Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к полипептиду, представляющему собой слитый белок из белка DCTN1 и белка RET; к полинуклеотиду, кодирующему полипептид; к способу детекции полипептида или полинуклеотида; к соединению, нацеленному на полипептид или полинуклеотид; и к способу скрининга соединения.

Уровень техники

[0002]

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти в Японии, и ее лечение необходимо улучшать. Несмотря на то, что количество индивидуумов, пораженных раком щитовидной железы, увеличивается, соответствующее лечение на начальной стадии приводит к высокому уровню выживаемости, благодаря медленному прогрессированию заболевания в большинстве случаев. Заболевание, однако, почти не имеет субъективных симптомов, и ранняя диагностика является необходимой для адекватного лечения.

[0003]

Рак щитовидной железы разделяют по гистологическим типам на папиллярную злокачественную опухоль, фолликулярную злокачественную опухоль, медуллярную злокачественную опухоль, анапластическую злокачественную опухоль и злокачественную лимфому. Папиллярная злокачественная опухоль насчитывает приблизительно 80% рака щитовидной железы, и анапластическая злокачественная опухоль, которая, несмотря на то, что имеет более низкую встречаемость, как известно, имеет очень плохой прогноз (непатентный литературный источник 1).

[0004]

Известно, что папиллярная злокачественная опухоль развивается в большой степени из-за активации онкогенов, и выявлены взаимоисключающие генетические аномалии, такие как мутация в гене BRAF (50-60%), мутация в гене RAS (10-20%) и слитый ген RET (5-10%). Опубликованы также исследования, что при немелкоклеточном рак легкого, слитый ген RET присутствует с частотой 1-2%, взаимоисключающим образом с управляющими мутациями в других генах, такими как мутация в гене EGFR (непатентные литературные источники 2-5).

[0005]

Лечение лекарственными средствами является преобладающим способом лечения рака щитовидной железы на поздних стадиях, и апробировано множество ингибиторов множества киназ. Однако лекарственные средства, проявляющие эффект, специфический для управляющих мутаций в генах, остаются не одобренными. Опубликованы результаты исследований, что для положительных по слитому гену RET пациентов с раком легкого показано преимущество от ингибирования RET (непатентный литературный источник 6); также при раке щитовидной железы необходимо идентифицировать генные аномалии, такие как мутации в генах или слитые гены, которые могут являться показателем эффекта лекарственных средств.

[0006]

Очень желательна идентификация мутаций в генах (мутаций в белках), слитых генов (слитых белков) и т.д., которые могут управлять злокачественной опухолью; поскольку такая идентификация может прояснять природу злокачественной опухоли и вносить значительный вклад в разработку новых лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей или способов тестирования, направленных на эти мутации в генах или слитые гены. Однако мутации в генах, слитые гены и т.д., которые могут управлять развитием злокачественных опухолей, еще предстоит полностью прояснить, и идентификация генных аномалий, которые могут быть ассоциированы с терапевтическими эффектами лекарственных средств, могут являться очень важными.

Список литературы

Непатентные литературные источники

[0007]

Непатентный литературный источник 1: Cancer, 115 (16), pp. 3801-7 (2009)

Непатентный литературный источник 2: Oncogene, 22 (29), pp. 4578-80 (2003)

Непатентный литературный источник 3: Cell, 159 (3), pp. 676-90 (2014)

Непатентный литературный источник 4: Cancer Discov., 3 (6), pp. 630-5 (2013)

Непатентный литературный источник 5: Nature, 511 (7511), pp. 543-50 (2014)

Непатентный литературный источник 6: Lancet Respir Med., 5 (1), pp. 42-50 (2017).

Сущность изобретения

Техническая задача

[0008]

Целью настоящего изобретения является разработка нового полипептида, представляющего собой слитый белок, включающий по меньшей мере часть белка RET; полинуклеотида, кодирующего полипептид; способа детекции полипептида или полинуклеотида; соединения, нацеленного на полипептид или полинуклеотид; и способа скрининга соединения.

Решение задачи

[0009]

Авторы настоящего изобретения провели интенсивное исследование для достижения этой цели и идентифицировали новый полипептид, в котором часть белка DCTN1 слита с частью белка RET, и полинуклеотид, кодирующий полипептид, в клетках, полученных от пациентов с раком щитовидной железы. Авторы изобретения обнаружили также способ детекции полинуклеотида или полипептида по настоящему изобретению в клетках злокачественных опухолей, и способ скрининга соединения, ингибирующего экспрессию полинуклеотида, или экспрессию и/или активность полипептида. Это является новым обнаружением и не может быть предсказано из предшествующего уровня техники, что, среди широкого диапазона белков, слитый белок, содержащий комбинацию N-концевой части белка DCTN1 и C-концевой части белка RET, естественным образом встречается внутри клеток; и что, поскольку слитый ген из DCTN1 и RET функционирует как управляющий злокачественной опухолью, слитый белок можно использовать в диагностике злокачественных опухолей. Они, кроме того, обнаружили фармацевтическую композицию, которая содержит соединение, ингибирующее RET, в качестве активного ингредиента, и которая предназначена для использования в лечении пациентов с злокачественной опухолью, имеющей экспрессию полипептида и/или полинуклеотида, и завершили настоящее изобретение.

[0010]

Конкретно, настоящее изобретение относится к следующему объекту.

[0011]

Пункт 1.

Полипептид, где N-концевая часть белка DCTN1 слита с C-концевой частью белка RET.

[0012]

Пункт 2.

Полипептид по пункту 1, выбранный из следующих (a)-(c):

[0013]

(a) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24;

[0014]

(b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24; и

[0015]

(c) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0016]

Пункт 3.

Полинуклеотид, кодирующий полипептид по пункту 1 или 2.

[0017]

Пункт 4.

Полинуклеотид по пункту 3, выбранный из следующих (d) - (f):

[0018]

(d) полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24;

[0019]

(e) полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24; и

[0020]

(f) полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0021]

Пункт 5.

Полинуклеотид по пункту 3, выбранный из следующих (g)-(i):

[0022]

(g) полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, представленную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23;

[0023]

(h) полинуклеотид, гибридизующийся в строгих условиях с полинуклеотидом, содержащим последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований, представленной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23; и

[0024]

(i) полинуклеотид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность с последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0025]

Пункт 6.

Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пунктов 3-5.

[0026]

Пункт 7.

Клетка, трансфицированная полинуклеотидом по любому из пунктов 3-5.

[0027]

Пункт 8.

Антитело, специфически связывающееcя с полипептидом по пункту 1 или 2.

[0028]

Пункт 9.

Способ детекции присутствия полипептида по пункту 1 или 2 в образце.

[0029]

Пункт 10.

Праймер или зонд для детекции присутствия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 в образце, представляющий собой полинуклеотид, выбранный из следующих (j) - (l):

[0030]

(j) полинуклеотид, представляющий собой по меньшей мере один зонд, выбранный из группы, состоящей из зондов, гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и зондов, гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим белок RET;

[0031]

(k) полинуклеотид, представляющий собой зонд, гибридизующийся с точкой слияния между полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и полинуклеотидом, кодирующим белок RET; и

[0032]

(l) полинуклеотид, представляющий собой набор из смыслового праймера и антисмыслового праймера, разработанных для обрамления точки слияния между полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и полинуклеотидом, кодирующим белок RET.

[0033]

Пункт 11.

Способ детекции присутствия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 в образце.

[0034]

Пункт 12.

Способ диагностики злокачественной опухоли у пациента, когда присутствие полипептида по пункту 1 или 2 или полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 детектируют в образце, полученном от пациента, посредством способа детекции по пункту 9 или 11.

[0035]

Пункт 13.

Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET, где композиция содержит соединение, ингибирующее RET, в качестве активного ингредиента.

[0036]

Пункт 14.

Способ скрининга соединения, ингибирующего экспрессию и/или активность полипептида по пункту 1 или 2, или экспрессию полинуклеотида по любому из пунктов 3-5, включающий следующие стадии (1) и (2):

[0037]

(1) стадию приведения полипептида по пункту 1 или 2, клетки, экспрессирующей полипептид по пункту 1 или 2, или полинуклеотида по любому из пунктов 3-5, или клетки по пункту 7 в контакт с тестируемым соединением; и

[0038]

(2) стадию измерения того, ингибирована ли экспрессия и/или активность полипептида по пункту 1 или 2, или экспрессия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 на стадии (1), или стадию измерения того, ингибирован ли рост клетки на стадии (1).

[0039]

Пункт 15.

Способ с использованием полипептида по пункту 1 или 2 или полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 в качестве индикатора для определения того, является ли эффективной химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего RET,

включающий определение того, что химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего RET, является эффективной, когда полипептид по пункту 1 или 2 детектируют в образце посредством способа детекции по пункту 9, и/или когда присутствие полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 детектируют в образце посредством способа детекции по пункту 11.

[0040]

Пункт 16.

Биомаркер для детекции злокачественной опухоли, содержащий по меньшей мере один член, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, где N-концевая часть белка DCTN1 слита с C-концевой частью белка RET, и полинуклеотидов, кодирующих полипептиды.

[0041]

Пункт 17.

Способ лечения злокачественной опухоли, включающий

проведение химиотерапии с использованием соединения, ингибирующего RET, для пациента с злокачественной опухолью, положительного по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительного по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET.

[0042] Пункт 18.

Способ лечения злокачественной опухоли, включающий

детекцию присутствия полипептида по пункту 1 или 2, и/или присутствия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 в образце, полученном от тестируемого субъекта, и

проведение химиотерапии с использованием соединения, ингибирующего RET, для тестируемого субъекта, когда детектировано присутствие полипептида по пункту 1 или 2, и/или детектировано присутствие полинуклеотида по любому из пунктов 3-5.

[0043]

Пункт 19.

Соединение, ингибирующее RET, для применения в лечении пациента со злокачественной опухолью, положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET.

[0044]

Пункт 20.

Применение соединения, ингибирующего RET, для получения фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли для лечения пациента со злокачественной опухолью, положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET.

[0045]

Пункт 21.

Способ получения реагента для определения того, является ли химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего RET, эффективной, с использованием средств для детекции присутствия полипептида по пункту 1 или 2 в образце, и/или средств для детекции присутствия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5 в образце.

[0046]

Пункт 22.

Комбинация антитела к DCTN1 и антитела к RET для детекции присутствия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5.

[0047]

Пункт 23.

Применение антитела по пункту 8, комбинации антител по пункту 22 или праймера или зонда по пункту 10 для получения детектирующего реагента для детекции присутствия полипептида по пункту 1 или 2 или присутствия полинуклеотида по любому из пунктов 3-5.

Выгодные эффекты изобретения

[0048]

В настоящем изобретении показано, что полинуклеотид и/или полипептид по настоящему изобретению специфически экспрессируются в клетке злокачественной опухоли. Полинуклеотид, полипептид и клетку, экспрессирующую полинуклеотид и/или полипептид по настоящему изобретению, можно использовать в способе скрининга соединения, ингибирующего экспрессию полинуклеотида, или экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению. Использование присутствия полинуклеотида и/или полипептида по настоящему изобретению в качестве индикатора позволяет детекцию мишени, положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или мишени, положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET. Соединение, ингибирующее RET, можно использовать в качестве фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET.

