Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs755892 гена DNAJB1 Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России.

Сахарный диабет 2 типа является самым распространенным эндокринологическим заболеванием, при этом Россия находится на втором месте среди всех европейских стран по количеству больных диабетом, 90% из которых составляют больные диабетом 2 типа (СД2) [IDF Diabetes Atlas: Global, regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045 / H. Sun, P. Saeedi, S. Karuranga [et al.] // Diabetes research and clinical practice. - 2022. - Vol. 183. - Р. 109119]. Одним из ключевых нарушений, выявляемых при сахарном диабете 2 типа, является стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активация клеточного ответа на неупакованные белки, которые вызваны накоплением белков с неправильной укладкой и изменением белкового гомеостаза клетки [Pathological β-cell endoplasmic reticulum stress in type 2 diabetes: current evidence / N. Shrestha, E. De Franco, P. Arvan [et al.] // Frontiers in endocrinology. - 2021. - Vol. 12. - Р. 650158]. Хронический стресс ЭР ведет к прогрессирующей дисфункции, снижению и апоптозу функционирующей массы бета-клеток поджелудочной железы, что лежит в основе прогрессирования СД2 в ходе его естественного течения [Progressive endoplasmic reticulum stress over time due to human insulin gene mutation contributes to pancreatic beta cell dysfunction / N. S. Amirruddin, W. X. Tan, Y. S. Tan [et al.] // Diabetologia. - 2021. - Vol. 64,Iss. 11. - P. 2534-2549]. Дефекты в синтезе любых предшественников инсулина (препроинсулина, проинсулина) и самого инсулина, а также нарушение механизма секреции могут привести к нарушению фолдинга данного белкового гормона - главной причины дисфункции β-клеток [Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus / U. Galicia-Garcia, A. Benito-Vicente, S. Jebari [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2020. - Vol. 21. Iss. 17. - Р. 6275]. Процесс фолдинга белка заключается в поиске уникальной нативной структуры, отвечающей сохранению принципа минимума энергии. После того, как белок попадает в просвет ЭР, он начинает процесс упаковки с помощью уникальных белков - шаперонов. Одним из основных регуляторных шаперонов является семейство Hsp40, главным представителем которого является член 1 семейства белков теплового шока DNAJB1. Комплекс DNAJB1-шаперон необходим для идентификации и доставки полипептидной последовательности белков к шаперонам семейства Hsp70 для обеспечения правильного фолдинга, рефолдинга или деградации [An Ankyrin-B-Mediated Protein Chaperone Mechanism Modulates Pancreatic β-Cell Susceptibility to Proteotoxicity-Induced ER Stress and Apoptosis / J. Tzeng, H. Hohmeier, D. Lorenzo // Diabetes. - 2022. - Vol. 71.]. В отношении полиморфного варианта rs755892 DNAJB1 согласно биоинформатическому инструменту atSNP search установлено, что наличие рискового аллеля rs755892-А сопряжено с приобретением участков связывания для таких транскрипционных факторов, как FOXO1, SPDEF, XBP1 и FOXO3, которые вовлечены в активацию апоптоза в ответ на различные стимулы, включая стресс ЭР, окислительный стресс, цитокины и факторы роста [atSNP: transcription factor binding affinity testing for regulatory SNP detection / C. Zuo, S. Shin, S. Keleş // Bioinformatics. - 2015. - Vol. 31. Iss. 20. - Р. 3353-3355].

Известен способ прогнозирования СД2 типа при помощи ежедневного измерения уровня глюкозы натощак у больных с гипертонической болезнью (RU 2521202 C1, 27.06.2014). Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови и проводят анализ полиморфного варианта гена лимфотоксина α (+250G/A Ltα). В случае выявления аллеля +250G Ltα прогнозируют повышенный риск формирования сахарного диабета на фоне гипертонической болезни, при обнаружении генотипа +250АА Ltα прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета второго типа у уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью.

Недостаток метода заключается в том, что он нацелен только на пациентов с гипертонической болезнью и не может быть использован для людей без данной патологии.

