103 БОЕ/мл через 24 часа или 48 часов после инфицирования. Эти результаты указывают на то, что вирус HSV-1 (F) дикого типа обладает низкой инфекционной активностью в CAR-T- или нормальных Т-клетках, в то время как ослабленные вирусы Т7011, Т7012 и Т7013 не обладают инфекционной активностью.
[0143] Активность уничтожения (обеспечения гибели) клеток вируса oHSV серии Т7
[0144] CD19 CAR-T- (CAR-TCD19-) клетки и нетрансдуцированные нормальные Т-клетки высевали в 96-луночный планшет при 4×104 клеток на лунку и инфицировали Т7011, Т7012 и Т7013 при 0,01, 0,1, 1 и 10 БОЕ на клетку в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo через 24 и 48 ч после инфицирования (п. инф.). Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0145] Как показано на Фиг. 7, жизнеспособность клеток не снижается при инфицировании вирусом серии Т7, что доказывает, что вирусы серии Т7 не обладают активностью уничтожения клеток против CAR-T- или нормальных Т-клеток.
[0146] Противоопухолевый эффект комбинации Т7011 с CAR-TCD19
[0147] Клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали Т7011 или без него при 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 и 1 БОЕ на клетку в трех параллельных лунках. Через 24 часа после инфицирования добавляли 4×104 клеток на лунку CAR-TCD19- или Т-клеток при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 4:1 для совместного культивирования с опухолевыми клетками. Нетрансдуцированные нормальные Т-клетки служили в качестве контроля. Через 24 часа совместного культивирования определяли жизнеспособность клеток с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0148] Как показано на Фиг. 8, комбинация Т7011 с CAR-TCD19 демонстрирует ≥60% более высокий эффект, чем обработка одним агентом. Представленные результаты демонстрируют, что противоопухолевый эффект значительно усиливается в группе комбинированной обработки Т7011 и CAR-TCD19 по сравнению с группой, получившей только Т7011 и CAR-T. Напротив, комбинированная обработка Т7011 и нормальными Т-клетками демонстрирует незначительный противоопухолевый эффект.
[0149] Кроме того, клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали Т7011 или Т3011 или без них при 1 БОЕ на клетку в трех повторностях. Через 24 часа после инфицирования добавляли 4×104 клеток на лунку CAR-ТCD19-клеток при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 4:1 для еще одного 24-часового совместного культивирования. Необработанная клетка служила необработанным контролем. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0150] Как показано на Фиг. 9, только комбинированная обработка Т7011 и CAR-TCD19 обеспечивает значимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с группой, подвергнутой одиночной обработке, а также группой комбинированной обработки Т3011 и CAR-Т. Использованная в качестве контроля комбинация Т3011 с CAR-TCD19 не оказывает эффекта. Все эти результаты указывают на то, что инфицирование вирусом Т7011 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-TCD19.
[0151] Противоопухолевый эффект комбинации Т7012 с CAR-TCD19
[0152] Клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали или не инфицировали Т7012 при 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 и 1 БОЕ на клетку в трех параллельных лунках. Через 24 часа после инфицирования добавляли 4×104 клеток на лунку CAR-TCD19- или Т-клеток при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 4:1 для совместного культивирования с опухолевыми клетками. Нетрансдуцированные нормальные Т-клетки служили в качестве контроля. Через 24 часа совместного культивирования определяли жизнеспособность клеток с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0153] Как показано на Фиг. 10, комбинация Т7012 с CAR-TCD19 демонстрирует ≥50% более высокий эффект, чем обработка одним агентом. Представленные результаты демонстрируют, что противоопухолевый эффект значительно усиливается в группе комбинированной обработки Т7012 и CAR-TCD19 по сравнению с группой, получившей только Т7012 и CAR-T. Напротив, комбинированная обработка Т7012 и нормальными Т-клетками продемонстрировала незначительный противоопухолевый эффект.
[0154] Кроме того, клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали Т7012 или Т3011 или без них при 1 БОЕ на клетку в трех повторностях. Через 24 часа после инфицирования добавляли 4×104 клеток на лунку CAR-ТCD19-клеток при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 4:1 для еще одного 24-часового совместного культивирования. Необработанная клетка служила необработанным контролем. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0155] Как показано на Фиг. 11, только комбинированная обработка Т7012 и CAR-TCD19 обеспечивает значимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с группой, подвергнутой одиночной обработке, а также группой комбинированной обработки Т3011 и CAR-Т. Использованная в качестве контроля комбинация Т3011 с CAR-TCD19 не оказывает эффекта. Все эти результаты указывают на то, что инфицирование вирусом Т7012 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-TCD19.