Краткое описание чертежей

[0049]

Фиг. 1: Подтверждение экспрессии слитого гена DCTN1-RET и GAPDH в ткани злокачественной опухоли щитовидной железы с использованием цифровой капельной ПЦР (цкПЦР).

Фиг. 2: Подтверждение экспрессии слитого гена DCTN1-RET и GAPDH в нормальной ткани щитовидной железы с использованием цифровой капельной ПЦР (цкПЦР).

Фиг. 3: Подтверждение экспрессии полноразмерного слитого гена DCTN1-RET в нормальной ткани щитовидной железы и в ткани злокачественной опухоли щитовидной железы.

Фиг. 4: Подтверждение экспрессии слитого белка DCTN1-RET в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3:

a) Детекция слитого белка DCTN1-RET с использованием антитела к фосфорилированного RET;

b) Детекция слитого белка DCTN1-RET с использованием антитела к RET; и

c) Детекция слитого белка DCTN1-RET с использованием антитела к DCTN1.

Фиг. 5: Подтверждение роста клеток NIH/3T3, экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET, в 3-мерной культуре.

N=3, среднее+SD.

Фиг. 6: Подтверждение онкогенности клеток NIH/3T3, экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET, in vivo.

Фиг. 7: Подтверждение ингибирования экспрессии фосфорилированного RET посредством миРНК RET в клетках NIH/3T3, экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET.

Фиг. 8: Подтверждение эффекта ингибирования роста на клетки NIH/3T3, экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET, посредством миРНК RET.

Фиг. 9: Подтверждение ингибирования экспрессии фосфорилированного RET в клетках NIH/3T3, экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET, посредством соединений, ингибирующих RET.

Описание вариантов осуществления

[0050]

Настоящее изобретение относится к новому полинуклеотиду или полипептиду; к способу детекции полинуклеотида или полипептида; к соединению, нацеленному на полинуклеотид или полипептид; и к способу скрининга соединения.

[0051]

Настоящее изобретение относится к полипептиду, в котором N-концевая часть белка DCTN1 слита с C-концевой частью белка RET (который может быть далее в настоящем описании обозначен как «полипептид по настоящему изобретению»). Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид (который может быть далее в настоящем описании обозначен как «полинуклеотид по настоящему изобретению»).

[0052]

«Белок DCTN1 (субъединицу 1 динактина)» по настоящему изобретению называют также белком ассоциированного с динеином полипептида 150 кДа или белком DAP-150, и он включает белок DCTN1 человека или не относящегося к человеку млекопитающего, где белок DCTN1 человека является предпочтительным. Белок DCTN1 кодирован геном, локализованным на 2p13.1 у человека. По настоящему изобретению, «белок DCTN1» включает изоформы (его варианты сплайсинга), и примеры белка DCTN1 человеческого происхождения включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, представленную номером доступа в GenPept NP_004073, NP_075408, NP_001128512, NP_001128513, NP_001177765 или NP_001177766. Более конкретно, примеры включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Кроме того, «N-концевая часть белка DCTN1» по настоящему изобретению относится к полипептиду, содержащему часть или весь суперспиральный домен, который находится на N-концевой стороне белка DCTN1, и предпочтительно, к полипептиду, содержащему весь суперспиральный домен, который находится на N-концевой стороне белка DCTN1.

[0053]

«Белок RET» по настоящему изобретению называют также протоонкогенным белком RET, белком рецепторной тирозинкиназы RET или белком, подвергаемым реаранжировке в ходе трансфекции; и включает белок RET человека или не относящегося к человеку млекопитающего, где белок RET человека является предпочтительным. Белок RET кодирован геном, локализованным на 10q11.2 у человека. По настоящему изобретению, «белок RET» включает изоформы (его варианты сплайсинга), и примеры белка RET человеческого происхождения включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, представленную номером доступа в GenPept NP_066124 или NP_065681. Более конкретно, примеры включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32. Кроме того, «C-концевая часть белка RET» по настоящему изобретению относится к полипептиду, содержащему киназный домен, который находится на C-концевой стороне белка RET.

[0054]

«Полипептид, в котором N-концевая часть белка DCTN1 является слитой с C-концевой частью белка RET», по настоящему изобретению, представляет собой полипептид, в котором полипептид, содержащий часть или весь суперспиральный домен, который находится на N-концевой стороне белка DCTN1, является слитым с полипептидом, содержащим киназный домен, который находится на C-концевой стороне белка RET, предпочтительно, полипептид, в котором полипептид, содержащий весь суперспиральный домен, который находится на N-концевой стороне белка DCTN1, является слитым с полипептидом, содержащим киназный домен, который находится на C-концевой стороне белка RET, и более предпочтительно, с полипептидом, выбранным из следующих (a)-(c). Эти полипептиды, предпочтительно, имеют активность киназы и/или эффект вызова пролиферации клеток.

[0055]

(a) Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0056]

(b) Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0057]

(c) Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0058]

Более предпочтительно, полипептид выбран из следующих (a)-(c). Эти полипептиды, предпочтительно, имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток.

[0059]

(a) Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18.

[0060]

(b) Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 18.

[0061]

(c) Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 18.

[0062]

«Полипептид, в котором N-концевая часть белка DCTN1 является слитой с C-концевой частью белка RET», по настоящему изобретению включает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24 (пункт (b) выше). Примеры полипептидов, содержащих такую аминокислотную последовательность, где N-концевая часть белка DCTN1 является слитой с C-концевой частью белка RET, включают изоформы полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24, где N-концевая часть белка DCTN1 является слитой с C-концевой частью белка RET. Эти полипептиды, предпочтительно, имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток. В рамках изобретения, «несколько аминокислот, которые заменены, делетированы или добавлены», обозначает, например, предпочтительно, 1-10 аминокислот, и более предпочтительно, 1-5 аминокислот. «Добавление» включает добавление от одной до нескольких аминокислот к N-концу или C-концу, или добавление от одной до нескольких аминокислот к обоим концам.

[0063]

Примеры полипептида, где одна или несколько аминокислот заменены, включают полипептиды, в которых валин в положении 804 (в положении 1325 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1191 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1300 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1186 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1283 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1318 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24), который находится в участке-привратнике белка RET, содержащем аминокислотную последовательность, представленную номером доступа в GenPept: NP_066124 (SEQ ID NO: 31) или NP_065681 (SEQ ID NO: 32), заменен на лейцин, метионин или глутаминовую кислоту; и полипептиды, в которых тирозин в положении 806 (в положении 1327 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1193 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1302 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1188 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1285 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1320 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24) заменен на цистеин, глутаминовую кислоту, серин, гистидин или аспарагин.

[0064]

Примеры также включают аминокислоты, локализованные в положении, отличном от участка-привратника, но без ограничения, полипептиды, в которых глутаминовая кислота в положении 768 (в положении 1289 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1155 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1264 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1150 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1247 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1282 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24) заменен на аспарагиновую кислоту; полипептиды, в которых аланин в положении 883 (в положении 1404 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1270 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1379 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1265 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1362 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1397 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24) заменен на фенилаланин или серин; полипептиды, в которых глутаминовая кислота в положении 884 (в положении 1405 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1271 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1380 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1266 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1363 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1398 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24) заменена на валин; полипептиды, в которых серин в положении 891 (в положении 1412 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1278 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1387 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1273 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1370 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1405 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24) заменен на аланин или лейцин; и полипептиды, в которых метионин в положении 918 (в положении 1439 в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, в положении 1305 в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, в положении 1414 в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12, в положении 1300 в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16, в положении 1397 в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20, в положении 1432 в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24) заменен на треонин.

[0065]

Полипептид, в котором N-концевая часть белка DCTN1 является слитой с C-концевой частью белка RET, по настоящему изобретению включает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24, при их соответствующем выравнивании (пункт (c) выше). Эти полипептиды, предпочтительно, имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток.

[0066]

Идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24, составляет предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%. Идентичность аминокислотной последовательности можно рассчитывать общепринятым способом.

[0067]

Полипептид по настоящему изобретению может содержать аминокислоты, составляющие белковую метку, в дополнение к аминокислотной последовательности, составляющей полипептид по настоящему изобретению. Примеры полезных меток включают метки, хорошо известные специалисту в данной области; например, полезные метки включают метки для улучшения эффективности экспрессии и метки для улучшения эффективности очистки, такие как метка His, метка Myc и метка FLAG.

[0068]

Полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, в котором N-концевая часть белка DCTN1 является слитой с C-концевой частью белка RET, и предпочтительно, представляет собой полинуклеотид, выбранный из следующих (d)-(i). Эти полинуклеотиды, предпочтительно, кодируют полипептиды, которые имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток.

[0069]

(d) Полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0070]

(e) Полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0071]

(f) Полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.

[0072]

(g) Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, представленную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0073]

(h) Полинуклеотид, гибридизующийся в строгих условиях с полинуклеотидом, содержащим последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований, представленной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0074]

(i) Полинуклеотид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность с последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0075]

Более предпочтительно, полинуклеотид по настоящему изобретению выбран из следующих (d)-(i). Эти полинуклеотиды предпочтительно кодируют полипептиды, которые имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток.

[0076]

(d) Полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18.

[0077]

(e) Полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, где одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 18.

[0078]

(f) Полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 18.

[0079]

(g) Полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, представленную SEQ ID NO: 17.

[0080]

(h) Полинуклеотид, гибридизующийся в строгих условиях с полинуклеотидом, содержащим последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований, представленной SEQ ID NO: 17.

[0081]

(i) Полинуклеотид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность с последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO: 17.

[0082]

Полинуклеотид по настоящему изобретению включает не только его двухцепочечную ДНК, но также различные типы одноцепочечной ДНК и РНК, составляющие двухцепочечную ДНК, такие как смысловые цепи и антисмысловые цепи. Антисмысловые цепи можно использовать в качестве зондов и т.п. ДНК включает виды ДНК, полученные посредством клонирования, химического синтеза или их комбинации, такие как кДНК и геномная ДНК. Кроме того, последовательности оснований, такие как последовательности нетранслируемой области (UTR), можно добавлять к полинуклеотиду по настоящему изобретению, в дополнение к последовательности оснований для кодирования полипептида по настоящему изобретению.

[0083]

Строгие условия, в рамках изобретения включают, например, условия, описанные в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition, J. Sambrook et al., 1989). Конкретно, строгие условия включают такие условия, что раствор, содержащий 6×SSC (состав 1×SSC: 0,15 M хлорид натрия, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,0), 0,5% SDS, 5×Denhalt и 100 мг/мл ДНК спермы сельди, подвергают изотермической обработке вместе с зондом при 65°C в течение 8-16 часов для проведения гибридизации.

[0084]

Идентичность с последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23, предпочтительно, составляет по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%. Идентичность последовательности оснований можно рассчитывать общепринятым способом.

