РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ С ДОМЕНАМИ CCN И СЛИТЫЕ БЕЛКИ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/475 C07K19/00 C12N15/62 C12N15/63 A61K38/18 A61K47/64 A61P35/00 A61P43/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным белкам, имеющим последовательность аминокислот, соответствующую или родственную домену гомологии к повторам тромбоспондина I типа (домен III) представителя семейства белков CCN, и их применению, в том числе, в частности, таким белкам, который усечены и/или содержат определенные модификации аминокислот. Кроме того, настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим последовательность аминокислот, соответствующую или родственную домену гомологии к повторам тромбоспондина I типа представителя семейства белков CCN, скомбинированную с партнером для слияния, необязательно посредством линкерного пептида. В частности, партнер для слияния представляет собой мономерный белок, и указанные слитые белки являются мономерными.

Также в настоящей заявке раскрыты новые устойчивые к протеазам Fc-фрагменты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Белки CCN представляют собой семейство секретируемых гликопротеинов. Изначально для обозначения CCN была выбрана аббревиатура, происходящая от первых трех идентифицированных представителей указанного семейства генов; Cyr61, CTGF и NOV. Однако недавно смысл указанной аббревиатура был адаптирован и теперь она представляет собой сокращение от «факторов сети клеточной коммуникации» («Cellular Communication Network»), ратифицированное Комитетом по номенклатуре генов HUGO (Perbal В, Tweedie S and Bruford E, J Cell Commun Signal. 2019 Sep; 13(3):435). Указанные белки часто классифицируют как матриклеточные белки, ассоциированные с внеклеточным матриксом (ВКМ). Белки CCN не участвуют в выполнении функций скаффолда, организующих клетки в ткани, а считаются сигнальными белками и могут функционировать в качестве независимых аутокринных или паракринных сигнальных факторов, или в качестве модификаторов других внеклеточных сигнальных белков. Наряду с группой из трех белков Wnt-индуцируемого сигнального пути (WISP1/CCN4, WISP2/CCN5 и WISP3/CCN6) они включают семейство из шести гомологичных богатых цистеином белков у млекопитающих, которые были переименованы в CCN1-6.

Исходные представители семейства CCN отличает общая модульная структура, где за N-концевым сигнальным пептидом для секреции следуют четыре консервативных домена. Первый домен демонстрирует гомологию последовательностей относительно связывающих инсулиноподобный фактор роста белков (IGFBP) и, соответственно, известен как гомологичный IGF-связывающим белкам домен, хотя он и имеет пренебрежимо малую аффинность к IGF. Второй домен известен как домен гомологии с повторами фактора фон Виллебранда типа С (VWC), часто встречающийся в белках внеклеточного матрикса (ВКМ). Третий домен известен как домен гомологии с повторами тромбоспондина типа I (TSP-1), который может быть вовлечен в прикрепление белков CCN к интегринам. Четвертый домен представляет собой богатый цистеином С-концевой повтор или домен гомологии к цистиновому узлу, домен, который, как сообщалось, связывает гепарин. Пятый представитель семейства белков CCN, WISP2 (белок Wnt1-индуцируемого сигнального пути 2), также известный как CCN5, атипичен, поскольку не содержит карбокси-концевого домена цистинового узла (домена 4). Домены гомологии с TSP-1 семейства белков CCN характеризуются 34% идентичности последовательностей аминокислот и 25% сходства последовательностей (по результатам анализа ClustalOmega, см. источник ниже). Четырехдоменные белки CCN содержат 38 консервативных остатка цистеина по длине первичной последовательности, за исключением CCN6, где 4 цистеина в домене гомологии к VWC не сохраняются относительно других представителей семейства. Также, в CCN5, где отсутствует карбоксиконцевой домен гомологии к цистиновому узлу, все цистеины доменов гомологии к IGFBP, VWC и TSP-1 консервативны относительно других представителей семейства CCN.

Неконсервативная чувствительная к протеазам центральная область, часто называемая шарнирной областью, рассекает белки на две половины. Экспрессия белков CCN регулируется на транскрипционном, посттранскрипционном и трансляционном уровнях в ответ на изменения стимулов среды.

Информацию относительно доменной организации семейства белков CCN можно найти, например, в источнике: Liu et al., 2017, Journal of Diabetes, 9, pp. 462-474.

На клеточном уровне белки CCN могут играть разнообразные регуляторные роли на границе внеклеточного матрикса и поверхности клеток. Белки CCN могут регулировать клеточную адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, выживание, старение и генную экспрессию. Модулируя один или более аспектов указанных клеточных функций специфичным для типа клеток способом, CCN координируют сложные биологические процессы, в том числе развитие сердечно-сосудистой и скелетной систем во время эмбриогенеза, а также воспаление, заживление ран, и повреждение и восстановление тканей у взрослых. В общем случае, 4-доменные CCN 1-4 и CCN6 (в частности, CCN1, CCN2 и CCN4) могут проявлять профибротическую активность, тогда как CCN5, который содержит только 3 домена I-III, обладает антифибротической активностью.

Белки CCN также вовлечены в разнообразные патологические состояния, такие как недостаточность органов в результате прогрессирующего фиброза, например, фиброза печени и идиопатического фиброза легких, и в инвазию и метастазирование рака. Соответствующую информацию можно найти в источнике: Jun and Lau, 2011, Nat. Rev. Drug. Discovery, 10(12), pp. 945-963. Также было показано, что, в общем случае, 4-доменные белки CCN, в частности, CCN2, вовлечены в механизмы различных фиброзных заболеваний, тогда как в доклинических моделях таких заболеваний, напротив, было показано, что повышенные уровни CCN5 могут быть благоприятными.

В источнике: et al., J. Biol. Chem, 293:46, pp. 17953-17970, сообщается, что фактор роста соединительной ткани (CTGF), также известный как CCN2, синтезируется и секретируется в виде неактивного препробелка, который требует протеолитического расщепления для высвобождения биологически активного CCN2, и что гомодимер С-концевого фрагмента, состоящий из доменов III-IV, представляет собой биологически полностью активную форму CCN2, и, наконец, что все основные описанные виды активности CCN2 могут быть воспроизведены гомодимером С-концевых фрагментов доменов III-IV. Анализы активности, описанные с соавторами, показывают, что ни непроцессированный полноразмерный CCN2, ни N-концевой фрагмент, состоящий из доменов I-II, не были биологически активными. Кроме того, было обнаружено, что протеолитический процессинг полноразмерного CCN2 в результате активности матриксной металл о протеиназы (ММР) высвобождал его латентную активность. В совокупности, данные, полученные с соавторами, подразумевают, что препро-CCN2 аутоингибируют N-концевые домены I и II. Было также обнаружено, что C-концевых доменов III и IV фрагмента CCN1 и CCN3 было достаточно для активации быстрой клеточной сигнализации и стимуляции физиологических ответов клеток. Однако неизвестно, в какой степени эндопептидазное расщепление шарнирной области CCN1 и/или CCN3, или любого другого представителя семейства белков CCN, необходимо для высвобождения биологической активности.

Известно, что CCN2 экспрессируется на высоком уровне в ходе развития, при различных патологических состояниях, включающих усиленный фиброгенез и фиброз тканей, и при некоторых видах рака (Jun and Lau, 2011, выше). Тот факт, что белки CCN вовлечены в широкий спектр патологических состояний, представляют собой внеклеточные белки, механистически вовлеченные в развитие фиброза, и демонстрируют ограниченную экспрессию в здоровых организмах, делает их привлекательными терапевтическими мишенями.

В источнике: Jeong et al., 2016, J. American College of Cardiology, 67: 13, pp. 1557-1568, описано исследование, направленное на изучение роли опосредованного аденоассоциированным вирусом переноса генов CCN5 в сердца мышей после экспериментально индуцированной перегрузки сердца давлением. В исследовании сделан вывод, что CCN5 может обращать вспять развившийся фиброз сердца за счет ингибирования образования и повышения апоптоза миофибробластов в миокарде, что позволяет предположить, что CCN5 может служить платформой для разработки средств терапии фиброза сердца.

В US 2008/0207489 раскрыт способ лечения расстройства, основанного на пролиферации гладких мышц, включающий экспрессию CCN5 или введение белка CCN5 в гладкомышечные клетки.

В ЕР 2556839 предложена композиция, содержащая генетический носитель, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую полноразмерный CCN5 или CCN2ACT, и высказано предположение о его роли в лечении сердечной недостаточности. CCN2ACT в ЕР 2556839 определен как последовательность аминокислот CCN2, усеченная после K251 (нумерация Uniprot).

Хотя было описано, что избыточная экспрессия CCN5 в некоторых экспериментальных системах приводит к фенотипу, противоположному наблюдаемому при избыточной экспрессии CCN2 (Jeong et al. выше, Yoon et al., J Mol Cell Cardiol, 49 (2), 294-303 Aug 2010), о прямом антагонизме CCN5 с четырехдоменными белками CCN5, насколько известно авторам настоящего изобретения, сообщений не было. В частности, структурная основа CCN5/WISP2-опосредованного антагонизма других представителей семейства CCN была неизвестна до исследования, представленного в настоящей заявке.

Авторы настоящего изобретения на более ранней стадии показали, что полноразмерный CCN2 (FL-CCN2) представляет собой препробелок, неактивный предшественник, и что фрагмент, содержащий домены III и IV, по-видимому, осуществляет все биологически релевантные виды активности CCN2. Остается неизвестным, в какой степени белки CCN, в целом, секретируются как неактивные препробелки, которые требуют протеолитической активации. Тем не менее чувствительность полноразмерных белков CCN к нескольким протеазам, как продемонстрировано авторами настоящего изобретения ( et al., J. Biol. Chem. (2018) 293(46) 17953-17970) и другими авторами (Butler, G.S. et al. Matrix Biol 59, 23-38 (2017) и Guillon-Munos, A. et al. J Biol Chem 286, 25505- 25518 (2011)), подразумевает, что немодифицированные полноразмерные белки CCN были бы крайне неподходящими для применения в качестве лекарственных средств по причинам стабильности, как в ходе производства рекомбинантного белка, так и после введения in vivo. Указанная непригодность для применения немодифицированных полноразмерных белков CCN в качестве терапевтических белков также относится к слитым белкам полноразмерных белков CCN, например, согласно описанию для полноразмерного CCN1 (Schutze, N. et al. (2005) Protein Expr Purif 42, 219-225) и полноразмерного CCN6 (Schutze, N. et al. (2007) BMC Cell Biol 8, 45). В области техники, относящейся к белкам CCN, хорошо известно, что чувствительность указанных белков к протеолизу является одной из причин, объясняющих значительную сложность получения рекомбинантных белков CCN. Кроме того, на основании новых данных, полученных с соавторами ( et al. J Biol Chem 2018; 293(46):17953-17970), рекомбинантные полноразмерные белки CCN могут быть далеко не идеальными биологическими лекарственными средствами, поскольку их активность может зависеть от предшествующего протеолитического процессинга, что делает фармакокинетику и фармакодинамику непредсказуемыми. Кроме того, в случае слитых белков с Fc наряду с протеолитической чувствительностью компонентов, например, пептидного линкера, CCN-фрагмента и Fc-фрагмента, была показана также важность расположения компонентов для эффективности и мощности рекомбинантных слитых белков. Один из подтверждающих это примеров описан в работе, опубликованной авторами настоящего изобретения ( et al. (2018)), где было обнаружено, что варианты слитых белков с Fc, содержащих домены III-IV CCN2, имеют активность, варьирующую в широком диапазоне и не являющуюся заранее легко предсказуемой.

Была описана чувствительность действий белков CCN к антагонизирующим эффектам высоких концентраций синтетических пептидов, происходящих из первичных последовательностей белков CCN. Одним из примеров является ингибирование фосфорилирования АКТ, стимулированного рекомбинантным CCN2 в фибробластах Rat2, пептидами, происходящими из домена I, домена гомологии к IGFBP, и в меньшей степени пептидами, происходящими из домена III, домена гомологии к повторам TSP-1, CCN2 (Мое et al., J. Cell Commun. Signal. (2013) 7:31-47). Другим примером является ингибирование стимулированной CCN2 (домен IV) адгезии жиронакапливающих клеток печени пептидом, происходящим из домена IV, домена гомологии к цистиновому узлу, из CCN2 (Gao R and Brigstock DR., J Biol Chem. 2004 Mar 5; 279(10):8848-55). Кроме того, сообщалось, что пептиды из домена III CCN1 (Leu et al. J. Biol. Chem, 2003, Vol. 278, NO: 36, Issue of September 5, pp. 33801-33808, 2003) и домена III CCN1, CCN2, CCN3, CCN5 и CCN6 (Karagiannis EG and Popel, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39 (2007) 2314 2323) оказывают некоторые анти-ангиогенные эффекты в анализах in vitro на клетках HUVEC (Leu et al. J. Biol. Chem, 2003, и Karagiannis EG and Popel, Int J Biochem Cell Biol 39 (2007)) и анти-адгезионные эффекты на 1064SK фибробласты крайней плоти человека (Leu et al. J. Biol. Chem, 2003), указанные пептиды содержат только один (Leu et al. J. Biol. Chem, 2003) или два (Karagiannis EG and Popel, Int J Biochem Cell Biol 39, 2007) из консервативных цистеинов, которые играют центральную роль в изобретении, описанном в настоящей заявке. Цистеины в домене III белков CCN, как известно, образуют дисульфидные мостики, как продемонстрировано для CCN2, эндогенно экспрессируемого клетками HUVEC (Lu, S et al. (2015) Nat methods 12, 329-331), и очищенного рекомбинантного CCN2 ( et al., J. Biol. Chem. 2018). Дисульфидные мостики, продемонстрированные для CCN2, захватывающие С199-С228 (нумерация Uniprot), обеспечивают комплексную трехмерную структуру, в которой аминокислотная цепь сворачивается с образованием складки. Это подразумевает, что нельзя ожидать воспроизведения полного домена III белка CCN короткими пептидами, которые структурно не ограничены дисульфидными мостиками между цистеинами, как в полном домене III белков CCN, продуцируемых в эукариотических системах. Кроме того, ингибирование активности CCN2 пептидами, происходящими из первичных последовательностей доменов I, III и IV, иллюстрирует отсутствие знаний в данной области относительно того, могут ли пептиды, происходящие из конкретного домена CCN2, обеспечивать способность к ингибированию четырехдоменным белкам CCN.

В настоящей работе авторы настоящего изобретения на основании структурно-функционального анализа белков семейства CCN и наблюдения, что CCN2 нуждается в протеолитическом процессинге, чтобы стать биологически активным, обнаружили, что биологически активная часть белка CCN5 представлена доменом III, доменом гомологии к повторам тромбоспондина типа I. Эти новые данные привели к получению биоактивных структур на основе домена III CCN5, а также домена III других представителей семейства белков CCN.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаруженная авторами настоящего изобретения взаимосвязь структуры и активности CCN5 и других белков CCN позволила получить новые биологически активные рекомбинантные белки, которые воспроизводят клеточную сигнализацию и физиологические функции клеток, приписываемые CCN-сигнализации, а также способные противодействовать другим четырехдоменным белкам CCN (Cyr61 (также известен как CCN1), CTGF (также известен как CCN2), NOV (также известен как CCN3), WISP1 (также известен как CCN4) и WISP3 (также известен как CCN6)). Другими словами, предложены белки, в том числе в форме слитых белков, на основе домена III, домена гомологии с TSP-1, белка CCN, которые воспроизводят или имеют биологическую активность CCN5, и способны антагонизировать или ингибировать эффекты 4-доменных белков CCN, CCN1-4 или CCN6. В частности, белки согласно настоящей заявке имеют антифибротическую активность и могут также осуществлять прямую противораковую активность.

Как отмечалось выше, было неожиданно обнаружено, что домен III (домен гомологии с TSP-1) других белков CCN, а именно, 4-доменных белков CCN, когда он представлен отдельным доменом в отсутствие других доменов CCN, достаточен для воспроизведения описанных видов активности CCN5. Соответственно, другими словами, домен III 4-доменных белков CCN, когда он представлен отдельным доменом в отсутствие других доменов CCN (т.е. в виде выделенного домена), имеет такую же активность, как и CCN5, или, говоря иначе, как домен III/домен гомологии с TSP-1 CNN5 (то есть активность, противоположную активности полноразмерных 4-доменных белков CCN). Соответственно, из экспериментов, раскрытых в указанной заявке, ясно, что выделенный домен гомологии с TSP-1 любого белка CCN может осуществлять ту же активность, что и домен гомологии с TSP-1 CCN5. За исключением CCN5, указанные виды активности могут быть иными, чем осуществляемые полноразмерным белком CCN.

Было обнаружено, что мономерные слитые белки, отличающиеся тем, что домен III белка CCN слит с мономерным партнером для слияния, обладают особенными преимуществами и полезностью в соответствии с настоящим изобретением и описанием в настоящей заявке.

В соответствии с первым аспектом в настоящем изобретении предложен мономерный слитый белок, содержащий:

(i) полипептид, соответствующий по меньшей мере части домена гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN;

(ii) мономерный партнер для слияния, слитый на N- или С-конце с последовательностью аминокислот по (i); и

(iii) необязательно, пептидный линкер между полипептидом по (i) и мономерным партнером для слияния по (ii),

где полипептид по (i) имеет длину от 40 до 60 аминокислот и содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 37 или 2 6, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6, причем все остатки цистеина в указанной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6, сохранены, а мономерный партнер для слияния по (ii) и пептидный линкер по (iii) не представляют собой или не содержат домен гомологии со связывающим IGF белком, домен гомологии с повторами фактора фон Виллебранда типа С или домен цистинового узла белка семейства CCN.

Как описано более подробно ниже, SEQ ID NO: 37 и 2-6 представляют усеченные фрагменты из 44 аминокислот домена III CCN5, CCN3, CCN2, CCN1, CCN4 и CCN6, соответственно, которые содержат 6 консервативных остатков цистеина указанного домена. В частности, указанные фрагменты фланкированы первым и последним остатками цистеина указанного домена. Было обнаружено, что такие фрагменты, в частности, эффективны и устойчивы к протеолитическому разложению.

Согласно варианту реализации полипептид по (i) содержит или состоит из:

(a) последовательности аминокислот, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 8-12; или

(b) последовательности аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 8-12; или

(c) части последовательности аминокислот по (а) или (b), отличающейся тем, что указанная часть содержит по меньшей мере последовательность из 44 аминокислот из SEQ ID NO: 37, 6, 2, 3, 4 или 5, соответственно, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37, 6, 2, 3, 4 или 5, соответственно.

SEQ ID NO: 1 и 8-12 представляют незначительно более длинные усеченные по N-концу фрагменты домена III CCN5, CCN6, CCN3, CCN2, CCN1 и CCN4, соответственно. Указанные фрагменты содержат соответствующие последовательности SEQ ID NO: 37, 6, 2, 3, 4 и 5, соответственно, с какой-либо дополнительной C-концевой последовательностью из соответствующего домена III.

Согласно дополнительному варианту реализации полипептид по (i) содержит остаток аланина в положении, соответствующем положению 2 указанной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6, или SEQ ID NO: 1 или 8-12. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность аминокислот по (i) содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 38 или 42 46, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную указанной. Согласно другому варианту реализации последовательность аминокислот по (i) содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 7, или 47-51, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную указанной. В этом отношении было обнаружено, что замена указанного остатка в положении 2 полезна для повышения стабильности белка.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения мономерный слитый белок имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84, 85, 88, 89, 97, 98, 102, 103, 106, 107, ПО, 111, или последовательность аминокислот, на 80% идентичную указанной.

Во вариантах реализации указанных аспектов мономерный партнер для слияния выбирают из сывороточного альбумина, трансферрина и мономерных Fc-фрагментов, в частности, мономерных Fc-фрагментов IgG, более конкретно - IgG человека.

Как отмечалось выше, замена положения 2 во фрагментах домена III согласно настоящему изобретению улучшает стабильность фрагмента, в частности, устойчивость к разложению протеазами. Считается и предполагается в настоящей заявке, что такие варианты фрагментов домена III с модифицированной последовательностью сами по себе являются полезными белками, без связывания с партнером для слияния.

Соответственно, согласно другому аспекту настоящего изобретения также предложен белок длиной от 40 до 60 аминокислот, который содержит последовательность, или белок, который состоит из последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 7, 38, 42 46, или 47-51, или последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной указанной, причем указанный белок содержит остаток аланина в положении, соответствующем положению 2 указанной последовательности из SEQ ID NO: 7, 38, 42-16, 47-51, и все остатки цистеина в указанной последовательности сохранены.

Другие белки и слитые белки также предложены в качестве дополнительных аспектов настоящих изобретений, согласно подробному описанию ниже.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретению предложен рекомбинантный белок, состоящий из формулы (I)

где

А представляет собой пептид формулы II

где А1 выбран из группы, состоящей из Р, А, V, I и L; А2 выбран из группы, состоящей из Е, D, A, I, L, и V; A3 выбран из группы, состоящей из G, Q, Y, S, N, W, F; А4 выбран из группы, состоящей из A, I, L, V, S, Т; А5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т, Y, N, G, Q и S; А6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А, V, I, L, Р, S, Е, D, К, R и Н; А7 представляет собой W; А8 выбран из группы, состоящей из G, Т, S, Q, Y, N, Р, А, V, I и L; А9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А, Р, L, I, V, Q; и

В представляет собой пептид формулы III

где В1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Y и Т; В2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из, Т, S, N, F, Q, Н, R и K; В3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Y, Т; при этом один из В1-В3 отсутствует; и

С представляет собой пептид формулы IV

где С1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Y и Т; С2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K, R, Н, М, Т, S, A, L, I и V; С3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Y и Т; С4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, F, A, I, L, V и W; С5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Т, Y, A, I, L и V; С6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S и Т; С7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, R и L; С8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, L, I, и V; С9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Т и Y; С10 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Т, Y (предпочтительно N); С11 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, Р, A, I, L, G, Q, N, S, Т, Y, R, K, D и Е; С12 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Y и Т; С13 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, K, R, A, L, I, V, Р, G, Q, N, S, Y и Т; С14 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, Р, W, G, Q, N, S, Y, Т, Е и D; и

D представляет собой пептид формулы V

где D1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из R, K, Н, D, Е, W, Р; D2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Р, А, L, I, V, М, W, D и Е; D3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, Е, A, L, I, V, R, K и Н; D4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, S, Y, Т, R, L, K и Н; D5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из G, Q, N, S, Y, Т, D и Е; D6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, R; K, G, Q, N, S, Y и Т; D7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, Н и R; D8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, L, I и V; и

Е представляет собой пептид формулы VI

отличающийся тем, что Е1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Р, A, L, I, V, М, W, G, Q, N, S, Т, Y, D и Е; Е2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из; Р, A, L, I, V, М, W, G, Q, N, S, Т, Y; Е3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из, R, K, Н, G, Q, N, S, Т и Y; Е4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Р, A, L, I и V; F отсутствует или представляет собой последовательность аминокислот длиной до приблизительно 13 аминокислот,

где рекомбинантный белок содержит от 40 до 60 аминокислот.

В соответствии с одним вариантом реализации вышеописанного аспекта предложен рекомбинантный белок формулы (I), отличающийся тем, что

А1 выбран из группы, состоящей из Р, I и L; А2 выбран из группы, состоящей из Е, V, и А; A3 выбран из группы, состоящей из W, Q, и Y; А4 выбран из группы, состоящей из S, Т, и А; А5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т и S; А6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А, Е, Р, S и K; А7 представляет собой W; А8 выбран из группы, состоящей из G, S и Т; А9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Р, Q и А; и

В1 представляет собой серии (S); В2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т, K и R; В3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т и S; и

С1 представляет собой аминокислоту G; С2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т, L и М; С3 представляет собой G; С4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М, F, I и V; С5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из S и А; С6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т и N; С7 представляет собой R; С8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, и I; С9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из S и Т; С10 представляет собой аспарагин N; С11 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Q, R, D, V и Е; С12 представляет собой аспарагин N; С13 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из R, А, Р, и S; С14 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, Q, S, Е и N; и

D1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из R, Е и W; D2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, М и Р; D3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, L, V и R; D4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Т, K и Q; D5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Q и Е; D6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из R, Т, S и K; D7 представляет собой аргинин (R); D8 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L и I; и

Е1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, М, Е, N и Y; Е2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из; S, V, L и I; Е3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из, Q и R; Е4 представляет собой Р; F отсутствует или представляет собой пептид длиной до 13 аминокислот и содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из PPSRGRSPQNSAF, GQPVYSSL, EADLEEN, EQEPEQPTD, DVDIHTLI и DSNILKTIKIP,

где рекомбинантный белок содержит в общей сложности от 44 до 57 аминокислот.

В соответствии с еще одним вариантом реализации вышеописанного аспекта предложен рекомбинантный белок формулы I, где F полностью отсутствует, частично отсутствует, или представляет собой пептид длиной приблизительно 13 аминокислот, содержащий последовательность аминокислот PPSRGRSPQNSAF.

Более конкретно, предложен рекомбинантный белок, отличающийся тем, что указанный белок содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; и ее фрагменты или варианты с более чем 50% идентичностью последовательностей последовательностям аминокислот SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены рекомбинантные белки согласно определению выше, отличающиеся тем, что указанный белок пегилирован.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен слитый белок, содержащий

(i) домен гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN;

(ii) партнер для слияния слит на N- или С-конце с доменом гомологии к повторам TSP-1 по (i), при этом указанный партнер для слияния выбран из группы, состоящей из сывороточного альбумина, трансферрина и Fc-фрагмента IgG человека;

(iii) необязательно, пептидный линкер между доменом гомологии к повторам TSP-1 и Fc-фрагментом (слитый на N- или С-конце с доменом гомологии к повторам TSP-1 по (i)).

В соответствии с вариантом реализации вышеописанного аспекта предложены слитые белки, содержащие рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением согласно описанию выше, в качестве дополнительного аспекта настоящего изобретения.

Партнер для слияния слитого белка согласно настоящему изобретению соответствует одному из вариантов реализации, выбранных из группы, состоящей из Fc-фрагментом IgG1, IgG2 или IgG4, сывороточного альбумина и трансферрина.

В соответствии с дополнительным вариантом реализации предложен слитый белок, отличающийся тем, что партнер для слияния (ii) представляет собой Fc-фрагмент IgG1, IgG2 или IgG4, содержащий стабилизирующий дисульфидный мостик. Такие мутации могут повышать термическую стабильность белка. Стабилизирующие мутации известны и были описаны в данной области техники.

В соответствии с еще одним дополнительным вариантом реализации предложен слитый белок, отличающийся тем, что партнер для слияния (ii) представляет собой Fc-фрагмент IgG1, IgG2 или IgG4, содержащий одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из S228P (относится к IgG4), Е233Р (относится к IgG1 и IgG4), F234A (относится к IgG4), L234A (относится к IgG1), L234V (относится к IgG1), F234V (относится к IgG4), L235A (относится к IgG1 и IgG4), AG236 (относится к IgG1 и IgG4) и ΔK447 (относится к IgG1, IgG2 и IgG4).

Согласно другому варианту реализации слитый белок может содержать Fc-фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

Согласно другому варианту реализации слитый белок содержит линкер, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 39.

В соответствии с одним вариантом реализации указанный линкер содержит последовательность аминокислот (EAAAK)n, где n равен по меньшей мере 4, предпочтительно n равен 8.

Согласно другому варианту реализации указанный слитый белок содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41.

Согласно другому варианту реализации указанный партнер для слияния по (ii) представляет собой сывороточный альбумин.

В соответствии с другим вариантом реализации второго аспекта настоящего изобретения партнер для слияния по (ii) представляет собой трансферрин.

Также согласно настоящему изобретению, в соответствии с еще одним дополнительным аспектом, предложена молекула нуклеиновой кислоты (например, ДНК), кодирующая рекомбинантный белок, белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с одним вариантом реализации указанного аспекта предложена последовательность ДНК, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 86, 87, 90, 91, 99, 100, 104, 105, 108, 109, 112 или 113, и последовательностях нуклеиновых кислот, приблизительно на 80% идентичных SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 86, 87, 90, 91, 99, 100, 104, 105, 108, 109, 112 или 113.

Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен экспрессионный вектор, содержащий последовательность ДНК в соответствии с настоящим изобретением. Также предложена клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор в соответствии с настоящим изобретением.

Наконец, предложен домен гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN, белок и слитый белок согласно определению выше для применения в качестве медикамента для лечения или предотвращения расстройств путем ингибирования или противодействия клеточной сигнализации и физиологических функций клетки, приписываемым четырехдоменным белкам семейства CCN.

Согласно одному аспекту предложен слитый белок или белок согласно определению в настоящей заявке для применения в терапии.

Указанный слитый белок или белок может быть предназначен для применения при лечении состояния, ассоциированного с активностью 4-доменного белка CCN, в частности, нежелательной или аберрантной активности 4-доменного белка CCN. Указанная активность может быть ассоциирована с фибротическим эффектом. Указанная активность может представлять собой профибротическую активность.

Согласно другому аспекту предложен слитый белок или белок согласно определению в настоящей заявке для применения при лечении или предотвращении фиброза, или любого состояния, при котором наблюдается фиброз (т.е. фибротического состояния или заболевания). Согласно дополнительному аспекту предложен слитый белок или белок согласно определению в настоящей заявке для применения при лечении рака. Также предложен слитый белок или белок согласно определению в настоящей заявке для применения при лечении воспалительных или аутоиммунных заболеваний, или метаболических заболеваний.

Также в соответствии с такими аспектами настоящего изобретения предложено применение белка или слитого белка согласно определению в настоящей заявке для изготовления медикамента для лечения или предотвращения состояния или заболевания согласно определению или описанию в настоящей заявке.

Такие аспекты также включают композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую белок или слитый белок согласно определению в настоящей заявке для применения при лечении или предотвращении состояния или заболевания согласно определению или описанию в настоящей заявке.

Такие аспекты также включают способ лечения или предотвращения состояния или заболевания согласно определению или описанию в настоящей заявке, отличающийся тем, что указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту белка или слитого белка согласно определению в настоящей заявке, в частности, эффективного количества указанного белка или слитого белка.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показаны клеточные физиологические процессы и клеточная сигнализация CCN5(dIII)-Fcv2 (вариант реализации настоящего изобретения согласно определенному в последовательности SEQ ID NO: 28).

A) показано, что слитый белок CCN5(dIII)-Fcv2 из SEQ ID NO: 28 вызывает зависимое от концентрации ингибирование фосфорилирования АКТ (серин-473) в клетках рака легкого А549.

B) показано, что слитый белок CCN5(dIII)-Fcv2 из SEQ ID. NO: 28 ингибирует пролиферацию линии клеток фибробластов легкого человека, IMR90.

C) показано, что слитый белок CCN5(dIII)-Fcv2 из SEQ ID NO: 28 ингибирует сферообразующую способность (независимый от подложки рост) линии положительных по рецептору эстрогена рака молочной железы клеток MCF-7 и линии клеток рака молочной железы с тройным негативным фенотипом MDA-MB-231.

D) показано, что слитый белок CCN5(dIII)-Fcv2 из SEQ ID NO: 28 дозозависимо ингибирует индуцированную ТФР-β SMAD репортерную активность (белки SMAD представляют собой канонические регулируемые ТФР-β транскрипционные факторы).

Все планки погрешностей отражают SD. Статистическая значимость вычислена с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным тестом Даннета (р<0,05 отмечено символом *).

На Фиг. 2 показан эффект разных вариантов шарнирной области Fc-фрагмента на чувствительность к протеазе вариантов реализации настоящего изобретения, где CCN5(dIII) слит с Fc-фрагментом IgG, когда тестируемый слитый белок содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, соответственно, см. Пример 6 ниже.

На Фиг. 3 показана склонность к агрегации варианта реализации настоящего изобретения в зависимости от структуры пептидного линкера, соединяющего CCN5(dIII) с Fc-фрагментом IgG, когда тестируемый слитый белок содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31.