[0156] Противоопухолевый эффект комбинации Т7013 с CAR-TCD19
[0157] Клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали или не инфицировали Т7013 при 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 и 1 БОЕ на клетку в трех параллельных лунках. Через 24 часа после инфицирования добавляли 4×104 клеток на лунку CAR-TCD19- или Т-клеток при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 4:1 для совместного культивирования с опухолевыми клетками. Нетрансдуцированные нормальные Т-клетки служили в качестве контроля. Через 24 часа совместного культивирования определяли жизнеспособность клеток с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0158] Как показано на Фиг. 12, комбинация Т7013 с CAR-TCD19 демонстрирует ≥60% более высокий эффект, чем обработка одним агентом. Представленные результаты демонстрируют, что противоопухолевый эффект значительно усиливается в группе комбинированной обработки Т7013 и CAR-TCD19 по сравнению с группой, получившей только Т7013 и CAR-T. Напротив, комбинированная обработка Т7013 и нормальными Т-клетками продемонстрировала незначительный противоопухолевый эффект.
[0159] Кроме того, клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали Т7013 или Т3011 или без них при 1 БОЕ на клетку в трех повторностях. Через 24 часа после инфицирования добавляли 4×104 клеток на лунку CAR-ТCD19-клеток при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 4:1 для еще одного 24-часового совместного культивирования. Необработанная клетка служила необработанным контролем. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0160] Как показано на Фиг. 13, только комбинированная обработка Т7013 и CAR-TCD19 обеспечивает значимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с группой, подвергнутой одиночной обработке, а также группой комбинированной обработки Т3011 и CAR-Т. Использованная в качестве контроля комбинация Т3011 с CAR-TCD19 не оказывает эффекта. Все эти результаты указывают на то, что инфицирование вирусом Т7013 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-TCD19.
[0161] Активность уничтожения клеток вируса oHSV серии Т7 (Т7011, Т7012 и Т7013) в CAR-NKCD19- и NK-клетках
[0162] NK-клетки выделяли из РВМС в соответствии со способами, известными в данной области техники. CD19 CAR-NK- (CAR-NKCD19-) клетки и нетрансдуцированные нормальные NK-клетки высевали в 96-луночный планшет при 4×104 клеток на лунку и инфицировали HSV-1(F), Т7011, Т7012 и Т7013 при 0,01, 0,1, 1 и 10 БОЕ на клетку в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo через 24, 48 ч и 72 ч после инфицирования (п. инф.). Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0163] Как показано на Фиг. 14, жизнеспособность клеток не снижается при инфицировании вирусом серии Т7, что доказывает, что вирусы серии Т7 не обладают активностью уничтожения клеток против CAR-NK- или нормальных NK-клеток.
[0164] Вирусная репликация HSV-1 (F) и Т7011 в CAR-NKCD19- и NK-клетках
[0165] CAR-NKCD19- и NK-клетки высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 5×105 клеток/лунку и инфицировали HSV-1 (F) и Т7011 при 1 БОЕ на клетку в присутствии IL-2 (+IL-2) или в отсутствие IL-2. Клеточные осадки собирали через 2, 24, 48 и 72 часа (ч) после инфицирования. Затем клеточные осадки промывали PBS, а затем ресуспендировали в DPBS+10% глицерина, замораживали и размораживали 3 раза. Потомство вируса титровали на клетках Vero.
[0166] Как показано на Фиг. 15, вирус Т7011 не обладает инфекционной активностью в CAR-NKCD19- или нормальных NK-клетках.
[0167] Влияние Т7011 на пролиферацию CAR-NKCD19-клеток
[0168] CAR-NKCD19-клеток высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 5×105 клеток/лунку и инфицировали HSV-1 (F) и Т7011 или без них при 0,1 или 1 БОЕ на клетку в присутствии (+IL-2) или в отсутствие IL-2. Клеточные осадки собирали через 24, 48 и 72 часа (ч) после инфицирования и определяли живые клетки с помощью окрашивания трипановым синим.
[0169] Как показано на Фиг. 16, Т7011 не оказывает отрицательного влияния на пролиферацию CAR-NKCD19-клеток.
[0170] Влияние Т7011 на пролиферацию CAR-NK-клеток
[0171] NK-клетки высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 5×105 клеток/лунку и инфицировали HSV-1 (F) и Т7011 или без них при 0,1 или 1 БОЕ на клетку в присутствии (+IL-2) или в отсутствие IL-2. Клеточные осадки собирали через 24, 48 и 72 часа (ч) после инфицирования и определяли живые клетки с помощью окрашивания трипановым синим.