[0085]

В этом описании, фраза «имеют активность киназы» в «имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток» означает наличие ферментной активности для фосфорилирования тирозина. Кроме того, фраза «имеют эффект вызова пролиферации клеток» в «имеют активность киназы или эффект вызова пролиферации клеток» означает, что трансфекция полинуклеотида и/или полипептида по настоящему изобретению в клетку улучшает способность клетки к пролиферации, по сравнению с клеткой, в которую не трансфицируют полинуклеотид и/или полипептид. Этот эффект можно подтверждать, например, следующим образом: полинуклеотидом и/или полипептидом трансфицируют линию клеток, пролиферирующую в зависимости от цитокинов, и если линия клеток пролиферирует независимо от цитокинов, полинуклеотид и/или полипептид имеет эффект вызова пролиферации клеток.

[0086]

Полинуклеотид по настоящему изобретению можно выделять, например, с использованием библиотеки кДНК или библиотеки геномной ДНК, полученной из злокачественной опухоли щитовидной железы и т.д., сохраняющей ген, слитый из гена DCTN1 и гена RET, с использованием праймера, который специфически гибридизуется с частью последовательности оснований полинуклеотида по настоящему изобретению. Для этого праймера, можно использовать любой праймер любой последовательности и любой длины, при условии, что праймер специфически гибридизуется по меньшей мере с частью полинуклеотида по настоящему изобретению или его антисмысловой цепью. Можно использовать также способ искусственного синтеза полинуклеотидов (Nat. Methods, 11: 499-507, 2014).

[0087]

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению не является конкретно ограниченным, при условии, что экспрессирующий вектор содержит полинуклеотид по настоящему изобретению, и позволяет экспрессию полипептида по настоящему изобретению. Примеры включают экспрессирующие векторы, полученные посредством вставки полинуклеотида по настоящему изобретению в известный экспрессирующий вектор, подходящим образом выбранный в соответствии с хозяином для использования.

[0088]

Хозяин не является конкретно ограниченным, при условии, что хозяин представляет собой живую клетку, которая может подвергаться трансформации, и примеры включают бактерии, такие как E. coli и Bacillus subtilis; настоящие грибы, такие как дрожжи и мицелиальные грибы; клетки насекомых, такие как клетки Sf9; насекомых, таких как шелкопряд; клетки животных; и растения или клетки растительного происхождения.

[0089]

Вектор для вставки полинуклеотида по настоящему изобретению не является конкретно ограниченным, при условии, что вектор является способным к репликации в хозяине. Вектор можно подходящим образом выбирать в соответствии, например, с типом хозяина, подвергаемого введению, и со способом введения. Примеры включают плазмидную ДНК, фаговую ДНК и вирусные векторы. Для векторной ДНК для использования в конструировании экспрессирующего вектора, можно использовать широко распространенную и легко доступную векторную ДНК. Примеры включают pUC19 (Takara Bio Inc.), pTV118N (Takara Bio Inc.), pMAMneo (Clontech Laboratories, Inc.), pGEX (GE Healthcare), pET160 (Invitrogen), pDEST (Invitrogen), pIEx (Merck Millipore) и pBacPAK (Clontech Laboratories, Inc.). Примеры вирусных векторов включают ДНК-вирусы и РНК-вирусы, такие как бакуловирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы (например, вирус иммунодефицита человека или HIV), аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы (вектор AAV), вирус герпеса, вирус осповакцины, поксвирус, вирус полиомиелита, вирус синдбис, вирус сендай и вирус обезьян-40 (SV-40).

[0090]

Трансформацию хозяина с использованием экспрессирующего вектора можно проводить, например, способом протопластов, способом компетентных клеток или способом электропорации. Полученный трансформант можно культивировать в подходящих условиях в среде, содержащей источник углерода, источник азота, соли металлов, витамины и т.д., которые может использовать хозяин.

[0091]

Примеры клетки, трансфицированной полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, включают клетки, трансформированные экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, и клетки, в которые полинуклеотид по настоящему изобретению введен посредством редактирования генома. Клетка для использования включает клетки-хозяева, перечисленные выше. Примеры способа подтверждения того, была ли клетка трансформирована экспрессирующим вектором, включают способ детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению и способ детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению.

[0092]

«Клетки, в которые полинуклеотид по настоящему изобретению введен посредством редактирования генома», предпочтительно, представляют собой клетки, имеющие ген, полученный посредством слияния независимо присутствующего гена DCTN1 и гена RET посредством редактирования генома, и более предпочтительно, клетки, имеющие ген, полученный посредством слияния экзона 27 DCTN1 и экзона 12 RET в соответствующих независимо присутствующих гене DCTN1 и гене RET посредством редактирования генома. Эти клетки можно получать общепринятым способом, и примеры включают способ, описанный в Cell Rep., 9(4), pp. 1219-1227 (2014), Nat. Commun., 5, 3728 (2014). Примеры способа подтверждения того, представляет ли клетка собой клетку, в которую полинуклеотид по настоящему изобретению введен посредством редактирования генома, включают способ детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению и способ детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению.

[0093]

Полипептид по настоящему изобретению можно получать посредством получения культурального раствора и/или клеток посредством культивирования клеток, трансформированных экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, в среде, подходящей для культивирования клеток, в подходящих условиях, и затем сбора и очистки белка из культурального раствора и/или клеток типичным способом. Полипептид по настоящему изобретению можно также получать посредством введения экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему изобретению, или РНК-матрицы или ДНК-матрицы, кодирующей полинуклеотид по настоящему изобретению, в бесклеточную систему синтеза белка (например, экстракт, полученный из линии клеток человека, экстракт ретикулоцитов кролика, экстракт зародышей пшеницы и экстракт E. coli); инкубацию полученной смеси в подходящих условиях; и сбор и очистку белка из полученного реакционного раствора типичным способом.

[0094]

По настоящему изобретению, антитело, специфически связывающееcя с полипептидом по настоящему изобретению, включает антитело, которое специфически связывается с точкой слияния N-концевой части белка DCTN1 и C-концевой части белка RET. Антитело относится к антителу, которое специфически связывается с точкой слияния N-концевой части белка DCTN1 и C-концевой части белка RET, но которое не связывается ни с одним из белка DCTN1 дикого типа и RET дикого типа.

[0095]

По настоящему изобретению, фраза «точка слияния» в «точка слияния N-концевой части белка DCTN1 и C-концевой части белка RET» относится к точке, в которой полипептид, происходящий из N-концевой части белка DCTN1, слит с полипептидом, происходящим из C-концевой части белка RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 2 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1233 из SEQ ID NO: 2, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1234-1635 из SEQ ID NO: 2, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 4 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1233 из SEQ ID NO: 4, происходящий из N-концевой части DCTN 1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1234-1593 из SEQ ID NO: 4, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 6 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1099 из SEQ ID NO: 6, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1100-1501 из SEQ ID NO: 6, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 8 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1099 из SEQ ID NO: 8, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1100-1459 из SEQ ID NO: 8, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 10 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1208 из SEQ ID NO: 10, происходящий из N-концевой части of DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1209-1610 из SEQ ID NO: 10, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 12 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1208 из SEQ ID NO: 12, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1209-1568 из SEQ ID NO: 12, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 14 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1094 из SEQ ID NO: 14, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1095-1496 из SEQ ID NO: 14, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 16 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1094 из SEQ ID NO: 16, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1095-1454 из SEQ ID NO: 16, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 18 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1191 из SEQ ID NO: 18, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1192-1593 из SEQ ID NO: 18, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 20 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1191 из SEQ ID NO: 20, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1192-1551 из SEQ ID NO: 20, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 22 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1226 из SEQ ID NO: 22, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1227-1628 из SEQ ID NO: 22, происходящим из C-концевой части RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 24 представляет собой точку, в которой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из положений 1-1226 из SEQ ID NO: 24, происходящий из N-концевой части DCTN1, слит с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность из положений 1227-1586 из SEQ ID NO: 24, происходящим из C-концевой части RET.

[0096]

Примеры антитела включают иммуноглобулины (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и IgY), фрагменты Fab, фрагменты F(ab')₂, одноцепочечные фрагменты антител (scFv), однодоменные антитела и диатела (Nat. Rev. Immunol., 6: 343-357, 2006). Они включают, но без ограничения, моноклональные антитела и поликлональные антитела, например, из человеческих антител, гуманизированных антител, химерных антител, мышиных антител, антител ламы и антител курицы.

[0097]

Антитело можно получать различными известными способами, и способ получения не является конкретно ограниченным. Известные способы включают способ, в котором полипептид по настоящему изобретению, фрагмент полипептида, содержащий точку слияния N-концевой части белка DCTN1 и C-концевой части белка RET, или т.п., инокулируют иммунизированному животному для активации иммунной системы животного, и сыворотку животного собирают для получения поликлонального антитела; и способ получения моноклонального антитела, например, способом гибридомы и способом фагового дисплея.

[0098]

Способ скрининга соединения, ингибирующего экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, можно осуществлять способом, включающим следующие стадии (1) и (2).

[0099]

Конкретно, способ скрининга по настоящему изобретению осуществляют способом, включающим:

(1) стадию приведения полипептида по настоящему изобретению, или клетки, экспрессирующей полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, в контакт с тестируемым соединением; и

[0100]

(2) стадию измерения того, ингибированы ли экспрессия и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессия полинуклеотида по настоящему изобретению на стадии (1), или стадию измерения того, ингибирован ли рост клетки на стадии (1).

[0101]

Более предпочтительно, способ скрининга по настоящему изобретению представляет собой способ, включающий следующие стадии (1) и (2).

[0102]

(1) Стадия приведения клетки, экспрессирующей полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, в контакт с тестируемым соединением.

[0103]

(2) Стадия измерения того, ингибирован ли рост клетки на стадии (1).

[0104]

Способ скрининга соединения, ингибирующего экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, можно осуществлять способом, включающим следующие стадии (1)-(3).

[0105]

Конкретно, способ скрининга по настоящему изобретению осуществляют способом, включающим:

(1) стадию приведения полипептида по настоящему изобретению или клетки, экспрессирующей полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, в контакт с тестируемым соединением;

[0106]

(2) стадию измерения того, ингибирована ли экспрессия и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессия полинуклеотида по настоящему изобретению на стадии (1), или стадию измерения того, ингибирован ли рост клетки на стадии (1); и

[0107]

(3) стадию определения того, что тестируемое соединение ингибирует экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, когда экспрессия и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессия полинуклеотида по настоящему изобретению ингибирована на стадии (2), или когда рост клетки на стадии (1) ингибирован на стадии (2).

[0108]

Более предпочтительно, способ скрининга по настоящему изобретению представляет собой способ, включающий следующие стадии (1) - (3).

[0109]

(1) Стадия приведения клетки, экспрессирующей полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, в контакт с тестируемым соединением.

[0110]

(2) Стадия измерения того, ингибирован ли рост клетки на стадии (1).

[0111]

(3) Стадия определения того, что тестируемое соединение ингибирует экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, когда рост клетки на стадии (1) ингибирован на стадии (2).