Известен способ прогнозирования риска СД2 у людей с метаболическим синдромом (RU 2580632 С1, 14.10.2014), который включает определение содержания аспартатаминотрансферазы (х1), по данным эхокардиографии определение конечного систолического объема левого желудочка (х2) и конечного диастолического объема левого желудочка (х3), содержания аланинаминотрансферазы (х4), систолического артериального давления (х5), размера левого предсердия (х6), содержания триглицеридов (x7), кортизола (х8), сахара в сыворотке крови через два часа после приема пищи (х9), возраста больного (х), индекса массы тела больного (х11), наличия или отсутствия у больного отягощенной наследственности по сахарному диабету 2 типа (х12) с последующим расчетом стратификационного показателя риска по формуле: G(x)=0,27×x1+0,28×x2+5,03×х3+0,25×х4+0,1×х5+1,93×х6-3,13×х7+0,28×x8++1,05×x9+0,17×x10+0,06×х11+0,59×х12. Если G(x) превышает 88,1, то риск развития сахарного диабета оценивают как высокий, в противном случае как незначительный.

Однако данный метод характерен только для пациентов с метаболическим синдромом. Кроме того, существенным недостатком данного способа является невозможность учета ряда информативных показателей: отягощенной наследственности, иммунобиохимических показателей крови, результатов эхокардиографии.

Известен способ прогнозирования риска развития СД 2 типа у пациентов различного возраста, по патенту RU 2611900 С1 (публикация: 01.03.2017), включающий сбор клинико-анамнестических данных: индекс массы тела, окружность талии, наличие артериальной гипертензии, наличие сахарного диабета у родственников 1 и 2 степени родства, а также лабораторные показатели: триглицериды > 1,7 ммоль/л, холестерин высокой плотности > 1,0 ммоль/л; САД > 140 и/или ДАД > 90 мм рт. ст.; уровень глюкозы в крови > 5,6 ммоль/л. Далее количественно (в баллах) оценивали полученные показатели, суммируя их, и если итоговое значение менее 8 баллов - низкая степень риска СД2, если более 8 баллов - высокая степень риска СД2.

Недостаток метода заключается в том, что для расчета степени риска заболевания требуется определение большого количества лабораторных показателей, что является трудоемким процессом. Кроме того, существенным показателем является знание о наличии/отсутствии сахарного диабета 2 типа у родственников 1 и 2 степени родства, что не всегда представляется возможным. Отсутствие данной информации делают шкалу риска субъективной.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа по патенту на изобретение RU 2655635 (дата публикации 29.05.2018), включающий забор периферической венозной крови пациента, экстракцию ДНК с последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и анализ полиморфизма гена рецептора к инкретинам GLP-1R по результатам которого прогнозируют пониженный риск развития СД2 в случае выявления генотипа GG полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R.

Недостаток метода заключается в том, что он характерен только для людей с метаболическим синдромом (ИМТ от 30 до 48,8 кг/м²) и относительно маленький размер выборки для статистической значимости эксперимента (87 больных СД2 и 109 относительно здоровых добровольцев). Кроме того, в патенте не указана этническая принадлежность популяции.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России по данным о генетическом полиморфизме rs755892 (G>A).

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена из семейства белков теплового шока DNAJB1 rs755892 (G>A) и прогнозируют повышенный риск формирования сахарного диабета 2 типа в случае выявления аллеля rs755892-А, а при обнаружении генотипа rs755892-G/G - низкий риск развития сахарного диабета 2 типа в популяции Центральной России.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы К QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма гена DNAJB1 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`- ACGTTGGATGGTTTTAGGGCTAATGGTGCG -3`, обратный R: 5`- ACGTTGGATGGGTGGCAGTGAATGCTAATG -3`, праймер удлинения E: 5`- CTAATGGTGCGTAGGAA -3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser. Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования сахарного диабета 2 типа в случае выявления аллеля rs755892-А и пониженного риска развития сахарного диабета 2 типа при выявлении генотипа rs755892- G/G.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития сахарного диабета 2 типа подтверждает анализ результатов наблюдений 1457 пациентов с СД2, из которых у 251 был диагностирован впервые выявленный сахарный диабет 2 типа. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что носительство генотипов rs755892-G/A и rs755892-A/A DNAJB1 ассоциировалось с повышенным риском развития сахарного диабета 2 типа у жителей центральной России, независимо от пола возраста и ИМТ: OR=1,79, 95% CI 1,40-2,30, P<0,0001 (таблица 1).