На Фиг. 4 показан слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, содержащий домен гомологии к повторам TSP-1, который соединен на С-конце с пептидным линкером, и соединен посредством Fc-шарнира с Fc-фрагментом.

На Фиг. 5 показана сниженная чувствительность к расщеплению эндопептидазой в том случае, когда вариант реализации настоящего изобретения содержит мутацию пролин-195 домена гомологии к повторам TSP-1 CCN5, представленного в SEQ ID NO: 7 (Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A, SEQ ID NO: 41), относительно варианта P195 дикого типа домена гомологии к повторам TSP-1 CCN5 (Fc-HLn8-CCN5(dIII), SEQ ID NO: 40).

На Фиг. 6 показано получение белка, соответствующего SEQ ID NO: 58, очищенного путем хроматографии с захватом на белке А. Видно, что в отсутствие восстанавливающего агента бета-меркаптоэтанола присутствует димер ((-) дорожка). Однако в присутствии бета-меркаптоэтанола ((+) дорожка), как можно видеть, первичный продукт представляет собой фрагмент после расщепления, состоящий только из Fc-фрагмента, а не интактный слитый белок, содержащий все части, кодируемые SEQ ID NO: 58 (домен гомологии с TSP-1 фрагмент, пептидный линкер и Fc-фрагмент).

На Фиг. 7 показано получение белка, соответствующего SEQ ID NO: 27, имеющего усеченную C-концевую часть, очищенного путем хроматографии с захватом на белке А. Видно, что указанный белок значимо более устойчив к разложению протеазой, чем белок, соответствующий SEQ ID NO: 58, который включает C-концевую часть.

На Фиг. 8 показано получение белка, соответствующего SEQ ID NO: 73, аналогичного белку, соответствующему SEQ ID NO: 27, очищенного путем хроматографии с захватом на белке А. В этом случае также, как можно видеть, в присутствии бета-меркаптоэтанола ((+) дорожка) указанный белок более устойчив к разложению протеазой, чем белок, соответствующий SEQ ID NO: 58.

На Фиг. 9 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT (Ser-473) в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белка, соответствующего SEQ ID NO: 41, продуцируемого в стабильно трансфицированных клетках. Видно, что указанный белок не демонстрирует ингибирования фосфорилирования AKT.

На Фиг. 10 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT (Ser-473) в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белка, соответствующего SEQ ID NO: 80, продуцируемого в стабильно трансфицированных клетках. Видно, что указанный белок не демонстрирует значимого ингибирования фосфорилирования AKT и, фактически, даже может приводить к повышению уровня фосфо-AKT при более высокой концентрации.

На Фиг. 11 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT (Ser-473) в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белка, соответствующего SEQ ID NO: 80, продуцируемого в транзиентно трансфицированных клетках. Можно видеть, что при продуцировании в транзиентно трансфицированных клетках указанный белок характеризуется зависимой от концентрации ингибиторной активностью в отношении фосфорилирования AKT.

На Фиг. 12 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT (Ser-473) в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белков, соответствующих SEQ ID NO: 84, 94 и 106. Видно, что каждый из указанных белков характеризуется зависимой от концентрации ингибиторной активностью в отношении фосфорилирования AKT.

На Фиг. 13 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT (Ser-473) в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белка, соответствующего SEQ ID NO: 88. Видно, что указанный белок способен ингибировать фосфорилирование АКТ в концентрациях выше 10 мкг/мл.

На Фиг. 14 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT (Ser-473) в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белков, соответствующих SEQ ID NO: 102 и 97. Видно, что оба белка характеризуются зависимой от концентрации ингибиторной активностью в отношении фосфорилирования AKT.

На Фиг. 15 представлены результаты анализа для измерения уровней фосфо-AKT в клетках рака легкого А549 после введения варьирующих концентраций белка, соответствующего SEQ ID NO: 110. Видно, что указанный белок характеризуется зависимой от концентрации ингибиторной активностью в отношении фосфорилирования AKT.

На Фиг. 16 представлены результаты ряда экспериментов, включающих белок, соответствующий SEQ ID NO: 106.

A) показывает, что указанный белок ингибирует миграцию фибробластов легких человека, индуцированную как ТФР-бета, так и CCN2.

B) показывает, что указанный белок ингибирует зарастание царапины, индуцированное как ТФР-бета, так и CCN2.

C) показывает, что указанный белок обеспечивает частичное ингибирование индукции ТФР-бета экспрессии гена COL1A1, который, как известно, является профибротическим.

D) показывает, что указанный белок обеспечивает частичное ингибирование индукции ТФР-бета экспрессии гена FN1, который, как известно, является профибротическим.

E) показывает, что указанный белок обеспечивает частичное ингибирование индукции ТФР-бета экспрессии гена АСТА2, который, как известно, является профибротическим.

F) показывает, что указанный белок обеспечивает частичное ингибирование индукции ТФР-бета экспрессии гена CCN2, который, как известно, является профибротическим.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, как уже упоминалось, основано на неожиданном открытии того, что домен гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) CCN5 представляет собой полностью активную структуру, обеспечивающую функции клеточной сигнализации CCN5/WISP2. На основании указанных новых данных относительно активности домена гомологии к повторам TSP-1 CCN5 авторы настоящего изобретения предлагают белки, рекомбинантные белки и слитые белки в соответствии с настоящим изобретением, которые могут быть использованы для ингибирования или противодействия клеточной сигнализации и физиологическим функциям клетки, приписываемым четырехдоменным белкам CCN, т.е. CCN1, CCN2, CCN3, CCN4 и CCN6. Указанные новые данные, как считается, предположительно, критически важны для обеспечения формирования стабильной, гомогенной лекарствоподобной молекулы на основе CCN5, поскольку ранее не было установлено, какая часть полноразмерного CCN5 необходима для воспроизведения активности CCN5, и поскольку полноразмерные молекулы CCN очень восприимчивы к протеолизу и их трудно получить в активном гомогенном виде. Кроме того, эти данные, подразумевающие, что конкретная часть CCN5 может быть достаточной для воспроизводства активности, наблюдаемой, например, при транзиентной сверхэкспрессии полноразмерного белка, также противоречат преобладающему в данной области мнению, что белки CCN функционируют как матриклеточные белки. Преобладающее мнение о механизме действия белков CCN и матриклеточных белков в целом заключается в том, что разные сегменты белков CCN взаимодействует с различными другими белками ВКМ и рецепторами клеточной поверхности, таким образом, модулируя их активность, а не работают как прямые модуляторы клеточной сигнализации. Новая информация об активности домена гомологии к повторам TSP-1 CCN5, а также информация о структурной близости с другими представителями семейства белков CCN предполагает, что и домены гомологии к повторам TSP-1 других белков семейства CCN могут также быть использованы для ингибирования функций клеточной сигнализации четырехдоменных белков семейства CCN. Согласно одному аспекту рекомбинантные белки и слитые белки согласно настоящему изобретению ингибируют фосфорилирование АКТ (Ser473) в клетках А549.

Ингибирование указанной клеточной сигнализации имеет значение при лечении различных расстройств. CCN2, например, вовлечен в ряд заболеваний, в частности, заболеваний, при которых усиленный фиброгенез и тканевой фиброз представляют собой характерный патофизиологический признак.

Например, было показано, что избыточная экспрессия CCN2 сама по себе достаточна для индуцирования фиброза в легком (см. Sonnylal et el., Arthritis Rheum 62, 1523-1532 (2010)). Также было обнаружено, что CCN2 необходим для индуцированного блеомицином фиброза легких (Bonniaud, P. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 31, 510-516 (2004)), радиационно-индуцированного фиброза легких (Bickelhaupt, S. et al. J Natl Cancer Inst 109 (2017) и фиброза легких в результате утраты экспрессии PTEN (гомолога фосфатазы и тензина) (Parapuram, S.K. et al. Matrix Biol 43, 35-41 (2015)). Кроме того, было обнаружено, что в отсутствие других стимулирующих агентов CCN2 индуцирует фиброз легких при экспрессии и секреции легочными клетками Клара (Wu, S. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 42, 552-563 (2010)), альвеолярными эпителиальными клетками II типа (Chen, S. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 300, L330-340), при экспрессии со специфичного для фибробластов промотора (Sonnylal et al (2010), выше, Sonnylal, S. et al., J Cell Sci 126, 2164-2175 (2013)) или доставке аденовирусом (Bonniaud, P. et al., Am J Respir Crit Care Med 168, 770-778 (2003)). Соответственно, все имеющиеся сообщения подтверждают вывод о том, что CCN2 не только достаточен для стимуляции фиброза в коже или легком, однако также необходим для полного фиброзного фенотипа в нескольких моделях заболеваний. Фиброз легких представляет собой признак заболевания человека идиопатического фиброза легких (ИФЛ), однако это также возникает при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) (Jang, J.H. et al., COPD 14, 228-237 (2017)) и системном склерозе. На самом деле фиброз легких регистрируется как первичная причина смерти до 40% пациентов с системным склерозом (Tyndall AJ et al., Ann Rheum Dis. 2010 Oct; 69(10):1809-15). Показано, что CCN2 и другие белки CCN, такие как WISP1, также вовлечены в патофизиологию ИФЛ (Konigshoff, М. et al., J Clin Invest 119, 772-787 (2009) и ХОБЛ (Jang et al, выше) у пациентов-людей.

Другой пример представлен неопластическими расстройствами. Например, в условиях рака молочной железы CCN2, как было показано, вносит вклад в метастазирование в кости в модели рака молочной железы с тройным негативным фенотипом (MDA-MB-231) (Kang, Y. et al., Cancer Cell 3, 537-549 (2003)). Кроме того, нокдаун CCN2 в клетках рака молочной железы с тройным негативным фенотипом (MDA-MB-231), линии клеток, которая экспрессирует высокие уровни CCN2 (Chen, P.S. et al., J Cell Sci 120, 2053-2065 (2007)), снижал способность указанных клеток к миграции, тогда как избыточная экспрессия CCN2 в положительных по рецепторам гормона клетках линии рака молочной железы MCF-7, при низкой эндогенной экспрессии CCN2 (Chen et al., выше), повышала способность последних к миграции (Chen et al., выше, Chien, W. et al., Int J Oncol 38, 1741-1747 (2011)). В более позднем отчете также было описано, что избыточная экспрессия CCN2 в клетках MCF-7 увеличивает хеморезистентность, тогда как нокдаун CCN2 в клетках MDA-MB-231 снижает хеморезистентность (Wang, M.Y. et al., Cancer Res 69, 3482-3491 (2009)). Сообщалось также об увеличении хеморезистентности, вызываемой CCN2, других клеток рака молочной железы (Lai, D et al., Cancer Res 71, 2728-2738 (2011)). Кроме того, с помощью исследований сверхэкспрессии или нокдауна было также показано, что CCN2 вносит вклад в эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) и увеличивает способность к независимому от подложки росту (образованию маммосфер) клеток рака молочной железы (Chen et al., выше, Zhu, X. et al., Oncotarget 6, 25320-25338 (2015)). Обнаружение как повышенной хеморезистентности, так и усиления ЕМТ, индуцируемых CCN2, согласуется со связью, установленной между ЕМТ и хеморезистентностью и при других типах рака (Fischer, K.R. et al., Nature 527, 472-476 (2015), Zheng, X. et al., Nature 527, 525-530 (2015)).

Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения предложен мономерный слитый белок согласно определению выше, содержащий полипептид, соответствующий по меньшей мере части домена гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN, причем последовательность указанного домен гомологии с TSP-1 может быть усечена и/или модифицирована, однако при этом остатки цистеина указанного домена сохранены. Указанный полипептид для удобства может быть назван в настоящей заявке «полипептидом TSP-1», и указанный термин, соответственно, следует понимать как не обуславливающий или не подразумевающий каких-либо ограничений до исключительно конкретной природной последовательности домена гомологии с TSP-1. Термин «полипептид TSP-1» может использоваться как синоним или взаимозаменяемо с «белком домена TSP-1» или «последовательностью домена TSP-1».

Как продемонстрировано в приведенных ниже примерах, неожиданным образом было обнаружено, что мономерные партнеры для слияния предпочтительнее для получения активных и стабильных белков по сравнению с димерными партнерами для слияния, такими как Fc-фрагменты, происходящие из IgG-белков, которые формируют димерные слитые белки. Мономерные слитые белки сохраняют активность полипептида домена TSP-1, который они содержат. Кроме того, указанные белки стабильны, в том числе применительно к протеолитическому разложению. Как подробнее описано ниже, устойчивость к протеолитическому разложению может быть повышена путем введения модификаций в последовательность аминокислот полипептида TSP-1, в том числе, в частности, замены Ala, упомянутой выше.

Соответственно, полипептид компонента (i) слитого белка может содержать инсерции, делеции, замены, мутации или любую их комбинацию относительно указанной последовательности SEQ ID NO: 37 или 2-6, или последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 8 12, при условии, что полипептид сохраняет по меньшей мере 80% идентичности последовательностей указанной последовательности, и все остатки цистеина в указанной последовательности сохранены.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен белок (например, рекомбинантный белок), который состоит из полипептида или содержит полипептид, соответствующий по меньшей мере части домена гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN, но не в контексте слитого белка, где последовательность домена TSP-1 может быть усечена и/или модифицирована и содержит замену Ala в положении, соответствующем положению 2 SEQ ID NO: 37 или 2-6, или SEQ ID NO: 1 или 8-12, однако при этом остатки цистеина указанного домена сохранены. Иными словами, белок домена TSP-1 может быть предоставлен без другого компонента, такого как партнер для слияния, или независимо от него. Соответственно, белок домена TSP-1 не сливают или не соединяют с другим белковым доменом или компонентом, или другой функциональной или структурной последовательностью белка. Для удобства такие белки могут называться «белками с заменой на Ala».

В настоящей заявке термин «консервативный» означает, что остаток в определенной последовательности не делетирован или не заменен. Иными словами, термин «консервативный» используется как синоним (и взаимозаменяемо) с термином «сохраненный». Он просто означает, что остатки цистеина не удалены из последовательности. Соответственно, в описанном выше контексте это означает, что остатки цистеина в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6 или 1 или 8-12, не делетированы и не удалены. Отметим, что инсерция дополнительных остатков между консервативными остатками (например, между консервативными остатками цистеина) или делеция неконсервативных остатков (например, остатков, не являющихся цистеином) может изменять положение консервативных остатков в последовательности полипептида относительно их положения в исходной референсной последовательности (например, последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6). Однако такие остатки все же считают «консервативными» согласно определению в настоящей заявке. Соответственно, термин «консервативный» не подразумевает какого-либо сужения или ограничения положения (или, более конкретно, номера положения) остатков цистеина.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид по (i) содержит или состоит из:

(а) последовательности аминокислот, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 8-12; или

b) последовательности аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 8-12; или

c) части последовательности аминокислот по (а) или (b), отличающейся тем, что указанная часть содержит по меньшей мере последовательность из 44 аминокислот из SEQ ID NO: 37, 6, 2, 3, 4 или 5, соответственно, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37, 6, 2, 3, 4 или 5, соответственно.

Как отмечалось выше, мономерный партнер для слияния по (ii) и пептидный линкер по (iii) не представляют собой домен или не содержат домена гомологии со связывающим IGF белком, домена гомологии с повторами фактора фон Виллебранда типа С или домена цистинового узла белка семейства CCN. Иными словами, единственный домен белка семейства CCN, который может присутствовать в слитом белке согласно настоящему изобретению, представляет собой домен гомологии с TSP-1.

Сходным и аналогичным образом, в контексте белков с заменой на Ala, которые не являются слитыми белками, указанный белок не содержит каких-либо других доменов CCN (помимо белка домена TSP-1).

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид по (i) или белок с заменой на Ala, может содержать только часть домена гомологии с TSP-1 согласно определению выше. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что минимальный требуемый фрагмент домена TSP-1 представлен последовательностью из 44 аминокислот из SEQ ID NO: 37, 6, 2, 3, 4 или 5. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации длина полипептида по (i) составляет по меньшей мере 44 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид по (i) имеет длину от 44 до 57 аминокислот. Однако, как отмечалось выше, в минимальном фрагменте из 44 аминокислот может присутствовать одна или более делеций аминокислот, которые расположены между остатками цистеина. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации длина полипептида TSP-1 может составлять менее 44 остатков, т.е. 40-43 остатка.

Согласно некоторым вариантам реализации полипептид по (i) состоит из последовательности аминокислот, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2-6.

Согласно описанию выше, белки согласно настоящему изобретению, в том числе слитые белки, проявляют (или, другими словами, демонстрируют или имеют) активность CCN5, более конкретно - биологическую активность CCN5. Согласно варианту реализации указанные белки могут сохранять, или проявлять, или иметь активность домена гомологии с TSP-1 CCN5. Как вариант, указанные белки могут быть определены как проявляющие (или демонстрирующие, или имеющие) активность, в частности, биологическую активность выделенного домена гомологии с TSP-1 белка CCN. Сказанное выше может относиться к любой активности указанного домена, а также к конкретным видам активности, отражающим антифибротический эффект указанного домена гомологии с TSP-1. Такая активность может быть проанализирована (или протестирована, или детектирована) с применением любого удобного анализа или способа на основе любого конкретного биологического эффекта указанного домена.

Отметим, что активность определенного белка может удобным образом быть оценена путем анализа эффекта белка на фосфорилирование AKT. В частности, определенный белок может быть проанализирован на способность ингибировать фосфорилирование AKT (Ser-473) в клетках рака легкого человека А549, согласно описанию в Примере 2. Специалисту будет понятно, что другие аналогичные анализы могут быть разработаны для оценки этой же активности или для оценки других родственных видов антифибротической активности.

Как отмечалось выше, согласно другим аспектам настоящего изобретения предложены рекомбинантные белки, которые ингибируют или противодействуют клеточной сигнализации и физиологическим функциям клетки, приписываемым четырехдоменным белкам CCN, содержащие последовательность аминокислот в соответствии с приведенной выше формулой I.

где А, В, С, D, Е и F соответствуют определению выше и в прилагаемой формуле изобретения.

Формула I представляет собой результат выравнивания домена гомологии к повторам TSP-1 структурно родственных белков семейства CCN (CCN 1 - CCN6), все из которых содержат 6 консервативных остатков цистеина, с учетом того, что аминокислоты могут быть заменены так, чтобы это не влияло на активность указанного белка (консервативные замены, как подробнее обсуждается ниже). Положение первого консервативного остатка цистеина домена гомологии к повторам TSP1 других белков CCN определяют как положение №1 рекомбинантного белка формулы I.

Пять сегментов между консервативными цистеинами обозначены как А, В, С, D и Е, соответственно.

Первый сегмент А определяет формула где А1-А9 соответствует определению выше. Аминокислота в положении №7 (А7) сегмента А представляет собой триптофан (W) у всех представителей семейства белков CCN и считается консервативной.

Второй сегмент В определяет формула В1-В2-В3, где В1-В3 соответствует определению выше. В соответствии с одним вариантом реализации В1 и В3 представляет собой либо серии, либо треонин.

Третий сегмент С определяет формула где аминокислоты С1-С14 соответствуют определению выше. В соответствии с одним вариантом реализации аминокислоты С1 и С3 представляют собой глицин (G).

Согласно другому варианту реализации С7 представляет собой аргинин (R), оба из С10 и С12 представляют собой аспарагин (N).

Четвертый сегмент D определяет формула где аминокислоты D1-D8 соответствуют определению выше. В соответствии с одним вариантом реализации D7 представляет собой аргинин (R).

Пятый сегмент Е определяет формула где аминокислоты Е1-Е4 соответствуют определению выше. В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения Е4 представляет собой пролин.

После последнего остатка цистеина расположен карбоксиконцевой пептидный сегмент вариабельной длины (F), содержащий от 0 до 13 аминокислот.

F может быть делетирован или укорочен по сравнению с последовательностями аминокислот домена гомологии к повторам TSP-1 семейства белков CCN. В соответствии с одним вариантом реализации F отсутствует. Согласно другому варианту реализации F состоит из пептида, выбранного из группы, состоящей из PPSRGRSPQNSAF, GQPVYSSL, EADLEEN, EQEPEQPTD, DVDIHTLI и DSNILKTIKIP. В соответствии с одним аспектом указанного варианта реализации рекомбинантные белки могут принимать форму последовательности аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 8-12.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены рекомбинантные белки, содержащие последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; и их фрагментов или вариантов по меньшей мере с 50% идентичностью последовательностей последовательностям аминокислот SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38.

Согласно одному аспекту предложен рекомбинантный белок, состоящий из последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38; и их фрагментов или вариантов с более чем 50% идентичностью последовательностей последовательностям аминокислот SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38.

«Рекомбинантные белки» в настоящей заявке представляют собой белки, кодируемые рекомбинантными нуклеиновыми кислотами. Они экспрессируются с рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетке-хозяине как подробнее описано ниже.

«Рекомбинантная нуклеиновая кислота» в настоящей заявке описывает молекулу нуклеиновой кислоты, которая, ввиду происхождения или в результате манипуляций, не связана с полным полинуклеотидом или с частью полинуклеотида, с которым связана в природе, и/или соединена не с тем полинуклеотидом, с которым соединена в природе, как подробнее описано ниже.

Специалисту будет понятно, что может быть введена модификация последовательности аминокислот рекомбинантных белков и слитых белков в соответствии с настоящим изобретением без изменения активности указанного белка. Аминокислоты обычно классифицируют как гидрофобные или гидрофильные и/или имеющие полярные или неполярные боковые цепи. Замены одной аминокислоты на другую, имеющую те же биохимические характеристики, общеизвестны как консервативные замены.

Консервативные замены аминокислот включают взаимные замены аминокислот внутри следующих групп:

• MILV

• FYW

• KRH

• AG

• ST

• QN

• ED

Обычно «консервативная замена аминокислоты» относится к замене аминокислоты, которая не изменяет характеристик относительного заряда или размера белка, в котором осуществляют замену аминокислоты, и, соответственно, редко изменяет структуру белка, поэтому биологическая активность также значимо не изменяется.

Специалисту будет понятно, что биологическая активность белка также может быть сохранена, если одна или несколько аминокислот делетированы, инсертированы или добавлены к последовательности аминокислот, при условии сохранения структурных и физико-химических свойств.

Символ «Δ» в настоящей заявке перед аминокислотой относится к делеции указанной аминокислоты, например, ΔК447 следует понимать как белок, в котором отсутствует К447. Также в настоящей заявке делецию конкретной аминокислоты, как вариант, обозначают символом «-», например, К447- также следует понимать как белок, в котором отсутствует К447.

Соответственно, следует понимать, что настоящим изобретением охвачены рекомбинантные белки и слитые белки согласно описанию в прилагаемой формуле изобретения, в которые могут быть введены такие модификации согласно описанию выше (замены, делеции, инсерции и добавления аминокислот) по существу без изменения их биологической активности, т.е. способности ингибировать или противодействовать клеточной сигнализации и физиологическим функциям клетки, приписываемым четырехдоменным белкам семейства CCN; CCN1, CCN2, CCN3, CCN4 и CCN6.

В настоящем описании упоминаются последовательности аминокислот. В настоящем описании применительно к последовательностям аминокислот иногда упоминается модификация рассматриваемой последовательности аминокислот или белка со ссылкой на «нумерацию Uniprot» или Eu-нумерацию. Нумерация Uniprot относится к нумерации, используемой в базе данных Uniprot (Uniprot Consortium, Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8;47(D1):D506-D515). Нумерацию Uniprot используют для нумерации аминокислот белков CCN. Eu-нумерация относится к нумерации антитела Eu (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85), и ее используют в отношении аминокислот в Fc-фрагментах подклассов IgG человека с мутациями или без мутаций, или химерах, отличных от дикого типа. Система нумерации Ей доступна, например, в международной информационной системе iMMunoGeneTics (IMGT) ресурса IMGT Scientific chart. Система IMGT описана в источнике: Lefranc М-Р, Biomolecules. 2014 Dec; 4(4): 1102- 1139.

В контексте настоящего описания, когда речь идет об «идентичности последовательности», последовательность по меньшей мере с х% идентичностью второй последовательности означает, что х% соответствует числу аминокислот в первой последовательности, идентичных соответствующим им аминокислотам второй последовательности при проведении оптимального выравнивания последовательностей путем глобального выравнивания по всей длине второй последовательности аминокислот. Оптимальное выравнивание обеих последовательностей выполнено, если х максимален. Выравнивание и определение процента идентичности может проводиться вручную или автоматически.

Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислот может быть достигнуто различными путями в пределах компетенции специалиста в данной области техники, например, с использованием открытого компьютерного обеспечения, такого как ClustalOmega (Sievers F, Higgins DG (2018) Protein Sci 27:135-145), Protein BLAST (от Национального центра биотехнологической информации (NCBI), США) или коммерческого программного обеспечения, такого как программное обеспечение Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить подходящие показатели для измерения выравнивания, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей. NCBI BLAST представляет собой другой пример программного обеспечения для определения идентичности последовательности аминокислот (MacWilliam et al., Nucleic Acids Res.2013 Jul; 41(Web Server issue): W597-W600).

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложен рекомбинантный белок, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38; и ее фрагменты или варианты по меньшей мере с 50% идентичностью последовательностей последовательностям аминокислот SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38.

Согласно другому аспекту предложен рекомбинантный белок, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере с 60%, 70%, 80%, 90%, или 95% идентичностью последовательностей последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38.

Биологически активные белки и пептиды играют важную роль в клиническом лечении заболеваний человека. Однако со многими белками и пептидами возникают затруднения из-за их далеко не идеальных фармакокинетических свойств, поскольку они элиминируются в результате фильтрации почками из-за малого размера и/или протеолитического метаболизма. Такие факторы могут налагать ограничения или приводить к затруднениям при введении лекарства субъектному нуждающемуся в лечении, например, необходимость проведения постоянных инфузий или частых подкожных введений для поддержания циркулирующих концентраций белка или пептида на эффективном терапевтическом уровне. Необходимость постоянного или очень частого введения лекарственного средства клинически нежелательна из-за очевидных проблем и неудобства как для пациента, так и для лечащего врача.

Одна из стратегий увеличения времени полужизни биологически активного пептида или белка состоит в том, чтобы связать группу полиэтиленгликоля (ПЭГ) с пептидом или белком, представляющим интерес, с помощью процесса, называемого пегилированием (см., например, Dozie et al. (2015), Int. J. Mot Sci, 16(10) 25831-25864). Общая стратегия пегилирования белков состоит в проведении реакции функциональной группы на белке с комплементарной группой на молекуле ПЭГ с образованием конъюгата белка и ПЭГ. ПЭГ-фрагмент обеспечивает ряд преимуществ для увеличения стабильности белка и времени полужизни в кровотоке благодаря его гибкости, гидрофильности, вариабельному размеру и низкой токсичности.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, соответственно, предложен рекомбинантный белок согласно описанию выше, отличающийся тем, что указанный указанный белок пегилирован. Слитые белки в соответствии с настоящим изобретением могут также быть пегилированными.

Слитые белки

Другой способ избежать затруднений, связанных с медицинским применением пептидов и белков, заключается в продлении времени полужизни биоактивного белка или пептида путем получения слитых белков, (см. например Valeria et al. (2017), «А New Approach to Drag Therapy: Fc-Fusion Technology), Prim Health Care, 7:255, doi: 10.4172/2167-1079.1000255). Путем ковалентного слияния белка или пептида с белком-носителем посредством генетической рекомбинации можно увеличить молекулярную массу белка, представляющего интерес, до приблизительно 60-70 кДа, что соответствует порогу для фильтрации почками.

В настоящем изобретении предложен слитый белок, содержащий

(i) Домен гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN;

(ii) партнер для слияния, слитый на N- или С-конце с доменом гомологии к повторам TSP-1 по (i), причем указанный партнер для слияния выбран из группы, состоящей из сывороточного альбумина, трансферрина и Fc-фрагмента иммуноглобулина.

(iii) необязательно, пептидный линкер между доменом гомологии к повторам TSP-1 и Fc-фрагментом (слитым на N- или С-конце с доменом гомологии к повторам TSP-1) по (i).

В настоящем описании домен гомологии к повторам TSP-I также может называться доменом III и относиться к домену III, то есть третьему домену белков семейства CCN.

В одном предпочтительном аспекте партнер для слияния представляет собой мономерный партнер для слияния и приводит к получению мономерного слитого белка. Такие слитые белки и, в частности, их домены TSP-1, определены выше и подробнее описаны ниже.

Однако настоящее изобретение также включает другие варианты реализации, как применительно к компоненту белку домена TSP-1, так и к компоненту партнеру для слияния.

В соответствии с одним таким вариантом реализации домен гомологии к повторам TSP-1 представляет собой рекомбинантный белок формулы I согласно определению выше.

Домен гомологии к повторам TSP-1 в соответствии с другим вариантом реализации представляет собой рекомбинантный белок, имеющий последовательность аминокислот согласно определению в любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-12, 37 и 38, или рекомбинантный белок формулы I согласно определению выше.

В соответствии с одним вариантом реализации домен гомологии к повторам TSP-1 представляет собой рекомбинантный белок, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере с 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичностью последовательностей последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38.

Белки по своей природе чувствительны к разложению протеазами. Для предотвращения разложения протеазами рекомбинантных белков и слитых белков в соответствии с настоящим изобретением в последовательность аминокислот могут быть введены модификации, например, с помощью направленного мутагенеза, чтобы получить устойчивые к протеазам рекомбинантные белки и слитые белки. Например, точечная мутация может быть введена в домен гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN согласно определению в SEQ ID NO: 1-12, 37 или 38, или, более конкретно, в белок согласно определению в любой из SEQ ID NO: 1-6, 8-12 или 37, слитый белок или рекомбинантный белок. В соответствии с одним вариантом реализации вводят точечную мутацию, снижающую чувствительность к протеолитическому разложению. Неограничивающий пример точечной мутации, которая приводит к меньшему протеолизу рекомбинантных белков и слитых белков согласно настоящему изобретению, заключается во введении точечной мутации, соответствующей замене пролина на аланин в положении 195 (Р195А) домена III CCN5, такой, как показана в SEQ ID NO: 7. Аналогичная мутация может также быть введена в последовательности аминокислот, происходящие из домена III других представителей семейства CCN. SEQ ID NO: 38 соответствует усеченной последовательности из 44 аминокислот домена TSP-1 CCN5, содержащей замену на Ala. SEQ ID NO: 42-46 соответствуют усеченным последовательностям из 44 аминокислот доменов гомологии с TSP-1 CCN1, 2, 3, 4 и 6, соответственно, содержащим замену на Ala. SEQ ID NO: 47-51 соответствуют более длинным последовательностям гомологии с TSP-1 CCN1, 2, 3, 4 и 6, соответственно, содержащим замену Ala. Любая такая последовательность, или последовательность, по меньшей мере на 80% ей идентичная, может применяться в соответствии с настоящим изобретением.

Как отмечалось выше, согласно предпочтительному варианту реализации указанный партнер для слияния (ii) слитого белка в соответствии с настоящим изобретением является мономерным. Может применяться любой мономерный партнер для слияния. Соответственно, партнер для слияния может представлять собой любой белок или его часть (например, домен белка), который возникает и остается в мономерной форме при слиянии с компонентом белком с доменом гомологии с TSP-1. Соответственно, слитый белок, содержащий мономерный партнер для слияния и белок с доменом гомологии с TSP-1, остается мономером. Это означает, что он не димеризуется и не образует сам с собой мультимеры более высоких порядков.

Известны различные белки, подходящие в качестве возможные партнеров для слияния, они могут включать природные белки, или их фрагменты или варианты с модифицированной последовательностью аминокислот, а также синтетические белки или гомополимеры аминокислот. Такие белки включают, в частности, Fc-фрагменты IgG, сывороточный альбумин или трансферрин.