[0112]

«Клетка, экспрессирующая полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению», включает клетки, трансформированные экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, клетки, в которые введен полинуклеотид по настоящему изобретению посредством редактирования генома, первичную культуру клеток, экспрессирующих полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, линии клеток, экспрессирующие полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, и происходящие от пациента с злокачественной опухолью клетки, экспрессирующие полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению. Примеры способа подтверждения того, экспрессирует ли клетка полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, включают способ детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению и способ детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению.

[0113]

По настоящему изобретению, «экспрессия полипептида по настоящему изобретению или экспрессия полинуклеотида по настоящему изобретению ингибирована» в фразе «экспрессия и/или активность полипептида по настоящему изобретению или экспрессия полинуклеотида по настоящему изобретению ингибирована» означает, например, следующее. Клетку, экспрессирующую полипептид и/или полинуклеотид по настоящему изобретению, приводят в контакт с тестируемым соединением, и уровень экспрессии полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению в клетке оценивают с использованием способа детекции присутствия полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению. Когда для клетки, приведенной в контакт с тестируемым соединением, показан статистически значимо уменьшенный уровень экспрессии полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению, по сравнению с клеткой, не приводимой в контакт с тестируемым соединением, определяют, что экспрессия полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению ингибирована.

[0114]

Фраза «активность полипептида по настоящему изобретению ингибирована» в фразе «экспрессия и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессия полинуклеотида по настоящему изобретению ингибирована» означает, например, следующее. Когда для полипептида по настоящему изобретению или клетки, экспрессирующей полипептид по настоящему изобретению, приведенных в контакт с тестируемым соединением, получают статистически значимо меньший процент фосфорилирования тирозина, чем для полипептида или клетки, не приводимых в контакт с тестируемым соединением, определяют, что активность полипептида по настоящему изобретению ингибирована.

[0115]

Когда для клетки, экспрессирующей полипептид по настоящему изобретению, приведенной в контакт с тестируемым соединением, показан статистически значимо ингибированный рост клетки, по сравнению с клеткой, не приводимой в контакт с тестируемым соединением, определяют, что активность полипептида по настоящему изобретению ингибирована.

[0116]

По настоящему изобретению, «фосфорилирование тирозина» включает не только фосфорилирование тирозина в белке RET (включая белок RET, слитый с другим белком), но также фосфорилирование тирозина в белке передачи сигналов ниже RET. Примеры белков передачи сигналов ниже RET включают STAT, AKT и ERK. Фосфорилирование тирозина, предпочтительно, представляет собой фосфорилирование тирозина в белке RET (включая белок RET, слитый с другим белком).

[0117]

«Тирозин процент фосфорилирования» можно измерять с использованием, например, специфического для фосфорилированного RET антитела, посредством Вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, иммуногистохимии, ELISA или проточной цитометрии.

[0118]

По настоящему изобретению, «образец» включает не только биологические образцы (например, клетки, ткани, органы, жидкости организма (например, кровь и лимфу), желудочный сок и мочу), но также экстракты нуклеиновой кислоты (например, экстракты геномной ДНК, экстракты мРНК и препараты кДНК, и препараты кРНК, полученные из экстрактов мРНК) и экстракты белка, полученные из этих биологических образцов. Образцы могут представлять собой образцы, подвергнутые формалиновой фиксации, спиртовой фиксации, обработке замораживанием или погружению в парафин. Биологический образец для использования может представлять собой образец, собранный из живого организма, и, предпочтительно, представляет собой образец, полученный от пациента с злокачественной опухолью, и более предпочтительно, образец, содержащий клетки опухолей. Способ сбора биологического образца можно подходящим образом выбирать, в зависимости от типа биологического образца.

[0119]

Настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению в образце.

[0120]

По настоящему изобретению, способ детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению в образце включает способы детекции в соответствии с общепринятыми способами, такими как ELISA, Вестерн-блоттинг или иммуногистохимическое окрашивание, с использованием антитела, специфически связывающего полипептид по настоящему изобретению; и FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции) с использованием антитела, специфически связывающего белок DCTN1, и антитела, специфически связывающего белок RET. Способ детекции, предпочтительно, представляет собой ELISA, Вестерн-блоттинг или иммуногистохимическое окрашивание с использованием антитела, специфически связывающего полипептид по настоящему изобретению.

[0121]

Антитело, специфически связывающее белок DCTN1, и антитело, специфически связывающее белок RET, предпочтительно, представляет собой антитело, которое связывает N-концевую часть от точки слияния в белке DCTN1, и антитело, которое связывает C-концевую часть от точки слияния в белке RET. Эти антитела могут представлять собой коммерчески доступные продукты или могут быть получены типичным известным способом.

[0122]

По настоящему изобретению, способ детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению в образце предпочтительно включает стадию детекции полипептида по настоящему изобретению с использованием антитела, специфически связывающего полипептид по настоящему изобретению, или антитела, специфически связывающего белок DCTN1, и антитела, специфически связывающего белок RET; и более предпочтительно, включает стадию детекции полипептида по настоящему изобретению с использованием антитела, специфически связывающего полипептид по настоящему изобретению. Средства для детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению не являются конкретно ограниченными, и их примеры включают комбинацию антитела, специфически связывающего белок DCTN1, и антитела, специфически связывающего белок RET; и антитела, специфически связывающего полипептид по настоящему изобретению.

[0123]

Настоящее изобретение относится к праймеру или зонду для детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению в образце. По настоящему изобретению, средства для детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению не являются конкретно ограниченными, и их примеры включают праймер или зонд для детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению.

[0124]

Праймер или зонд включает полинуклеотиды, выбранные из следующих (j)-(l):

(j) полинуклеотид, представляющий собой по меньшей мере один зонд, выбранный из группы, состоящей из зондов, гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и зондов, гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим белок RET;

[0125]

(k) полинуклеотид, представляющий собой зонд, гибридизующийся с точкой слияния между полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и полинуклеотидом, кодирующим белок RET; и

[0126]

(l) полинуклеотид, представляющий собой набор из смыслового праймера и антисмыслового праймера, разработанных для обрамления точки слияния между полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и полинуклеотидом, кодирующим белок RET.

[0127]

По настоящему изобретению, «точка слияния» в фразе «точка слияния между полинуклеотидом, кодирующим белок DCTN1, и полинуклеотидом, кодирующим белок RET», относится к точке, в которой полинуклеотид, кодирующий белок DCTN1, слит с полинуклеотидом, кодирующим белок RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 1 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3699 из SEQ ID NO: 1, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3700-4905 из SEQ ID NO: 1, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 3 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3699 из SEQ ID NO: 3, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3700-4779 из SEQ ID NO: 3, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 5 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3297 из SEQ ID NO: 5, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3298-4503 из SEQ ID NO: 5, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 7 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3297 из SEQ ID NO: 7, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3298-4377 из SEQ ID NO: 7, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 9 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3624 из SEQ ID NO: 9, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3625-4830 из SEQ ID NO: 9, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 11 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3624 из SEQ ID NO: 11, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3625-4704 из SEQ ID NO: 11, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 13 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3282 из SEQ ID NO: 13, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3283-4488 из SEQ ID NO: 13, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 15 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3282 из SEQ ID NO: 15, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3283-4362 из SEQ ID NO: 15, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 17 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3573 из SEQ ID NO: 17, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3574-4779 из SEQ ID NO: 17, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 19 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3573 из SEQ ID NO: 19, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3574-4653 из SEQ ID NO: 19, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 21 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3678 из SEQ ID NO: 21, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3679-4884 из SEQ ID NO: 21, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET. Точка слияния в SEQ ID NO: 23 представляет собой точку, в которой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований из положений 1-3678 из SEQ ID NO: 23, происходящую из полинуклеотида, кодирующего DCTN1, слит с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований из положений 3679-4758 из SEQ ID NO: 23, происходящую из полинуклеотида, кодирующего RET.

[0128]

По настоящему изобретению, праймер или зонд получают в форме полинуклеотида, который специфически гибридизуется с полинуклеотидом по настоящему изобретению, на основании информации о последовательности полинуклеотида по настоящему изобретению, в соответствии с типичным известным способом. Количество оснований для праймера или зонда составляет 10-50, предпочтительно, 15-50, и более предпочтительно, 18-35.

[0129]

Праймер или зонд не обязательно должен являться полностью комплементарным, при условии, что праймер или зонд специфически гибридизуется с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Праймер или зонд представляет собой полинуклеотид, имеющий по меньшей мере 70% идентичность, предпочтительно, по меньшей мере 80% идентичность, более предпочтительно, по меньшей мере 90% идентичность, более предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичность, и более предпочтительно, по меньшей мере 98% идентичность с соответствующей последовательность оснований.

[0130]

Праймер или зонд по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой полинуклеотид, представленный (i) SEQ ID NO: 69, (ii) SEQ ID NO: 70 или (iii) SEQ ID NO: 71, более предпочтительно, полинуклеотид, представляющий собой набор из смыслового праймера и антисмыслового праймера, представленный (iv) SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 70, и более предпочтительно, полинуклеотид, представляющий собой набор из смыслового праймера, антисмыслового праймера и зонда, представленный (v) SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 71.

[0131]

Настоящее изобретение относится к способу детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению в образце.

[0132]

По настоящему изобретению, способ детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению в образце представляет собой способ детекции в соответствии с общепринятым способом детекции, таким как Нозерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, RT-ПЦР, ПЦР с детекцией в реальном времени, цифровая ПЦР, микромассив ДНК, гибридизация in situ и анализ последовательности.

[0133]

По настоящему изобретению, способ детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению в образце также включает способ детекции присутствия полинуклеотида слитого гена RET, включая полинуклеотид по настоящему изобретению. Способ включает способ, в котором продукт ПЦР, амплифицированный способом 5' RACE с использованием праймера, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок RET (например, праймера, который гибридизуется с последовательностью с 3'-стороны от киназного домена RET), подвергают анализу последовательности.

[0134]

По настоящему изобретению, способ детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению в образце, предпочтительно, включает стадию детекции полинуклеотида по настоящему изобретению с использованием праймера или зонда по настоящему изобретению.

[0135]

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET, где композиция содержит соединение, ингибирующее RET, в качестве активного ингредиента.

[0136]

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET, где композиция содержит соединение, ингибирующее экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента.

[0137]

По настоящему изобретению, «злокачественная опухоль, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET», в фразе «злокачественная опухоль, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET», относится к злокачественной опухоли, которая экспрессирует полинуклеотид по настоящему изобретению, и предпочтительно, к злокачественной опухоли, в которой полинуклеотид по настоящему изобретению детектирован с использованием способа детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению.

[0138]

По настоящему изобретению, «злокачественная опухоль, которая является положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET», в фразе «злокачественная опухоль, которая является положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET», относится к злокачественной опухоли, которая экспрессирует полипептид по настоящему изобретению, и предпочтительно, к злокачественной опухоли, в которой полипептид по настоящему изобретению детектирован с использованием способа детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению.