Таблица 1
Ассоциация полиморфного варианта rs755892 гена DNAJB1 с повышенным риском развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России Ген
(SNP ID) Генотип, аллель Больные СД2
(n=1428) Контроль
(n=1456) Р¹ OR (95% CI)² DNAJB1
G>A rs755892 G/G 589 (41,2%) 492 (33,8%) <0,0001 1,00 G/A 656 (45,9%) 694 (47,7%) 1,40 (1,17-1,68) A/A 183 (12,8%) 270 (18,5%) 1,79 (1,40-2,30) A 3,6% 4,2% <0,0001 0,76 (0,68-0,84) ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты - пол, возраст и индекс массы тела;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты - пол, возраст и индекс массы тела.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование русских пациентов Центральной России и не являющихся родственниками между собой по локусу rs755892 (G>A) гена DNAJB1.

Пациенту П., мужчине 39 лет, при прохождении профилактического осмотра на базе поликлиники ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 17.05.2016 г. было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа в связи с имеющимися факторами риска - ожирением III степени, отягощенной наследственностью по диабету (сахарным диабетом 2 типа страдает отец), малоподвижный образ жизни, высококалорийная диета. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs755892 (G>A) был выявлен генотип А/А DNAJB1, что позволило отнести пациента в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по снижению массы тела и коррекции образа жизни не проводились. С жалобами на сухость во рту, жажду до 5 л в сутки, полиурию с никтурией, сильную слабость и головокружение пациент П. 27.10.2017 был доставлен бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение, где получала стационарное лечение по 01.11.2017. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 15 ммоль/л, гликированный гемоглобин 10,4%. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 27.10.2017, фаза компенсации от 09.11.2017. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%, целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л.

Донор-доброволец П., женщина 56 лет, обратилась в ОБУЗ «Курская областная клиническая станция переливания крови» комитета здравоохранения Курской области 07.09.2017 г. для сдачи крови. Пациентке было предложено принять участие в научном исследовании для выявления генетической предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У женщины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs755892 (G>A) был выявлен генотип G/G DNAJB1, что позволило отнести женщину в группу лиц с низким риском развития сахарного диабета 2 типа. Анализ крови подтвердил факт отсутствия нарушений углеводного обмена: концентрация глюкозы крови натощак 3,7 ммоль/л, гликированный гемоглобин 4,9%, что соответствует норме. Дальнейшее наблюдение не выявило диагноз сахарного диабета 2 типа.

Пациент Б., 46 лет, проходил медосмотр в поликлинике ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 14.02.2016 г. При анализе крови натощак была выявлена гипергликемия 6,2 ммоль/л, в связи с чем мужчина был направлена на консультацию к эндокринологу. В связи с наличием факторов риска сахарного диабета 2 типа: ожирение III степени, сидячий образ жизни, наследственная отягощенность по материнской линии (СД2 страдают мать и родная тетя), пациенту было рекомендовано выполнение тестирования для оценки генетического риска развития заболевания. У пациента Б. была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфизма rs755892 (G>A) был выявлен генотип А/А DNAJB1, что позволило отнести пациента в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по снижению массы тела, коррекции образа жизни пациентом не проводились. Через 1,5 год пациент Б. был госпитализирована с жалобами на сухость во рту, жажду, никтурию, снижение остроты зрения и выраженную общую слабость в эндокринологическое отделение ОБУЗ КГКБ СМП, где он находился на стационарном лечении с 08.09.2017 по 14.09.2017 с диагнозом: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 08.09.2017, кетонурия от 11.09.2017, фаза компенсации от 14.09.2017. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<6,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <6,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <8,0 ммоль/л. Биохимический анализ крови подтвердил наличие сахарного диабета 2 типа: гипергликемия натощак 14,4 ммоль/л и повышенный уровень гликированного гемоглобина 10,3%.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди жителей Центральной России группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития сахарного диабета 2 типа.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель rs755892-А гена DNAJB1 является генетическим фактором риска развития сахарного диабета 2 типа (OR=2,30).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать предрасположенность к сахарному диабету 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного заболевания в группе лиц высокого риска - диспансерное наблюдение, регулярный контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России. Осуществляют забор образца периферической венозной крови и экстракцию ДНК. Проводят анализ полиморфного варианта гена из семейства белков теплового шока hsp40 DNAJB1 rs755892 (G>A). В случае выявления аллеля rs755892-А прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа. При обнаружении генотипа rs755892-G/G прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета 2 типа. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России по данным о генетическом полиморфизме rs755892 (G>A). 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена из семейства белков теплового шока hsp40 DNAJB1 rs755892 (G>A) и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления аллеля rs755892-А, а при обнаружении генотипа rs755892-G/G – низкий риск развития сахарного диабета 2 типа.