Партнер для слияния в настоящей заявке определен в широком смысле как второй полипептид (или вторая последовательность аминокислот), который не присутствует в комбинации (например, не расположен смежно, или не связан, прямо или непрямо) с первым полипептидом CCN с гомологией TSP-1 в природе, и соединен с первым полипептидом CCN с гомологией TSP-1 в синтетической или искусственной комбинации. Соответственно, слитый белок содержит не встречающуюся в природе комбинацию по меньшей мере двух последовательностей аминокислот или полипептидов, соединенных или слитых вместе.

Партнером для слияния может быть последовательность аминокислот длиной по меньшей мере 6, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 или более аминокислот. Как правило, партнер для слияния представляет собой функциональный полипептид, или, другими словами, он представляет собой полипептид, который обеспечивает функцию или свойство слитого белка, например, стабилизирует слитый белок (делая первый полипептид более стабильным) или увеличивает время его полужизни в сыворотке. Соответственно, партнер для слияния может представлять собой структурный белок или иметь структурную функцию, или он может обеспечивать активность или свойство слитого белка, например, связывающую активность (например, партнер для слияния может быть членом связывающейся пары, или может быть партнером для аффинного связывания, и т.п.). В репрезентативных примерах партнером для слияния может быть альбумин (в частности, сывороточный альбумин), фибриноген, глутатион-S-трансфераза, трансферрин, стрептавидин или стрептавидино-подобный белок, или иммуноглобулин, или его часть, в частности, Fc-часть иммуноглобулина (например IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), или ее часть или модифицированный вариант. Подходящие сывороточные альбумины включают бычий сывороточный альбумин (БСА), сывороточный альбумин мыши (МСА) и, в особенности, сывороточный альбумин человека (ЧСА). Другие возможные партнеры для слияния включают полипептиды, которые могут действовать, улучшая фармакокинетические свойства слитого белка, например, синтетические полипептиды, такие как гомополимер аминокислоты, пролин-аланин-сериновый полимер или эластиноподобный пептид, например, согласно описанию в источнике: Strohl, 2015, BioDrugs 29, 215-239. Может применяться любой партнер для слияния для применения с терапевтическими белками, известный в данной области техники.

Согласно варианту реализации партнером для слияния (ii) слитого белка в соответствии с настоящим изобретением может быть Fc-фрагмент IgG (любого подкласса или химеры любых подклассов), сывороточный альбумин или трансферрин.

Партнер для слияния может быть сопряжен на N- или С-конце с компонентом - белком с доменом гомологии с TSP-1 слитого белка, например, с доменом гомологии к повторам TSP-1 CCN5 или любых других белков CCN согласно определению в настоящей заявке. Он может быть присоединен прямо или непрямо, посредством линкера, как подробнее описано ниже.

Fc-фрагменты склонны образовывать димеры, и при использовании в слитых белках конструкция слитого белка проявляет склонность к включению двух копий слитого белка. Однако в данной области техники известно, что могут быть получены мономерные Fc-фрагменты и содержащие их мономерные слитые белки.

Соответственно, если партнер для слияния представляет собой Fc-фрагмент, он предпочтительно представляет собой мономерный Fc-фрагмент, такой как мономерный Fc-фрагмент IgG человека любого класса. Предусмотрены химерные Fc-фрагменты, содержащие части Fc-областей из разных классов, а также Fc-фрагменты с модифицированными последовательностями.

Слитые с Fc белки представляют растущий класс белковых терапевтических средств на основе химерных белков, состоящих из эффекторного домена, сопряженного с Fc-фрагментом IgG-изотипа. Типичным примером биофармацевтического продукта является этанерцепт (рецептор ФНО-α, связанный с Fc-фрагментом), используемый при лечении, например, ревматоидного артрита. Другим примером биофармацевтического белка слияния Fc является афлиберцепт. Афлиберцепт, слитый с Fc белок рецептора ФРЭС, используется в лечении влажной формы макулярной дегенерации и метастатического рака ободочной и прямой кишки. Основным обоснованием для получения слитых белков с Fc-фрагментом является продление времени полужизни за счет увеличения молекулярной массы, достаточного для исключения почечной экскреции и усиления почечной проксимальной канальцевой реабсорбции через неонатальный Fc-рецептор. Также рН-зависимое связывание слитых с Fc белков с неонатальным рецептором Fc (FcRn) на эндотелиальных клетках позволяет слитым белкам на основе Fc, которые в противном случае подверглись бы эндоцитозу и последующему лизосомному разложению, проходить рециклинг и попадать обратно в кровоток.

В соответствии с одним вариантом реализации предложен слитый белок, отличающийся тем, что партнер для слияния (ii) представляет собой Fc-фрагмент из IgG человека (иммуноглобулин G, также известный как иммуноглобулин γ), включая любые подклассы IgG человека. В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения предложен слитый белок, отличающийся тем, что партнер для слияния представляет собой Fc-фрагмент IgG1, IgG2 или IgG4. Предпочтительно, Fc-фрагмент IgG человека относится к подклассу IgG4 (SEQ ID. NO 13) или IgG2 (SEQ ID. NO 14).

IgG1, IgG2 и IgG4 часто предпочтительнее, чем IgG3, ввиду более длительного времени полужизни, составляющего приблизительно 3 недели. Специалисту будет понятно, что выбор изотипа IgG конкретного подкласса в качестве Fc-партнера для слияния зависит от требуемого продления времени полужизни и уровня цитотоксической активности итогового соединения. Терапевтические антитела, предназначенные для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, принадлежат, по большей части, к подклассу IgG1 ввиду высокой аффинности к Fc-рецепторам и мощной способности стимулировать иммунные эффекторные функции. IgG2 и IgG4, с другой стороны, являются предпочтительными подклассами IgG для применения в качестве остова кандидатного терапевтического средства, когда требуется отсутствие иммунных эффекторных функций, поскольку иммунные эффекторные функции могут быть причиной нежелательных явлений. Склонность Fc-фрагмента к активации иммунных эффекторных функций зависит от изотипа и подкласса Ig и варьирует для разных иммунных эффекторных функций. Помимо выбора Fc-фрагмента подходящего подкласса IgG последовательность аминокислот указанного подкласса IgG может быть модифицирована, например, путем направленного мутагенеза, для снижения способности Fc-фрагментов активировать иммунные эффекторные функции.

Могут быть выбраны Fc-фрагменты, которые образуют мономеры, или, точнее, которые сохраняют или имеют мономерную форму или могут быть модифицированы путем введения мутаций, которые позволяют или облегчают получение мономерной структуры. Такие мутации в настоящей заявке называются «мутациями, обеспечивающими образование мономеров» Примеры Fc-фрагментов, которые содержат мутации, обеспечивающие образование мономеров, представлены SEQ ID NO: 54 и 55. Специалист в данной области техники знает, как ввести такие мутации и выбрать мономерные Fc-мутанты.

Избегание функции активации иммунных эффекторов Fc-фрагментами

Например, в биофармацевтический слитый белок дулаглутид (Трулисити, Trulicity™), слитый белок с агонистом GLP-1 и Fc-фрагментом, используемый один раз в неделю при лечении типа 2 диабета, вводят хорошо охарактеризованные мутации F234A и L235A в шарнирную область Fc-фрагмента IgG4 для снижения его способности активировать иммунные эффекторные функции.

В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения Fc-партнер для слияния представляет собой Fc-фрагмент IgG4, отличающийся тем, что указанный IgG4 Fc-фрагмент модифицирован так, чтобы избежать иммунных эффекторных функций, например, он содержит вышеуказанные мутации F234A и L235A.

Fc-фрагменты, устойчивые к протеазе

Другой фактор, который может уменьшить и выход в процессе изготовления, и биологический период полужизни - это расщепление слитого белка эндопептидазой. Для снижения или элиминации риска протеолитического разложения в последовательности аминокислот Fc-фрагмента могут быть введены модификации, в частности, путем введения мутации в сайты, чувствительные к протеолитическому расщеплению. В заявке на патент ЕР ЕР2654780 В1 Fc-домен константной области IgG1 был модифицирован путем замены E233-L234-L235-G236 на P233-V234-A235 (делеция G236) (нумерация ЕС) для придания итоговому модифицированному Fc-содержащему белку устойчивости к протеолитическому разложению.

Включение модификации аминокислот, раскрытой в ЕР2654780 В1, в Fc-фрагмент IgG4, сопряженный с доменом III CCN5, было признано неспособным обеспечить достаточную устойчивость к эндопептидазам. Однако улучшение устойчивости к протеазам было достигнуто путем дополнительных модификаций подтипа IgG, используемого в качестве партнер для слияния в соответствии с настоящим изобретением.

Более конкретно, было обнаружено, что слитые белки, содержащие полную шарнирную область IgG2 и константные тяжелые цепи 2 и 3 IgG4, проявляют превосходную протеолитическую устойчивость.

В источнике: Mueller JP et al., Mol. Immunol. (1997), 34(6), pp.441-452, раскрыто применение химер IgG2/IG4 в антителах IgG. Другое биофармацевтическое моноклональное антитело, экулизумаб, который используют в лечении ночной пароксизмальной гемоглобинурии и атипичного гемолитического уремического синдрома, как было показано, может подходить для применения, например, чтобы устранить способность IgG4 активировать FcγR-зависимый иммунный эффекторный ответ. Кроме того, показано, что константные домены 2 и 3 IgG4 такого химерного Fc-фрагмента также устраняют способность IgG2 активировать комплемент-зависимые иммунные эффекторные функции. Информация на эту тему приведена в отчетах Rother et al., (2007), см. Nat. Biotechnol., 25(11), pp. 1256-1264 и Mueller JP et al., выше.

Также в источнике: Borrok et al. (2017), J. Pharm. Sci. 106; 1008-1017 описано введение модификаций в Fc-фрагмент для исследования его эффекта на иммунные эффекторные функции антител (мутации FQQ-YTE). В WO 2017158426A1 раскрыты модификации антител путем введения мутаций в Fc-фрагмент для продления времени полужизни антител. В частности, раскрыты модификации в одном или более положениях 311, 434, 428, 438 и 435 в Fc-области иммуноглобулина.

Кроме того, Kinder et al. J Biol Chem. 2013 Oct 25; 288(43):30843-54 сообщают, что мутации в нижнем шарнире IgGl (т.е. Е233Р, L234V, L235A, G236-, Eu-нумерация) приводили к получению устойчивых к протеазам антител IgG1.

В соответствии с одним вариантом реализации Fc-фрагмент слитого белка в соответствии с настоящим изобретением состоит из Fc-фрагмента подкласса IgG4, включающего следующие мутации: S228P, F234A, L235A, К447-, Eu-нумерация, см. SEQ ID NO:15.

В источнике: Jacobsen et al. J Biol Chem. 2017 Feb 3;292(5): 1865-1875 сообщается, что мутация Asn297 приводит к получению агликозилированного Fc-фрагмента, что в дальнейшем приводит к отсутствию эффекторных функций IgG. Jacobsen также обнаружил, что некоторые варианты (N297G) приводили к получению антител с лучшей стабильностью и пригодностью для разработки по сравнению с другими вариантами (N297Q или N297A). Также вводили дополнительные модификации (дисульфидные мостики), что приводило к лучшей стабильности, чем у исходного IgG1.

В соответствии с настоящим изобретением, когда партнер для слияния представляет собой Fc-фрагмент, он может быть агликозилирован, без стабилизирующего дисульфидного мостика или со стабилизирующим дисульфидным мостиком, как, например, в SEQ ID NO: 16.

Насколько известно авторам настоящего изобретения, Fc-фрагмент, состоящий из полной шарнирной области IgG2 и константных тяжелых цепей 2 и 3 IgG4, ранее не использовался для получения слитых белков путем соединения указанного Fc-фрагмента с эффекторным белком.

В соответствии с одним вариантом реализации партнер для слияния предложенного слитого белка представляет собой Fc-фрагмент IgG1, который агликозилирован и стабилизирован дисульфидным мостиком, и отличается тем, что в нижний шарнир введены следующие мутации: Е233Р, L234V, L235A, G236- (Eu-нумерация) (SEQ ID NO: 17).

В соответствии с одним вариантом реализации партнер для слияния слитого белка, содержащего домен гомологии к повторам TSP-1 белка семейства CCN, представляет собой Fc-фрагмент IgG4, и отличается тем, что в нижний шарнир введены следующие мутации: Е233Р, L234V, L235A, G236- (Eu-нумерация) наряду с мутациями S228P и К477- (SEQ ID NO: 18).

Согласно одному предпочтительному варианту реализации указанный Fc-фрагмент представляет собой химеру шарнирной области IgG2 (216 ERKCCVECPPCPAPPVA-GP 238, Eu-нумерация) и любого другого из подклассов IgG. Наиболее предпочтительно Fc-фрагмент представляет собой химеру шарнирной области IgG2 и константных доменов тяжелой цепи 2 и 3 IgG4 с делецией карбоксиконцевого К477 (Eu-нумерация), представленную в SEQ ID. NO: 19. Указанный вариант реализации настоящего изобретения, как было показано, имеет улучшенные характеристики устойчивости к протеазам (см. Пример 6).

Согласно одному варианту реализации партнер для слияния мономерного слитого белка согласно настоящему изобретению представляет собой Fc-фрагмент IgGl, стабилизированный дисульфидным мостиком (R292C, V302C), агликозилированный (N297G) и содержащий мутации, обеспечивающие образование мономеров (C220Q, C226Q, C229Q, T366R, L368H, Р395К, К409Т, M428L), Eu-нумерация), как представлено в SEQ ID NO: 54.

Согласно дополнительному варианту реализации партнер для слияния мономерного слитого белка согласно настоящему изобретению представляет собой Fc-фрагмент, представляющий собой химеру шарнирной области IgG2 и константных доменов тяжелой цепи 2 и 3 IgG4 с делецией карбоксиконцевого К477- и с мутациями, обеспечивающими образование мономеров (C219Q, C220Q, C226Q, C229Q, L351F, T366R, Р395К, F405R, Y407E), и продлевающими время полужизни мутациями (M252Y, S254T, Т256Е) (Eu-нумерация), как представлено в SEQ ID NO: 55.

Хотя в примере слитого белка в соответствии с настоящим изобретением использован Fc-фрагмент, состоящий из полной шарнирной области IgG2, константных тяжелых цепей 2 и 3 IgG4, и домена III представителя семейства белков CCN, считается, что благоприятная устойчивость к протеазам также достигается, когда такой химерный Fc-фрагмент сопряжен с другими эффекторными молекулами, например, такими как VEGFR, FGF- 21 или GLP1. Эффекторная молекула является частью слитого с Fc белка, которая обеспечивает требуемые фармакодинамические свойства, тогда как Fc-фрагмент вносит вклад в фармакокинетические свойства.

Сывороточный альбумин в качестве партнера для слияния

Альтернативная стратегия для продления времени полужизни пептидов и белков заключается в использовании сывороточного альбумина (СА) в качестве партнера для слияния. IgG и СА имеют продолжительное время полужизни, равное приблизительно 19 дней, по сравнению с несколькими днями или менее для большинства других циркулирующих белков. СА также имеет аффинность к неонатальному рецептору Fc (FcRn) и избегает внутриклеточного разложения (см. Andersen et al. (2014), J Biol Chem, 289(19); pp. 13492- 13502).

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен слитый белок согласно описанию выше, отличающийся тем, что партнером для слияния является сывороточный альбумин, предпочтительно сывороточный альбумин человека.

Согласно одному варианту реализации предложен мономерный слитый белок согласно описанию выше, отличающийся тем, что указанный слитый белок содержит аминокислоты 25 606 сывороточного альбумина человека, как представлено в SEQ ID NO: 101.

Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанный альбумин, например, сывороточный альбумин человека, модифицированный, например, для увеличения или уменьшения времени полужизни за счет изменения его аффинности к FcRn, с зависимостью или без зависимости от рН, что приводит к увеличению или уменьшению периода полужизни.

Трансферрин как партнер для слияния

Также альтернативной стратегией продления времени полужизни пептидов и белков является применение трансферрина в качестве партнера для слияния с использованием естественного длительного времени полужизни трансферрина (Strohl W. FJioDrugs. 2015; 29(4): 215 239). Трансферрин может быть использован в гликозилированной или негликозилированной форме.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен слитый белок согласно описанию выше, отличающийся тем, что партнером для слияния является трансферрин, предпочтительно трансферрин человека.

Согласно одному варианту реализации предложен мономерный слитый белок согласно описанию выше, отличающийся тем, что указанный слитый белок содержит аминокислоты 20-698 трансферрина человека, как представлено в SEQ ID NO: 53.

Линкер

Согласно другому варианту реализации слитые белки в соответствии с настоящим изобретением могут необязательно содержать пептидный линкер между партнером для слияния и эффекторной молекулой, т.е. линкер слит на N- или С-конце с доменом гомологии к повторам TSP-1 белка CCN (белок/полипептид с доменом TSP-1).

Может применяться любой пептидный линкер (при условии, что он не является последовательностью белка CCN), многие из которых известны и описаны в данной области техники. Линкер может представлять собой последовательность гибкого линкера (которая может включать повторы мотива последовательности гибкого линкера). Типичные линкеры, известные в данной области техники, богаты небольшими неполярными остатками (например, глицина) или полярными остатками (например, серина или треонина), и обычно состоят из отрезков остатков глицина и серина (GS), или остатков других аминокислот, таких как аланин, лизин и/или глутамат (А, K, и/или Е), или, фактически, любых аминокислот. Часто используемым линкером является линкер (GGGGS) (SEQ ID NO: 121), который может быть предоставлен в виде повторяющихся единиц линкера (как (GGGGS) n, где количество копий n может быть скорректировано, например от 1-10, 1-6, 1-4 и т.п.). Длина линкера может составлять 1-50, 1-45, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-12, 1-10, например, 1-8, 1-6, 1-5, или 1-4 аминокислоты. Различные отличающиеся линкеры описаны и использованы в примерах, представленных ниже, и любые из них могут применяться в любых слитых белках согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации указанный линкер содержит не более 50 аминокислот.

Свойства пептидного линкера могут дополнительно улучшать сохранение эффекторных функций. Однако пептидные линкеры могут быть восприимчивы к расщеплению эндопептидазой и элиминации слитого белка. Пептидные линкеры с глицином, с остатками или без остатков серина часто используются, однако указанный дизайн не всегда дает слитые белки с требуемыми видами активности и устойчивости к эндопептидазе. В US20180273603, раскрывающем нейротрофин-связывающий белок-Fс-слитый белок, предлагается применение а-спиральных линкеров, предусматривающих повторы последовательности А (ЕАААК) A (SEQ ID NO: 14 в указанном источнике). Кроме того, в US2018/0127478 раскрыто применение аминокислотного линкера, состоящего из одного-трех повторов последовательности ЕАААK, в слитом белке с Fc.

В соответствии с настоящим изобретением линкер, состоящий из пептидной последовательности ЕАААK (SEQ ID NO: 21 в настоящей заявке), может также быть вставлен между доменом гомологии с TSP-1 и партнером для слияния (Fc-фрагментом). Более предпочтительно линкер состоит из повторяющейся последовательности аминокислот ЕАААK.

Если линкер включен в слитый белок согласно настоящему изобретению, указанный линкер находится между партнером для слияния и эффекторной молекулой, т.е. доменом III белка CCN. Линкер может быть введен на С-конце или N-конце домена III белка CCN.

Кроме того, спиральный линкер был устойчив к расщеплению эндопептидазой после экспрессии рекомбинантного белка в суспензии клеток СНО. Это важно как для целей изготовления, так и для in vivo эффективности. Кроме того, показано, что включение α-спирального линкера между Fc-фрагментом и эффекторным доменом в слитом с Fc белке снижает склонность к агрегации указанного слитого с Fc белка.

Хотя указанные результаты обнаружены для слитого белка, содержащего домен III белка CCN в качестве эффекторного белка, считается, что благоприятная пониженная склонность к агрегации и эффекты устойчивости к протеазам также достигаются, если объединить другие эффекторные молекулы с Fc-фрагментом α-спиральным линкером в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно настоящему изобретению, соответственно, предложен слитый с Fc белок, содержащий Fc-фрагмент, который содержит последовательность пептидного линкера формулы АK1-АK2-(ЕАААK)n-АK3-АK4-АK5, где n≥4, между Fc-фрагментом и эффекторной молекулой, и где аминокислоты АK1, АK2, АK3, АK4, АK5 независимым образом отсутствуют или представляют собой аминокислоту. Линкер может быть размещен на N-конце или С-конце Fc-фрагмента. В соответствии с одним вариантом реализации n равен 8. Согласно другому варианту реализации АK1 представляет собой треонин (Т), АK1, АK2, АK3, АK4 и АK5 представляют собой Ala (А). В соответствии с одним вариантом реализации линкер для вышеуказанного Fc-слитого белка выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25. В частности, было показано, что применение слитого белка в соответствии с настоящим изобретением, содержащего линкер, состоящий из (ЕАААK)-повтора, т.е. такой как (ЕАААK)n, где n равен 8, благоприятным образом приводит к меньшей агрегации.

Альтернативный линкер, который можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой линкер с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 20 (TEGRMD).

Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение может, соответственно, предусматривать включение линкерного пептида между партнером для слияния и доменом III на CCN5 (например, SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 12, 37 или 38). Неограничивающие примеры слитых белков, содержащих линкер из SEQ ID NO: 20, представлены в SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, соответственно.

В том случае, когда согласно изобретению используют вариант реализации домена III CCN5, генетически слитый на N-конце с пептидным линкером (как в SEQ ID NO 20) и Fc-фрагментом IgG подтипа IgG4, включающим следующие мутации (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация) (как в SEQ ID NO 15), полная последовательность соответствует SEQ ID NO: 28, также обозначаемой CCN5(dIII)-Fcv2.

В том случае, когда согласно изобретению используют вариант реализации домена III CCN5, генетически слитый на N-конце с пептидным линкером (как в SEQ ID NO: 20) и Fc-фрагментом IgG подтипа IgG4, включающим следующие мутации (S228P, Е233Р, F234V, L235A, G236-, K447-, Eu-нумерация), представленным в SEQ ID NO: 18, итоговая последовательность соответствует SEQ ID NO: 29, также обозначаемой CCN5(dIII)-Fcv2.1.

В том случае, когда согласно изобретению используют вариант реализации домена III CCN5, генетически слитый на N-конце с пептидным линкером (как в SEQ ID NO: 20) и химерным Fc-фрагментом подтипа IgG IgG2/4, представленным в SEQ ID NO: 19, итоговая последовательность соответствует SEQ ID NO: 30, также обозначаемой CCN5(dIII)-Fcv2.3.

В том случае, когда согласно изобретению используют вариант реализации домена III CCN5 (как в SEQ ID NO: 1), генетически слитый на N-конце с пептидным линкером (как в SEQ ID NO: 25) и химерным Fc-фрагментом подтипа IgG IgG2/4, представленным в SEQ ID NO: 19, итоговая последовательность соответствует SEQ ID NO: 31, также обозначаемой CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения предложен слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, содержащий:

1) точечную мутацию в домене III белка семейства CCN, в частности, CCN5 (см. SEQ ID NO: 7, которая приводит к пониженной протеолитической чувствительности указанного домена III;

2) сконструированную химеру Fc-фрагмента IgG4 человека и IgG2 человека (SEQ ID NO: 19, которая уменьшает протеолитическую чувствительность относительно ранее описанных остовов на основе Fc-фрагмента, используемых в слитых с Fc белках; и

3) содержащий оптимизированную композицию пептидного линкера (см. SEQ ID NO: 21-25), который уменьшает протеолитическую чувствительность, усиливает биологическую активность слитого белка и уменьшает склонность к агрегации слитого белка.

Согласно некоторым вариантам реализации пептидный линкер между последовательностью аминокислот по (i) и мономерным партнером для слияния имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-25 или 39, или последовательность аминокислот, на 80% идентичную указанной.

Альтернативные линкерные последовательности, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, представлены в SEQ ID NO: 57, 63, 65, 67 и 121.

Рекомбинантная экспрессия

Рекомбинантные белки и слитые белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены путем культивирования клетки-хозяина, позволяющей экспрессию последовательностей нуклеотидов, кодирующих указанные белки. Специалист хорошо знаком с различными доступными биотехнологическими методиками, обеспечивающими экспрессию выделенных последовательностей нуклеиновых кислот для получения рекомбинантных белков путем гетерологичной экспрессии в различных системах клеток-хозяев с применением общедоступных методик генетического конструирования и систем экспрессии рекомбинантной ДНК, см. например, источники: «Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, 1997, Ed. Rocky S Tuan, Human Press (ISSN 1064-3745) или Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (third edition), 2001, CSHL Press, (ISBN 978-087969577-4). Например, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, могут быть инсертированы в подходящие экспрессионные векторы, содержащие все необходимые транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, специально адаптированные для направления экспрессии кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты требуемого белка в подходящей клетке-хозяине. Подходящие экспрессионные векторы представляют собой, например, плазмиды, космиды, вирусы или искусственные дрожжевые хромосомы (YAC).

Последовательности ДНК, кодирующие рекомбинантные белки согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы с применением способов, хорошо известных специалисту, или синтезированы коммерческими поставщиками, хорошо известными специалисту, например, Genscript, Thermo Fisher Scientific и т.п.

В соответствии с одним вариантом реализации указанного аспекта предложена молекула ДНК, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 86, 87, 90, 91, 99, 100, 104, 105, 108, 109, 112 или 113, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную любой вышеупомянутой последовательности. Также предложены экспрессионные векторы, содержащие такие молекулы ДНК. В соответствии с другим вариантом реализации указанного аспекта также предложены клетки-хозяева, содержащие такие векторы.

Последовательности ДНК для экспрессии и применения для получения рекомбинантных белков могут быть инсертированы в векторы, общеизвестные как входящие векторы, с применением системы клонирования Gateway (Esposito et al, 2009, "Gateway Cloning for Protein Expression", Methods in Molecular Biology, 498, pp.31-54). Гены, клонированные во входящий вектор, могут легко быть введены в различные экспрессионные векторы путем рекомбинации. Например, синтезированная последовательность, кодирующая рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, может быть рекомбинирована путем рекомбиназного клонирования BP Gateway с получением входящего вектора, который может быть использован для размножения плазмид в подходящей клетке-хозяине, например, клетках Е. coli. Согласно предпочтительному варианту реализации используют клетки E.coli, мутированные таким образом, чтобы они позволяли эффективное размножение плазмид, такие как, например, клетки One Shot Top 10™.

В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения получают экспрессионный вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, функционально связанный с промотором. Специалисту будет понятно, что «промотор» в настоящей заявке относится к области ДНК, расположенной выше (в направлении 5') относительно кодирующей последовательности ДНК, которая контролирует и инициирует транскрипцию конкретного гена. Промотор контролирует распознавание и связывание РНК-полимеразы и других белков для инициации транскрипции. «Функционально связанный» относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, когда последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующих второй последовательности. В общем случае «функционально связанный» означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот расположены непрерывно.

Входящий вектор, а также экспрессионный вектор, такой как полученный из принимающего вектора, упоминаемого ниже, может быть выделен с применением стандартных методик выделения плазмид, хорошо известных специалисту, например, с применением набора QIAprep™ Spin Miniprep от Qiagen™ или набора QIAGEN™ Plasmid Plus Maxi Kit.

Если используют входящий вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, указанный входящий вектор может быть дополнительно рекомбинирован с принимающим вектором с применением рекомбиназы LR Gateway для получения экспрессионного вектора. Экспрессионный вектор может затем быть использован для экспрессии кодирующей белок последовательности ДНК в подходящей клетке-хозяине. Неограничивающий пример применимого принимающего вектора представлен, например, pUCOE-DHFR-DEST согласно описанию в источнике: et al., J. Biol. Chem, 293:46, pp.17953-17970.

Также итоговый экспрессионный вектор может быть верифицирован с использованием стандартного анализа с расщеплением рестрикционными ферментами и гель-электрофореза

ДНК.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложен экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок формулы (I). В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложен экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8-12, 37, 38, 84, 85, 88, 89, 97, 98, 102, 103, 106, 107, 110 и 111; и их фрагментов или вариантов по меньшей мере с 50% идентичностью последовательностей последовательностям аминокислот SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, и SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38; и SEQ ID NO: 84,85, 88, 89, 97,98, 102, 103, 106, 107, 110 и 111.

Согласно другому аспекту предложен экспрессионный вектор, кодирующий рекомбинантный белок, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере с 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичностью последовательностей последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38, и SEQ ID NO: 84, 85, 88, 89, 97, 98, 102, 103, 106, 107, ПО и 111.

В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения предложены экспрессионные векторы, кодирующие слитый белок в соответствии с настоящим изобретением.

Специалисту хорошо известно о вырожденности генетического кода, и предпочтительном использовании конкретных кодонов в различных организмах. Соответственно, в зависимости от выбора клетки-хозяина, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный белок и слитые белки согласно настоящему изобретению, может быть адаптирована так, чтобы содержать предпочтительные для клетки-хозяина кодоны. Соответственно, аминокислоты белков согласно настоящему изобретению может кодировать любая комбинация кодонов из представленных в таблице ниже:

Предпочтительно указанные кодоны дополнительно оптимизированы для высоких уровней экспрессии в соответствии с выбранной клеткой-хозяином.

Для экспрессии белков с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в дополнение к конкретному варианту реализации настоящего изобретения к N-концу последовательности белка предпочтительно добавляют последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид. Сигнальный пептид может служить для направленной локализации слитого белка во время и/или после синтеза в клетке-хозяине. Он может, соответственно, представлять собой последовательность, направляющую секрецию слитого белка. Применение таких последовательностей сигнальных пептидов хорошо известно в данной области техники. Сигнальный пептид может быть представлен любой формой, например, может представлять собой сигнальный пептид IgGk-цепи, или может представлять собой сигнальный пептид из сывороточного альбумина человека (SEQ ID. NO 32).

В том случае, когда сигнальным пептидом из сывороточного альбумина человека (SEQ ID №32) дополнен N-конец SEQ ID NO: 28, последовательность белка для экспрессии может соответствовать SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 85, 89, 98, 103, 107 или 111.

Кроме того, для экспрессии белка с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в соответствии с одним конкретным вариантом реализации настоящего изобретения, белком, имеющим последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 33, может применяться последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 86, 90, 99, 104, 108 или 112, где 3'-конец кодирующей последовательности дополнен трансляционным стоп-кодоном.

В том случае, когда вариантом реализации изобретения является последовательность нуклеотидов из SEQ ID. NO: 34, указанная последовательность нуклеотидов предпочтительно дополнена непосредственно на 5'-конце кодирующей последовательности последовательностью KOZAK, например, GCCACC, как в SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 86, 90, 99, 104, 108 или 112. Последовательность ДНК может дополнительно быть фланкирована ДНК-элементами, позволяющими субклонирование, например, такими как рекомбиназные сайты attB Gateway. Однако для получения последовательности ДНК и облегчения субклонирования в экспрессионный вектор могут быть использована любая стратегия клонирования или синтеза. В том случае, когда последовательность ДНК включает рекомбиназные сайты Gateway, позволяющие субклонирование, последовательность нуклеотидов может соответствовать представленной в SEQ ID NO 36 или SEQ ID NO: 87, 91, 100, 105, 109 или 113.

Полученный экспрессионный вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок или слитый белок согласно настоящему изобретению, может быть введен в подходящие клетки-хозяева для продуцирования требуемого белка. Могут применяться различные коммерчески доступные или самостоятельно полученные клетки-хозяева. Например, экспрессионный вектор может быть перенесен в эукариотические клетки-хозяева, такие как клетки СНО, например, адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО DG44 DHFR (дигидрофолатредуктаза^-/-). Трансфекция клеток-хозяев экспрессионным вектором может быть выполнена с применением способов, хорошо известных специалисту, например, с применением электропорации.