[0139]

Активный ингредиент фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли в соответствии с настоящим изобретением представляет собой соединение, ингибирующее RET, и более предпочтительно, соединение, ингибирующее экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению. Соединение, выбранное способом скрининга по настоящему изобретению, можно также использовать в качестве активного ингредиента. Например, соединение, как известно, ингибирующее RET, можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Соединение, ингибирующее RET, может представлять собой соединение, ингибирующее экспрессию и/или активность других тирозинкиназ, при условии, что соединение может ингибировать экспрессию и/или активность RET, и более предпочтительно, соединение, которое может ингибировать активность RET и экспрессию и/или активность других тирозинкиназ. Примеры таких соединений включают вандетаниб, сорафениб, сунитиниб, мотесаниб, кабозантиниб, ленватиниб и соединения, описанные в брошюре WO2016/127074, брошюре WO2017/043550, брошюре WO2017/011776 и брошюре WO2017/146116.

Активный ингредиент для фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, положительной по гену, слитому из гена DCTN1 и гена RET, и/или положительной по белку, слитому из белка DCTN1 и белка RET, представляет собой соединение, ингибирующее RET; более предпочтительно, вандетаниб, кабозантиниб, ленватиниб, конденсированное соединение пиримидина, представленное формулой (1), описанное в брошюре WO2017/043550, и конденсированное соединение пиримидина, представленное формулой (1), описанное в брошюре WO2017/146116; более предпочтительно, вандетаниб, кабозантиниб, ленватиниб, примеры соединений 1-90, описанные в брошюре WO2017/043550, и примеры соединений 1-207, описанные в брошюре WO2017/146116; еще более предпочтительно, вандетаниб, кабозантиниб, ленватиниб, 4-амино-1-(трет-бутил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-1H-пиразолo[3,4-d]пиримидин-3-карбоксамид, 4-амино-7-(трет-бутил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-7-(1-фтор-2-метилпропан-2-ил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7-(1-метилциклопропил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-7-(2-циклопропилпропан-2-ил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-(3-морфолинопро-1-пин-1-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)этинил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, (R)-4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-((тетрагидрофуран-2-ил)метокси)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид и 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-6-((1-метил-1H-пиразол-4-ил)этинил)-7-(1-метилциклопропил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид; и особенно предпочтительно, 4-амино-1-(трет-бутил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-1H-пиразолo[3,4-d]пиримидин-3-карбоксамид, 4-амино-7-(трет-бутил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-7-(1-фтор-2-метилпропан-2-ил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7-(1-метилциклопропил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-7-(2-циклопропилпропан-2-ил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-(3-морфолинопро-1-пин-1-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)этинил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, (R)-4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-((тетрагидрофуран-2-ил)метокси)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид и 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-6-((1-метил-1H-пиразол-4-ил)этинил)-7-(1-метилциклопропил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид.

[0140]

По настоящему изобретению, «может ингибировать экспрессию RET» в фразе «соединение может ингибировать экспрессию и/или активность RET» означает, например, следующее. Клетку, экспрессирующую полипептид и/или полинуклеотид RET, приводят в контакт с тестируемым соединением, и детектируют уровень экспрессии полипептида или полинуклеотида RET в клетке. Когда для клетки, приведенной в контакт с тестируемым соединением, показывают более низкий уровень экспрессии полипептида или полинуклеотида RET, чем в клетке, которую не приводили в контакт с тестируемым соединением, определяют, что экспрессия RET ингибирована. Такие соединения включают соединения, описанные выше, миРНК, мкРНК и аптамеры нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК). Примеры миРНК включают CACAUGUCAUCAAAUUGUATT (SEQ ID NO: 74), GGAUUGAAAACAAACUCUATT (SEQ ID NO: 75) и GCUUGUCCCGAGAUGUUUATT (SEQ ID NO: 76); и миРНК, предпочтительно, представляет собой CACAUGUCAUCAAAUUGUATT (SEQ ID NO: 74) или GGAUUGAAAACAAACUCUATT (SEQ ID NO: 75).

[0141]

Может ли соединение «ингибировать активность RET», в фразе «соединение может ингибировать экспрессию и/или активность RET», можно определять с использованием фосфорилирования тирозина в качестве индикатора. Примеры способа измерения фосфорилирования тирозина включают способ, описанный в тестовом примере 1 в брошюре WO2017/043550.

[0142]

Кроме того, соединение можно определять как способное ингибировать активность RET с использованием клетки, экспрессирующей полипептид и/или полинуклеотид RET, когда эффект ингибирования роста клетки является индикатором. Примеры способа измерения эффекта ингибирования роста клетки включают способ, описанный в тестовом примере 3 и тестовом примере 4 из брошюры WO2017/043550.

[0143]

Злокачественная опухоль, на которую нацелена фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, не является конкретно ограниченной, при условии, что злокачественная опухоль экспрессирует полинуклеотид и/или полипептид по настоящему изобретению, и примеры включают рак головы и шеи, рак щитовидной железы, злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта (например, рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак печени, рак желчевыводящих путей (например, рак желчного пузыря и рак желчного протока), рак поджелудочной железы, рак тонкого кишечника, рак кишечника (например, колоректальный рак, рак ободочной кишки, рак прямой кишки) и стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта), рак легкого (немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого), рак молочной железы, рак яичника, рак матки (например, рак шейки матки, рак эндометрия), рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы и рак кожи. Злокачественная опухоль, предпочтительно, представляет собой рак щитовидной железы или рак легкого (немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого). Злокачественная опухоль, в рамках изобретения, включает не только первичные опухоли, но также злокачественную опухоль, распространившуюся на другие органы (например, печень).

[0144]

Препарат, содержащий соединение, ингибирующее экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента, можно получать в форме фармацевтической композиции, содержащей фармацевтический носитель, так чтобы она подходила для множества лекарственных форм. Примеры лекарственных форм включают пероральные средства, средства для инъекций, суппозитории, мази и пластыри. Эти лекарственные формы можно получать способами получения, известными и общепринятыми для специалиста в данной области.

[0145]

Фармацевтический носитель для использования включает различные органические или неорганические вещества-носители, общепринятые в качестве материалов для получения препаратов, и их добавляют в качестве наполнителей, связующих веществ, дезинтегрирующих средств, смазывающих средств, покрывающих средств и т.п. для твердых составов; и растворителей, солюбилизирующих средств, суспендирующих средств, средств для придания тоничности, регуляторов pH и буферов, успокаивающих средств и т.п. для жидких составов. Необязательно, полезными являются такие добавки для составов, как консерванты, антиоксиданты, окрашивающие средства, ароматизаторы и стабилизаторы.

[0146]

При получении перорального твердого состава, наполнитель, необязательно, с наполнителем, связующим, дезинтегрирующим средством, смазывающим средством, окрашивающим средством, ароматизатором и т.д., добавляют к соединению по настоящему изобретению, и затем таблетки, покрытые таблетки, гранулы, порошки, капсулы и т.п. получают в соответствии с обычным способом.

[0147]

При получении перорального жидкого состава, регулятор pH и буфер, стабилизатор, ароматизатор и т.п. добавляют к соединению по настоящему изобретению, и жидкое лекарственное средство для внутреннего применения, лекарственное средство в форме сиропа, эликсир и т.п., получают в соответствии с обычным способом.

[0148]

При получении составов для инъекций, регулятор pH и буфер, стабилизатор, средство для придания тоничности, местный анестетик, и т.п. добавляют к соединению по настоящему изобретению, и затем средство для подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции получают в соответствии с обычным способом.

[0149]

Настоящее изобретение относится к способу диагностики злокачественной опухоли, когда присутствие полипептида по настоящему изобретению или полинуклеотида по настоящему изобретению детектируют в образце способом детекции присутствия полипептида по настоящему изобретению, или способом детекции присутствия полинуклеотида по настоящему изобретению. Злокачественная опухоль, диагностируемая по этому изобретению, включает злокачественные опухоли, перечисленные в качестве мишеней фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Как описано выше, использование полипептида или полинуклеотида по настоящему изобретению позволяет диагностику злокачественной опухоли. Таким образом, полипептид и полинуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в качестве биомаркера для детекции злокачественной опухоли.

[0150]

Настоящее изобретение относится к способу применения полипептида по настоящему изобретению или полинуклеотида по настоящему изобретению в качестве индикатора для определения того, эффективна ли химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего RET, где способ определяет, что химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего RET, является эффективной, когда полипептид по настоящему изобретению детектируют в образце посредством способа детекции по настоящему изобретению, и/или когда присутствие полинуклеотида по настоящему изобретению детектируют в образце посредством способа детекции по настоящему изобретению.

[0151]

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу с использованием полипептида по настоящему изобретению или полинуклеотида по настоящему изобретению в качестве индикатора для определения того, эффективна ли химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, где способ определяет, что химиотерапия с использованием соединения, ингибирующего экспрессию и/или активность полипептида по настоящему изобретению, или экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению, является эффективной, когда полипептид по настоящему изобретению детектируют в образце посредством способа детекции по настоящему изобретению, и/или когда присутствие полинуклеотида по настоящему изобретению детектируют в образце посредством способа детекции по настоящему изобретению.

[0152]

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу с использованием полипептида по настоящему изобретению или полинуклеотида по настоящему изобретению в качестве индикатора для определения того, эффективна ли химиотерапия с использованием соединения, полученного в способе скрининга по настоящему изобретению, где способ определяет, что химиотерапия с использованием соединения, полученного в способе скрининга по настоящему изобретению, является эффективной, когда полипептид по настоящему изобретению детектируют в образце посредством способа детекции по настоящему изобретению, и/или когда присутствие полинуклеотида по настоящему изобретению детектируют в образце посредством способа детекции по настоящему изобретению.

[0153]

Следующие примеры подробно описывают настоящее изобретение. Однако, настоящее изобретение не является ограниченным этими примерами.

Примеры

[0154]

Пример 1: Получение гена, слитого из гена DCTN1 и гена RET (слитого гена DCTN1-RET)

1-1: Выделение РНК, происходящей из клинического образца

РНК выделяли из ткани злокачественной опухоли щитовидной железы человека, закупленной из Asterand Bioscience, с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen) в соответствии со следующим способом. 600 мкл буфера RLT добавляли к ткани злокачественной опухоли щитовидной железы, и наносили на колонку для центрифугирования QIAshredder, с последующим центрифугированием (16000 об/мин, 2 минуты, комнатная температура), таким образом, собирая фильтрат. Эквивалентное количество 70% водного раствора этанола добавляли к собранному фильтрату. После того, как их смешивали, смесь наносили на колонку RNeasy Mini и затем центрифугировали (10000 об/мин, 15 секунд, комнатная температура). 700 мкл буфера RW1 добавляли в колонку RNeasy Mini и центрифугировали (10000 об/мин, 15 секунд, комнатная температура). 500 мкл буфера RPE дополнительно добавляли к этому и центрифугировали (10000 об/мин, 15 секунд, комнатная температура). Таким же способом, 500 мкл буфера RPE добавляли снова, и центрифугировали (10000 об/мин, 2 минуты, комнатная температура). Колонку RNeasy Mini центрифугировали снова (16000 об/мин, 1 минута, комнатная температура), и оставшийся буфер удаляли. 40 мкл свободной от РНКазы воды наносили на колонку RNeasy Mini и центрифугировали (10000 об/мин, 1 минута, комнатная температура), таким образом, собирая фильтрат как тотальную РНК.