[0172] Как показано на Фиг. 17, Т7011 не оказывает отрицательного влияния на пролиферацию NK-клеток.
[0173] Эффект уничтожения клеток комбинации Т7011 с CAR-NKCD19
[0174] Клетку карциномы гортани человека Нер-2, клетку меланомы человека А375 и клетки карциномы предстательной железы человека РС-3 высевали в 96-луночный планшет. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали Т7011 при 0,01, 0,1 и 1 БОЕ на клетку в трех параллельных лунках. Через 24 часа после инфицирования добавляли CAR-NKCD19-клетки при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 2:1 для совместного культивирования с опухолевыми клетками. Еще через 24 часа или 48 часов определяли жизнеспособность клеток с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0175] Как показано на Фиг. 18, комбинация Т7011 с CAR-NKCD19 продемонстрировала более высокий эффект, чем обработка одним агентом.
[0176] Кроме того, клетки меланомы человека А375 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инфицировали NK, CAR-NKCD19 или Т7011 при 1 БОЕ на клетку в трех повторностях. Через 24 часа после инфицирования к клеткам, инфицированным Т7011, добавляли CAR-NKCD19- или NK-клетки при соотношении эффектор : мишень (Е:Т) 2:1 для еще одного 24-часового совместного культивирования. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как процент от необработанных клеток.
[0177] Как показано на Фиг. 19, комбинированная обработка Т7011 и CAR-NKCD19 обеспечивает значимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с группой, подвергнутой одиночной обработке, а также группой комбинированной обработки Т7011 и NK. Все эти результаты указывают на то, что инфицирование вирусом Т7011 может специфически оказывать синергический эффект с противоопухолевой активностью CAR-NKCD19.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ImmVira Biopharmaceuticals Co., Limited
<120> Генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса,
доставляющий хемокин и опухоль-ассоциированный/специфический антиген
<130> 193332-22D-RUP
<160> 17
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 1
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 2
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 2
gaagatctaa tatttttatt gcaactccct g 31
<210> 3
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 3
ctagctagct tataaaaggc gcgtcccgtg g 31
<210> 4
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 4
gctctagatt gcgacgcccc ggctc 25
<210> 5
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 5
ccttaattaa ggttaccacc ctgtagcccc gatgt 35
<210> 6
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 6
tcccatggat ttaacaaacg ggggggtgtc g 31
<210> 7
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 7
ggcccccgag gccagcatga cgttatct 28
<210> 8
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 8
gagtaaccgc ccccccccca tgccaccctc ac 32
<210> 9
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 9
gtgttttact gccactacac ccccggggaa c 31
<210> 10
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 10
tctagagatc agggtgttga tcaccacgga g 31
<210> 11
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 11
gaattcgggc tgcccgcaca tccggacaat c 31
<210> 12
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 12
catatgggac ggcgtgggtt gcggactttc tg 32
<210> 13
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 13
ttaattaatc acgcgcatgc ccgccactcg cc 32
<210> 14
<211> 323
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> усеченный несигнальный вариант CD19
<400> 14
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg
<210> 15
<211> 77
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> усеченный несигнальный вариант BCMA
<400> 15
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu
65 70 75
<210> 16
<211> 675
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> усеченный несигнальный вариант HER2
<400> 16
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile
675
<210> 17
<211> 297
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> усеченный несигнальный вариант Trop-2
<400> 17
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val
50 55 60
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala
85 90 95
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105 110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120 125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185 190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200 205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
210 215 220
Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235 240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250 255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg
260 265 270
Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu
275 280 285
Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile
290 295
<---
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ОНКОЛИТИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1 ТИПА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА | 2021 |
|
RU2824514C1 |
ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА АНТИГЕН СОЗРЕВАНИЯ В-КЛЕТОК, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2761632C2 |
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ | 2013 |
|
RU2729401C2 |
ТРАНСГЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТКИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2822461C1 |
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИММУНОТЕРАПИИ | 2014 |
|
RU2798348C2 |
ТРАНСГЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТКИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2729112C2 |
CD19-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2014 |
|
RU2727447C2 |
УСТОЙЧИВЫЕ К РИТУКСИМАБУ ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2020 |
|
RU2816370C2 |
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР КЛЕТОК | 2015 |
|
RU2751362C2 |
ХИМЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ АНТИТЕЛО/Т-КЛЕТОЧНЫЙ РЕЦЕПТОР И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2767209C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Описан генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), причем в геном указанного oHSV встроен полинуклеотид, кодирующий (a) усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, и (b) по меньшей мере один хемокин, при этом экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанного по меньшей мере одного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и
при этом указанный усеченный несигнальный вариант экспрессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки в качестве биомаркера при репликации указанного oHSV в указанной опухолевой клетке, и указанный по меньшей мере один хемокин экспрессируется и высвобождается для индукции хемотаксиса иммунной клетки к указанной опухолевой клетке. Описан фармацевтический набор для лечения рака, содержащий, по отдельности, oHSV и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, причем указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака. Раскрыт генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), причем в геном указанного oHSV встроен полинуклеотид, кодирующий усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, причем экспрессия указанного усеченного несигнального варианта находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и причем указанный усеченный несигнальный вариант экспрессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки в качестве биомаркера при репликации указанного oHSV в указанной опухолевой клетке. Раскрыт фармацевтический набор для лечения рака, содержащий, по отдельности, oHSV и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, причем указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения рака. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 19 ил., 5 табл.
1. Генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), причем в геном указанного oHSV встроен полинуклеотид, кодирующий
(a) усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, и
(b) по меньшей мере один хемокин,
при этом экспрессия указанного усеченного несигнального варианта и указанного по меньшей мере одного хемокина находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и
при этом указанный усеченный несигнальный вариант экспрессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки в качестве биомаркера при репликации указанного oHSV в указанной опухолевой клетке, и указанный по меньшей мере один хемокин экспрессируется и высвобождается для индукции хемотаксиса иммунной клетки к указанной опухолевой клетке.
2. Генетически модифицированный oHSV по п. 1, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один опухоль-ассоциированный/опухоль-специфический антиген выбран из группы, состоящей из HER2, PSMA, ВСМА, CD20, CD33, CD19, CD22, CD123, CD30, GPC-3, CEA, клаудина 18.2, ЕрСАМ, GD2, MSLN, EGFR, MUC1, EGFRVIII, CD38, Trop-2, с-МЕТ, нектина-4, CD79b, CCK4, GPA33, HLA-A2, CLEC12A, р-кадгерина, TDO2, MART-1, Pmel 17, MAGE-1, AFP, СА125, TRP-1, TRP-2, NY-ESO, PSA, CDK4, BCA225, CA 125, MG7-Ag, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TAAL6 и TAG72.
3. Генетически модифицированный oHSV по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один хемокин выбран из группы, состоящей из CXCL1-CXCL17, CCL1-CCL28, XCL1, XCL2 и CX3CL1.
4. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный усеченный несигнальный вариант представляет собой внеклеточный домен, внеклеточный-трансмембранный домены или их эквивалент, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична указанному внеклеточному или внеклеточному-трансмембранному доменам.
5. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный промотор предраннего гена HSV выбран из группы, состоящей из IE 1 (промотор ICP0), IE 2 (промотор ICP27), IE 3 (промотор ICP4) и IE 4/5 (промотор ICP22 и ICP47) HSV-1.
6. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид кодирует усеченные несигнальные варианты двух опухоль-ассоциированных/опухоль-специфических антигенов; и по меньшей мере один хемокин.
7. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один хемокин включает CCL5.
8. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид вставлен между UL37 и UL38.
9. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид кодирует:
(a) усеченный несигнальный вариант CD19, усеченный несигнальный вариант ВСМА и CCL5;
(b) усеченный несигнальный вариант CD19, усеченный несигнальный вариант Trop-2 и CCL5;
(c) усеченный несигнальный вариант CD19, усеченный несигнальный вариант HER2 и CCL5;
(d) усеченный несигнальный вариант CD19 и CCL5;
(e) усеченный несигнальный вариант Trop-2 и CCL5;
(f) усеченный несигнальный вариант ВСМА и CCL5; или
(g) усеченный несигнальный вариант HER2 и CCL5.
10. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанный промотор предраннего гена HSV представляет собой промотор предраннего гена IE4/5 HSV-1.
11. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что ниже по ходу транскрипции от полинуклеотида, кодирующего усеченный антиген и хемокин, расположен полиА-хвост.
12. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанная опухолевая клетка представляет собой клетку солидной опухоли.
13. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанная опухолевая клетка не экспрессирует опухоль-ассоциированный/опухоль-специфический антиген, кодируемый указанным полинуклеотидом.
14. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что указанный oHSV дополнительно модифицирован таким образом, что фрагмент нуклеиновой кислоты oHSV удален.
15. Генетически модифицированный oHSV по п. 14, отличающийся тем, что указанный фрагмент нуклеиновой кислоты oHSV представляет собой внутренние инвертированные повторы oHSV, фрагмент, кодирующий вирусный ген, или и то, и другое.