При культивировании клеток-хозяев в подходящей культуральной среде будут продуцироваться рекомбинантные белки или слитые белки в соответствии с настоящим изобретением, кодируемые экспрессионным вектором в клетка-хозяине, и итоговый белок может быть собран и очищенный с применением способов, хорошо известных специалисту.

Экспрессионный вектор может включать сигнальные последовательности, общеизвестные как «сигнальный пептид», для секреции экспрессированного белка или слитого белка в культуральную среду.

Для выделения и очищения секретированного рекомбинантного белка из клеточной культуральной среды обычно проводят один или более этапов предварительной обработки или очищения, в первую очередь для удаления больших частиц и биомассы. Неограничивающие примеры применимых этапов предварительной обработки представлены, например, обратным осмосом, центрифугированием, методами фильтрации и диафильтрации, или их комбинацией. Затем полученный белок обычно очищают с помощью одного или более из различных хроматографических методов, хорошо известных специалисту, например, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии со смешанным режимом, хроматографии гидрофобного взаимодействия, эксклюзионной хроматографии или других хроматографических техник, или их комбинации.

Например, рекомбинантный белок или слитый белок, экспрессируемый подходящей клеткой-хозяином, может быть очищен с применением метода аффинной хроматографии, например, с применением сред MabSelect™ SuRe™, например, на колонке на 5 мл HiTrap MabSelect™ SuRe™, установленной в систему для высокопроизводительной жидкостной хроматографии, например, систему BioRad NGC Discover™ 10 Pro, оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. После загрузки образца, содержащего белок для очищения, колонку обычно промывают один или более раз одним или более применимыми промывочными буферами, после чего белок элюируют с использованием подходящего элюирующего буфера. Полученный белок может быть дополнительно очищен одним или более из перечисленных выше хроматографических способов.

Следует понимать, что различные модификации могут быть введены в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные белки согласно настоящему изобретению, с использованием методик, хорошо известных специалисту, например, для облегчения экспрессии. Путем применения направленного мутагенеза можно ввести модификацию для адаптации кодирующей последовательности к нужному хозяину, используемому для экспрессии последовательности и, соответственно, продуцирования рекомбинантного белка. Специалисту хорошо известно о существовании специфичных для хозяев кодонов, и о том, что адаптация гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты с включением специфичных для хозяев кодонов повышает эффективность экспрессии, как упоминалось выше. Могут также быть введены другие модификации, например, для облегчения выделения и очищения, т.е. путем добавления последовательности, кодирующей пептид или белок, подходящие для таких целей. Также к последовательностям нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут быть дополнительно присоединены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию требуемого рекомбинантного белка из клетки-хозяина.

Согласно настоящему изобретению также предложена клетка-хозяин, подходящая для продуцирования рекомбинантного белка или слитого белка в соответствии с настоящим изобретением. Могут применяться различные коммерчески доступные клетки-хозяева, конкретным образом адаптированные для продуцирования рекомбинантных белков, как прокариотические клетки-хозяева, так и эукариотические клетки-хозяева. Неограничивающими примерами подходящих клеток-хозяев являются, например, клетки СНО, клетки НЕК293, клетки Pichia pastoris, клетки NS0 или клетки Е. coli.

Наконец, настоящее изобретение также относится к домену гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN, и к слитому белку, содержащему указанный домен гомологии к повторам TSP-1 для применения в качестве медикамента для лечения или предотвращения расстройств путем ингибирования или противодействия клеточной сигнализации и физиологическим функциям клетки, приписываемым белкам семейства CCN.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен белок, например, слитый белок согласно определению в настоящей заявке, для применения в терапии.

Согласно некоторым аспектам указанный белок, например, слитый белок, может быть предназначен для применения при лечении или предотвращении фиброза, или любого состояния, при котором наблюдается фиброз (т.е. любого фибротического состояния или расстройства). Фиброз может влиять на любую ткань или орган, в том числе, например, на легкие, глаз, сердце, скелетные мышцы, брюшину, почки, печень, поджелудочную железу, желчные протоки, кожу, кровеносные сосуды или более глобальные системы. В частности, состояние, при котором проявляется фиброз, может быть выбрано из фиброза легких, который может быть любой этиологии, в том числе идиопатического фиброза легких, бронхолегочной дисплазии, фиброза сетчатки, диабетической ретинопатии, возрастной макулярной дегенерации, отслоения сетчатки, индуцированной кислородом ретинопатии, глаукомы, сердечного фиброза, фиброза трансплантата после трансплантации, ассоциированного с кардиомиопатией фиброза, мышечного фиброза, мышечной дистрофии Дюшенна, перитонеального фиброза, диабетической нефропатии, хронической болезни почек (фиброза почек), острого повреждения почек, тубулоинтерстициального фиброза, хронической нефропатии аллотрансплантата, фиброза печени, неалкогольного стеатогепатита, жировой болезни печени, хронического панкреатита, билиарного фиброза, келоидов, рубцов, системного склероза, атеросклероза, эпидурального фиброза.

В контексте сердечного фиброза состояния, подлежащие лечению или предотвращению, могут включать гипертрофию сердца и сердечную недостаточность с сохраненной фракцией выброса или без нее.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен белок, например, слитый белок согласно определению в настоящей заявке, для применения в лечении воспалительного или аутоиммунного заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации указанное воспалительное заболевание выбрано из ревматоидного артрита, амиотрофического бокового склероза (ALS), воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, болезни Крона.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен белок, например, слитый белок согласно определению в настоящей заявке, для применения при лечении рака. В этом отношении известно, что 4-доменные белки CCN могут как вызывать онкогенные ответы в выделенных раковых клетках, так и способствовать метастазированию, хеморезистентности и устойчивости к иммунотерапии, воздействуя прямо на раковые клетки или на строму опухоли. Активность белков согласно настоящему изобретению, относящаяся к ингибированию эффекта или активности 4-доменного белка CCN, соответственно, является обоснованием для их применения в лечении рака. Рак может представлять собой любое злокачественное или предзлокачественное неопластическое состояние. Это может быть рак любой ткани или любого органа. В одном из вариантов реализации рак может проявляться в виде солидных опухолей. Согласно другому варианту реализации рак может представлять собой рак системы кроветворения или находиться в системе кроветворения. Он может представлять собой первичный рак или вторичный рак, или метастазы. Рак может, соответственно, представлять собой рак поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, шейки матки, яичников, печени, мочевого пузыря, мозга, крови, костей, кожи, легких или желудка. Согласно некоторым вариантам реализации рак выбран из рака поджелудочной железы, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, уротелиального рака мочевого пузыря, рака головного мозга, глиобластомы, острого лимфобластного лейкоза, остеосаркомы, меланомы, мезотелиомы, рака желудка, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака пищевода, рака ободочной и прямой кишки, рака легкого.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен белок, например, слитый белок согласно определению в настоящей заявке, для применения при лечении метаболического заболевания. Указанное метаболическое заболевание может представлять собой или может быть ассоциировано с инсулинорезистентностью или нарушением толерантности к глюкозе. Согласно некоторым вариантам реализации указанное метаболическое заболевание выбрано из диабета 2 типа и метаболического синдрома.

Слитый белок согласно настоящему изобретению может также применяться согласно описанным выше способам лечения состояний. Аналогичным образом, слитый белок согласно настоящему изобретению может применяться в способах изготовления медикамента для применения в лечении состояний, описанных выше.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Экспрессия слитого белка в соответствии с настоящим изобретением

В этом примере описано получение слитого белка, содержащего аминокислоты 194-246 CCN5 (SEQ ID NO: 1), слитого на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 20) и Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2) (т.е. слитого белка в соответствии с SEQ ID NO: 28). Указанный слитый белок также был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, и экспрессирован в клетках млекопитающих согласно описанию ниже.

Последовательность ДНК, представленную в последовательности SEQ ID NO: 36, синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик. Синтезированная последовательность была рекомбинирована с pDonrZeo путем рекомбиназного клонирования BP Gateway для создания входящего вектора. После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Тор10™), выделяли входящий вектор с помощью стандартных методик выделения плазмид с применением набора QIAprep™ Spin Miniprep от Qiagen™. После выделения плазмиды входящий вектор верифицировали путем расщепления рестрикционными ферментами с последующим гель-электрофорезом ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту.

Затем входящий вектор, содержащий последовательность SEQ ID NO: 35, рекомбинировали с принимающим вектором с применением рекомбиназы LR Gateway. Использовали принимающий вектор pUCOE-DHFR-DEST согласно описанию Kaasb0ll и соавторов, 2018, см. выше.

После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Top 10™), экспрессионный вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с применением набора QIAGEN™ Plasmid Plus Maxi Kit. Итоговый экспрессионный вектор верифицировали с помощью стандартного расщепления рестрикционными ферментами и гель-электрофореза ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту. Итоговый экспрессионный вектор затем переносили в адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО ExpiCHO в соответствии с протоколом «Мах Titer» от изготовителя набора для трансфекции СНО Expifectamine™ (Gibco кат. №: А29129) и кратким описанием и соавторов, 2018, выше. Клетки осаждали через 6 дней после трансфекции центрифугированием при 4750g в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 1 мМ и 0,5М ЭДТК до концентрации 2 мМ. Затем добавляли 96% этанол до конечной концентрации приблизительно 3%. Перед хроматографическим очищением добавляли 1М TrisHCl с рН 7,4 до конечной концентрации 25 мМ.

Этап захвата при очищении выполняли путем аффинной хроматографии на хроматографической среде с белком А. В этом эксперименте использовали среду rProtein А FF (GE Healthcare). Колонку HiTrap ™ rProtein A FF на 5 мл (GE Healthcare) использовали для очищения экспрессированного рекомбинантного белка из 60 мл клеточной культуральной среды, собранной и дополненной согласно описанию, см. выше. Колонку HiTrap ™ rProtein А FF устанавливали в систему скоростной высокопроизводительной жидкостной хроматографии (систему BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм, и уравновешивали буфером, содержащим 25 мМ TrisHCl, рН 7,4, 25 мМ NaCl и 3% этанола. Собранную клеточную культуральную среду, содержащую рекомбинантный белок, загружали с помощью пробоотборного насоса со скоростью 2,5 мл/мин, с последующим промыванием промывочным буфером в количестве 6 объемов колонки (25 мМ TrisHCl рН 7,4, 25 мМ NaCl и 3% этанола)) до элюирования 0,1М цитратом Na, рН 3,0, в 3% этаноле. Элюат с показателем поглощения УФ на 280 нм, превышающим 100 мЕОП, собирали фракциями по 3 мл в пробирки с низким связыванием белков, предварительно заполненные 1 мл 1М TrisHCl, рН 9,0. Фракцию, содержащую пик поглощения УФ, концентрировали до 500 мкл с использованием концентратора Vivaspin® 20 мл, с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа. После концентрирования образец загружали в контур для загрузки образцов системы скоростной высокопроизводительной жидкостной хроматографии (FPLC) (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro). Система FPLC-хроматографии была оснащена колонкой Superdex® 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare), которую уравновешивали 50 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, рН 7,0. Вводили образец и колонку перфузировали буфером для предварительного уравновешивания (50 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, рН 7,0) со скоростью потока 0,25 мл/мин. Было обнаружено, что основной пик поглощения УФ на 280 нм содержит очищенный рекомбинантный белок (CCN5(dIII)-Fcv2, SEQ ID NO: 28). Образцы собранных фракций объемом 10 мкл подвергали ДСН-ПААГ, используя готовые гели Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ и выделенные рекомбинантные белки визуализировали с использованием системы визуализации ChemiDoc™ (BioRad).

Специалистам хорошо известно, что рекомбинантные белки могут быть получены в различных экспрессионных системах и очищены с помощью различных хроматографических способов с аналогичными результатами.

Пример 2

Последовательность ДНК, кодирующую слитый белок, содержащий аминокислоты 194 246 CCN5 (SEQ ID NO: 1), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 20) и Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2) экспрессировали для продуцирования рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 28.

Полученный белок тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 в AKT) в клетках рака легкого человека А549 (Фиг. 1А). Обработанные для культивирования тканей 96-луночные стерильные полистироловые планшеты Corning Incorporated Costar® покрывали фибронектином (Sigma, кат. № F1141, разведен до 10 мкг/мл забуференным фосфатом солевым раствором по Дульбекко BioWhittaker® (Lonza, кат. №17-512F, в дальнейшем называемый ФСБ)). Раствор для покрытия, содержащий фибронектин, распределяли по лункам в объеме 100 мкл/лунку, инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем декантировали раствор для покрытия, распределяли в покрытые фибронектином лунки по 100 мкл ФСБ, и также декантировали. Клетки А549, субкультивированные для поддержания плотности с максимальной конфлюентностью 80%, разделяли путем обработки ферментом (Аккутаза®, кат. № L0950-100 от Biowest®), разведенным в модифицированной по Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (Gibco кат. №: 41965-039), добавляли 10% инактивированную нагреванием фетальную бычью сыворотку (ФБС) (флаконы на 500 мл с ФБС (кат. №16000-044 от Gibco), уравновешивали до комнатной температуры, инкубировали в воде с температурой 60°С при перемешивании в течение 30 минут) и с 50 мкг/мл генсумицина (Sanofi)) до концентрации 110000 клеток/мл, и по 100 мкл раствора клеток распределяли в покрытые фибронектином лунки. Все инкубации клеток проводили в инкубаторах для клеточных культур при поддержании температуры 37°С, во влажной атмосфере с комнатным воздухом и 5% СО2. После инкубации в течение ночи клетки А549 двукратно промывали ФСБ и 90 мкл модифицированной по Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM, Gibco кат. №: 41965-039), и в лунки распределяли по 50 мкг/мл генсумицина (Sanofi) без ФБС. Через 18 часов инкубации в среде без ФБС клетки стимулировали 10 мкл раствора рассматриваемого рекомбинантного белка. После стимуляции в течение 60 среду декантировали и клетки собирали путем добавления 50 мкл буфера для лизиса с блокирующим реагентом, в соответствии с набором для фосфо-AKT от Cisbio (Ser473) (Cisbio Inc, кат. №: 64AKSPEG). После добавления буфера для лизиса с блокирующим реагентом 96-луночный планшет инкубируют в течение 60 минут на планшетном шейкере PST-60HL Plus (ThermoFisher) при 500 об/мин. После перемешивания лизированные образцы растирали, после чего переносили по 16 мкл из каждой лунки в белые 96-луночные малообъемные HTRF-планшеты (Cisbio Inc., кат. №: 66PL96025). Для анализа количества фосфорилированной AKT (Ser473) в каждую лунку добавляли 4 мкл смеси меченых антител (50/50 об/об смесь антител, AT к фосфо-AKT d2 и меченое криптатом AT к фосфо-AKT от Cisbio bic, кат. №: 64AKSPEG) (в отрицательные контрольные лунки добавляли только антитело с криптатом), планшеты запечатывали клейкой полимерной пленкой и инкубировали при 4°С в течение ночи, после чего считывали на планшет-ридере PolarStar Omega (BMG Labtech, Германия), оснащенном регистратором TR-FRET и эмиссионным фильтром на 337 нм и фильтрами возбуждения на 615 нм и 665 нм. Соотношение между зарегистрированными показателями возбуждения на 665 нм и 615 нм корректировали по холостым пробам, и значения для рекомбинантного белка из стимулированных лунок выражали через процент относительно стимулированных носителем лунок.

Пример 3

Последовательность ДНК, кодирующую слитый белок, содержащий аминокислоты 194-246 CCN5 (SEQ ID. NO: 1), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 20) и Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2), экспрессировали для получения рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 28.

Полученный белок тестировали на способность ингибировать профибротическую стимулированную ТФР-β транскрипцию (со связывающих SMAD2/3 цис-элементов) в фибробластах легких человека IMR90 (Фиг. 1D). Анализ проводили в техническом отношении согласно описанию Kaasbell et al. (2018) выше, за исключением использования 2500 фибробластов легких IMR90 /лунку вместо клеток Rat2. Для стимуляции использовали белки, указанные на Фиг. 1D. Клетки IMR90 перед применением субкультивировали согласно описанию для клеток А549, см. выше. Клетки IMR90 использовали до 20 пересева, т.е. до достижения репликативного старения.

Пример 4

Последовательность ДНК, кодирующую слитый белок, содержащий аминокислоты 194-246 CCN5 (SEQ ID. NO: 1), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 20) и Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2), экспрессировали для продуцирования рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 28.

Полученный белок тестировали на способность ингибировать пролиферацию клеток линии фибробластов легких человека IMR90 (Фиг. 1В). Клетки IMR90 субкультивировали согласно описанию для клеток А549 перед применением, выше. Клетки IMR90 использовали до пересева 20, т.е. до достижения репликативного старения. Для экспериментов клетки IMR90 собирали согласно описанию для клеток А549, выше, промывали ФСБ, разводили DMEM с 1% ФБС и генсумицином согласно описанию для эксперимента 2, выше, и высевали в планшеты для измерения импеданса xCELLigence с плотностью 12000 кл./лунку. Через 2 часа клетки стимулировали 10 мкл раствора рассматриваемого рекомбинантного белка или ФБС и инкубировали в течение еще 72 часов, после чего собирали данные с использованием CellTiter-Glo® (Promega Inc.) согласно описанию в и соавторов, (2018), выше.

Пример 5

Последовательность ДНК, кодирующую слитый белок, содержащий аминокислоты 194-246 CCN5 (SEQ ID. NO: 1), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 20) и Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2), экспрессировали для продуцирования рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 28.

Полученный белок тестировали на способность ингибировать сферообразующую способность (независимый от подложки рост) клеток положительной по рецептору эстрогена линии рака молочной железы MCF-7 и клеток линии рака молочной железы с тройным негативным фенотипом MDA-MB-231 (Фиг. 1С) согласно описанию и соавторов, выше. Клетки MDA-MB-231 обрабатывали согласно описанию для линии клеток MCF-7 и соавторов, выше. Клетки линий MCF-7 и MDA-MB-231 субкультивировали согласно описанию для линии клеток А549, выше.

Пример 6

Последовательности ДНК, кодирующие слитый белок, содержащий аминокислоты 194 246 CCN5 (SEQ ID. NO: 1), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 20) и либо Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, К447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2), либо Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 18 (S228P, E233P, F234V, L235A, G236-, K447-, Eu-нумерация) (CCN5(dIII)-Fcv2.1), либо химерным Fc-фрагментом подклассов IgG2/4 (SEQ ID NO: 19) (CCN5(dIII)-Fcv2.3), экспрессировали для продуцирования рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 28 (CCN5(dIII)-Fcv2), SEQ ID NO: 29 (CCN5(dIII)- Fcv2.1) и SEQ ID NO: 30 (CCN5(dIII)-Fcv2.3).

В частности, экспрессионными векторами для экспрессии SEQ ID NO: 28 (CCN5(dIII)-Fcv2), SEQ ID NO: 29 (CCN5(dIII)-Fcv2.1) и SEQ ID NO: 30 (CCN5(dIII)-Fcv2.3) трансфицировали адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО ExpiCHO в соответствии с протоколом «Мах Titer» от изготовителя набора для трансфекции СНО Expifectamine™ (Gibco, кат. №: A29129) и кратким описанием и соавторов, выше. Клетки осаждали через 6 дней после трансфекции центрифугированием при 13000 об/мин в настольной центрифуге Heraeus Biofuge Pico в течение 5 минут и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Образцы собранных супернатантов клеточной культуральной среды разделяли в ДСН-ПААГ с использованием готовых гелей Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™, и визуализировали рекомбинантные белки с использованием системы визуализации ChemiDoc™ (BioRad). Разделенные белки затем переносили на ПВДФ-мембраны с применением Trans-Blot Turbo, системы полусухого блоттинга (Bio-Rad) для анализа методом вестерн-блоттинга. Блот зондировали антителом против IgG4 человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (Invitrogen, кат. №: А10654), которое использовали в сочетании с субстратом SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoFisherScientific) и системой визуализации ChemiDoc™ (BioRad) для визуализации.

На Фиг. 2 приведены данные, демонстрирующие улучшенную устойчивость к протеазам остова на основе Fc-фрагмента, состоящего из химеры IgG2/4 (показан на SEQ ID NO: 19).

CCN5/WISP2 (домен III) слитый с Fc-фрагментом IgG4 либо с помощью шарнира IgG4 с сайленсингом иммунных эффекторных функций (согласно определению в SEQ ID NO: 28); CCN5 (домен III)-Fcv2, где тот же остов IgG4 включает мутации на основе IgG2 (согласно определению в SEQ ID. NO: 29); CCN5 (домен III)-Fcv2.1, или тот же остов IgG4 с полной шарнирной областью IgG2 (согласно определению в SEQ ID NO: 30); CCN5 (домен III)-Fcv2.3 экспрессировали в системе ExpiCHO и собирали кондиционированную среду (СМ) через 6 дней. Вестерн-блоттинг и окрашивание на тотальный белок гелей ДСН-ПААГ показали, что вариант CCN5 (домен III)-Fcv2.3 наименее чувствителен к протеазам, присутствующим при культивировании. Обратим внимание, что иммунореактивность антитела против IgG4 по отношению к Fc-фрагменту частично утрачивается при замене на последовательности IgG2, и, соответственно, оценка уровня указанного белка на основании окрашивания общего белка занижена.

Пример 7

Последовательности ДНК, кодирующие слитый белок, содержащий аминокислоты 194 246 CCN5 (SEQ ID NO: 1), слитые на N-конце с пептидным линкером, описанным в SEQ ID NO: 20, и химерным Fc-фрагментом подклассов IgG2/4 (SEQ ID NO: 19) (CCN5(dIII)-Fcv2.3), или с пептидным линкером, описанным в SEQ ID NO: 25 и химерным Fc-фрагментом подклассов IgG2/4 (SEQ ID NO: 19) (CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3), экспрессировали для продуцирования рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 30 (CCN5(dIII)-Fcv2.3) и SEQ ID NO: 31 (CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3).

В частности, экспрессионными векторами для экспрессии SEQ ID NO: 30 (CCN5(dIII)-Fcv2.3) и SEQ ID NO: 31 (CCN5(dIII)-HLn8-Fcv2.3) трансфицировали адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО ExpiCHO в соответствии с протоколом «Мах Titer» от изготовителя набора для трансфекции СНО Expifectamine™ (Gibco, кат. №: А29129) и кратким описанием и соавторов, выше. Клетки осаждали через 4 дня после трансфекции центрифугированием при 13000 об/мин в настольной центрифуге Heraeus Biofuge Pico в течение 5 минут и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Образцы собранного супернатанта клеточной культуральной среды разделяли с помощью ДСН-ПААГ с использованием готовых гелей Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™. Разделенные белки переносили на ПВДФ-мембраны с применением Trans-Blot Turbo, системы полусухого блоттинга (Bio-Rad) для анализа методом вестерн-блоттинга. Блот зондировали антителом против IgG4 человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (Invitrogen, кат. №: А10654), которое использовали для визуализации в сочетании с субстратом SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoFisherScientific) и системой визуализации ChemiDoc™ (BioRad).

На Фиг. 3 приведены данные, отражающие сниженную склонность к агрегации в тех случаях, когда вариант реализации настоящего изобретения включает пептидный линкер, представленный в SEQ ID NO: 25.

Невосстанавливающий ДСН-ПААГ СМ из транзиентно трансфицированных суспензионных клеток СНО, экспрессирующих CCN5 (домен III), слитый с аминоконцом химерного Fc-фрагмента IgG2/4 посредством различных пептидных линкеров. Вестерн-блоттинг показывает, что слитый белок с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 31; (dIII)-HLn8-Fcv2.3, имеет меньшую склонность к агрегации, чем слитый белок согласно настоящему изобретению, имеющий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 30; CCN5 (домен III)-Fcv2.3. Этот результат показывает, что пептидный линкер согласно определению в последовательности SEQ ID NO: 25, обеспечивает меньшую склонность к агрегации слитого белка по сравнению со слитым белком, содержащим пептидный линкер согласно определению в последовательности SEQ ID NO: 20.

Пример 8

Последовательности ДНК, кодирующие слитый белок, содержащий либо аминокислоты 194-246 CCN5 (SEQ ID. NO: 1), либо аминокислоты 194-246 CCN5 (SEQ ID. NO: 7), где аминокислота в положении 195 (пролин) заменена на аланин, слитый на С-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 39) и Fc-фрагментом IgG подтипа IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация), экспрессировали для продуцирования рекомбинантного белка в соответствии с SEQ ID NO: 40 (Fc-HLn8-CCN5(dIII)) или SEQ ID NO:: 41 (Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A).

В частности, экспрессионными векторами для экспрессии SEQ ID NO: 40 (Fc-HLn8-CCN5(dIII)) и SEQ ID NO: 41 (Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A) трансфицировали адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО ExpiCHO в соответствии с протоколом «Мах Titer» от изготовителя набора для трансфекции СНО Expifectamine™ (Gibco, кат. №: А29129) и кратким описанием и соавторов, выше. Клетки осаждали через 3 дня после трансфекции центрифугированием при 13000 об/мин в настольной центрифуге Heraeus Biofuge Pico в течение 5 минут и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Образцы собранного супернатанта клеточной культуральной среды разделяли с помощью ДСН-ПААГ с использованием готовых гелей Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™. Разделенные белки переносили на ПВДФ-мембраны с применением Trans-Blot Turbo, системы полусухого блоттинга (Bio-Rad), для анализа методом вестерн-блоттинга. Блот зондировали антителом против IgG4 человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (Invitrogen, кат. №: А10654), которое использовали в сочетании с субстратом SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoFisherScientific) и системой визуализации ChemiDoc™ (BioRad) для визуализации.

На Фиг. 5 приведены данные, отражающие пониженную чувствительность к расщеплению эндопептидазой в тех случаях, когда вариант реализации настоящего изобретения включает мутацию пролин-195 в домене гомологии к повторам TSP-1 CCN5, представленную в SEQ ID NO: 7.

Восстанавливающий ДСН-ПААГ СМ из транзиентно трансфицированных суспензионных клеток СНО, экспрессирующих CCN5(домен III), слитый с карбоксильным концом Fc-фрагмента IgG4 согласно описанию в SEQ ID NO: 15, либо включающий мутацию Р195А (Fc-HLn8-CCN5(dIII)-P195A), либо экспрессирующих вариант дикого типа Р195 домена гомологии к повторам TSP-1 CCN5 (Fc-HLn8-CCN5(dIII)). Указанный блот демонстрирует, что мутация Р195А обеспечивает протеолитическую устойчивость домена гомологии к повторам TSP-1 CCN5.

Пример 9

Раскрыт слитый белок, содержащий аминокислоты 194-250 CCN5 человека (SEQ ID NO: 56), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 57) и Fc-фрагментом IgG человека, подкласса IgG4, из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация), с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 58 (CCN5(dIII)-SL-Fcv0). К указанному слитому белку была дополнительно добавлена N-концевая сигнальная последовательность для секреции, происходящая из альбумина из SEQ ID NO: 32, для получения слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 59, и он был экспрессирован в клетках млекопитающих, как описано ниже.

Последовательность ДНК, кодирующую слитый белок из SEQ ID NO: 59, кодон-оптимизировали для экспрессии белка в клетках хомяка (используя алгоритм коммерческого поставщика), присоединяли последовательность KOZAK для трансляции на 5'-конце и вводили стоп-кодон на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 60. Указанную последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 61. Последовательность из SEQ ID NO: 61 синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик. Синтезированную последовательность рекомбинировали с pDonrZeo путем рекомбиназного клонирования BP Gateway для получения входящего вектора. После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Тор10™), входящий вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с использованием набора QIAprep™ Spin Miniprep от Qiagen™. После выделения плазмиды входящий вектор верифицировали путем расщепления рестрикционными ферментами с последующим гель-электрофорезом ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту.

Входящий вектор, содержащий последовательность SEQ ID NO: 60, дополнительно рекомбинировали с принимающим вектором с применением рекомбиназы LR Gateway. Использовали принимающий вектор pUCOE-DHFR-DEST согласно описанию в источнике: et al., 2018, J. Biol. Chem, 293:46, pp. 17953-17970.

После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Top10™), экспрессионный вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с применением набора QIAGEN™ Plasmid Plus Maxi Kit. Итоговый экспрессионный вектор верифицировали с помощью стандартного расщепления рестрикционными ферментами и гель-электрофореза ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту. Итоговый экспрессионным вектором затем трансфицировали адаптированные для суспензионной культуры клетки ExpiCHO в соответствии с протоколом «Мах Titer» от изготовителя набора для трансфекции СНО Expifectamine™ (Gibco, кат. №: А29129) и кратким описанием и соавторов, 2018, выше. Клетки осаждали через 4 дня после трансфекции центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли ОДМ ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 1 мМ и добавляли 0,5М ЭДТК до концентрации 2 мМ. Затем добавляли 96% этанол до конечной концентрации приблизительно 3%. Добавляли 1М TrisHCl рН 7,4 до конечной концентрации 25 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали аффинной хроматографией с использованием хроматографической среды с белком А. В этом эксперименте использовали хроматографическую среду rProtein А FF (GE Healthcare). Использовали колонку HiTrap ™ rProtein A FF (GE Healthcare) на 5 мл для очищения экспрессированного рекомбинантного белка из 120 мл клеточной культуральной среды, собранной и дополненной согласно описанию, см. выше. Колонку HiTrap ™ rProtein А FF устанавливали в систему скоростной высокопроизводительной жидкостной хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм и уравновешивали буфером, содержащим 25 мМ TrisHCl рН 7,4, 25 мМ NaCl и 3% этанола. Собранную клеточную культуральную среду, содержащую рекомбинантный белок, загружали с помощью пробоотборного насоса со скоростью 2,5 мл/мин, с последующим промыванием 10 объемами колонки промывочного буфера (25 мМ TrisHCl рН 7,4, 25 мМ NaCl и 3% этанола)) до элюирования ОДМ цитратом Na, рН 3,0, в 3% этаноле. Элюированные фракции объемом 3 мл собирали в пробирки с низким связыванием белков, предварительно наполненные 1 мл 1М TrisHCl, рН 9,0. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ на 280 нм, и образцы объединенных фракций объемом 10 мкл, содержащих пик поглощения УФ на 280 нм, подвергали ДСН-ПААГ с использованием готовых гелей Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента β-меркаптоэтанола, и выделенные рекомбинантные белки визуализировали с использованием системы визуализации ChemiDoc™ (BioRad).

Специалисту в данной области техники хорошо известно, что рекомбинантные белки могут быть получены в различных экспрессионных системах и очищены различными хроматографическими способами с получением аналогичных результатов.

На Фиг. 6 показана, что экспрессия и очищение белка, соответствующего SEQ ID NO: 58, действительно приводят к получению белка, мигрирующего выше ожидаемого уровня в отсутствие восстанавливающего агента β-меркаптоэтанола, что, соответственно, указывает на формирование димеров. Однако, как можно видеть по дорожке, которая содержит очищенный белок, в присутствии восстанавливающего агента β-меркаптоэтанола экспрессия и очищение белка, соответствующего SEQ ID NO: 58, приводит в первую очередь к получению расщепленных фрагментов, а не интактного белка.