[0155]

1-2: Получение кДНК, происходящей из клинического образца

кДНК синтезировали из тотальной РНК, полученной в разделе 1-1 выше, с использованием набора для синтеза кДНК SuperScript VILO (Invitrogen) в соответствии со следующим способом. 500 нг тотальной РНК доводили свободной от РНКазы водой для получения количества 14 мкл, и к этому добавляли 4 мкл реакционной смеси 5×VILO и 2 мкл смеси ферментов 10×SuperScript Mix, и перемешивали. Смесь поддерживали теплой при 25°C в течение 10 минут, и затем поддерживали теплой при 42°C в течение 60 минут. Для остановки реакции, смесь, наконец, инкубировали при 85°C в течение 5 минут, таким образом, получая кДНК.

[0156]

1-3: Получение и очистка клонирующего вектора

Для амплификации слитого гена DCTN1-RET, разработаны праймеры, показанные в таблице 1: праймер 1 (SEQ ID NO: 33) в качестве смыслового праймера и праймер 2 (SEQ ID NO: 34) в качестве антисмыслового праймера, так же, как праймер 3 (SEQ ID NO: 35) в качестве смыслового праймера и праймер 4 (SEQ ID NO: 36) в качестве антисмыслового праймера для использования в гнездовой ПЦР.

[0157]

Таблица 1

Праймер 1 5'-TGTCCAGCTTTGTGCCTGATTGATGT-3' SEQ ID NO: 33 Праймер 2 5'-GCTGGGCACTGAAGAGAAAGGAATGC-3' SEQ ID NO: 34 Праймер 3 5'-AGCAGGATGAGTGCGGAGGCAAGC-3' SEQ ID NO: 35 Праймер 4 5'-TTAACTATCAAACGTGTCCATTAATTTTGCCGC-3' SEQ ID NO: 36

[0158]

Слитый ген DCTN1-RET амплифицировали с использованием кДНК, синтезированной в разделе 1-2 выше, в качестве матрицы, с использованием этих праймеров и с использованием KOD-Plus-Neo (Toyobo), в соответствии со следующим способом. 2 мкл кДНК, 5 мкл 10×буфера для ПЦР для KOD-Plus-Neo, 5 мкл 2 мМ dNTP, 3 мкл 25 мМ MgSO₄, 1 мкл KOD-Plus-Neo, 1,5 мкл праймера 1 (10 мкМ), 1,5 мкл праймера 2 (10 мкМ) и 31 мкл дважды дистиллированной воды (DDW) смешивали; и проводили ПЦР. Затем полученный продукт ПЦР разводили в 100 раз, и 2 мкл разведенного продукта ПЦР, 5 мкл 10×буфера для ПЦР для KOD-Plus-Neo, 5 мкл 2 мМ dNTP, 3 мкл 25 мМ MgSO₄, 1 мкл KOD-Plus-Neo, 1,5 мкл праймера 3 (10 мкМ), 1,5 мкл праймера 4 (10 мкМ) и 31 мкл DDW смешивали; и проводили гнездовую ПЦР.

[0159]

Продукт гнездовой ПЦР разделяли посредством электрофореза с использованием 1% агарозного геля (Nacalai Tesque), и продукт ПЦР очищали из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction (Qiagen).

[0160]

ДНК pUC18 (Takara Bio Inc.), расщепленную рестрикционным ферментом SmaI (NEB), очищенный продукт ПЦР, T4 ДНК-лигазу (NEB) и реакционный буфер для T4 ДНК-лигазы (NEB) смешивали, и смесь инкубировали при 16°C в течение ночи. Продукт лигирования обрабатывали SmaI (NEB), и трансформацию компетентных клеток проводили следующим способом. Продукт лигирования, обработанный SmaI, добавляли к 50 мкл компетентных клеток E. coli DH5α (Takara Bio Inc.), и позволяли стоять на льду в течение 30 минут. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 30 секунд, и позволяли стоять на льду в течение 2 минут. К этому добавляли среду SOC (Takara Bio Inc.), и клетки культивировали с качанием при 37°C в течение 1 час. Затем культуральный раствор наносили на содержащую ампициллин чашку с агаризованной средой LB (Unitech), и позволяли стоять при 37°C в течение ночи. Колонии E. coli суспендировали в содержащей ампициллин среде LB (InvivoGen), и культивировали с качанием при 37°C в течение ночи. Плазмидную ДНК со вставкой слитого гена DCTN1-RET очищали из пролиферирующих E. coli с использованием набора QIAquick Spin Miniprep (Qiagen), в соответствии с протоколом, предоставленным с набором.

[0161]

1-4: Определение последовательности

Реакцию секвенирования проводили с использованием плазмидной ДНК, полученной в разделе 1-3 выше, в качестве матрицы, с использованием праймеров 5-36 для секвенирования, показанных в таблице 2, и с использованием набора для секвенирования BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing; и анализ последовательности проводили с использованием анализатора ДНК Applied Biosystems 3730xl. Результаты анализа последовательности выявили, что слитый ген DCTN1-RET представлял собой ген (SEQ ID NO: 17), в котором экзоны 12-20 из варианта 2 RET (номер доступа в GenBank: NM_020975) были слиты ниже 3'-конца с экзонами 1-27 из варианта 5 DCTN1 (номер доступа в GenBank: NM_001190836).

[0162]

Таблица 2

Праймер 5 5'-AGTACTGGGGTGGCTGGG-3' SEQ ID NO: 37 Праймер 6 5'-CACTTTGGACAAGGAGATG-3' SEQ ID NO: 38 Праймер 7 5'-ACAGAACTGGAGCTGCGG-3' SEQ ID NO: 39 Праймер 8 5'-GGACTGGTGTACTCGCTG-3' SEQ ID NO: 40 Праймер 9 5'-TCCTAGACTGCAGGAAACAC-3' SEQ ID NO: 41 Праймер 10 5'-CATCGAGAAAGTCCAGAC-3' SEQ ID NO: 42 Праймер 11 5'-GCTGCTGGAGACATTGAA-3' SEQ ID NO: 43 Праймер 12 5'-TCACTGCTGCTCAGCTCA-3' SEQ ID NO: 44 Праймер 13 5'-GAGGATCCAAAGTGGGAATT-3' SEQ ID NO: 45 Праймер 14 5'-AGTATCTGGCCGAGATGAAG-3' SEQ ID NO: 46 Праймер 15 5'-GCAAAGACCTGGAGAAGATG-3' SEQ ID NO: 47 Праймер 16 5'-AGGACGTTGAACTCTGACAG-3' SEQ ID NO: 48 Праймер 17 5'-CCTTTGCTTCATCCAGAATC-3' SEQ ID NO: 49 Праймер 18 5'-GATTTTGTGTTTCTCCAGCTCT-3' SEQ ID NO: 50 Праймер 19 5'-CCTGCTTCTCTGAGGAAGAA-3' SEQ ID NO: 51 Праймер 20 5'-GGGCCTTAGTCTCAGCAAAC-3' SEQ ID NO: 52 Праймер 21 5'-GAGCACTCTGCGTGAACTTA-3' SEQ ID NO: 53 Праймер 22 5'-CAGCTTGTTCATGGTACTGAT-3' SEQ ID NO: 54 Праймер 23 5'-TGGTGAGTCCTTCACCAG-3' SEQ ID NO: 55 Праймер 24 5'-CCTAGAGTTTTTCCAAGAACCA-3' SEQ ID NO: 56 Праймер 25 5'-CATTTAACTGGAATCCGACC-3' SEQ ID NO: 57 Праймер 26 5'-GACTCTCTCCAGGCCAGTTC-3' SEQ ID NO: 58 Праймер 27 5'-GGCTATCAGAAGTAAAACCACC-3' SEQ ID NO: 59 Праймер 28 5'-CGAGAGCTGATGGCACTA-3' SEQ ID NO: 60 Праймер 29 5'-CTTCATCACAAGTGAAGTACTTCC-3' SEQ ID NO: 61 Праймер 30 5'-CGTACTCCACGATGAGGAG-3' SEQ ID NO: 62 Праймер 31 5'-GATTCTGGATGAAGCAAAGG-3' SEQ ID NO: 63 Праймер 32 5'-GGAAGTACTTCACTTGTGATGAAG-3' SEQ ID NO: 64 Праймер 33 5'-CCCAGCCACCCCAGTACT-3' SEQ ID NO: 65 Праймер 34 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' SEQ ID NO: 66 Праймер 35 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' SEQ ID NO: 67 Праймер 36 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' SEQ ID NO: 68

[0163]

Пример 2: Детекция слитого гена DCTN1-RET

кДНК синтезировали из РНК, происходящей из нормальной ткани щитовидной железы человека, закупленной из Asterand Bioscience, и из РНК, происходящей из ткани злокачественной опухоли щитовидной железы человека, полученной в разделе 1-1, с использованием набора для синтеза кДНК SuperScript VILO (Invitrogen), в соответствии со следующим способом. 280 нг тотальной РНК доводили свободной от РНКазы водой для получения количества 14 мкл, и к этому добавляли, соответственно, 4 мкл реакционной смеси 5×VILO и 2 мкл смеси ферментов 10×SuperScript, и перемешивали. Смесь поддерживали теплой при 25°C в течение 10 минут, и затем поддерживали теплой при 42°C в течение 60 минут. Для окончания реакции, смесь, наконец, инкубировали при 85°C в течение 5 минут.

[0164]

Для детекции слитого гена DCTN1-RET, разработаны праймеры и зонд, показанные в таблице 3: праймер 37 (SEQ ID NO: 69) в качестве смыслового праймера для детекции слитого гена DCTN1-RET, праймер 38 (SEQ ID NO: 70) в качестве антисмыслового праймера для детекции слитого гена DCTN1-RET, и праймер 39 (SEQ ID NO: 71) в качестве зонда для детекции слитого гена DCTN1-RET (зонд: TaqMan MGB; флуоресцентный краситель: FAM (Thermo Fisher Scientific)).

[0165]

Таблица 3

Праймер 37 5'-CTGGAGCCACAGTACCCACT-3' SEQ ID NO: 69 Праймер 38 5'-TCCAAATTCGCCTTCTCCTA-3' SEQ ID NO: 70 Праймер 39 5'-TTCATCAGCCTTCCTCAGGGAGGAT-3' SEQ ID NO: 71

[0166]

Полученную кДНК разводили в 10 раз, и 1,1 мкл этого использовали в качестве матрицы. 11 мкл смеси для цкПЦР для зонда ddPCR Supermix (Bio-Rad), 2 мкл праймера 37 (10 мкМ), 2 мкл праймера 38 (10 мкМ), 0,6 мкл праймера 39 (10 мкМ) и 1,1 мкл смеси для анализа 20×HEX для детекции GAPDH (Prime PCR ddPCR Expression Probe Assay: GAPDH, Human, Bio-Rad) смешивали; и капли получали с использованием автоматизированного генератора капель (Bio-Rad). ПЦР проводили в полученных каплях, и капли, положительные по DCTN1-RET и GAPDH, подсчитывали с использованием считывателя капель (Bio-Rad). На фиг. 1 и 2 показаны результаты.