16. Генетически модифицированный oHSV по п. 14, отличающийся тем, что указанный фрагмент нуклеиновой кислоты oHSV находится в положениях с 117005 по 132096 в геноме прототипа Р штамма F.
17. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что указанный oHSV дополнительно модифицирован для кодирования иммуностимулирующего агента, иммунотерапевтического агента или и того, и другого.
18. Генетически модифицированный oHSV по п. 17, отличающийся тем, что указанный иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27.
19. Генетически модифицированный oHSV по п. 17 или 18, отличающийся тем, что указанный иммунотерапевтический агент представляет собой антитело к PD-1, антитело к CTLA4 или их антигенсвязывающий фрагмент.
20. Генетически модифицированный oHSV по любому из пп. 17-19, отличающийся тем, что указанный иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12, и указанный иммунотерапевтический агент представляет собой антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
21. Фармацевтический набор для лечения рака, содержащий, по отдельности, oHSV по любому из пп. 1-20 и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, причем указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака.
22. Фармацевтический набор по п. 21, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из CAR-T-клетки, CAR-NK-клетки, BiTE и ADC.
23. Фармацевтический набор по п. 22, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из CAR-T-клетки, нацеленной на CD19, CAR-NK-клетки, нацеленной на CD19, и BiTE, нацеленного на CD19 или ЕрСАМ.
24. Фармацевтический набор по п. 22, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, представляет собой ADC, нацеленный на HER2, Trop-2, нектин-4, ВСМА, CD33, CD30, CD22 или CD79b.
25. Фармацевтический набор по п. 22, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Tecartus®, Kymriah®, Yescarta®, JWCAR-029, IM19CAR-T, CNCT19, BZ019, HD CD19 CAR-T, pCAR-19B, CD19-CART, CT032, iPD1 CD19 eCAR-T, LCAR-B38M, CT103A, CAR-BCMA T, AU-101, 4SCAR-PSMA, PSMA-CART, P-PSMA-101, C-CAR066, MB-CART20.1, PBCAR20A, LB1095, LB1901, PRGN-3006, AMG553, CT041, CD30.CAR-T и CAR-GPC3 Т.
26. Фармацевтический набор по п. 22, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Blincyto®, AMG420, PF-3135 и GBR1302.
27. Фармацевтический набор по п. 22, отличающийся тем, что указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, выбран из группы, состоящей из Kadcyla®, Enhertu®, SHR-A1811, ТАА013, RC-48, ВАТ8001, ARX788, А166, Trodelvy®, BAT8003, DAC-002, DS-1062, SKB264, RC-108, TR1801-ADC, Padccv®, Polivy®, Adcetris®, Mylotarg®, Blenrep®, ADC к PSMA, ADCT-402, PTK7-ADC и TRS005.
28. Генетически модифицированный онколитический вирус простого герпеса (oHSV), причем в геном указанного oHSV встроен полинуклеотид, кодирующий усеченный несигнальный вариант по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, причем экспрессия указанного усеченного несигнального варианта находится под контролем промотора предраннего гена HSV, и причем указанный усеченный несигнальный вариант экспрессируется и презентируется на поверхности опухолевой клетки в качестве биомаркера при репликации указанного oHSV в указанной опухолевой клетке.
29. Фармацевтический набор для лечения рака, содержащий, по отдельности, oHSV по п. 28 и терапевтический агент, нацеленный на опухоль, причем указанный терапевтический агент, нацеленный на опухоль, имеет нацеливающий фрагмент, специфичный к указанному усеченному несигнальному варианту по меньшей мере одного опухоль-ассоциированного/опухоль-специфического антигена, кодируемого указанным полинуклеотидом, и эффекторный фрагмент для обеспечения гибели или ингибирования пролиферации клетки указанного рака.
Chang-Myung Oh, Hong Jae Chon, and Chan Kim, Combination Immunotherapy Using Oncolytic Virus for the Treatment of Advanced Solid Tumors, Int J Mol Sci | |||
Способ восстановления спиралей из вольфрамовой проволоки для электрических ламп накаливания, наполненных газом | 1924 |
|
SU2020A1 |
И.В | |||
Холоденко, И.И | |||
Доронин, Р.В | |||
Холоденко ОПУХОЛЕВЫЕ МОДЕЛИ В ИЗУЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, Иммунология, 2013, номер 5, стр.282-285 | |||
Печь для сжигания твердых и жидких нечистот | 1920 |
|
SU17A1 |
Авторы
Даты
2024-09-24—Публикация
2022-04-07—Подача