Пример 10

Получали несколько вариантов последовательности SEQ ID NO: 58 с целью повысить протеолитическую устойчивость белка, соответствующего SEQ ID NO: 58. Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием для получения плазмид согласно описанию в Примере 9, и экспрессировали белки согласно описанию в Примере 9. Указанные варианты включают белки с модификациями, представленные ниже:

1) N-концевая сигнальная последовательность, происходящая из альбумина из SEQ ID NO: 32, со стороны аминоконца фрагмента CCN5, состоящего из аминокислот 194-249, включающего мутацию (P245L), соответствующего SEQ ID NO: 62, в комбинации с усеченным пептидным линкером, соответствующим SEQ ID NO: 63, и Fc-фрагментом SEQ ID NO: 15, с получением последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 64,

2) N-концевая сигнальная последовательность, происходящая из альбумина из SEQ ID NO: 32, со стороны аминоконца фрагмента CCN5, состоящего из аминокислот 194-246, соответствующего SEQ ID NO: 1, в комбинации с вариантом пептидного линкера, соответствующим SEQ ID NO: 65, и Fc-фрагментом из SEQ ID NO: 15, с получением последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 66,

3) N-концевая сигнальная последовательность, происходящая из альбумина из SEQ ID NO: 32, со стороны аминоконца фрагмента CCN5, состоящего из аминокислот 194-246, соответствующего SEQ ID NO: 1, в комбинации с вариантом пептидного линкера, соответствующим SEQ ID NO: 67, и Fc-фрагментом из SEQ ID NO: 15, с получением последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 68,

4) N-концевая сигнальная последовательность, происходящая из альбумина из SEQ ID NO: 32, со стороны аминоконца фрагмента CCN5, состоящего из аминокислот 194-246, соответствующего SEQ ID NO: 1, в комбинации с вариантом пептидного линкера, соответствующим SEQ ID NO: 65, и Fc-фрагментом из SEQ ID NO: 19, с получением последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 69.

Указанные версии (1-4, выше) белка, раскрытого в Примере 12, действительно показали некоторое повышение устойчивости к протеолитическому расщеплению во время экспрессии в системе ExpiCHO, проведенной согласно описанию в Примере 9. Однако при экспрессии белков, соответствующих SEQ ID NO: 64, SEQ ID. NO 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID 69, обнаружилось, что степень протеолитической устойчивости все же была недостаточной, чтобы обеспечить получение интактных очищенных белков.

Пример 11

Получали слитый белок, содержащий аминокислоты 194-237 CCN5, где аминокислота в положении 195 (пролин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 38), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21) и химерным Fc-фрагментом IgG подтипа IgG2/4 с делецией карбоксиконцевого K477- (Eu-нумерация) (SEQ ID NO: 19), с получением SEQ ID NO: 27. К слитому белку дополнительно добавляли N-концевую сигнальную последовательность для секреции, происходящую из альбумина SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 70. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 70, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 71. Указанную последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 72.

Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, и белок, соответствующий SEQ ID NO: 70 экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO согласно описанию в Примере 9.

Клетки осаждали через 6 дней после трансфекции центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ. Добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap ™ MabSelectSuRe™ 1 мл (GE Healthcare) непосредственно за которым следовало высаливание на колонке BioScale™ Mini Bio-Gel® Р-6 10 мл (BioRad). Колонки устанавливали в систему FPLC-хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. Колонку MabSelectSuRe™ устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером, состоящим из 30 мМ цитрата Na, рН 5,5, а колонку Bio-Gel® устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А2 (100 мМ NaH₂PO4/Na₂HPO4 рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонку Bio-Gel®, 140 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на колонку MabSelectSuRe™ с помощью пробоотборного насоса со скоростью 2,0 мл/мин, с последующим промыванием 5 объемами колонки промывочного буфера А1 (30 мМ цитрат Na, рН 5,5), а затем 5 объемами колонки промывочного буфера A3 (30 мМ цитрат Na, 0,5М NaCl, рН 5,5), и затем 3 объемами колонки промывочного буфера А1. До элюирования элюирующим буфером (30 мМ лимонная кислота, рН 3,4) колонку Bio-Gel®, установленную на второй клапан для переключения колонки, устанавливали в положение для подключения к проточному каналу. После элюирования 2 мл элюирующего буфера колонку MabSelectSuRe™ отключали от проточного канала и очищенный белок элюировали с колонки Bio-Gel® буфером А2. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 100 мЕОП. Собранные фракции объединяли и образец 10 мкл подвергали ДСН-ПААГ с использованием готовых гелей Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ в присутствии восстанавливающего агента β-меркаптоэтанола, и выделенные рекомбинантные белки визуализировали с использованием системы визуализации ChemiDoc™ (BioRad).

На Фиг. 7 показано, что экспрессия и очищение белка, соответствующего SEQ ID NO: 27, где карбоксиконцевой фрагмент CCN5 усеченный, по существу более протеолитически устойчивы, чем варианты, где присутствуют все карбоксиконцевые аминокислоты CCN5 (как в SEQ ID NO: 58, 64, 66, 68 и 69), даже несмотря на то, что клеточную культуральную среду собирали позже на 2 дня после субкультивирования по сравнению с Примером 9 (Фиг. 6).

Пример 12

Получали слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3, где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 44), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21) и химерным Fc-фрагментом IgG подтипа IgG2/4 с делецией карбоксиконцевого K477- (Eu-нумерация) (SEQ ID NO: 19), с получением слитого белка из SEQ ID NO: 73. К слитому белку дополнительно добавляли N-концевую сигнальную последовательность для секреции, происходящую из альбумина SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 74. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 74, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 75. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 76.

Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, и белок, соответствующий SEQ ID NO: 74, экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO согласно описанию в Примере 9.

Клетки осаждали через 5 дней после трансфекции центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ. Добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ MabSelectSuRe™ 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке 53 мл HiPrep™ 26/10 (GE Healthcare). Колонки устанавливали в систему FPLC-хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. Колонку MabSelectSuRe™ устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером, состоящим из 30 мМ цитрата Na, рН 5,5, а колонку HiPrep™ устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А2 (100 мМ NaH₂PO4/Na₂HPO4 рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонку HiPrep™, 260 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на колонку MabSelectSuRe™ с помощью пробоотборного насоса со скоростью 3,5 мл/мин, с последующим промыванием 5 объемами колонки промывочного буфера А1 (30 мМ цитрат Na, рН 5,5), затем 5 объемами колонки промывочного буфера A3 (30 мМ цитрат Na, 0,5М NaCl, рН 5,5), и затем 2 объемами колонки промывочного буфера А1. До элюирования элюирующим буфером (30 мМ лимонная кислота, рН 3,4) колонку HiPrep™, установленную на второй клапан для переключения колонки, устанавливали в положение для подключения к проточному каналу. После элюирования 10 мл элюирующего буфера колонку MabSelectSuRe™ отключали от проточного канала, и очищенный белок элюировали с колонки HiPrep™ буфером А2. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 100 мЕОП. Собранные фракции объединяли и образец объемом 10 мкл подвергали ДСН-ПААГ с использованием готовых гелей Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента β-меркаптоэтанола и выделенные рекомбинантные белки визуализировали с использованием системы визуализации ChemiDoc™ (BioRad).

На Фиг. 8 можно видеть, что слитый белок, содержащий аминокислоты, происходящие из CCN3/NOv (домен III/домен гомологии с TSP-1), согласно описанию в SEQ ID NO: 73, аналогичный слитому белку, содержащему аминокислоты, происходящие из гомологичного CCN5 (домен III/домен гомологии с TSP-1), согласно описанию в SEQ ID NO: 27, обладает аналогичной или лучшей устойчивостью к протеолизу, чем слитый белок, содержащий аминокислоты, происходящие из CCN5, согласно описанию в Примере 11 и на Фиг. 7.

Пример 13

Слитый белок, содержащий аминокислоты 194-246 CCN5, где аминокислота в положении 195 (пролин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 7), слитый на С-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 39) и Fc-фрагментом IgG подкласса IgG4 из SEQ ID NO: 15 (S228P, F234A, L235A, K447-, Eu-нумерация), с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 41, дополняли N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 77. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 77, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 78. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 79.

Последовательность из SEQ ID NO: 79 синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик. Синтезированную последовательность рекомбинировали с pDonrZeo путем рекомбиназного клонирования BP Gateway для получения входящего вектора. После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Top10™), входящий вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с использованием набора QIAprep™ Spin Miniprep от Qiagen™. После выделения плазмиды входящий вектор верифицировали путем расщепления рестрикционными ферментами с последующим гель-электрофорезом ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту.

Входящий вектор, содержащий последовательность SEQ ID NO: 78, дополнительно рекомбинировали с принимающим вектором с применением рекомбиназы LR Gateway. Использовали принимающий вектор pUCOE-DHFR-DEST, согласно описанию в источнике: et al., 2018, J. Biol. Chem, 293:46, pp. 17953 - 17970.

После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Top10™), экспрессионный вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с применением набора QIAGEN™ Plasmid Plus Maxi Kit. Итоговый экспрессионный вектор верифицировали с помощью стандартного расщепления рестрикционными ферментами и гель-электрофореза ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту. Затем итоговый экспрессионный вектор переносили в адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО DG44 путем электропорации с использованием системы трансфекции Neon (ThermoFisherScientilic).

Клетки поддерживали в вентилируемых колбах Эрленмейера в инкубаторах для клеточных культур при 37°С с 8% CO₂ на шейкерной платформе (согласно описанию Kaasbøll и соавторов, выше). Трансфицированные клетки выдерживали в течение ночи в среде CD для клеток DG44 (Gibco, кат. №12610-010) до перенесения в среду HyClone ™ ActiPro™ (без гипоксантина и тимидина, GE Healthcare), и субкультивировали до 80% жизнеспособности, в этот момент в среду добавляли 0,1 мкМ метотрексат. После добавления 0,1 мкМ метотрексата клетки субкультивировали до повторного достижения 80% жизнеспособности, в этот момент в среду добавляли 1 мкМ метотрексат. Клетки снова субкультивировали до превышения 98% жизнеспособности и снижения времени удвоения до менее чем 26 часов, после чего пул клеток считали стабильно трансфицированным. После получения стабильного пула клеток объем клеточной культуры увеличивали, чтобы обеспечить заселение стабильно трансфицированными клетками для продуцирования с плотностью, составляющей 1*10⁶ клеток/мл. В культуры клеток добавляли 4/0,4% по объему HyClone™ Cell Boost™ 7a/7b ежедневно, начиная с 3 дня после субкультивирования. Через 10 дней клетки осаждали центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1 М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ. Добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ MabSelectSuRe™ 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare), согласно описанию в Примере 15. Очищенный белковый состав (без наблюдаемых признаков протеолитического процессинга) затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 9, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 41, продуцированный стабильно трансфицированным пулом суспензионных клеток СНО, неожиданным образом не показал признаков способности ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473).

Пример 14

Получали слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3 (SEQ ID NO: 44), где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин, слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 22) и химерным Fc-фрагментом IgG подтипа IgG2/4 (SEQ ID NO: 19), с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 80, которую дополняли N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 81. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 81, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 82. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 83.

Последовательность из SEQ ID NO: 83 синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик. Синтезированную последовательность рекомбинировали с pDonrZeo путем рекомбиназного клонирования BP Gateway для получения входящего вектора. После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Top10™), входящий вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с использованием набора QIAprep™ Spin Miniprep от Qiagen™. После выделения плазмиды входящий вектор верифицировали путем расщепления рестрикционными ферментами с последующим гель-электрофорезом ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту.

Входящий вектор, содержащий последовательность SEQ ID NO: 82, дополнительно рекомбинировали с принимающим вектором с применением рекомбиназы LR Gateway. Использовали принимающий вектор pUCOE-DHFR-DEST, согласно описанию в источнике: et al., 2018, J. Biol. Chem, 293:46, pp.17953-17970.

После трансфекции компетентных E.coli, мутированных так, чтобы позволять эффективное размножение плазмид (клетки One Shot Top10™), экспрессионный вектор выделяли с помощью стандартных методик выделения плазмид с применением набора QIAGEN™ Plasmid Plus Maxi Kit. Итоговый экспрессионный вектор верифицировали с помощью стандартного расщепления рестрикционными ферментами и гель-электрофореза ДНК в соответствии со стандартными методиками, хорошо известными специалисту. Затем итоговый экспрессионный вектор переносили в адаптированные к суспензионной культуре клетки СНО ExpiCHO в соответствии с протоколом «Создания и масштабирования стабильной клеточной линии с использованием продуктов ExpiCHO™» от изготовителя среды для продуцирования ExpiCHO™ Stable Production Medium (Gibco, кат. №:A3711001). Клетки поддерживали в вентилируемых колбах Эрленмейера в инкубаторах для клеточных культур при 37°С с 8% CO₂ на шейкерной платформе (согласно описанию Kaasbøll и соавторов, выше). Трансфицированные клетки выдерживали в течение ночи в среде для экспрессии в клетках ExpiCHO™ до перенесения на среду для экспрессии в клетках ExpiCHO™ с добавлением 0,1 мкМ метотрексата. Затем клетки субкультивировали до повторного достижения 80% жизнеспособности, в этот момент в среду добавляли 1 мкМ метотрексат. Клетки снова субкультивировали до превышения 95% жизнеспособности и снижения времени удвоения до менее чем 20 часов, после чего пул клеток считали стабильно трансфицированным. После получения стабильного пула клеток объем клеточной культуры увеличивали, чтобы обеспечить заселение стабильно трансфицированными клетками для продуцирования с плотностью, составляющей 1*10^∧6 клеток/мл. Через 5 дней клетки осаждали центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ. Добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ и добавляли 2М L-аргинин, рН 4,0 до конечной концентрации 100 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ MabSelect PrismA™ 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare), с использованием протокола согласно описанию в Примере 12, за исключением добавления 100 мМ L-Аргинина в буфер A1, А2, A3 и В1. Затем очищенный белковый состав (не проявляющий признаков протеолитического процессинга) тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 10, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 80, продуцированный стабильно трансфицированным пулом суспензионных клеток СНО, неожиданным образом не показал признаков способности ингибировать фосфорилирование AKT (серина 473) демонстрируя, что ни один из составов интактных димерных слитых с Fc белков, содержащих аминокислоты, происходящие из CCN5 (SEQ ID NO: 41, Пример 13, Фиг. 9) или аминокислоты, происходящие из CCN3 (SEQ ID NO: 80) не является биологически активным.

Пример 15

Экспрессионную плазмиду, описанную в Примере 14, содержащую SEQ ID NO: 82, кодирующую слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3 (SEQ ID NO: 44), где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин, слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 22) и химерным Fc-фрагментом IgG подтипа IgG2/4 (SEQ ID NO: 19) с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 80, также дополненной N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32 и соответствующей SEQ ID NO: 81, экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 9. Клетки осаждали, согласно описанию в Примере 14, через 6 дней после трансфекции, и в среду вносили добавки согласно описанию в Примере 14. Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ MabSelect PrismA™ 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare), согласно описанию в Примере 14.

Очищенный белковый состав (который был частично протеолитически процессирован) затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 11, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 80, продуцированный транзиентно трансфицированными клетками ExpiCHO™, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473), демонстрируя, что экспрессионная система, используемая для получения слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 80, и, следовательно, степень наблюдаемого протеолитического процессинга существенно влияют на активность или отсутствие активности итогового белкового состава.

Пример 16

Слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3 (SEQ ID NO: 44), где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин, слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21) и Fc-фрагментом с индуцирующими образование мономеров и продлевающими время полужизни мутациями (SEQ ID NO: 55), с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 84, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 85. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 85, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 86. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 86. Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, и их экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 9. Клетки осаждали, согласно описанию в Примере 14, через 5 дней после трансфекции и в среду вносили добавки согласно описанию в Примере 14. Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ MabSelect PrismA™ 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare) согласно описанию в Примере 14.

Очищенный белковый состав, который демонстрировал ожидаемую мономерную форму, затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 12, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 84, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473), демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домена гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 17

Слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3 (SEQ ID. NO: 44), где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин, слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21) и Fc-фрагментом с индуцирующими образование мономеров и стабильность мутациями (SEQ ID NO: 54), с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 88, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32 с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 89. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 89, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 90. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 91. Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9 и их экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 9. Клетки осаждали, согласно описанию в Примере 14, через 6 дней после трансфекции и в среду вносили добавки согласно описанию в Примере 14. Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ MabSelect PrismA™ 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare), согласно описанию в Примере 14.

Очищенный белковый состав, который в основном демонстрировал ожидаемую мономерную форму, затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 13, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 88, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473), демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домен гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 18

Слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3 (SEQ ID NO: 44), где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин, слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 93) и многофункциональной меткой, включающей метку 6xHis, HaloTag и элементы Sumo* (SEQ ID NO: 92), с получением последовательности белка, соответствующего SEQ ID NO: 94, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 114. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 114, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 95. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 96. Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, и их экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 15. Клетки осаждали, согласно описанию в Примере 14, через 5 дней после трансфекции. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ, добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ и 2М L-аргинин, рН 4,0 до конечной концентрации 0,1М; и добавляли имидазол до конечной концентрации 5 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке HiTrap™ HisTrap™ Excel 5 мл (GE Healthcare), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare). Колонки устанавливали в систему FPLC-хроматографии (BioRad NGC Discover™ 10 Pro система), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. Колонку HisTrap™ устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1, состоящим из 5 мМ имидазола, 50 мМ NaCl, 100 мМ L-аргинина, а колонку HiPrep™ устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А2 (100 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 100 мМ L-аргинин, рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонку HiPrep™, 250 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на колонку HisTrap™ с помощью пробоотборного насоса со скоростью 3,5 мл/мин, с последующим промыванием 5 объемами колонки промывочного буфера А1, затем 5 объемами колонки промывочного буфера A3 (5 мМ Имидазол, 0,5М NaCl, 100 мМ L-Аргинин), и затем 2 объемами колонки промывочного буфера А1. До элюирования элюирующим буфером (250 мМ Имидазол, 50 мМ NaCl, 100 мМ L-Аргинин) колонку HiPrep™, установленную на второй клапан для переключения колонки, устанавливали в положение для подключения к проточному каналу. После элюирования 10 мл элюирующего буфера колонку HisTrap™ отключали от проточного канала и очищенный белок элюировали с колонки HiPrep™ буфером А2. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 60 мЕОП.

Очищенный белковый состав, который демонстрировал ожидаемую мономерную форму, затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 12, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 94, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473), демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домена гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 19

Слитый белок, содержащий аминокислоты 194-237 CCN5, где аминокислота в положении 195 (пролин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 38), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21), и аминокислоты 25-609 сывороточного альбумина человека (SEQ ID NO: 52), с получением SEQ ID NO: 97, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 98. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 98, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 99. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 100.

Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, а суспензионные клетки СНО DG44, сконструированные для экспрессии конститутивно активной формы AKT, использовали для получения стабильного пула суспензионных клеток СНО, экспрессирующих белок из SEQ ID NO: 98 согласно описанию в Примере 13. После получения стабильного пула клеток объем клеточной культуры увеличивали, чтобы обеспечить заселение стабильно трансфицированными клетками для продуцирования с плотностью, составляющей 1*10⁶ клеток/мл. Через 6 дней клетки осаждали центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды, добавляли ОДМ ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ, добавляли 0,5М ЭДТК до конечной концентрации 2 мМ, добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ и добавляли 2М L-аргинин, рН 4,0 до конечной концентрации ОДМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке Tricorn (GE Healthcare) заполненная 3 мл матрицы для очищения альбумина человека Capture Select™ Human Albumin Affinity Matrix (ThermoFisherScientific), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare). Колонки устанавливали в систему FPLC-хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. Содержащую CaptureSelect™ колонку устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1, состоящим из 100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинина, рН 6,5, а колонку HiPrep™ устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинина, рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонку HiPrep™, 500 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на содержащую CaptureSelect™ колонку с помощью пробоотборного насоса со скоростью 2,0 мл/мин, с последующим промыванием 5 объемами колонки промывочного буфера А1, затем 5 объемами колонки промывочного буфера А2 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-Аргинин, 0,25М NaCl, рН 6,5), и затем 5 объемами колонки промывочного буфера А1. До элюирования элюирующим буфером (30 мМ лимонная кислота, рН 3,5+0,5М L-аргинин) колонку HiPrep™, установленную на второй клапан для переключения колонки, устанавливали в положение для подключения к проточному каналу. После элюирования 10 мл элюирующего буфера содержащую CaptureSelect™ колонку отключали от проточного канала и очищенный белок элюировали с колонки HiPrep™ буфером А1. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 100 мЕОП.

Очищенный белковый состав, который демонстрировал ожидаемую мономерную форму, затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 14, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 97, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473) демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домена гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 20

Слитый белок сывороточного альбумина человека (аминокислоты 25-606, SEQ ID NO: 101) сливали на С-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 22), соединенным с аминокислотами 194-246 CCN5 человека, где аминокислота в положении 195 (пролин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 7), с получением SEQ ID NO: 103. Слитый белок, соответствующий SEQ ID NO: 102, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 103. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 103, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 104. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 105.

Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9 и DG44 суспензионные клетки СНО, сконструированные для экспрессии конститутивно активной формы AKT, использовали для получения стабильного пула суспензионных клеток СНО, экспрессирующих указанный белок из SEQ ID NO: 104 согласно описанию в Примере 13. После получения стабильного пула клеток объем клеточной культуры увеличивали, чтобы обеспечить заселение стабильно трансфицированными клетками для продуцирования с плотностью, составляющей 1*10⁶ клеток/мл. Через 6 дней клетки осаждали центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ, добавляли 0,5М ЭДТК до конечной концентрации 2 мМ, добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ и добавляли 2М L-аргинин, рН 4,0 до конечной концентрации 0,1М перед хроматографическим очищением.

Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке Tricorn (GE Healthcare), заполненной 3 мл матрицы CaptureSelect™ Human Albumin Affinity Matrix (ThermoFisherScientific), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare) согласно описанию в Примере 19, за исключением того, что скорость загрузки образцов составляла 0,37 мл/мин вместо 2,0 мл/мин.

Очищенный белковый состав, который демонстрировал ожидаемую мономерную форму, затем тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 14, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 102, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473) демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домен гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 21

Слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3, где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 44), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21) и аминокислотами 25 609 сывороточного альбумина человека (SEQ ID NO: 52) с получением SEQ ID NO: 106, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 107. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 107, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 108. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 109.

Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, и их экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 9. Клетки осаждали, согласно описанию в Примере 14, через 6 дней после трансфекции, и в среду вносили добавки согласно описанию в Примере 19. Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке Tricorn (GE Healthcare), заполненной 10 мл матрицы CaptureSelect™ Human Albumin Affinity Matrix (ThermoFisherScientific), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare). Колонки устанавливали в систему FPLC-хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. Содержащую CaptureSelect™ колонку устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1, состоящим из 100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинина, рН 6,5, а колонку HiPrep™ устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинин, рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонку HiPrep™, 500 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на содержащую CaptureSelect™ колонку с помощью пробоотборного насоса со скоростью 1,0 мл/мин, с последующим промыванием 3 объемами колонки промывочного буфера А1, затем 2 объемами колонки промывочного буфера А2 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-Аргинин, 0,25М NaCl, рН 6,5), и затем 3 объемами колонки промывочного буфера А1. До элюирования элюирующим буфером (30 мМ лимонная кислота, рН 3,5+0,1М L-аргинин) колонку HiPrep™, установленную на второй клапан для переключения колонки, устанавливали в положение для подключения к проточному каналу. После элюирования 15 мл элюирующего буфера содержащую Capture Select™ колонку отключали от проточного канала и очищенный белок элюировали с колонки HiPrep™ буфером А1. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 100 мЕОП.

Затем очищенный белковый состав, который содержал ожидаемую мономерную форму, тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 12, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 106, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473), демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домена гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 22

Слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3, где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 44), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 22) и аминокислот 25-609 сывороточного альбумина человека (SEQ ID NO: 52) с получением SEQ ID NO: 110, был дополнен N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32, с получением слитого белка, соответствующего SEQ ID NO: 111. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок из SEQ ID NO: 111, была кодон-оптимизирована для экспрессии белка в клетках хомяка (с использованием алгоритма коммерческого поставщика), последовательность KOZAK для трансляции присоединяли на 5'-конце, а стоп-кодон вводили на 3'-конце, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 112. Последовательность ДНК также дополняли на обоих концах сайтами attB Gateway, получая последовательность ДНК из SEQ ID NO: 113.

Последовательности ДНК синтезировал и верифицировал коммерческий поставщик перед субклонированием с получением плазмид согласно описанию в Примере 9, и их экспрессировали путем транзиентной трансфекции клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 9. Клетки осаждали, согласно описанию в Примере 14, через 6 дней после трансфекции, и в среду вносили добавки согласно описанию в Примере 19. Белок очищали тандемной хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке Tricorn (GE Healthcare), заполненной 10 мл матрицы CaptureSelect™ Human Albumin Affinity Matrix (ThermoFisherScientific), непосредственно за которым следовало высаливание на высаливающей колонке HiPrep™ 26/10 53 мл (GE Healthcare). Колонки устанавливали в систему FPLC-хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм. Содержащую CaptureSelect™ колонку устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1, состоящим из 100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинина, рН 6,5, а колонку HiPrep™ устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинин, рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонку HiPrep™, 300 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на содержащую CaptureSelect™ колонку с помощью пробоотборного насоса со скоростью 1,0 мл/мин, с последующим промыванием 3 объемами колонки промывочного буфера А1, затем 2 объемами колонки промывочного буфера А2 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-Аргинин, 0,25М NaCl, рН 6,5), и затем 3 объемами колонки промывочного буфера А1. До элюирования элюирующим буфером (30 мМ лимонная кислота, рН 3,5+0,5М L-аргинин) колонку HiPrep™, установленную на второй клапан для переключения колонки, устанавливали в положение для подключения к проточному каналу. После элюирования 15 мл элюирующего буфера содержащую CaptureSelect™ колонку отключали от проточного канала и очищенный белок элюировали с колонки HiPrep™ буфером А1. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 100 мЕОП.

Затем очищенный белковый состав, который содержал ожидаемую мономерную форму, тестировали на способность ингибировать способствующую выживанию сигнализацию (фосфорилирование серина-473 AKT) в клетках рака легкого человека А549 согласно описанию в Примере 2. Как можно видеть на Фиг. 15, очищенный белок, соответствующий SEQ ID NO: 110, проявлял зависимую от концентрации способность ингибировать фосфорилирование AKT (серии 473), демонстрируя, что другой мономерный слитый белок, содержащий аминокислоты из домена III/домена гомологии с TSP-1 белка CCN, обладал способностью ингибировать фосфорилирование AKT (серин-473) в клетках рака легкого человека А549.

Пример 23

Экспрессионная плазмида, описанная в Примере 21, содержащая SEQ ID NO: 108, кодирующую слитый белок, содержащий аминокислоты 206-249 CCN3, где аминокислота в положении 207 (изолейцин) заменена на аланин (SEQ ID NO: 44), слитый на N-конце с пептидным линкером (SEQ ID NO: 21), и аминокислоты 25-609 сывороточного альбумина человека (SEQ ID NO: 52), также дополненный N-концевой сигнальной последовательностью для секреции, происходящей из альбумина из SEQ ID NO: 32 и соответствующей SEQ ID NO: 107, использовали для получения пула стабильно трансфицированных клеток ExpiCHO™ согласно описанию в Примере 14. Для получения партии кондиционированной среды, содержащей секретируемый белок, соответствующий SEQ ID NO: 106, пул стабильно трансфицированных клеток размножали, чтобы обеспечить заселение объема 250 мл стабильно трансфицированными клетками с плотностью 1*10⁶ клеток/мл. В культуры клеток добавляли 5% по объему 2Х EfficientFeed™ С+(Gibco™) через день, начиная с 2 дня после субкультивирования, 3% глюкозы (10% масса/объем) на 2 день после субкультивирования и 5% глюкозы (10% масса/объем) на 6 день после субкультивирования. Через 9 дней клетки осаждали центрифугированием при 4750xg в течение 20 минут при 4°С и собирали супернатант клеточной культуральной среды. Добавляли 0,1М ПМСФ в 100% изопропаноле до концентрации 0,1 мМ. Добавляли 1М цитрат Na, рН 5,5 до конечной концентрации 30 мМ, и 2М L-аргинин, рН 4,0 до конечной концентрации 100 мМ перед хроматографическим очищением.

Белок очищали 20-хроматографией, состоящей из этапа захвата на колонке Tricorn (GE Healthcare), заполненной 10 мл матрицы CaptureSelect™ Human Albumin Affinity Matrix (ThermoFisherScientific), непосредственно за которым следовала эксклюзионная хроматография на двух последовательно соединенных колонках Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare). Колонки были установлены в систему FPLC-хроматографии (система BioRad NGC Discover™ 10 Pro), оснащенную проточной кюветой для УФ-детекции с длиной оптического пути 5 мм и выходным клапаном, соединенным с контуром для образцов на 5 мл. Содержащую CaptureSelect™ колонку устанавливали на первый клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1, состоящим из 100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинина, рН 6,5, а колонки Superdex 200 Increase устанавливали на второй клапан для переключения колонки и уравновешивали буфером А1 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-аргинин, рН 6,5). При установленном в положение для обхода втором клапане для переключения колонки, содержащем колонки Superdex 200 Increase, 120 мл собранной клеточной культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок, загружали на содержащую CaptureSelect™ колонку с помощью пробоотборного насоса со скоростью 3,9 мл/мин. После загрузки собранную клеточную культуральную среду, содержащую рекомбинантный белок, на содержащую CaptureSelect™ колонку, ее промывали 3 объемами колонки буфера А1, затем 2 объемами колонки буфера А2 (100 мМ NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 100 мМ L-Аргинин, 0,25М NaCl, рН 6,5), и затем 3 объемами колонки буфера А1. Проводили элюирование содержащей CaptureSelect™ колонки 15 мл буфера В1 (30 мМ лимонная кислота, 0,5М L-аргинин, рН 3,5), при этом которого система была настроена на сбор элюата с показателями поглощения выше 1200 мЕОП, в контур для образцов. После элюирования содержащей CaptureSelect™ колонки, соединенной с первым клапаном для переключения колонки, ее отключали от проточного канала, а второй клапан для переключения колонки устанавливали в положение для подключения колонок, содержащих Superdex 200 Increase, к проточному каналу. Затем элюат с содержащей CaptureSelect™ колонки, содержащий элюировавший белок, загружали на колонки, содержащие Superdex 200 Increase, с буфером А1 со скоростью 0,5 мл/мин. Элюирование белка отслеживали по поглощению УФ при 280 нм и запускали сбор, когда показатель поглощения превышал 200 мЕОП. Затем очищенный белковый состав, который содержал ожидаемую мономерную форму, тестировали на способность ингибировать индуцированные ТФР-β и активным CCN2 виды активности нормальных фибробластов легких человека (NHLF) (Lonza Bioscience, Кат. №: СС-2512). NHLF субкультивировали в полной ростовой среде (Lonza Bioscience BulletKit (Кат. №: СС-3132) со всеми добавками (2% фетальной бычьей сыворотки, инсулин, hFGF-B, гентамицин/амфотерицин-В)) для поддержания плотности с максимальной конфлюентностью 80% в соответствии с инструкциями продавца (Lonza Bioscience). Активный CCN2 состоял из доменов 3-4 CCN2, и был продуцирован и очищен согласно описанию у и соавторов, 2018, выше.