[0167]

Слитый ген DCTN1-RET амплифицировали с использованием кДНК, синтезированной выше, в качестве матрицы, с использованием KOD-Plus-Neo (Toyobo) в соответствии со следующим способом. 2 мкл кДНК, 5 мкл 10×буфера для ПЦР для KOD-Plus-Neo, 5 мкл 2 мМ dNTP, 3 мкл 25 мМ MgSO₄, 1 мкл KOD-Plus-Neo, 1,5 мкл праймера 1 (10 мкМ), 1,5 мкл праймера 2 (10 мкМ) и 31 мкл DDW смешивали, и проводили ПЦР. Затем, полученный продукт ПЦР разводили в 100 раз, и 2 мкл разведенного продукта ПЦР, 5 мкл 10×буфера для ПЦР для KOD-Plus-Neo, 5 мкл 2 мМ dNTP, 3 мкл 25 мМ MgSO₄, 1 мкл KOD-Plus-Neo, 1,5 мкл праймера 3 (10 мкМ), 1,5 мкл праймера 4 (10 мкМ) и 31 мкл of DDW смешивали; и проводили гнездовую ПЦР. Продукт гнездовой ПЦР разделяли посредством электрофореза с использованием 1% агарозного геля (Nacalai Tesque) и фотографировали. На фиг. 3 показаны результаты.

[0168]

Как показано на фиг. 1, фиг. 2 и фиг. 3, в то время как слитый ген DCTN1-RET детектирован в кДНК, синтезированной из РНК, происходящей из ткани злокачественной опухоли щитовидной железы человека, слитый ген DCTN1-RET не детектирован в кДНК, синтезированной из РНК, происходящей из нормальной ткани щитовидной железы человека. Эти результаты показывают, что слитый ген DCTN1-RET можно использовать в качестве биомаркера для злокачественной опухоли.

[0169]

Пример 3: Конструирование экспрессирующего вектора для слитого гена DCTN1-RET

Для конструирования экспрессирующего вектора, праймер 40 (SEQ ID NO: 72) в качестве смыслового праймера и праймер 41 (SEQ ID NO: 73) в качестве антисмыслового праймера, сконструированы, как показано в таблице 4.

[0170]

Таблица 4

Праймер 40 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCAGCAGGATGAGTGCGGAGGCAAGCGCCCGG-3' SEQ ID NO: 72 Праймер 41 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTAACTATCAAACGTGTCCATTAATTTTGC-3' SEQ ID NO: 73

[0171]

Слитый ген DCTN1-RET амплифицировали с использованием этих праймеров, кДНК, синтезированной в разделе 1-2 выше, в качестве матрицы, и ДНК-полимеразы Prime STAR Max (TaKaRa), в соответствии со способом, описанным ниже. 1 мкл кДНК, 25 мкл 2× ДНК-полимеразы Prime STAR Max, 1 мкл праймера 40 (10 мкМ), 1 мкл праймера 41 (10 мкМ) и 22 мкл дважды дистиллированной воды (DDW) смешивали для проведения ПЦР. Полученный продукт ПЦР разделяли посредством электрофореза с использованием 1% агарозного геля (Nacalai Tesque), и продукт ПЦР очищали из геля с использованием набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Затем очищенный продукт ПЦР вставляли в вектор Gateway pDONR221 с использованием смеси ферментов Gateway BP Clonase II (Thermo Fisher) в соответствии со способом, описанным ниже, таким образом, получая входной вектор. Конкретно, 5,0 мкл очищенного продукта ПЦР, 3,5 мкл pDONR221 (85 нг/мкл), 4,0 мкл смеси ферментов BP Clonase II и 7,5 мкл TE смешивали, и инкубировали при 25°C в течение 90 минут. После инкубации, к этому добавляли 1 мкл протеиназы K (2 мг/мл), с последующей инкубацией при 37°C в течение 10 минут, таким образом, получая входной вектор.

[0172]

Полученный входной вектор добавляли к 50 мкл компетентных клеток E. coli DH5α (Takara Bio Inc.), и позволяли стоять на льду в течение 30 минут. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 37°C в течение 20 секунд и позволяли стоять в течение 2 минут на льду. Затем к этому добавляли среду SOC (Takara Bio Inc.), и клетки подвергали культивированию с качанием при 37°C в течение 1 часа. Затем культуральный раствор наносили на содержащую канамицин чашку с агаризованной средой LB и позволяли стоять при 37°C в течение ночи. Колонии Escherichia coli суспендировали в содержащей канамицин среде LB, и подвергали культивированию с качанием при 37°C в течение ночи. Из выращенной Escherichia coli, плазмидную ДНК с вставкой слитого гена DCTN1-RET (клон входного вектора) очищали с использованием автоматизированной системы для выделения ДНК GENE PREP STAR PI-480 (Kurabo Industries Ltd.).

[0173]

Слитый ген DCTN1-RET вставляли в вектор pJTI Fast DEST с использованием полученной плазмиды и смеси ферментов Gateway LR Clonase II (Thermo Fisher) в соответствии со способом, описанным ниже, таким образом, получая экспрессирующий вектор.

150 нг клона входного вектора, 1 мкл вектора pJTI Fast DEST (150 нг/мкл), 2 мкл смеси ферментов LR Clonase II и буфер TE смешивали для получения всего 10 мкл, и смесь инкубировали при 25°C в течение 90 минут. После инкубации, к этому добавляли 1 мкл протеиназы K (2 мг/мл), с последующей инкубацией при 37°C в течение 10 минут, таким образом, получая вектор pJTI Fast DEST со вставленным слитым геном DCTN1-RET (вектор, экспрессирующий слитый ген DCTN1-RET). Полученный вектор, экспрессирующий слитый ген DCTN1-RET, добавляли к 50 мкл компетентных клеток E. coli DH5α (Takara Bio Inc.) и позволяли стоять в течение 30 минут на льду. Затем, клетки подвергали тепловому шоку при 37°C в течение 20 секунд, и позволяли стоять в течение 2 минут на льду. Затем к этому добавляли среду SOC (Takara Bio Inc.), и клетки подвергали культивированию с качанием при 37°C в течение 1 часа. Культуральный раствор наносили на содержащую ампициллин чашку с агаризованной средой LB и позволяли стоять при 37°C в течение ночи. Колонии Escherichia coli суспендировали в содержащей ампициллин среде LB, и подвергали культивированию с качанием при 37°C в течение ночи. Из выращенной Escherichia coli, плазмидную ДНК с вставкой слитого гена DCTN1-RET (вектор, экспрессирующий слитый ген DCTN1-RET) очищали с использованием набора Plasmid Plus Maxi (QIAGEN).

[0174]

Пример 4: Получение клетки, экспрессирующей слитый ген DCTN1-RET

4-1: Получение клетки

Для клетки-хозяина для получения клетки, экспрессирующей слитый ген DCTN1-RET, выбраны клетки эмбриональные фибробласты мыши NIH/3T3 (Американская коллекция типовых культур), и клетки трансфицировали экспрессирующим вектором с вставленным слитым геном DCTN1-RET, полученным выше, таким образом, получая клетку, экспрессирующую слитый ген DCTN1-RET. Детали способа являются следующими. Клетки NIH/3T3 получали посредством культивирования в среде для типичной культуры (2-мерной культуры клеток) при 37°C в 5% CO₂; и среду для использования в 2-мерной культуре клеток получали посредством добавления сыворотки новорожденного теленка (NBCS) (Gibco) в D-MEM (с высоким содержанием глюкозы) (содержащую L-глутамин, фенол красный, пируват натрия, 1500 мг/л гидрокарбоната натрия) (Wako) для получения 10%. За сутки до проведения трансфекции, клетки NIH/3T3 рассевали в 6-луночный планшет (Iwaki) при 1,5×10⁵ клеток/2 мл и инкубировали при 37°C в 5% CO₂ в течение ночи. Реагент для трансфекции ViaFect добавляли в смешанный раствор, полученный посредством смешивания 1,5 мкг вектора, экспрессирующего слитый ген DCTN1-RET, и 1,5 мкг вектора pJTI с интегразой phiC31, таким образом, чтобы количество реагента для трансфекции ViaFect в шесть раз превышало количество смешанного раствора; и затем к этому добавляли Opti-MEM для получения общего количества 300 мкл, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 5 минут, таким образом, получая раствор для трансфекции. Из лунок, в которые рассевали клетки NIH/3T3, отбирали по 300 мкл среды, и 300 мкл полученного раствора для трансфекции добавляли в лунки, с последующей инкубацией при 37°C в 5% CO₂ в течение ночи. На следующие сутки, среду заменяли для удаления раствора для трансфекции. При замене среды, гигромицин B (Nacalai Tesque) добавляли в новую среду для получения 500 мкг/мл. Гигромицин B удаляет клетки, не трансфицированные вектором, экспрессирующим вставленный слитый ген DCTN1-RET. После трансфекции, при замене среды приблизительно дважды в неделю, клетки культивировали, пока они не пролиферируют. Через 22 суток после трансфекции, клетки собирали с использованием трипсина, и проводили клонирование отдельных клеток, в соответствии со следующим способом. Измеряли количество собранных клеток, и к ним добавляли среду для получения 1 клетки/200 мкл. Клетки рассевали в 96-луночный планшет (Thermo Fisher) для получения 200 мкл на лунку. После рассева, клетки наблюдали ежесуточно, и отбирали клетки, выращенные из отдельных клеток; эти клетки представляли собой клетки, экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET- (экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3).