Для тестирования эффекта белка, соответствующего SEQ ID NO: 106, на индуцированную активным CCN2 и ТФР-β миграцию клеток NHLF (анализ в системе Transwell/модифицированный анализ в камере Бойдена), клетки сначала рассоединяли трипсином/ЭДТК, нейтрализовали реагентами для нейтрализации трипсина (Lonza Bioscience, Кат. № СС-5034) и ресуспендировали в базальных ростовых средах (Базальная среда для фибробластов (LonzaBioscience Кат. №: СС-3131, без каких-либо добавок, кроме генсумицина (50 мкг/мл))), после чего высевали 30000 клеток в объеме 100 мкл на лунку с верхней стороны вкладышей Transwell с размером пор 5 мкм (24-луночный планшет, Corning® Transwell®, Кат. № CLS3402-48EA от SigmaAldrich (Merck KGaA)). Нижняя камера лунок содержала тестируемые вещества или контрольный носитель, растворенные в 500 мкл базальной ростовой среды без каких-либо добавок, кроме генсумицина. Через 20 часов инкубации вкладыши убирали из лунок, дважды промывали, погружая в забуференный фосфатом солевой раствор (ФСБ, Lonza Bioscience, Кат. №: 17-512F), после чего фиксировали в 4% формальдегиде (Solveco, Швеция, Кат. №: 621092) в течение 15 минут при 37°С. Клетки пермеабилизировали обработкой 0,1% Triton Х-100 в ФСБ в течение 10 минут, после чего дважды промывали ФСБ. Немигрировавшие клетки на верхней стороне вкладышей удаляли, соскабливая ватным тампоном, после чего мембрану оставляли для высыхания. Ядра мигрировавших клеток на обратной стороне вкладышей окрашивали раствором Hoechst 33342 20 мМ (1:5000 в ФСБ, ThermoFisherScientific, Кат. №: 62249) в течение 15 минут в темноте, после чего дважды промывали, погружая в ФСБ. Мембрану вырезали из вкладыша Transwell и монтировали на предметных стеклах, стороной с мигрировавшими клетками к стеклу, покрытому одной каплей Pro Long™ Gold Antifade (ThermoFisherScientific, Кат. №: P36934), закрывали стеклянным покровным стеклом, и по 5-10 изображений каждой лунки захватывали с помощью системы визуализации Zeiss Axio Observer Z.1. Изображения анализировали полуавтоматически с использованием программного обеспечения ImageJ v1.51k, Rasband, WS, ImageJ, от Национальных институтов здравоохранения США, Бетесда, Мэриленд, США, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2018 гг..). Как можно видеть на Фиг. 16А, белок, соответствующий SEQ ID NO: 106, ингибирует миграцию, индуцированную как ТФР-β, так и активным CCN2.

Для тестирования эффекта белка, соответствующего SEQ ID NO: 106, на индуцированные активным CCN2 и ТФР-β результаты анализа зарастания царапины, NHLF рассоединяли трипсином/ЭДТК, нейтрализовали реагентами для нейтрализации трипсина (Lonza Bioscience, Кат. № СС-5034), после чего высевали 100000 клеток в объеме 1 мл в обработанные для культивирования тканей 12-луночные планшеты (Corning Costar®, Кат. № 3513). На следующий день после высевания клетки двукратно промывали 0,9% NaCl и полную ростовую среду заменяли на базальную ростовую среду. После инкубации в базальной ростовой среде в течение 16-20 часов на монослой клеток наносили царапину стерильным наконечником для пипетки на 12,5 мкл (ThermoFisherScientific, Кат. №: 94420053), клетки однократно промывали ФСБ, после чего инкубировали в 1 мл базальной ростовой среды совместно с тестируемыми веществами или носителем. Клетки инкубировали в течение дополнительных 24 часов до троекратного промывания ФСБ до фиксации в течение 15 минут при 37°С в 4% формальдегиде. После фиксации клетки снова промывали в течение 3x3 минут в ФСБ, осторожно встряхивая, пермеабилизировали 0,1% Triton Х-100 в ФСБ в течение 10 минут, осторожно встряхивая. Ядра клеток окрашивали 20 мМ раствором Hoechst 33342 (1:5000, разведенный в ФСБ), ThermoFisherScientific, Кат. №: 62249) в течение 15 минут в темноте, после чего промывали 3x5 минут в ФСБ, осторожно встряхивая. Наносили 1 каплю Pro Long™ Gold Antifade (ThermoFisherScientific, Кат. №: P36934) до монтировки препаратов и захватывали по 5 изображений, с центром на остающемся зазоре в каждой лунке, с помощью системы визуализации Zeiss Axio Observer Z.1. Изображения анализировали путем измерения размера оставшегося зазора после нанесения царапины через 3 фиксированных интервала вдоль всей длины царапины. Вычисляли среднее для всех измерений на всех изображениях из каждой лунки и засчитывали как один биологический репликат. Как можно видеть на Фиг. 16 В, белок, соответствующий SEQ ID NO: 106, ингибирует зарастание царапины, индуцированное как ТФР-β, так и активным CCN2.

Для тестирования эффекта белка, соответствующего SEQ ID NO: 106, на индуцированную ТФР-β регуляцию генов, NHLF рассоединяли трипсином/ЭДТК, нейтрализовали реагентами для нейтрализации трипсина (Lonza Bioscience, Кат. № СС-5034), после чего высевали 100000 клеток в объеме 1 мл в обработанные для культивирования тканей 12-луночные планшеты (Corning Costar®, Кат. № 3513). На следующий день после высевания клетки двукратно промывали 0,9% NaCl и полную ростовую среду заменяли на базальную ростовую среду с добавлением 0,1% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Кат. № 16000-044 от Gibco™, термоинактивацию проводили согласно описанию в Примере 2). После инкубации в базальной ростовой среде с 0,1% фетальной бычьей сыворотки в течение 6 часов добавляли в лунки тестируемые вещества или контрольный носитель. Через 96 часов лунки двукратно промывали в ФСБ и экстрагировали РНК с использованием набора для экстракции РНК Qiagen RNeasy (Кат. № 74106) в соответствии с протоколом изготовителя. Концентрации РНК количественно определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, США), разводили водой без нуклеаз до конечной концентрации РНК 50 нг/мкл перед использованием 200 нг РНК из каждого репликата для получения кДНК с помощью набора для обратной транскрипции TaqMan™ (Кат. № N8080234) в соответствии с протоколом производителя. Дифференциальную генную экспрессию анализировали в полученных образцах кДНК с применением соответствующих анализов TaqMan™ и мастер-микса TaqMan Fast Advanced Master Mix (ThermoFisherScientific Кат. № 4444557). (ThermoFisherScientific Кат. № 4444557). Реакции ПЦР в реальном времени TaqMan™ проводили с получением технических трипликатов для каждого образца, используя систему ПЦР в реальном времени Applied Biosystems StepOnePlus Real Time PCR в соответствии с протоколами изготовителя. Относительные количества разных транскриптов вычисляли по стандартной кривой до усреднения данных технических трипликатов для получения единственного значения для каждого образца. Все результаты генной экспрессии сопоставляли с уровнями мРНК ГАФДГ (ThermoFisherScientific, Кат. № Hs02786624_g1) и нормировали, выражая в виде показателя кратности относительно среднего значения для лунок, стимулированных контролем-носителем. Как можно видеть на Фиг. 19C-F, белок, соответствующий SEQ ID NO: 107, обеспечивает частичное ингибирование индуцированных ТФР-β генов; COL1A1 («коллаген типа 1 α-1», ThermoFisherScientific, Кат. № Hs00164004_m1), FN1 («фибронектин 1», ThermoFisherScientific, Кат. № Hs01549976_m1), АСТА2 («гладкомышечный актин α-2», ThermoFisherScientific, Кат. № Hs00426835_g1) и CCN2 (ThermoFisherScientific, Кат. № Hs00170014_m1), которые обычно рассматривают как профибротические гены.

Нумерация белков CCN: в соответствии с базой данных Uniprot, согласно описанию в разделе «Подробное описание изобретения», выше. Нумерация Fc-фрагментов: в соответствии с системой нумерации Ей согласно описанию в разделе «Подробное описание изобретения», выше.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Oslo Universitetssykehus HF/ Осло Университетссикехус ХФ

<120> Recombinant CCN domain proteins and fusion proteins/

РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ И СЛИТЫЕ БЕЛКИ С ДОМЕНАМИ CCN

<130> 27.11.145331/01

<150> EP 19163970.7

<151> 2019-03-20

<160> 121

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 53

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln

50

<210> 2

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Cys Ile Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys

35 40

<210> 3

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys

35 40

<210> 4

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu

20 25 30

Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys

35 40

<210> 5

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Cys Ile Ala Tyr Thr Ser Pro Trp Ser Pro Cys Ser Thr Ser Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Val Ser Thr Arg Ile Ser Asn Val Asn Ala Gln Cys Trp Pro

20 25 30

Glu Gln Glu Ser Arg Leu Cys Asn Leu Arg Pro Cys

35 40

<210> 6

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Cys Leu Val Gln Ala Thr Lys Trp Thr Pro Cys Ser Arg Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Asn Arg Val Thr Asn Glu Asn Ser Asn Cys Glu Met

20 25 30

Arg Lys Glu Lys Arg Leu Cys Tyr Ile Gln Pro Cys

35 40

<210> 7

<211> 53

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN5

<400> 7

Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln

50

<210> 8

<211> 55

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 8

Cys Leu Val Gln Ala Thr Lys Trp Thr Pro Cys Ser Arg Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Asn Arg Val Thr Asn Glu Asn Ser Asn Cys Glu Met

20 25 30

Arg Lys Glu Lys Arg Leu Cys Tyr Ile Gln Pro Cys Asp Ser Asn Ile

35 40 45

Leu Lys Thr Ile Lys Ile Pro

50 55

<210> 9

<211> 53

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Cys Ile Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Gln Glu Pro

35 40 45

Glu Gln Pro Thr Asp

50

<210> 10

<211> 52

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Asp Leu

35 40 45

Glu Glu Asn Ile

50

<210> 11

<211> 52

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu

20 25 30

Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys Gly Gln Pro Val

35 40 45

Tyr Ser Ser Leu

50

<210> 12

<211> 52

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

Cys Ile Ala Tyr Thr Ser Pro Trp Ser Pro Cys Ser Thr Ser Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Val Ser Thr Arg Ile Ser Asn Val Asn Ala Gln Cys Trp Pro

20 25 30

Glu Gln Glu Ser Arg Leu Cys Asn Leu Arg Pro Cys Asp Val Asp Ile

35 40 45

His Thr Leu Ile

50

<210> 13

<211> 229

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 13

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 14

<211> 228

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 15

<211> 228

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 15

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 16

<211> 232

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 16

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 17

<211> 231

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 17

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 18

<211> 227

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 18

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly

225

<210> 19

<211> 227

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 19

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly

225

<210> 20

<211> 6

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 20

Thr Glu Gly Arg Met Asp

1 5

<210> 21

<211> 5

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 21

Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 22

<211> 40

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 22

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

35 40

<210> 23

<211> 42

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 23

Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

20 25 30

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

35 40

<210> 24

<211> 43

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 24

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

35 40

<210> 25

<211> 45

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 25

Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

20 25 30

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

35 40 45

<210> 26

<211> 276

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 26

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

65 70 75 80

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

85 90 95

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

100 105 110

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

115 120 125

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

130 135 140

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

165 170 175

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

180 185 190

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

195 200 205

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

210 215 220

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

225 230 235 240

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

245 250 255

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

260 265 270

Leu Ser Leu Gly

275

<210> 27

<211> 276

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 27

Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

65 70 75 80

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

85 90 95

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

100 105 110

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

115 120 125

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

130 135 140

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

165 170 175

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

180 185 190

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

195 200 205

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

210 215 220

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

225 230 235 240

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

245 250 255

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

260 265 270

Leu Ser Leu Gly

275

<210> 28

<211> 287

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 28

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln Thr Glu Gly Arg Met Asp Glu Ser Lys Tyr Gly

50 55 60

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

65 70 75 80

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

85 90 95

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

100 105 110

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

115 120 125

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

130 135 140

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

145 150 155 160

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

180 185 190

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

210 215 220

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

225 230 235 240

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

245 250 255

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

260 265 270

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

275 280 285

<210> 29

<211> 286

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 29

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln Thr Glu Gly Arg Met Asp Glu Ser Lys Tyr Gly

50 55 60

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

65 70 75 80

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

85 90 95

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

100 105 110

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

115 120 125

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

130 135 140

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

145 150 155 160

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

165 170 175

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

180 185 190

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

195 200 205

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

210 215 220

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

225 230 235 240

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

245 250 255

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

260 265 270

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

275 280 285

<210> 30

<211> 286

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 30

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln Thr Glu Gly Arg Met Asp Glu Arg Lys Cys Cys

50 55 60

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

65 70 75 80

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

85 90 95

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

100 105 110

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

115 120 125

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

130 135 140

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

145 150 155 160

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

165 170 175

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

180 185 190

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

195 200 205

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

210 215 220

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

225 230 235 240

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

245 250 255

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

260 265 270

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

275 280 285

<210> 31

<211> 325

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 31

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

50 55 60

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

65 70 75 80

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

85 90 95

Ala Ala Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Leu Gly

325

<210> 32

<211> 18

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 32

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 33

<211> 305

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 33

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln Thr Glu Gly Arg Met Asp Glu Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

85 90 95

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

100 105 110

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

115 120 125

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

130 135 140

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

145 150 155 160

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

180 185 190

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

195 200 205

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

210 215 220

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

225 230 235 240

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

245 250 255

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

260 265 270

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

275 280 285

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

290 295 300

Gly

305

<210> 34

<211> 915

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 34

atgaaatggg tcacctttat ctccctgctg ttcctgttct cctccgccta ctcttgccct 60

gagtggtcta cagcttgggg cccttgctct accacctgtg gactcggcat ggccaccaga 120

gtgtctaacc agaacagatt ctgccggctg gaaacccagc ggagactgtg cctgtctaga 180

ccctgtcctc ctagcagagg cagatcccct cagaccgagg gcagaatgga cgagtctaag 240

tacggccctc cttgtcctcc atgtcctgct ccagaagctg ctggcggccc ttccgtgttt 300

ctgttccctc caaagcctaa ggacaccctg atgatctctc ggacccctga agtgacctgc 360

gtggtggtgg atgtgtccca agaggatccc gaggtgcagt tcaattggta cgtggacggc 420

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agttcaactc cacctacaga 480

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 540

aaggtgtcca acaagggcct gccttccagc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 600

cagcctaggg aaccccaggt ttacaccctg cctccaagcc aagaggaaat gaccaagaac 660

caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggaatgg 720

gagagcaatg gccagcctga gaacaactac aagaccacac ctcctgtgct ggactccgac 780

ggctccttct ttctgtactc ccgcctgacc gtggacaagt ccagatggca agagggcaac 840

gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca gaagtccctg 900

tctctgtccc tgggc 915

<210> 35

<211> 924

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 35

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgccctgagt ggtctacagc ttggggccct tgctctacca cctgtggact cggcatggcc 120

accagagtgt ctaaccagaa cagattctgc cggctggaaa cccagcggag actgtgcctg 180

tctagaccct gtcctcctag cagaggcaga tcccctcaga ccgagggcag aatggacgag 240

tctaagtacg gccctccttg tcctccatgt cctgctccag aagctgctgg cggcccttcc 300

gtgtttctgt tccctccaaa gcctaaggac accctgatga tctctcggac ccctgaagtg 360

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 420

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt caactccacc 480

tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 540

aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct tccagcatcg aaaagaccat ctccaaggcc 600

aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac accctgcctc caagccaaga ggaaatgacc 660

aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc aagggcttct acccttccga tatcgccgtg 720

gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 780

tccgacggct ccttctttct gtactcccgc ctgaccgtgg acaagtccag atggcaagag 840

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 900

tccctgtctc tgtccctggg ctaa 924

<210> 36

<211> 997

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 36

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgc cctgagtggt ctacagcttg 120

gggcccttgc tctaccacct gtggactcgg catggccacc agagtgtcta accagaacag 180

attctgccgg ctggaaaccc agcggagact gtgcctgtct agaccctgtc ctcctagcag 240

aggcagatcc cctcagaccg agggcagaat ggacgagtct aagtacggcc ctccttgtcc 300

tccatgtcct gctccagaag ctgctggcgg cccttccgtg tttctgttcc ctccaaagcc 360

taaggacacc ctgatgatct ctcggacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc 420

ccaagaggat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc 480

caagaccaag cctagagagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ccgtgctgac 540

cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg 600

cctgccttcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggccagccta gggaacccca 660

ggtttacacc ctgcctccaa gccaagagga aatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg 720

cctggtcaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagagca atggccagcc 780

tgagaacaac tacaagacca cacctcctgt gctggactcc gacggctcct tctttctgta 840

ctcccgcctg accgtggaca agtccagatg gcaagagggc aacgtgttct cctgctccgt 900

gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc ctgtctctgt ccctgggcta 960

atctagaaac ccagctttct tgtacaaagt ggtcccc 997

<210> 37

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 37

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys

35 40

<210> 38

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN5

<400> 38

Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys

35 40

<210> 39

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 39

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

20 25 30

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

35 40

<210> 40

<211> 325

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 40

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

225 230 235 240

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala

245 250 255

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

260 265 270

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

275 280 285

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

290 295 300

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

305 310 315 320

Gly Arg Ser Pro Gln

325

<210> 41

<211> 325

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 41

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

225 230 235 240

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala

245 250 255

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

260 265 270

Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

275 280 285

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

290 295 300

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

305 310 315 320

Gly Arg Ser Pro Gln

325

<210> 42

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN1

<400> 42

Cys Ala Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu

20 25 30

Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys

35 40

<210> 43

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN2

<400> 43

Cys Ala Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys

35 40

<210> 44

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN3

<400> 44

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys

35 40

<210> 45

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN4

<400> 45

Cys Ala Ala Tyr Thr Ser Pro Trp Ser Pro Cys Ser Thr Ser Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Val Ser Thr Arg Ile Ser Asn Val Asn Ala Gln Cys Trp Pro

20 25 30

Glu Gln Glu Ser Arg Leu Cys Asn Leu Arg Pro Cys

35 40

<210> 46

<211> 44

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN6

<400> 46

Cys Ala Val Gln Ala Thr Lys Trp Thr Pro Cys Ser Arg Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Asn Arg Val Thr Asn Glu Asn Ser Asn Cys Glu Met

20 25 30

Arg Lys Glu Lys Arg Leu Cys Tyr Ile Gln Pro Cys

35 40

<210> 47

<211> 52

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN1

<400> 47

Cys Ala Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu

20 25 30

Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys Gly Gln Pro Val

35 40 45

Tyr Ser Ser Leu

50

<210> 48

<211> 52

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN2

<400> 48

Cys Ala Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Ala Ser Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Asp Leu

35 40 45

Glu Glu Asn Ile

50

<210> 49

<211> 53

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN3

<400> 49

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Gln Glu Pro

35 40 45

Glu Gln Pro Thr Asp

50

<210> 50

<211> 52

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN4

<400> 50

Cys Ala Ala Tyr Thr Ser Pro Trp Ser Pro Cys Ser Thr Ser Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Val Ser Thr Arg Ile Ser Asn Val Asn Ala Gln Cys Trp Pro

20 25 30

Glu Gln Glu Ser Arg Leu Cys Asn Leu Arg Pro Cys Asp Val Asp Ile

35 40 45

His Thr Leu Ile

50

<210> 51

<211> 55

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN6

<400> 51

Cys Ala Val Gln Ala Thr Lys Trp Thr Pro Cys Ser Arg Thr Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Ile Ser Asn Arg Val Thr Asn Glu Asn Ser Asn Cys Glu Met

20 25 30

Arg Lys Glu Lys Arg Leu Cys Tyr Ile Gln Pro Cys Asp Ser Asn Ile

35 40 45

Leu Lys Thr Ile Lys Ile Pro

50 55

<210> 52

<211> 585

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 52

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 53

<211> 679

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 53

Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala

1 5 10 15

Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser

20 25 30

Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys

35 40 45

Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala

50 55 60

Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val

65 70 75 80

Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr

85 90 95

Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu

100 105 110

Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp

115 120 125

Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys

130 135 140

Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro

145 150 155 160

Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly

165 170 175

Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe

180 185 190

Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser

195 200 205

Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu

210 215 220

Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp

225 230 235 240

Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met

245 250 255

Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu

260 265 270

His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro

275 280 285

His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys

290 295 300

Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val

305 310 315 320

Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr

325 330 335

Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg

340 345 350

Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys

355 360 365

Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly

370 375 380

Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly

385 390 395 400

Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp

405 410 415

Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Ile Ala Val Val

420 425 430

Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys

435 440 445

Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met

450 455 460

Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe

465 470 475 480

Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys

485 490 495

Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu

500 505 510

Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly

515 520 525

Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly

530 535 540

Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu

545 550 555 560

Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn

565 570 575

Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp

580 585 590

Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe

595 600 605

Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser

610 615 620

Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys

625 630 635 640

Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val

645 650 655

Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu

660 665 670

Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro

675

<210> 54

<211> 232

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 54

Glu Pro Lys Ser Gln Asp Lys Thr His Thr Gln Pro Pro Gln Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 55

<211> 227

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный Fc-фрагмент

<400> 55

Glu Arg Lys Gln Gln Val Glu Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Phe Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Lys

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Glu Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly

225

<210> 56

<211> 57

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 56

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe

50 55

<210> 57

<211> 6

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 57

Ile Glu Gly Arg Met Asp

1 5

<210> 58

<211> 291

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 58

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu

50 55 60

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

65 70 75 80

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

85 90 95

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

100 105 110

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

115 120 125

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

130 135 140

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

165 170 175

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

180 185 190

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

195 200 205

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

210 215 220

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

225 230 235 240

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

245 250 255

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

260 265 270

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Leu Gly

290

<210> 59

<211> 309

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 59

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe Ile Glu Gly Arg Met

65 70 75 80

Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

85 90 95

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

100 105 110

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

115 120 125

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

130 135 140

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

145 150 155 160

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

165 170 175

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

180 185 190

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

195 200 205

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

210 215 220

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

225 230 235 240

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

245 250 255

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

260 265 270

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

275 280 285

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

290 295 300

Ser Leu Ser Leu Gly

305

<210> 60

<211> 936

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 60

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgccctgagt ggtctacagc ttggggccct tgctctacca cctgtggact cggcatggcc 120

accagagtgt ctaaccagaa cagattctgc cggctggaaa cccagcggag actgtgtctg 180

tccagacctt gtcctcctag ccggggcaga tcccctcaga actctgcctt tatcgagggc 240

agaatggacg agtctaagta cggccctcct tgtccaccat gtcctgctcc agaagctgct 300

ggcggccctt ccgtgtttct gttccctcca aagcctaagg acaccctgat gatctctcgg 360

acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 420

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 480

ttcaactcca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 540

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc cttccagcat cgaaaagacc 600

atctccaagg ccaagggcca gcctagggaa ccccaggttt acaccctgcc tccaagccaa 660

gaggaaatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tcaagggctt ctacccttcc 720

gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 780

cctgtgctgg actccgacgg ctccttcttt ctgtactccc gcctgaccgt ggacaagtcc 840

agatggcaag agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 900

tacacccaga agtccctgtc tctgtccctg ggctaa 936

<210> 61

<211> 1009

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 61

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgc cctgagtggt ctacagcttg 120

gggcccttgc tctaccacct gtggactcgg catggccacc agagtgtcta accagaacag 180

attctgccgg ctggaaaccc agcggagact gtgtctgtcc agaccttgtc ctcctagccg 240

gggcagatcc cctcagaact ctgcctttat cgagggcaga atggacgagt ctaagtacgg 300

ccctccttgt ccaccatgtc ctgctccaga agctgctggc ggcccttccg tgtttctgtt 360

ccctccaaag cctaaggaca ccctgatgat ctctcggacc cctgaagtga cctgcgtggt 420

ggtggatgtg tcccaagagg atcccgaggt gcagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga 480

agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagttc aactccacct acagagtggt 540

gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt 600

gtccaacaag ggcctgcctt ccagcatcga aaagaccatc tccaaggcca agggccagcc 660

tagggaaccc caggtttaca ccctgcctcc aagccaagag gaaatgacca agaaccaggt 720

gtccctgacc tgcctggtca agggcttcta cccttccgat atcgccgtgg aatgggagag 780

caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcct gtgctggact ccgacggctc 840

cttctttctg tactcccgcc tgaccgtgga caagtccaga tggcaagagg gcaacgtgtt 900

ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaagt ccctgtctct 960

gtccctgggc taatctagaa acccagcttt cttgtacaaa gtggtcccc 1009

<210> 62

<211> 56

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная последовательность CCN5

<400> 62

Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

35 40 45

Gly Arg Ser Leu Gln Asn Ser Ala

50 55

<210> 63

<211> 4

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 63

Gly Arg Met Asp

1

<210> 64

<211> 306

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 64

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Ser Leu Gln Asn Ser Ala Gly Arg Met Asp Glu Ser

65 70 75 80

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

85 90 95

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

100 105 110

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

115 120 125

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

130 135 140

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

145 150 155 160

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

165 170 175

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

180 185 190

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

195 200 205

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

210 215 220

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

225 230 235 240

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

245 250 255

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

260 265 270

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

275 280 285

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

290 295 300

Leu Gly

305

<210> 65

<211> 6

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 65

Thr Glu Gly Arg Met Asp

1 5

<210> 66

<211> 305

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 66

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln Thr Glu Gly Arg Met Asp Glu Ser Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

85 90 95

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

100 105 110

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

115 120 125

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

130 135 140

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

145 150 155 160

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

180 185 190

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

195 200 205

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

210 215 220

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

225 230 235 240

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

245 250 255

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

260 265 270

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

275 280 285

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

290 295 300

Gly

305

<210> 67

<211> 8

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 67

Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5

<210> 68

<211> 307

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 68

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Glu

65 70 75 80

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

85 90 95

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

100 105 110

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

115 120 125

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

130 135 140

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

145 150 155 160

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

165 170 175

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

180 185 190

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

195 200 205

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

210 215 220

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

225 230 235 240

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

245 250 255

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

260 265 270

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

275 280 285

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

290 295 300

Ser Leu Gly

305

<210> 69

<211> 304

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 69

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Pro Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln Thr Glu Gly Arg Met Asp Glu Arg Lys

65 70 75 80

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

85 90 95

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

100 105 110

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

115 120 125

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

130 135 140

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

145 150 155 160

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

165 170 175

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

180 185 190

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

195 200 205

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

210 215 220

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

225 230 235 240

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

245 250 255

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

260 265 270

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

275 280 285

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

290 295 300

<210> 70

<211> 294

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 70

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala

65 70 75 80

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

85 90 95

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

100 105 110

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

115 120 125

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

130 135 140

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

145 150 155 160

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

165 170 175

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

180 185 190

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

195 200 205

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

210 215 220

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

225 230 235 240

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

245 250 255

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

260 265 270

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

275 280 285

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

290

<210> 71

<211> 891

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 71

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgcgccgagt ggtctacagc ttggggccct tgttctacca cctgtggcct cggcatggcc 120

accagagtgt ccaaccagaa cagattctgc cggctggaaa cccagcggag actgtgtttg 180

tccagacctt gcgaggccgc tgccaaagaa agaaagtgct gcgtggaatg ccctccttgt 240

cctgctcctc ctgtggctgg cccttccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggacacc 300

ctgatgatct ctcggacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaagaggat 360

cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 420

cctagagagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 480

caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg actgccctcc 540

agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggacagccca gagaacccca ggtgtacaca 600

ctgcctccaa gccaagagga aatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag 660

ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagtcca atggccagcc tgagaacaac 720

tacaagacca cacctccagt gctggactcc gacggctcct tctttctgta ctcccgcctg 780

accgtggaca agtccagatg gcaagagggc aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag 840

gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc ctgtctctgt ccctgggcta a 891

<210> 72

<211> 964

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 72

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgc gccgagtggt ctacagcttg 120

gggcccttgt tctaccacct gtggcctcgg catggccacc agagtgtcca accagaacag 180

attctgccgg ctggaaaccc agcggagact gtgtttgtcc agaccttgcg aggccgctgc 240

caaagaaaga aagtgctgcg tggaatgccc tccttgtcct gctcctcctg tggctggccc 300

ttccgtgttt ctgttccctc caaagcctaa ggacaccctg atgatctctc ggacccctga 360

agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca agaggatccc gaggtgcagt tcaattggta 420

cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agttcaactc 480

cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga 540

gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggact gccctccagc atcgaaaaga ccatctccaa 600

ggccaaggga cagcccagag aaccccaggt gtacacactg cctccaagcc aagaggaaat 660

gaccaagaac caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc ttctaccctt ccgatatcgc 720

cgtggaatgg gagtccaatg gccagcctga gaacaactac aagaccacac ctccagtgct 780

ggactccgac ggctccttct ttctgtactc ccgcctgacc gtggacaagt ccagatggca 840

agagggcaac gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca 900

gaagtccctg tctctgtccc tgggctaatc tagaaaccca gctttcttgt acaaagtggt 960

cccc 964

<210> 73

<211> 276

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 73

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

65 70 75 80

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

85 90 95

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

100 105 110

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

115 120 125

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

130 135 140

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

165 170 175

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

180 185 190

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

195 200 205

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

210 215 220

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

225 230 235 240

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

245 250 255

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

260 265 270

Leu Ser Leu Gly

275

<210> 74

<211> 294

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 74

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser

20 25 30

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys

35 40 45

Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala

65 70 75 80

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

85 90 95

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

100 105 110

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

115 120 125

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

130 135 140

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

145 150 155 160

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

165 170 175

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

180 185 190

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

195 200 205

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

210 215 220

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

225 230 235 240

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

245 250 255

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

260 265 270

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

275 280 285

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

290

<210> 75

<211> 891

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 75

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgtgccgagc agaccacaga gtggaccgcc tgctctaagt cttgcggcat gggcttctcc 120

accagagtga ccaaccggaa cagacagtgc gagatgctga agcagacccg gctgtgtatg 180

gttcgacctt gcgaggccgc tgccaaagaa agaaagtgct gcgtggaatg ccctccttgt 240

cctgctcctc ctgtggctgg cccttccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggacacc 300

ctgatgatct ctcggacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaagaggat 360

cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 420

cctagagagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 480

caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccttcc 540

agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggacagccca gagaacccca ggtgtacaca 600

ctgcctccaa gccaagagga aatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag 660

ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagtcca atggccagcc tgagaacaac 720

tacaagacca cacctccagt gctggactcc gacggctcct tctttctgta ctcccgcctg 780

accgtggaca agtccagatg gcaagagggc aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag 840

gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc ctgtctctgt ccctgggcta a 891

<210> 76

<211> 964

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 76

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgt gccgagcaga ccacagagtg 120

gaccgcctgc tctaagtctt gcggcatggg cttctccacc agagtgacca accggaacag 180

acagtgcgag atgctgaagc agacccggct gtgtatggtt cgaccttgcg aggccgctgc 240

caaagaaaga aagtgctgcg tggaatgccc tccttgtcct gctcctcctg tggctggccc 300

ttccgtgttt ctgttccctc caaagcctaa ggacaccctg atgatctctc ggacccctga 360

agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca agaggatccc gaggtgcagt tcaattggta 420

cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agttcaactc 480

cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga 540

gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gccttccagc atcgaaaaga ccatctccaa 600

ggccaaggga cagcccagag aaccccaggt gtacacactg cctccaagcc aagaggaaat 660

gaccaagaac caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc ttctaccctt ccgatatcgc 720

cgtggaatgg gagtccaatg gccagcctga gaacaactac aagaccacac ctccagtgct 780

ggactccgac ggctccttct ttctgtactc ccgcctgacc gtggacaagt ccagatggca 840

agagggcaac gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca 900

gaagtccctg tctctgtccc tgggctaatc tagaaaccca gctttcttgt acaaagtggt 960

cccc 964

<210> 77

<211> 343

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 77

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

20 25 30

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

35 40 45

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

50 55 60

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

65 70 75 80

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

85 90 95

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

100 105 110

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

115 120 125

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

130 135 140

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

145 150 155 160

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

165 170 175

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

180 185 190

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

210 215 220

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

245 250 255

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

260 265 270

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

275 280 285

Ala Ala Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

290 295 300

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

305 310 315 320

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro

325 330 335

Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln

340

<210> 78

<211> 1038

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 78

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctccag cgcctactcc 60

gagtctaagt acggccctcc ttgtcctcca tgtcctgctc cagaagctgc tggcggccct 120

tccgtgtttc tgttccctcc aaagcctaag gacaccctga tgatctctcg gacccctgaa 180

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccaa gaggatcccg aggtgcagtt caattggtac 240

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gttcaactcc 300

acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 360

tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg ccttccagca tcgaaaagac catctccaag 420

gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg 480

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtcaagggct tctacccttc cgatatcgcc 540

gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg 600

gactccgacg gctccttctt tctgtactcc cgcctgaccg tggacaagtc cagatggcaa 660

gagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag 720

aagtccctgt ctctgtccct gggagctgag gccgctgcta aagaagctgc cgctaaagag 780

gccgcagcca aagaggcagc cgccaaagaa gccgctgcaa aagaggctgc tgcaaaagaa 840

gcagcagcta aagaagctgc tgccaaggcc gctgcttgtg ccgaatggtc tacagcttgg 900

ggcccttgct ctaccacctg tggactcggc atggccacca gagtgtctaa ccagaacaga 960

ttctgccggc tggaaaccca gcggagactg tgcctgtcta gaccctgtcc tcctagcaga 1020

ggcagatccc ctcagtga 1038

<210> 79

<211> 1111

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 79

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctccagcgc ctactccgag tctaagtacg gccctccttg 120

tcctccatgt cctgctccag aagctgctgg cggcccttcc gtgtttctgt tccctccaaa 180

gcctaaggac accctgatga tctctcggac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt 240

gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa 300

cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt caactccacc tacagagtgg tgtccgtgct 360

gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa 420

gggcctgcct tccagcatcg aaaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc 480

ccaggtttac accctgcctc caagccaaga ggaaatgacc aagaaccagg tgtccctgac 540

ctgcctggtc aagggcttct acccttccga tatcgccgtg gaatgggaga gcaatggcca 600

gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac tccgacggct ccttctttct 660

gtactcccgc ctgaccgtgg acaagtccag atggcaagag ggcaacgtgt tctcctgctc 720

cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag tccctgtctc tgtccctggg 780

agctgaggcc gctgctaaag aagctgccgc taaagaggcc gcagccaaag aggcagccgc 840

caaagaagcc gctgcaaaag aggctgctgc aaaagaagca gcagctaaag aagctgctgc 900

caaggccgct gcttgtgccg aatggtctac agcttggggc ccttgctcta ccacctgtgg 960

actcggcatg gccaccagag tgtctaacca gaacagattc tgccggctgg aaacccagcg 1020

gagactgtgc ctgtctagac cctgtcctcc tagcagaggc agatcccctc agtgatctag 1080

aaacccagct ttcttgtaca aagtggtccc c 1111

<210> 80

<211> 311

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 80

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

50 55 60

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

65 70 75 80

Ala Ala Ala Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

85 90 95

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

100 105 110

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

115 120 125

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

130 135 140

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

145 150 155 160

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

165 170 175

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

180 185 190

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

195 200 205

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

210 215 220

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

225 230 235 240

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

245 250 255

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

260 265 270

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

275 280 285

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

290 295 300

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

305 310

<210> 81

<211> 329

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 81

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser

20 25 30

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys

35 40 45

Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

65 70 75 80

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

85 90 95

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro

100 105 110

Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

325

<210> 82

<211> 996

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 82

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgtgccgagc agaccacaga gtggaccgcc tgctctaagt cttgcggcat gggcttctcc 120

accagagtga ccaaccggaa cagacagtgc gagatgctga agcagacccg gctgtgtatg 180

gttcgacctt gcgaggccgc tgccaaagag gctgctgcta aagaagccgc cgcaaaagag 240

gcagcagcaa aagaggctgc cgccaaagag gccgcagcca aagaagcagc agctaaagag 300

gccgctgcaa aagaacggaa gtgctgcgtg gaatgccctc cttgtcctgc tcctcctgtg 360

gctggccctt ccgtgtttct gttccctcca aagcctaagg acaccctgat gatctctcgg 420

acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 480

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 540

ttcaactcca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 600

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc cttccagcat cgaaaagacc 660

atctccaagg ccaagggaca gcccagagaa ccccaggtgt acacactgcc tccaagccaa 720

gaggaaatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tcaagggctt ctacccttcc 780

gatatcgccg tggaatggga gtccaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 840

ccagtgctgg actccgacgg ctccttcttt ctgtactccc gcctgaccgt ggacaagtcc 900

agatggcaag agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 960

tacacccaga agtccctgtc tctgtccctg ggctaa 996

<210> 83

<211> 1069

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 83

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgt gccgagcaga ccacagagtg 120

gaccgcctgc tctaagtctt gcggcatggg cttctccacc agagtgacca accggaacag 180

acagtgcgag atgctgaagc agacccggct gtgtatggtt cgaccttgcg aggccgctgc 240

caaagaggct gctgctaaag aagccgccgc aaaagaggca gcagcaaaag aggctgccgc 300

caaagaggcc gcagccaaag aagcagcagc taaagaggcc gctgcaaaag aacggaagtg 360

ctgcgtggaa tgccctcctt gtcctgctcc tcctgtggct ggcccttccg tgtttctgtt 420

ccctccaaag cctaaggaca ccctgatgat ctctcggacc cctgaagtga cctgcgtggt 480

ggtggatgtg tcccaagagg atcccgaggt gcagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga 540

agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagttc aactccacct acagagtggt 600

gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt 660

gtccaacaag ggcctgcctt ccagcatcga aaagaccatc tccaaggcca agggacagcc 720

cagagaaccc caggtgtaca cactgcctcc aagccaagag gaaatgacca agaaccaggt 780

gtccctgacc tgcctggtca agggcttcta cccttccgat atcgccgtgg aatgggagtc 840

caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcca gtgctggact ccgacggctc 900

cttctttctg tactcccgcc tgaccgtgga caagtccaga tggcaagagg gcaacgtgtt 960

ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac acccagaagt ccctgtctct 1020

gtccctgggc taatctagaa acccagcttt cttgtacaaa gtggtcccc 1069

<210> 84

<211> 276

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 84

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Arg Lys Gln Gln Val Glu Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

85 90 95

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

100 105 110

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

115 120 125

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

130 135 140

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

165 170 175

Gln Val Tyr Thr Phe Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

180 185 190

Val Ser Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

195 200 205

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

210 215 220

Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Glu Ser Arg Leu

225 230 235 240

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

245 250 255

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

260 265 270

Leu Ser Leu Gly

275

<210> 85

<211> 294

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 85

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser

20 25 30

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys

35 40 45

Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Arg Lys Gln Gln Val Glu Gln Pro Pro Gln Pro Ala

65 70 75 80

Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

85 90 95

Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

100 105 110

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

115 120 125

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

130 135 140

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

145 150 155 160

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

165 170 175

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

180 185 190

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Phe Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

195 200 205

Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

210 215 220

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

225 230 235 240

Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Arg Leu Glu Ser

245 250 255

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

260 265 270

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

275 280 285

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

290

<210> 86

<211> 891

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 86

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgtgccgagc agaccacaga gtggaccgcc tgctctaagt cttgcggcat gggcttctcc 120

accagagtga ccaaccggaa cagacagtgc gagatgctga agcagacccg gctgtgtatg 180

gttcgacctt gcgaggccgc tgccaaagaa agaaagcagc aggtcgagca gcctcctcag 240

cctgctcctc ctgttgctgg cccttccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggacacc 300

ctgtacatca cccgcgagcc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaagaggat 360

cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 420

cctagagagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 480

caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccttcc 540

agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggacagccca gagaacccca ggtgtacaca 600

ttccctccat ctcaagagga aatgaccaag aaccaggtgt ccctgcggtg cctggtcaag 660

ggcttctacc cttctgatat cgccgtggaa tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac 720

tacaagacca ccaagcctgt gctggactcc gacggctcct tccggcttga atctagactg 780

accgtggaca agtcccggtg gcaagagggc aacgtgttct cctgctctgt gatgcacgag 840

gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgtctctgt ccctgggcta a 891

<210> 87

<211> 964

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 87

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgt gccgagcaga ccacagagtg 120

gaccgcctgc tctaagtctt gcggcatggg cttctccacc agagtgacca accggaacag 180

acagtgcgag atgctgaagc agacccggct gtgtatggtt cgaccttgcg aggccgctgc 240

caaagaaaga aagcagcagg tcgagcagcc tcctcagcct gctcctcctg ttgctggccc 300

ttccgtgttt ctgttccctc caaagcctaa ggacaccctg tacatcaccc gcgagcctga 360

agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca agaggatccc gaggtgcagt tcaattggta 420

cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agttcaactc 480

cacctacaga gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga 540

gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gccttccagc atcgaaaaga ccatctccaa 600

ggccaaggga cagcccagag aaccccaggt gtacacattc cctccatctc aagaggaaat 660

gaccaagaac caggtgtccc tgcggtgcct ggtcaagggc ttctaccctt ctgatatcgc 720

cgtggaatgg gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccacca agcctgtgct 780

ggactccgac ggctccttcc ggcttgaatc tagactgacc gtggacaagt cccggtggca 840

agagggcaac gtgttctcct gctctgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca 900

gaagtccctg tctctgtccc tgggctaatc tagaaaccca gctttcttgt acaaagtggt 960

cccc 964

<210> 88

<211> 281

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 88

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Pro Lys Ser Gln Asp Lys Thr His Thr Gln Pro Pro Gln Pro

50 55 60

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

65 70 75 80

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

85 90 95

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

100 105 110

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu

115 120 125

Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

130 135 140

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

145 150 155 160

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

165 170 175

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

180 185 190

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro

195 200 205

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

210 215 220

Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

225 230 235 240

Tyr Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

245 250 255

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

260 265 270

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 89

<211> 299

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 89

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser

20 25 30

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys

35 40 45

Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Pro Lys Ser Gln Asp Lys Thr His Thr Gln Pro Pro

65 70 75 80

Gln Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

85 90 95

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

100 105 110

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

115 120 125

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys

130 135 140

Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val

145 150 155 160

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

165 170 175

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

180 185 190

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

195 200 205

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe

210 215 220

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

225 230 235 240

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

245 250 255

Phe Leu Tyr Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

260 265 270

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

275 280 285

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 90

<211> 906

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 90

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgtgccgagc agaccacaga gtggaccgcc tgctctaagt cttgcggcat gggcttctcc 120

accagagtga ccaaccggaa cagacagtgc gagatgctga agcagacccg gctgtgtatg 180

gttcgacctt gcgaggccgc tgccaaagag cctaagagcc aggacaagac ccacacacag 240

cctccacagc ctgctccaga attgctcgga ggcccttccg tgtttctgtt ccctccaaag 300

cctaaggaca ccctgatgat ctctcggacc cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg 360

tctcacgagg atcccgaagt gaagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac 420

gccaagacaa agccctgcga ggaacagtac ggctccacct acagatgcgt gtccgtgctg 480

acagtgctgc accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 540

gccctgcctg ctcctatcga aaagaccatc tccaaggcca agggccagcc tagagaaccc 600

caggtgtaca cactgccacc ttctagggac gagctgacca agaaccaggt gtccctgaga 660

tgccacgtga agggcttcta cccctccgat atcgccgtgg aatgggagtc taatggacag 720

cccgagaaca actacaagac caccaagcct gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg 780

tactctaccc tgaccgtgga caagtccaga tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctct 840

gtgctgcacg aggccctgca caatcactac acccagaagt ccctgtctct gtcccctggc 900

aagtga 906

<210> 91

<211> 979

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 91

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgt gccgagcaga ccacagagtg 120

gaccgcctgc tctaagtctt gcggcatggg cttctccacc agagtgacca accggaacag 180

acagtgcgag atgctgaagc agacccggct gtgtatggtt cgaccttgcg aggccgctgc 240

caaagagcct aagagccagg acaagaccca cacacagcct ccacagcctg ctccagaatt 300

gctcggaggc ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc 360

tcggacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa 420

gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagacaaagc cctgcgagga 480

acagtacggc tccacctaca gatgcgtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct 540

gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa 600

gaccatctcc aaggccaagg gccagcctag agaaccccag gtgtacacac tgccaccttc 660

tagggacgag ctgaccaaga accaggtgtc cctgagatgc cacgtgaagg gcttctaccc 720

ctccgatatc gccgtggaat gggagtctaa tggacagccc gagaacaact acaagaccac 780

caagcctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tctaccctga ccgtggacaa 840

gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctctgtg ctgcacgagg ccctgcacaa 900

tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaag tgatctagaa acccagcttt 960

cttgtacaaa gtggtcccc 979

<210> 92

<211> 402

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитая метка

<400> 92

Gly His His His His His His Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro

1 5 10 15

Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val

20 25 30

Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro

50 55 60

Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp

65 70 75 80

Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp

85 90 95

Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His

100 105 110

Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu

115 120 125

Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr

130 135 140

Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg

145 150 155 160

Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu

180 185 190

Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro

195 200 205

Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn

210 215 220

Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro

225 230 235 240

Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro

245 250 255

Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val

260 265 270

Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu

275 280 285

Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly

290 295 300

Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

305 310 315 320

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

325 330 335

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

340 345 350

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr

355 360 365

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

370 375 380

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

385 390 395 400

Gly Gly

<210> 93

<211> 20

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 93

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly

20

<210> 94

<211> 466

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 94

Gly His His His His His His Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro

1 5 10 15

Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val

20 25 30

Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro

50 55 60

Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp

65 70 75 80

Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp

85 90 95

Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His

100 105 110

Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu

115 120 125

Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr

130 135 140

Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg

145 150 155 160

Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu

180 185 190

Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro

195 200 205

Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn

210 215 220

Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro

225 230 235 240

Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro

245 250 255

Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val

260 265 270

Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu

275 280 285

Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly

290 295 300

Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

305 310 315 320

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

325 330 335

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

340 345 350

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr

355 360 365

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

370 375 380

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser

405 410 415

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala

420 425 430

Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg

435 440 445

Asn Arg Gln Cys Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg

450 455 460

Pro Cys

465

<210> 95

<211> 1461

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 95

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

ggccaccacc atcaccatca cggctccgag atcggaaccg gctttccttt cgaccctcac 120

tacgtggaag tgctgggcga gagaatgcac tatgtggacg tgggccccag agatggaacc 180

cctgtgctgt ttctgcacgg caaccctacc tccagctacg tgtggcggaa catcatccct 240

cacgtggccc ctacacacag atgtatcgcc cctgacctga tcggcatggg caagtctgac 300

aagcctgacc tgggctactt cttcgacgac cacgtgcggt tcatggacgc ctttatcgag 360

gctctgggcc tcgaagaggt ggtgctggtc atccatgatt ggggctctgc cctgggcttt 420

cactgggcca agagaaaccc cgagagagtg aagggaatcg ccttcatgga attcatccgg 480

cctattccta cctgggacga gtggcctgag ttcgccagag agacattcca ggccttcaga 540

accaccgacg tgggcagaaa gctgatcatc gaccagaacg tgttcatcga gggcaccctg 600

cctatgggag tcgtcagacc tctgaccgag gtggaaatgg accactacag agagcccttt 660

ctgaaccccg tggaccggga acctctttgg agattcccta acgagctgcc tatcgctggc 720

gagcctgcca atattgtggc cctggtggaa gagtacatgg actggctgca tcagagcccc 780

gtgcctaagc tgctgttttg gggaacaccc ggcgtgctga ttcctcctgc tgaagctgct 840

agactggcca agagcctgcc taactgcaag gccgtggata tcggccctgg cctgaatctg 900

ctgcaagagg acaaccccga tctgatcgga tctgagatcg cccggtggct gagcaccctg 960

gaaatcagtg gactgcagga ctccgaagtg aatcaagagg ccaagcctga agtgaagccc 1020

gaagtcaagc ctgagacaca catcaacctg aaggtgtccg acggctccag cgagatcttc 1080

ttcaagatca agaaaaccac acctctgcgg cggctgatgg aagcctttgc caagagacag 1140

ggcaaagaga tggactccct gaccttcctg tacgacggca tcgagatcca ggccgatcag 1200

acccctgagg acctggacat ggaagataac gacatcattg aggcccacag agagcagatc 1260

ggcggctctg gtggtagcgg aggttctggt ggatctggtg gttcttctgg cggcggatct 1320

tctggctgtg ctgagcagac aaccgagtgg accgcctgct ctaagtcttg tggcatgggc 1380

ttctccacca gagtgaccaa ccggaacaga cagtgcgaga tgctgaagca gacccggctg 1440

tgtatggtcc gaccttgcta a 1461

<210> 96

<211> 1552

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 96

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta taagcttgct gccaccatga aatgggtcac 60

ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct ggccaccacc atcaccatca 120

cggctccgag atcggaaccg gctttccttt cgaccctcac tacgtggaag tgctgggcga 180

gagaatgcac tatgtggacg tgggccccag agatggaacc cctgtgctgt ttctgcacgg 240

caaccctacc tccagctacg tgtggcggaa catcatccct cacgtggccc ctacacacag 300

atgtatcgcc cctgacctga tcggcatggg caagtctgac aagcctgacc tgggctactt 360

cttcgacgac cacgtgcggt tcatggacgc ctttatcgag gctctgggcc tcgaagaggt 420

ggtgctggtc atccatgatt ggggctctgc cctgggcttt cactgggcca agagaaaccc 480

cgagagagtg aagggaatcg ccttcatgga attcatccgg cctattccta cctgggacga 540

gtggcctgag ttcgccagag agacattcca ggccttcaga accaccgacg tgggcagaaa 600

gctgatcatc gaccagaacg tgttcatcga gggcaccctg cctatgggag tcgtcagacc 660

tctgaccgag gtggaaatgg accactacag agagcccttt ctgaaccccg tggaccggga 720

acctctttgg agattcccta acgagctgcc tatcgctggc gagcctgcca atattgtggc 780

cctggtggaa gagtacatgg actggctgca tcagagcccc gtgcctaagc tgctgttttg 840

gggaacaccc ggcgtgctga ttcctcctgc tgaagctgct agactggcca agagcctgcc 900

taactgcaag gccgtggata tcggccctgg cctgaatctg ctgcaagagg acaaccccga 960

tctgatcgga tctgagatcg cccggtggct gagcaccctg gaaatcagtg gactgcagga 1020

ctccgaagtg aatcaagagg ccaagcctga agtgaagccc gaagtcaagc ctgagacaca 1080

catcaacctg aaggtgtccg acggctccag cgagatcttc ttcaagatca agaaaaccac 1140

acctctgcgg cggctgatgg aagcctttgc caagagacag ggcaaagaga tggactccct 1200

gaccttcctg tacgacggca tcgagatcca ggccgatcag acccctgagg acctggacat 1260

ggaagataac gacatcattg aggcccacag agagcagatc ggcggctctg gtggtagcgg 1320

aggttctggt ggatctggtg gttcttctgg cggcggatct tctggctgtg ctgagcagac 1380

aaccgagtgg accgcctgct ctaagtcttg tggcatgggc ttctccacca gagtgaccaa 1440

ccggaacaga cagtgcgaga tgctgaagca gacccggctg tgtatggtcc gaccttgcta 1500

aatctagagc ggccgcggta ccaacccagc tttcttgtac aaagtggtcc cc 1552

<210> 97

<211> 634

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 97

Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

1 5 10 15

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

20 25 30

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

50 55 60

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr

85 90 95

Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp

100 105 110

Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr

115 120 125

Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu

130 135 140

Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn

145 150 155 160

Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe

165 170 175

His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala

180 185 190

Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys

195 200 205

Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala

210 215 220

Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala

225 230 235 240

Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly

245 250 255

Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe

260 265 270

Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr

275 280 285

Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

290 295 300

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile

305 310 315 320

Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser

325 330 335

His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro

340 345 350

Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr

355 360 365

Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala

370 375 380

Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys

385 390 395 400

Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His

405 410 415

Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu

420 425 430

Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly

435 440 445

Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val

450 455 460

Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly

465 470 475 480

Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

485 490 495

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu

500 505 510

His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu

515 520 525

Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

530 535 540

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala

545 550 555 560

Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

565 570 575

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

580 585 590

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys

595 600 605

Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu

610 615 620

Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

625 630

<210> 98

<211> 652

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 98

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

20 25 30

Cys Gly Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

35 40 45

Arg Leu Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp

65 70 75 80

Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln

85 90 95

Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

100 105 110

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn

115 120 125

Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val

130 135 140

Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys

145 150 155 160

Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn

165 170 175

Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr

180 185 190

Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe

210 215 220

Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp

225 230 235 240

Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly

245 250 255

Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys

260 265 270

Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln

275 280 285

Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp

290 295 300

Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys

305 310 315 320

Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp

325 330 335

Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

340 345 350

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp

355 360 365

Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys

370 375 380

Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu

385 390 395 400

Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu

405 410 415

Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp

420 425 430

Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val

435 440 445

Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln

450 455 460

Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys

465 470 475 480

Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn

485 490 495

Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg

500 505 510

Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys

515 520 525

Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys

530 535 540

Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val

545 550 555 560

Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe

565 570 575

His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

580 585 590

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys

595 600 605

Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys

610 615 620

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

625 630 635 640

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

645 650

<210> 99

<211> 1965

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 99

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgcgccgagt ggtctacagc ttggggccct tgttctacca cctgtggcct cggcatggcc 120

accagagtgt ccaaccagaa cagattctgc cggctggaaa cccagcggag actgtgcttg 180

tctagacctt gcgaggccgc tgccaaggac gctcataagt ctgaggtggc ccaccggttc 240

aaggacctgg gcgaagagaa cttcaaggcc ctggtgctga tcgccttcgc tcagtacttg 300

cagcagtgcc ccttcgagga ccacgtgaag ctggtcaacg aagtgaccga gttcgccaag 360

acctgcgtgg ccgatgagtc tgccgagaac tgcgacaagt ctctgcacac cctgttcggc 420

gacaagctgt gtaccgtggc taccctgaga gaaacctacg gcgagatggc cgactgctgc 480

gctaagcaag agcccgagag aaacgagtgc ttcctgcagc acaaggacga caaccctaac 540

ctgcctagac tcgtgcggcc tgaggtggac gtgatgtgta ccgccttcca cgacaacgag 600

gaaaccttcc tgaagaagta cctgtacgag atcgccagac ggcaccccta cttttacgcc 660

cctgagctgc tgttcttcgc caagcggtac aaggccgcct tcaccgagtg ttgtcaggcc 720

gctgataagg ccgcttgcct gctgcctaaa ctggacgagc tgagagatga aggcaaggcc 780

tccagcgcca agcagagact gaagtgtgcc agcctgcaga agttcggcga gagagccttt 840

aaggcctggg ccgtcgctag actgtcccag agatttccca aggccgagtt tgccgaggtg 900

tccaagctgg ttaccgacct gaccaaggtg cacaccgaat gctgtcacgg cgacctgctg 960

gaatgcgccg atgatagagc cgatctggcc aagtacatct gcgagaacca ggactccatc 1020

tcctccaagc tgaaagagtg ctgcgagaag cctctgctgg aaaagtccca ctgtatcgcc 1080

gaggtggaaa acgacgagat gcctgccgat ctgccttctc tggccgccga cttcgtggaa 1140

tctaaggacg tgtgcaagaa ctacgccgag gctaaggatg tgttcctggg catgtttctg 1200

tacgagtacg ctcggcggca ccccgactat tctgttgtgc tgctgctgag actggctaag 1260

acctacgaga caaccctcga gaagtgctgt gccgccgctg atcctcacga gtgttacgcc 1320

aaggtgttcg acgagttcaa gccactggtg gaagaacccc agaacctgat caagcagaat 1380

tgcgagctgt tcgagcagct gggcgagtac aagttccaga acgccctgct cgtgcggtac 1440

accaagaaag tgccccaggt gtccacacct acactggttg aggtgtcccg gaacctgggc 1500

aaagtgggct ctaagtgctg caagcacccc gaggccaaga gaatgccttg tgccgaggac 1560

tacctgtccg tggtgctgaa ccagctgtgc gtgctgcacg aaaagacccc tgtgtccgac 1620

agagtgacca agtgctgtac cgagagcctg gtcaacagac ggccttgctt ctctgccctg 1680

gaagtggacg agacatacgt gcccaaagag ttcaacgccg agacattcac cttccacgcc 1740

gacatctgca ccctgtccga gaaagagcgg cagatcaaga aacagaccgc tctggtggaa 1800

ctggtcaagc acaagcccaa ggccaccaaa gaacagctga aggccgtgat ggacgacttc 1860

gccgcctttg tggaaaagtg ttgcaaggcc gacgacaaag agacatgctt cgccgaagag 1920

ggcaagaaac tggtggccgc ttctcaggct gctctgggac tttaa 1965

<210> 100

<211> 2038

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 100

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgc gccgagtggt ctacagcttg 120

gggcccttgt tctaccacct gtggcctcgg catggccacc agagtgtcca accagaacag 180

attctgccgg ctggaaaccc agcggagact gtgcttgtct agaccttgcg aggccgctgc 240

caaggacgct cataagtctg aggtggccca ccggttcaag gacctgggcg aagagaactt 300

caaggccctg gtgctgatcg ccttcgctca gtacttgcag cagtgcccct tcgaggacca 360

cgtgaagctg gtcaacgaag tgaccgagtt cgccaagacc tgcgtggccg atgagtctgc 420

cgagaactgc gacaagtctc tgcacaccct gttcggcgac aagctgtgta ccgtggctac 480

cctgagagaa acctacggcg agatggccga ctgctgcgct aagcaagagc ccgagagaaa 540

cgagtgcttc ctgcagcaca aggacgacaa ccctaacctg cctagactcg tgcggcctga 600

ggtggacgtg atgtgtaccg ccttccacga caacgaggaa accttcctga agaagtacct 660

gtacgagatc gccagacggc acccctactt ttacgcccct gagctgctgt tcttcgccaa 720

gcggtacaag gccgccttca ccgagtgttg tcaggccgct gataaggccg cttgcctgct 780

gcctaaactg gacgagctga gagatgaagg caaggcctcc agcgccaagc agagactgaa 840

gtgtgccagc ctgcagaagt tcggcgagag agcctttaag gcctgggccg tcgctagact 900

gtcccagaga tttcccaagg ccgagtttgc cgaggtgtcc aagctggtta ccgacctgac 960

caaggtgcac accgaatgct gtcacggcga cctgctggaa tgcgccgatg atagagccga 1020

tctggccaag tacatctgcg agaaccagga ctccatctcc tccaagctga aagagtgctg 1080

cgagaagcct ctgctggaaa agtcccactg tatcgccgag gtggaaaacg acgagatgcc 1140

tgccgatctg ccttctctgg ccgccgactt cgtggaatct aaggacgtgt gcaagaacta 1200

cgccgaggct aaggatgtgt tcctgggcat gtttctgtac gagtacgctc ggcggcaccc 1260

cgactattct gttgtgctgc tgctgagact ggctaagacc tacgagacaa ccctcgagaa 1320

gtgctgtgcc gccgctgatc ctcacgagtg ttacgccaag gtgttcgacg agttcaagcc 1380

actggtggaa gaaccccaga acctgatcaa gcagaattgc gagctgttcg agcagctggg 1440

cgagtacaag ttccagaacg ccctgctcgt gcggtacacc aagaaagtgc cccaggtgtc 1500

cacacctaca ctggttgagg tgtcccggaa cctgggcaaa gtgggctcta agtgctgcaa 1560

gcaccccgag gccaagagaa tgccttgtgc cgaggactac ctgtccgtgg tgctgaacca 1620

gctgtgcgtg ctgcacgaaa agacccctgt gtccgacaga gtgaccaagt gctgtaccga 1680

gagcctggtc aacagacggc cttgcttctc tgccctggaa gtggacgaga catacgtgcc 1740

caaagagttc aacgccgaga cattcacctt ccacgccgac atctgcaccc tgtccgagaa 1800

agagcggcag atcaagaaac agaccgctct ggtggaactg gtcaagcaca agcccaaggc 1860

caccaaagaa cagctgaagg ccgtgatgga cgacttcgcc gcctttgtgg aaaagtgttg 1920

caaggccgac gacaaagaga catgcttcgc cgaagagggc aagaaactgg tggccgcttc 1980

tcaggctgct ctgggacttt aatctagaaa cccagctttc ttgtacaaag tggtcccc 2038

<210> 101

<211> 582

<212> PRT/Белок

<213> Homo sapiens

<400> 101

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala

580

<210> 102

<211> 675

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 102

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

580 585 590

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

595 600 605

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Cys Ala

610 615 620

Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly Leu Gly

625 630 635 640

Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu Glu Thr

645 650 655

Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg Gly Arg

660 665 670

Ser Pro Gln

675

<210> 103

<211> 693

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 103

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu

20 25 30

Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

35 40 45

Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val

50 55 60

Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys

65 70 75 80

Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala

85 90 95

Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln

100 105 110

Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro

115 120 125

Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala

130 135 140

Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile

145 150 155 160

Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala

165 170 175

Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys

180 185 190

Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys

195 200 205

Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe

210 215 220

Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg

225 230 235 240

Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu

245 250 255

Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala

260 265 270

Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

275 280 285

Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys

290 295 300

Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu

305 310 315 320

Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn

325 330 335

Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr

340 345 350

Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala

355 360 365

Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro

370 375 380

His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu

385 390 395 400

Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu

405 410 415

Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys

420 425 430

Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu

435 440 445

Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met

450 455 460

Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val

465 470 475 480

Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr

485 490 495

Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp

500 505 510

Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

515 520 525

Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln

530 535 540

Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu

545 550 555 560

Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys

565 570 575

Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys

580 585 590

Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

595 600 605

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

610 615 620

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

625 630 635 640

Cys Ala Glu Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr Cys Gly

645 650 655

Leu Gly Met Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys Arg Leu

660 665 670

Glu Thr Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Pro Pro Ser Arg

675 680 685

Gly Arg Ser Pro Gln

690

<210> 104

<211> 2088

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 104

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

gacgcccaca agtctgaggt ggcccacaga ttcaaggacc tgggcgaaga gaacttcaag 120

gccctggtgc tgatcgcctt cgctcagtac ttgcagcagt gccccttcga ggaccacgtg 180

aagctggtca acgaagtgac cgagttcgcc aagacctgcg tggccgatga gtctgccgag 240

aactgcgaca agtctctgca caccctgttc ggcgacaagc tgtgtaccgt ggctaccctg 300

agagaaacct acggcgagat ggccgactgc tgcgctaagc aagagcccga gagaaacgag 360

tgcttcctgc agcacaagga cgacaaccct aacctgccta gactcgtgcg gcctgaggtg 420

gacgtgatgt gtaccgcctt ccacgacaac gaggaaacct tcctgaagaa gtacctgtac 480

gagatcgcca gacggcaccc ctacttttac gcccctgagc tgctgttctt cgccaagcgg 540

tacaaggccg ccttcaccga gtgttgtcag gccgctgata aggccgcttg cctgctgcct 600

aaactggacg agctgagaga tgaaggcaag gcctccagcg ccaagcagag actgaagtgt 660

gccagcctgc agaagttcgg cgagagagcc tttaaggcct gggccgtcgc tagactgtcc 720

cagagatttc ccaaggccga gtttgccgag gtgtccaagc tggttaccga cctgaccaag 780

gtgcacaccg aatgctgtca cggcgacctg ctggaatgcg ccgatgatag agccgatctg 840

gccaagtaca tctgcgagaa ccaggactcc atctcctcca agctgaaaga gtgctgcgag 900

aagcctctgc tggaaaagtc ccactgtatc gccgaggtgg aaaacgacga gatgcctgcc 960

gatctgcctt ctctggccgc cgacttcgtg gaatctaagg acgtgtgcaa gaactacgcc 1020

gaggccaagg atgtgttcct gggcatgttt ctgtacgagt acgctcggcg gcaccccgac 1080

tattctgttg tgctgctgct gagactggct aagacctacg agacaaccct cgagaagtgc 1140

tgtgccgccg ctgatcctca cgagtgttac gccaaggtgt tcgacgagtt caagccactg 1200

gtggaagaac cccagaacct gatcaagcag aattgcgagc tgttcgagca gctgggcgag 1260

tacaagttcc agaacgccct gctcgtgcgg tacaccaaga aagtgcccca ggtgtccaca 1320

cctacactgg ttgaggtgtc ccggaacctg ggcaaagtgg gctctaagtg ctgcaagcac 1380

cctgaggcca agagaatgcc ttgcgccgag gactacctgt ccgtggtgct gaatcagctg 1440

tgcgtgctgc acgaaaagac ccctgtgtcc gacagagtga ccaagtgctg taccgagagc 1500

ctggtcaaca gacggccttg cttctctgcc ctggaagtgg acgagacata cgtgcccaaa 1560

gagttcaacg ccgagacatt caccttccac gccgacatct gcaccctgtc cgagaaagag 1620

cggcagatca agaaacagac cgctctggtg gaactggtca agcacaagcc caaggccacc 1680

aaagaacagc tgaaggccgt gatggacgac ttcgccgcct ttgtggaaaa gtgttgcaag 1740

gccgacgaca aagagacatg cttcgccgaa gagggcaaga aactggtggc cgcttctcag 1800

gctgctgagg ccgctgctaa agaggctgcc gctaaagaag ccgcagccaa agaggcagct 1860

gcaaaagaag ctgctgcaaa agaggcagcc gccaaagagg ccgctgctaa agaagcagcc 1920

gccaagtgtg ctgagtggtc tacagcttgg ggcccctgct ctacaacctg tggactcggc 1980

atggccacca gagtgtctaa ccagaacaga ttctgccggc tggaaaccca gcggagactg 2040

tgcctgtcta gaccctgtcc tcctagcaga ggcagatccc ctcagtga 2088

<210> 105

<211> 2161

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 105

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactctgac gcccacaagt ctgaggtggc 120

ccacagattc aaggacctgg gcgaagagaa cttcaaggcc ctggtgctga tcgccttcgc 180

tcagtacttg cagcagtgcc ccttcgagga ccacgtgaag ctggtcaacg aagtgaccga 240

gttcgccaag acctgcgtgg ccgatgagtc tgccgagaac tgcgacaagt ctctgcacac 300

cctgttcggc gacaagctgt gtaccgtggc taccctgaga gaaacctacg gcgagatggc 360

cgactgctgc gctaagcaag agcccgagag aaacgagtgc ttcctgcagc acaaggacga 420

caaccctaac ctgcctagac tcgtgcggcc tgaggtggac gtgatgtgta ccgccttcca 480

cgacaacgag gaaaccttcc tgaagaagta cctgtacgag atcgccagac ggcaccccta 540

cttttacgcc cctgagctgc tgttcttcgc caagcggtac aaggccgcct tcaccgagtg 600

ttgtcaggcc gctgataagg ccgcttgcct gctgcctaaa ctggacgagc tgagagatga 660

aggcaaggcc tccagcgcca agcagagact gaagtgtgcc agcctgcaga agttcggcga 720

gagagccttt aaggcctggg ccgtcgctag actgtcccag agatttccca aggccgagtt 780

tgccgaggtg tccaagctgg ttaccgacct gaccaaggtg cacaccgaat gctgtcacgg 840

cgacctgctg gaatgcgccg atgatagagc cgatctggcc aagtacatct gcgagaacca 900

ggactccatc tcctccaagc tgaaagagtg ctgcgagaag cctctgctgg aaaagtccca 960

ctgtatcgcc gaggtggaaa acgacgagat gcctgccgat ctgccttctc tggccgccga 1020

cttcgtggaa tctaaggacg tgtgcaagaa ctacgccgag gccaaggatg tgttcctggg 1080

catgtttctg tacgagtacg ctcggcggca ccccgactat tctgttgtgc tgctgctgag 1140

actggctaag acctacgaga caaccctcga gaagtgctgt gccgccgctg atcctcacga 1200

gtgttacgcc aaggtgttcg acgagttcaa gccactggtg gaagaacccc agaacctgat 1260

caagcagaat tgcgagctgt tcgagcagct gggcgagtac aagttccaga acgccctgct 1320

cgtgcggtac accaagaaag tgccccaggt gtccacacct acactggttg aggtgtcccg 1380

gaacctgggc aaagtgggct ctaagtgctg caagcaccct gaggccaaga gaatgccttg 1440

cgccgaggac tacctgtccg tggtgctgaa tcagctgtgc gtgctgcacg aaaagacccc 1500

tgtgtccgac agagtgacca agtgctgtac cgagagcctg gtcaacagac ggccttgctt 1560

ctctgccctg gaagtggacg agacatacgt gcccaaagag ttcaacgccg agacattcac 1620

cttccacgcc gacatctgca ccctgtccga gaaagagcgg cagatcaaga aacagaccgc 1680

tctggtggaa ctggtcaagc acaagcccaa ggccaccaaa gaacagctga aggccgtgat 1740

ggacgacttc gccgcctttg tggaaaagtg ttgcaaggcc gacgacaaag agacatgctt 1800

cgccgaagag ggcaagaaac tggtggccgc ttctcaggct gctgaggccg ctgctaaaga 1860

ggctgccgct aaagaagccg cagccaaaga ggcagctgca aaagaagctg ctgcaaaaga 1920

ggcagccgcc aaagaggccg ctgctaaaga agcagccgcc aagtgtgctg agtggtctac 1980

agcttggggc ccctgctcta caacctgtgg actcggcatg gccaccagag tgtctaacca 2040

gaacagattc tgccggctgg aaacccagcg gagactgtgc ctgtctagac cctgtcctcc 2100

tagcagaggc agatcccctc agtgatctag aaacccagct ttcttgtaca aagtggtccc 2160

c 2161

<210> 106

<211> 634

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 106

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

50 55 60

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr

85 90 95

Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp

100 105 110

Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr

115 120 125

Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu

130 135 140

Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn

145 150 155 160

Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe

165 170 175

His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala

180 185 190

Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys

195 200 205

Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala

210 215 220

Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala

225 230 235 240

Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly

245 250 255

Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe

260 265 270

Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr

275 280 285

Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

290 295 300

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile

305 310 315 320

Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser

325 330 335

His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro

340 345 350

Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr

355 360 365

Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala

370 375 380

Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys

385 390 395 400

Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His

405 410 415

Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu

420 425 430

Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly

435 440 445

Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val

450 455 460

Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly

465 470 475 480

Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

485 490 495

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu

500 505 510

His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu

515 520 525

Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

530 535 540

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala

545 550 555 560

Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

565 570 575

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

580 585 590

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys

595 600 605

Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu

610 615 620

Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

625 630

<210> 107

<211> 652

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 107

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser

20 25 30

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys

35 40 45

Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp

65 70 75 80

Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln

85 90 95

Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

100 105 110

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn

115 120 125

Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val

130 135 140

Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys

145 150 155 160

Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn

165 170 175

Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr

180 185 190

Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe

210 215 220

Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp

225 230 235 240

Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly

245 250 255

Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys

260 265 270

Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln

275 280 285

Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp

290 295 300

Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys

305 310 315 320

Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp

325 330 335

Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

340 345 350

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp

355 360 365

Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys

370 375 380

Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu

385 390 395 400

Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu

405 410 415

Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp

420 425 430

Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val

435 440 445

Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln

450 455 460

Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys

465 470 475 480

Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn

485 490 495

Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg

500 505 510

Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys

515 520 525

Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys

530 535 540

Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val

545 550 555 560

Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe

565 570 575

His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

580 585 590

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys

595 600 605

Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys

610 615 620

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

625 630 635 640

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

645 650

<210> 108

<211> 1965

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 108

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgtgccgagc agaccacaga gtggaccgcc tgctctaagt cttgcggcat gggcttctcc 120

accagagtga ccaaccggaa cagacagtgc gagatgctga agcagacccg gctgtgtatg 180

gttcgacctt gcgaggccgc tgccaaggat gctcataagt ctgaggtggc ccaccggttc 240

aaggacctgg gcgaagagaa cttcaaggcc ctggtgctga tcgccttcgc tcagtacttg 300

cagcagtgcc ccttcgagga ccacgtgaag ctggtcaacg aagtgaccga gttcgccaag 360

acctgcgtgg ccgatgagtc tgccgagaac tgcgacaagt ctctgcacac cctgttcggc 420

gacaagctgt gtaccgtggc taccctgaga gaaacctacg gcgagatggc cgactgctgc 480

gctaagcaag agcccgagag aaacgagtgc ttcctgcagc acaaggacga caaccctaac 540

ctgcctagac tcgtgcggcc tgaggtggac gtgatgtgta ccgccttcca cgacaacgag 600

gaaaccttcc tgaagaagta cctgtacgag atcgccagac ggcaccccta cttttacgcc 660

cctgagctgc tgttcttcgc caagcggtac aaggccgcct tcaccgagtg ttgtcaggcc 720

gctgataagg ccgcttgcct gctgcctaaa ctggacgagc tgagagatga aggcaaggcc 780

tccagcgcca agcagagact gaagtgtgcc agcctgcaga agttcggcga gagagccttt 840

aaggcctggg ccgtcgctag actgtcccag agatttccca aggccgagtt tgccgaggtg 900

tccaagctgg ttaccgacct gaccaaggtg cacaccgaat gctgtcacgg cgacctgctg 960

gaatgcgccg atgatagagc cgatctggcc aagtacatct gcgagaacca ggactccatc 1020

tcctccaagc tgaaagagtg ctgcgagaag cctctgctgg aaaagtccca ctgtatcgcc 1080

gaggtggaaa acgacgagat gcctgccgat ctgccttctc tggccgccga cttcgtggaa 1140

tctaaggacg tgtgcaagaa ctacgccgag gctaaggatg tgttcctggg catgtttctg 1200

tacgagtacg ctcggcggca ccccgattat agtgtggtgc tgctgctgag actggctaag 1260

acctacgaga caaccctcga gaagtgctgt gccgccgctg atcctcacga gtgttacgcc 1320

aaggtgttcg acgagttcaa gccactggtg gaagaacccc agaacctgat caagcagaat 1380

tgcgagctgt tcgagcagct gggcgagtac aagttccaga acgccctgct cgtgcggtac 1440

accaagaaag tgccccaggt gtccacacct acactggttg aggtgtcccg gaacctgggc 1500

aaagtgggct ctaagtgctg caagcacccc gaggccaaga gaatgccttg cgccgaggat 1560

tacctgtccg tggtgctgaa ccagctgtgc gtgctgcacg aaaagacccc tgtgtccgac 1620

cgcgtgacca agtgctgtac agagtccctg gtcaacagac ggccctgctt ctctgccctg 1680

gaagtggacg agacatacgt gcccaaagag ttcaacgccg agacattcac cttccacgcc 1740

gacatctgca ccctgtccga gaaagagcgg cagatcaaga aacagaccgc tctggtcgaa 1800

ctggtcaagc acaagcccaa ggccaccaaa gaacagctga aggccgtgat ggacgacttc 1860

gccgcctttg tggaaaagtg ttgcaaggcc gacgacaaag agacatgctt cgccgaagag 1920

ggcaagaaac tggtggccgc ttctcaggct gctctgggac tttaa 1965

<210> 109

<211> 2038

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 109

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgt gccgagcaga ccacagagtg 120

gaccgcctgc tctaagtctt gcggcatggg cttctccacc agagtgacca accggaacag 180

acagtgcgag atgctgaagc agacccggct gtgtatggtt cgaccttgcg aggccgctgc 240

caaggatgct cataagtctg aggtggccca ccggttcaag gacctgggcg aagagaactt 300

caaggccctg gtgctgatcg ccttcgctca gtacttgcag cagtgcccct tcgaggacca 360

cgtgaagctg gtcaacgaag tgaccgagtt cgccaagacc tgcgtggccg atgagtctgc 420

cgagaactgc gacaagtctc tgcacaccct gttcggcgac aagctgtgta ccgtggctac 480

cctgagagaa acctacggcg agatggccga ctgctgcgct aagcaagagc ccgagagaaa 540

cgagtgcttc ctgcagcaca aggacgacaa ccctaacctg cctagactcg tgcggcctga 600

ggtggacgtg atgtgtaccg ccttccacga caacgaggaa accttcctga agaagtacct 660

gtacgagatc gccagacggc acccctactt ttacgcccct gagctgctgt tcttcgccaa 720

gcggtacaag gccgccttca ccgagtgttg tcaggccgct gataaggccg cttgcctgct 780

gcctaaactg gacgagctga gagatgaagg caaggcctcc agcgccaagc agagactgaa 840

gtgtgccagc ctgcagaagt tcggcgagag agcctttaag gcctgggccg tcgctagact 900

gtcccagaga tttcccaagg ccgagtttgc cgaggtgtcc aagctggtta ccgacctgac 960

caaggtgcac accgaatgct gtcacggcga cctgctggaa tgcgccgatg atagagccga 1020

tctggccaag tacatctgcg agaaccagga ctccatctcc tccaagctga aagagtgctg 1080

cgagaagcct ctgctggaaa agtcccactg tatcgccgag gtggaaaacg acgagatgcc 1140

tgccgatctg ccttctctgg ccgccgactt cgtggaatct aaggacgtgt gcaagaacta 1200

cgccgaggct aaggatgtgt tcctgggcat gtttctgtac gagtacgctc ggcggcaccc 1260

cgattatagt gtggtgctgc tgctgagact ggctaagacc tacgagacaa ccctcgagaa 1320

gtgctgtgcc gccgctgatc ctcacgagtg ttacgccaag gtgttcgacg agttcaagcc 1380

actggtggaa gaaccccaga acctgatcaa gcagaattgc gagctgttcg agcagctggg 1440

cgagtacaag ttccagaacg ccctgctcgt gcggtacacc aagaaagtgc cccaggtgtc 1500

cacacctaca ctggttgagg tgtcccggaa cctgggcaaa gtgggctcta agtgctgcaa 1560

gcaccccgag gccaagagaa tgccttgcgc cgaggattac ctgtccgtgg tgctgaacca 1620

gctgtgcgtg ctgcacgaaa agacccctgt gtccgaccgc gtgaccaagt gctgtacaga 1680

gtccctggtc aacagacggc cctgcttctc tgccctggaa gtggacgaga catacgtgcc 1740

caaagagttc aacgccgaga cattcacctt ccacgccgac atctgcaccc tgtccgagaa 1800

agagcggcag atcaagaaac agaccgctct ggtcgaactg gtcaagcaca agcccaaggc 1860

caccaaagaa cagctgaagg ccgtgatgga cgacttcgcc gcctttgtgg aaaagtgttg 1920

caaggccgac gacaaagaga catgcttcgc cgaagagggc aagaaactgg tggccgcttc 1980

tcaggctgct ctgggacttt aatctagaaa cccagctttc ttgtacaaag tggtcccc 2038

<210> 110

<211> 669

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 110

Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met

20 25 30

Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala Ala Ala

35 40 45

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

50 55 60

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

65 70 75 80

Ala Ala Ala Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys

85 90 95

Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala

100 105 110

Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn

115 120 125

Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

130 135 140

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr

145 150 155 160

Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala

165 170 175

Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp

180 185 190

Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys

195 200 205

Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr

210 215 220

Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala

245 250 255

Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu

260 265 270

Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln

275 280 285

Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser

290 295 300

Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr

305 310 315 320

Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu

325 330 335

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln

340 345 350

Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu

355 360 365

Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala

370 375 380

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys

385 390 395 400

Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr

405 410 415

Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg

420 425 430

Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala

435 440 445

Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu

450 455 460

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu

465 470 475 480

Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr

485 490 495

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg

500 505 510

Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys

515 520 525

Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu

530 535 540

Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys

545 550 555 560

Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu

565 570 575

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr

580 585 590

Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys

595 600 605

Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

610 615 620

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu

625 630 635 640

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly

645 650 655

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

660 665

<210> 111

<211> 687

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 111

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp Thr Ala Cys Ser Lys Ser

20 25 30

Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys

35 40 45

Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met Val Arg Pro Cys Glu Ala

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

65 70 75 80

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala

85 90 95

Lys Glu Ala Ala Ala Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg

100 105 110

Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala

115 120 125

Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu

130 135 140

Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser

145 150 155 160

Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu

165 170 175

Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys

180 185 190

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys

195 200 205

Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val

210 215 220

Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr

225 230 235 240

Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln

260 265 270

Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg

275 280 285

Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser

290 295 300

Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg

305 310 315 320

Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu

325 330 335

Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu

340 345 350

Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu

355 360 365

Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro

370 375 380

Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met

385 390 395 400

Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp

405 410 415

Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

420 425 430

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu

435 440 445

Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala

450 455 460

Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys

465 470 475 480

Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu

485 490 495

Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg

500 505 510

Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val

515 520 525

Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu

530 535 540

Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn

545 550 555 560

Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr

565 570 575

Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala

580 585 590

Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr

595 600 605

Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln

610 615 620

Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys

625 630 635 640

Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe

645 650 655

Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

660 665 670

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

675 680 685

<210> 112

<211> 2070

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 112

gccaccatga aatgggtcac ctttatctcc ctgctgttcc tgttctcctc cgcctactct 60

tgtgccgagc agaccacaga gtggaccgcc tgctctaagt cttgcggcat gggcttctcc 120

accagagtga ccaaccggaa cagacagtgc gagatgctga agcagacccg gctgtgtatg 180

gttcgacctt gcgaggccgc tgccaaagag gctgctgcta aagaagccgc cgcaaaagag 240

gcagcagcaa aagaggctgc cgccaaagag gccgcagcca aagaagcagc agctaaagag 300

gccgctgcta aggacgccca caagtctgaa gtggcccacc ggtttaagga cctgggcgaa 360

gagaacttca aggccctggt gctgatcgcc ttcgctcagt acttgcagca gtgccccttc 420

gaggaccacg tgaagctggt caacgaagtg accgagttcg ccaagacctg cgtggccgat 480

gagtctgccg agaactgcga caagtctctg cacaccctgt tcggcgacaa gctgtgtacc 540

gtggctaccc tgagagaaac ctacggcgag atggccgact gctgcgctaa gcaagagccc 600

gagagaaacg agtgcttcct gcagcacaag gacgacaacc ctaacctgcc tagactcgtg 660

cggcctgagg tggacgtgat gtgtaccgcc ttccacgaca acgaggaaac cttcctgaag 720

aagtacctgt acgagatcgc cagacggcac ccctactttt acgcccctga gctgctgttt 780

ttcgccaagc ggtacaaggc cgccttcacc gagtgttgtc aggccgccga taaggccgct 840

tgtctgctgc ctaaactgga cgagctgcgc gacgaaggca aggcctcttc tgctaagcag 900

cggctgaagt gcgccagcct gcagaagttt ggcgagagag ccttcaaggc ttgggccgtc 960

gctagactgt cccagagatt tcccaaggcc gagtttgccg aggtgtccaa gctggttacc 1020

gacctgacca aggtgcacac cgaatgctgt cacggcgacc tgctggaatg cgccgatgat 1080

agagccgatc tggccaagta catctgcgag aaccaggact ccatctcctc caagctgaaa 1140

gagtgctgcg agaagcctct gctggaaaag tcccactgta tcgccgaggt ggaaaacgac 1200

gagatgcctg ccgatctgcc ttctctggcc gccgacttcg tggaatctaa ggacgtgtgc 1260

aagaactacg ccgaggccaa ggatgtgttc ctgggcatgt ttctgtacga gtacgctcgg 1320

cggcaccccg attatagtgt ggtgctgctg ctgagactgg ctaagaccta cgagacaacc 1380

ctcgagaagt gctgtgccgc cgctgatcct cacgagtgtt acgccaaggt gttcgacgag 1440

ttcaagccac tggtggaaga accccagaac ctgatcaagc agaattgcga gctgttcgag 1500

cagctgggcg agtacaagtt ccagaacgcc ctgctcgtgc ggtacaccaa gaaagtgccc 1560

caggtgtcca cacctacact ggttgaggtg tcccggaacc tgggcaaagt gggctctaag 1620

tgctgcaagc accctgaggc caagagaatg ccttgcgccg aggactacct gtccgtggtg 1680

ctgaatcagc tgtgcgtgct gcacgaaaag acccctgtgt ccgaccgcgt gaccaagtgc 1740

tgtacagagt ccctggtcaa cagacggccc tgcttctctg ccctggaagt ggacgagaca 1800

tacgtgccca aagagttcaa cgccgagaca ttcaccttcc acgccgacat ctgcaccctg 1860

tccgagaaag agcggcagat caagaaacag accgctctgg tcgagctggt taagcacaag 1920

cccaaggcca ccaaagaaca gctgaaggcc gtgatggacg acttcgccgc ctttgtggaa 1980

aagtgttgca aggccgacga caaagagaca tgcttcgccg aagagggcaa gaaactggtg 2040

gccgcttctc aggctgctct gggactttaa 2070

<210> 113

<211> 2143

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 113

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggtaccgcc accatgaaat gggtcacctt 60

tatctccctg ctgttcctgt tctcctccgc ctactcttgt gccgagcaga ccacagagtg 120

gaccgcctgc tctaagtctt gcggcatggg cttctccacc agagtgacca accggaacag 180

acagtgcgag atgctgaagc agacccggct gtgtatggtt cgaccttgcg aggccgctgc 240

caaagaggct gctgctaaag aagccgccgc aaaagaggca gcagcaaaag aggctgccgc 300

caaagaggcc gcagccaaag aagcagcagc taaagaggcc gctgctaagg acgcccacaa 360

gtctgaagtg gcccaccggt ttaaggacct gggcgaagag aacttcaagg ccctggtgct 420

gatcgccttc gctcagtact tgcagcagtg ccccttcgag gaccacgtga agctggtcaa 480

cgaagtgacc gagttcgcca agacctgcgt ggccgatgag tctgccgaga actgcgacaa 540

gtctctgcac accctgttcg gcgacaagct gtgtaccgtg gctaccctga gagaaaccta 600

cggcgagatg gccgactgct gcgctaagca agagcccgag agaaacgagt gcttcctgca 660

gcacaaggac gacaacccta acctgcctag actcgtgcgg cctgaggtgg acgtgatgtg 720

taccgccttc cacgacaacg aggaaacctt cctgaagaag tacctgtacg agatcgccag 780

acggcacccc tacttttacg cccctgagct gctgtttttc gccaagcggt acaaggccgc 840

cttcaccgag tgttgtcagg ccgccgataa ggccgcttgt ctgctgccta aactggacga 900

gctgcgcgac gaaggcaagg cctcttctgc taagcagcgg ctgaagtgcg ccagcctgca 960

gaagtttggc gagagagcct tcaaggcttg ggccgtcgct agactgtccc agagatttcc 1020

caaggccgag tttgccgagg tgtccaagct ggttaccgac ctgaccaagg tgcacaccga 1080

atgctgtcac ggcgacctgc tggaatgcgc cgatgataga gccgatctgg ccaagtacat 1140

ctgcgagaac caggactcca tctcctccaa gctgaaagag tgctgcgaga agcctctgct 1200

ggaaaagtcc cactgtatcg ccgaggtgga aaacgacgag atgcctgccg atctgccttc 1260

tctggccgcc gacttcgtgg aatctaagga cgtgtgcaag aactacgccg aggccaagga 1320

tgtgttcctg ggcatgtttc tgtacgagta cgctcggcgg caccccgatt atagtgtggt 1380

gctgctgctg agactggcta agacctacga gacaaccctc gagaagtgct gtgccgccgc 1440

tgatcctcac gagtgttacg ccaaggtgtt cgacgagttc aagccactgg tggaagaacc 1500

ccagaacctg atcaagcaga attgcgagct gttcgagcag ctgggcgagt acaagttcca 1560

gaacgccctg ctcgtgcggt acaccaagaa agtgccccag gtgtccacac ctacactggt 1620

tgaggtgtcc cggaacctgg gcaaagtggg ctctaagtgc tgcaagcacc ctgaggccaa 1680

gagaatgcct tgcgccgagg actacctgtc cgtggtgctg aatcagctgt gcgtgctgca 1740

cgaaaagacc cctgtgtccg accgcgtgac caagtgctgt acagagtccc tggtcaacag 1800

acggccctgc ttctctgccc tggaagtgga cgagacatac gtgcccaaag agttcaacgc 1860

cgagacattc accttccacg ccgacatctg caccctgtcc gagaaagagc ggcagatcaa 1920

gaaacagacc gctctggtcg agctggttaa gcacaagccc aaggccacca aagaacagct 1980

gaaggccgtg atggacgact tcgccgcctt tgtggaaaag tgttgcaagg ccgacgacaa 2040

agagacatgc ttcgccgaag agggcaagaa actggtggcc gcttctcagg ctgctctggg 2100

actttaatct agaaacccag ctttcttgta caaagtggtc ccc 2143

<210> 114

<211> 484

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<400> 114

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gly His His His His His His Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly

20 25 30

Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His

35 40 45

Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His

50 55 60

Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val

65 70 75 80

Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys

85 90 95

Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe

100 105 110

Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val

115 120 125

Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn

130 135 140

Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile

145 150 155 160

Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala

165 170 175

Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val

180 185 190

Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu

195 200 205

Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg

210 215 220

Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro

225 230 235 240

Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln

245 250 255

Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile

260 265 270

Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys

275 280 285

Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro

290 295 300

Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile

305 310 315 320

Ser Gly Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val

325 330 335

Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp

340 345 350

Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg

355 360 365

Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser

370 375 380

Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro

385 390 395 400

Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu

405 410 415

Gln Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

420 425 430

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Cys Ala Glu Gln Thr Thr Glu Trp

435 440 445

Thr Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met Gly Phe Ser Thr Arg Val Thr

450 455 460

Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met Leu Lys Gln Thr Arg Leu Cys Met

465 470 475 480

Val Arg Pro Cys

<210> 115

<211> 13

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть рекомбинантного белка

<400> 115

Pro Pro Ser Arg Gly Arg Ser Pro Gln Asn Ser Ala Phe

1 5 10

<210> 116

<211> 8

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть рекомбинантного белка

<400> 116

Gly Gln Pro Val Tyr Ser Ser Leu

1 5

<210> 117

<211> 7

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть рекомбинантного белка

<400> 117

Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn

1 5

<210> 118

<211> 9

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть рекомбинантного белка

<400> 118

Glu Gln Gln Pro Glu Gln Pro Thr Asp

1 5

<210> 119

<211> 8

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть рекомбинантного белка

<400> 119

Asp Val Asp Ile His Thr Leu Ile

1 5

<210> 120

<211> 11

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть рекомбинантного белка

<400> 120

Asp Ser Asn Ile Leu Lys Thr Ile Lys Ile Pro

1 5 10

<210> 121

<211> 5

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 121

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным белкам тромбоспондина I типа представителя семейства белков CCN, и может быть использовано в медицине для лечения рака или фиброза. Предложен мономерный слитый белок для ингибирования эффекта или активности 4-доменного белка CCN, содержащий полипептид, соответствующий по меньшей мере части домена гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN и слитый с ним на N- или C-конце мономерный партнер для слияния, который содержит по меньшей мере 6 аминокислот и увеличивает период полувыведения из сыворотки указанного слитого белка. Изобретение обеспечивает получение слитых белков на основе усеченных фрагментов домена III белка семейства CCN, которые воспроизводят или имеют биологическую активность CCN5, способны антагонизировать или ингибировать эффекты 4-доменных белков CCN и устойчивы к протеолитическому разложению. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 табл., 23 пр.

1. Мономерный слитый белок для ингибирования эффекта или активности 4-доменного белка CCN, содержащий:

(i) полипептид, соответствующий по меньшей мере части домена гомологии к повторам тромбоспондина типа 1 (TSP-1) белка семейства CCN;

(ii) мономерный партнер для слияния, слитый на N- или C-конце с последовательностью аминокислот по (i), причем указанный мономерный партнер для слияния содержит по меньшей мере 6 аминокислот и увеличивает период полувыведения из сыворотки указанного слитого белка; и

(iii) необязательно, пептидный линкер между полипептидом по (i) и мономерным партнером для слияния по (ii),

при этом указанный полипептид согласно (i) (a) содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 37 или 2, и имеет длину от 44 до 60 аминокислот, или (b) содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2, и имеет длину от 40 до 60 аминокислот, причем все остатки цистеина в указанной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2, сохранены, и причем указанный полипептид согласно (i) осуществляет ту же активность, что и домен гомологии с TSP-1 CCN5,

и при этом указанный мономерный партнер для слияния по (ii) и указанный пептидный линкер по (iii) не представляют собой или не содержат домен гомологии со связывающим IGF белком, домен гомологии с повторами фактора фон Виллебранда типа C или домен цистинового узла белка семейства CCN.

2. Слитый белок по п. 1, отличающийся тем, что указанный полипептид по (i) имеет длину от 44 до 57 аминокислот.

3. Слитый белок по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный полипептид по (i) содержит или состоит из:

(a) последовательности аминокислот, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 9; или

(b) последовательности аминокислот, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 или 9; или

(c) части последовательности аминокислот по (a) или (b), при том что указанная часть содержит по меньшей мере последовательность из 44 аминокислот из SEQ ID NO: 37 или 2, соответственно, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2, соответственно.

4. Слитый белок по любому из пп. 1–3, отличающийся тем, что указанный полипептид состоит из последовательности аминокислот, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2, или последовательности, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2.

5. Слитый белок по любому из пп. 1–4, отличающийся тем, что пептидный линкер по (iii) содержит не более 50 аминокислот.

6. Слитый белок по любому из пп. 1–5, отличающийся тем, что указанный полипептид по (i) содержит остаток аланина в положении, соответствующем положению 2 указанной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 37 или 2, или SEQ ID NO: 1 или 9.

7. Слитый белок по любому из пп. 1–6, отличающийся тем, что последовательность аминокислот по (i) содержит последовательность аминокислот, выбранную из SEQ ID NO: 7, 38, 44 или 49, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с указанной последовательностью, причем указанный белок содержит остаток аланина в положении, соответствующем положению 2 указанной последовательности SEQ ID NO: 7, 38, 44 или 49.

8. Слитый белок по любому из пп. 1–7, отличающийся тем, что указанный мономерный партнер для слияния выбран из группы, состоящей из сывороточного альбумина, трансферрина и мономерного Fc-фрагмента IgG человека.

9. Слитый белок по п. 8, отличающийся тем, что указанный мономерный Fc-фрагмент IgG человека представляет собой мономерный Fc-фрагмент IgG1, IgG2 или IgG4.

10. Слитый белок по п. 8 или 9, отличающийся тем, что указанный мономерный Fc-фрагмент агликозилирован.

11. Слитый белок по любому из пп. 8–10, отличающийся тем, что указанный мономерный Fc-фрагмент содержит стабилизирующий дисульфидный мостик и/или мутацию, стабилизирующую против действия протеазы.

12. Слитый белок по любому из пп. 8–11, отличающийся тем, что указанный мономерный Fc-фрагмент не обладает иммунной эффекторной функцией.

13. Слитый белок по любому из пп. 1–12, отличающийся тем, что указанный пептидный линкер между последовательностью аминокислот по (i) и указанным мономерным партнером для слияния имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20–25, 39, 57, 63, 65 или 67, или последовательность аминокислот, которая имеет 80% идентичности с указанной последовательностью.

14. Слитый белок по любому из пп. 1–8, отличающийся тем, что указанный слитый белок имеет последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 84, 85, 88, 89, 97, 98, 102, 103, 106, 107, 110 и 111, или последовательность аминокислот, которая имеет 80% идентичности с указанной последовательностью.

15. Молекула ДНК, кодирующая мономерный слитый белок, как определено в любом из пп. 1–14.

16. Молекула ДНК по п. 15, отличающаяся тем, что указанная молекула дополнительно содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую сигнальную последовательность.

17. Молекула ДНК по п. 15 или 16, отличающаяся тем, что указанная молекула содержит последовательность нуклеотидов согласно SEQ ID NO: 34, 35, 36, 86, 87, 90, 91, 99, 100, 104, 105, 108, 109, 112 или 113, или последовательность нуклеотидов, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с любой вышеуказанной последовательностью.

18. Экспрессионный вектор для обеспечения экспрессии в клетке млекопитающего, содержащий молекулу ДНК, как определено в любом из пп. 15–17.

19. Клетка-хозяин млекопитающего для экспрессии мономерного слитого белка по любому из пп. 1-14, содержащая вектор, как определено в п. 18.

20. Применение слитого белка по любому из пп. 1–14 при лечении или предотвращении фиброза, или любого состояния, при котором проявляется фиброз.

21. Применение слитого белка по любому из пп. 1–14 при лечении рака.