[0175]

4-2: Подтверждение экспрессии белка-мишени

Экспрессию слитого белка DCTN1-RET в полученных экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3 подтверждали посредством Вестерн-блоттинга. Конкретно, среду отбирали из культурального флакона, с последующей однократной промывкой PBS. Концентрат разбавителя 2 для образцов (R&D Systems), содержащий ингибитор фосфатаз (Roche) и ингибитор протеаз (Roche), добавляли в культуральный флакон, и лизат клеток собирали с использованием скребка. Из собранного лизата клеток, образец белка получали посредством центрифугирования. Образец белка подвергали определению белка, и концентрацию белка доводили до предписанной концентрации. Раствор буфера для образцов с восстанавливающим реагентом (6x) для SDS-PAGE (Nacalai Tesque) добавляли к образцу белка предписанной концентрации; и смесь инкубировали при 95°C в течение 5 минут для денатурации белка, таким образом, получая образец для использования в Вестерн-блоттинге. Для отрицательного контроля, образец для Вестерн-блоттинга получали с использованием клеток NIH/3T3 (исходной линии клеток), в соответствии с таким же способом. Экспрессию белка подтверждали с использованием образцов, в соответствии со способом, описанным ниже. Белок разделяли с использованием 4-15% акриламидного геля (Bio-Rad) и 1×буфера Трис/глицин/SDS посредством SDS-PAGE (в течение 30 минут при 200 В). Белок переносили на мембрану PVDF с использованием набора для переноса Trans-Blot Turbo RTA Midi PVDF Transfer Kit (Bio-Rad) и системы для переноса Trans-Blot Turbo (Bio-Rad), и мембрану PVDF погружали в блокирующий раствор Blocking One-P на 1 час. Раствор получали посредством разведения Blocking One-P с TBS-T для получения 10%, и первичное антитело (антитело против фосфо-RET (Tyr905) (CST), mAb кролика против Ret (C31B4) (CST) и антитело против Dctn1 (Atlas Antibodies)) разводили полученным раствором для получения концентрации 1/1000. Мембрану PVDF погружали в полученный раствор и инкубировали при 4°C в течение ночи. После промывки с использованием TBS-T, мембрану PVDF погружали в раствор разведенного вторичного антитела, который получали посредством разведения антитела к IgG кролика, связанного с HRP (CST), с использованием TBS-T для получения концентрации 1/2000; и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 час. После промывки мембраны с использованием TBS-T, белок детектировали с использованием субстрата SuperSignal West Dura Extended Duration (Thermo Fisher) с использованием анализатора изображений Amersham Imager 600 lumino (GE Healthcare). Молекулярную массу детектированного белка подтверждали с использованием предварительно окрашенных белковых стандартов Precision Plus Protein Kaleidoscope (Bio-Rad). Как показано на фиг. 4a) и 4b), эндогенный RET (150 и 175 кДа) не детектировали, когда использовали антитело против pRET или антитело против RET. Однако, полосу, по-видимому, являющуюся слитым белком DCTN1-RET, подтверждали при приблизительно 175 кДа только в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3. Кроме того, как показано на фиг. 4c), эндогенный DCTN1 детектировали при приблизительно 150 кДа при использовании антитела к DCTN1. Детектировали также полосу при приблизительно 175 кДа, выше полосы эндогенного DCTN1 при приблизительно 150 кДа, только в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3. Конкретно, полосу при приблизительно 175 кДа детектировали при использовании как антитела к RET, так и антитела к DCTN1, только в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3; это явно показывает, что слитый белок из DCTN1 и RET экспрессировался в полученных экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3.

[0176]

Пример 5: Подтверждение роста экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клеток NIH/3T3 посредством 3-мерной культуры клеток

Клетки NIH/3T3 хорошо росли в условиях 2-мерной культуры клеток, но с трудом росли в условиях 3-мерной культуры клеток. Однако, известно также, что клетки NIH/3T3 растут в условиях 3-мерной культуры клеток, когда онкоген экспрессируется в клетках. Таким образом, является ли слитый ген DCTN1-RET онкогеном, подтверждали с использованием этой характеристики. Экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3 и клетки NIH/3T3 культивировали при 37°C в 5% CO₂ в 2-мерной культуре клеток; и собирали с использованием трипсина, с последующим определением количества клеток. Для осуществления 3-мерного культивирования клеток, среду для 3-мерной культуры клеток получали с использованием набора для получения, серий FCeM (Nissan Chemical Industries, Ltd.), D-MEM (с высоким содержанием глюкозы) (содержащей L-глутамин, фенол красный, пируват натрия, и 1500 мг/л гидрокарбоната натрия) (Wako) и сыворотки новорожденного теленка (NBCS) (Gibco). Клетки суспендировали в полученной среде для 3-мерной культуры клеток для получения 1000 клеток/90 мкл и рассевали в 96-луночный прозрачный-черный микропланшет с круглодонными, сферическими лунками (Corning), 90 мкл на лунку, с последующей инкубацией при 37°C в 5% CO₂. На сутки после рассева (сутки 1) и через 8 суток после рассева (сутки 8), уровень люминесценции (импульсов в секунду: cps) измеряли с использованием детектирующего реагента для люминесценции внутриклеточного АТФ (реагента CellTiter-Glo 2.0, Promega) с использованием люминометра (EnSpire, PerkinElmer), и определили, что результат является индикатором количества жизнеспособных клеток. Затем скорость роста клеток рассчитывали по результату измерений на сутки 1 и результату измерений на сутки 8 (N=3). В результате, как показано на фиг. 5, в то время как количество клеток для клеток NIH/3T3 на сутки 8 в 2,4 раза превышало количество клеток на сутки 1, количество клеток для экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клеток NIH/3T3 на сутки 8 в 20,9 превышало количество клеток на сутки 1. Кроме того, в то время как не обнаружено агрегатов клеток, сформированных в клетках NIH/3T3 при 3-мерном культивировании клеток, подтвердили, что агрегаты клеток сформированы в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3 при 3-мерном культивировании клеток. Это явно показывает, что трансфекция слитым геном DCTN1-RET усиливала рост клеток, позволяя предполагать, что слитый ген DCTN1-RET является онкогеном.

[0177]

Пример 6: Подтверждение онкогенности в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3 in vivo

Для подтверждения онкогенности в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3 in vivo, проводили эксперимент трансплантации с использованием мышей. Общеизвестно, что клетки NIH/3T3, представляющие собой исходную линию клеток, не растут подкожно у мышей nude; и можно подтвердить, вносит ли слитый ген DCTN1-RET вклад в онкогенность, или является ли слитый ген DCTN1-RET онкогеном, посредством подкожной трансплантации мышей nude с использованием экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET- клеток NIH/3T3. Мышей nude, BALB/cAJcl-nu/nu (CLEA Japan, Inc.) использовали для трансплантации. Экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3 собирали с использованием трипсина, и суспендировали в PBS, чтобы, наконец, получить 1×10⁸ клеток/мл. К этому добавляли эквивалентное количество матрикса базальной мембраны матригеля (Corning) и доводили для получения 5×10⁷ клеток/мл для получения суспензии клеток для трансплантации. 0,1 мл суспензии клеток для трансплантации подкожно трансплантировали в правую сторону грудной клетки каждой мыши nude (N=10) с использованием иглы для инъекций 25G и 1-мл шприца. На сутки 10, 13 и 17 после трансплантации, длинную ось и короткую ось опухоли каждой мыши измеряли с использованием цифрового штангенциркуля (Mitutoyo Corporation), и объем опухоли рассчитывали на основании следующего уравнения.

Объем опухоли (мм³)=(длинная ось: мм)×(короткая ось: мм)×(короткая ось: мм)/2

На фиг. 6 показаны результаты измерения объема опухоли. Подтвердили, что экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3, подкожно трансплантированные мышам nude, вызывали онкогенез и хорошо росли; таким образом, этот эксперимент in vivo позволяет также предполагать, что слитый ген DCTN1-RET является онкогеном.

[0178]

Пример 7: Подтверждение ингибирования слитого белка DCTN1-RET и эффекта ингибирования роста клеток посредством миРНК в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3

Проверяли эффект обработки миРНК на экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3. миРНК для использования являлась следующей: три типа миРНК RET, показанные в таблице 5 ниже, и Silencer Select Negative Control #1 siRNA (Ambion) в качестве отрицательного контроля. Мишенью для трех типов миРНК RET является RET человека; и миРНК RET1 и миРНК RET2 содержат последовательность, которая связывается с частью RET слитого гена DCTN1-RET, в то время как миРНК RET3 не содержит последовательности, которая связывается со слитым геном DCTN1-RET. Иными словами, заключили, что миРНК RET1 и миРНК RET2 ингибируют экспрессию слитого гена DCTN1-RET, и миРНК RET3 не ингибирует. Далее описан способ из эксперимента с использованием миРНК.

[0179]

Таблица 5

миРНК RET1 CACAUGUCAUCAAAUUGUATT SEQ ID NO: 74 миРНК RET2 GGAUUGAAAACAAACUCUATT SEQ ID NO: 75 миРНК RET3 CCACUGCUACCACAAGUUUTT SEQ ID NO: 77

[0180]

Экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3 ДЛЯ использования получали посредством культивирования в среде для 2-мерной культуры клеток при 37°C в 5% CO₂. За сутки до обработки миРНК, клетки рассевали в 6-луночный планшет (Iwaki), 3×10⁵ клеток/2 мл, и инкубировали при 37°C в 5% CO₂в течение ночи. 12 мкл миРНК каждого типа, заблаговременно доведенной до 20 мкМ с использованием воды, 4 мкл реагента для трансфекции липофектамина RNAiMAX (Thermo Fisher) и 384 мкл Opti-MEM смешивали; и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, таким образом, получая растворы миРНК. 400 мкл каждого раствора миРНК добавляли в лунки, в которые рассевали клетки, и инкубацию проводили при 37°C в 5% CO₂ в течение ночи. На следующие сутки, часть инкубированных клеток отбирали в качестве образца для использования в анализе экспрессии белка; и другую часть также отбирали и повторно рассевали для использования для подтверждения роста клеток. Отбор образцов для анализа экспрессии белка и анализ экспрессии белка проводили таким же образом, как в 4-2: Подтверждение экспрессии белка-мишени, описанном выше, за исключением использования антитела к фосфо-RET (Tyr905) (CST), mAb кролика против Ret (C31B4) (CST), и mAb кролика против GAPDH (D16H11) XP (CST) в качестве первичных антител. Результаты показали, как показано на фиг. 7, что экспрессия слитого белка DCTN1-RET не была ингибирована в клетках, обработанных отрицательной контрольной миРНК (NC), сравнимо с клетками без обработки миРНК (без обработки). Когда клетки обрабатывали миРНК RET1 или миРНК RET2, подтвердили, что экспрессия слитого белка DCTN1-RET была ингибирована в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3, и не была ингибирована, когда использовали миРНК RET3.

Затем, для подтверждения эффекта ингибирования роста клеток, клетки собирали с использованием трипсина из лунок без обработки и из лунок, обработанных миРНК, и подсчитывали количество клеток. Затем проводили 3-мерное культивирование клеток таким же способом, как в примере 5, и на сутки проведения рассева (сутки 0) и через 4 суток после рассева (сутки 4), количество жизнеспособных клеток подсчитывали таким же способом, как в примере 5. Скорость роста клеток рассчитывали по результату измерения на сутки 0 и результату измерения на сутки 4. Результаты показывают, как показано на фиг. 8, что для клеток без обработки миРНК (без обработки) и для клеток, обработанных отрицательной контрольной миРНК (NC), соответственно, показано количество клеток на сутки 4 в 4,9 раз и в 3,6 раз больше, чем на сутки 0; однако, для клеток, обработанных миРНК RET1 и для клеток, обработанных миРНК RET2, показан рост только приблизительно в 2,0 раза и в 2,4 раза, соответственно, в обоих случаях заметно ниже. Для клеток, обработанных миРНК RET3, показан рост в 3,7 раза, который является по существу равным росту клеток, обработанных отрицательной контрольной миРНК, редко показывая уменьшение роста. Эти результаты выявили, что рост экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клеток NIH/3T3 также ингибирован, когда экспрессия RET ингибирована посредством миРНК.

[0181]

Пример 8: Эффект ингибирования роста клеток в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3

Анализ роста клеток in vitro проводили на экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3. 3-мерное культивирование клеток и рассев осуществляли таким же способом, как в примере 5. После рассева, проводили инкубацию при 37°C в 5% CO₂ в течение ночи (сутки 0). Кабозантиниб, вандетаниб, алектиниб, ленватиниб и конденсированные соединения пиримидина (соединения 1-9, показанные в таблице 6), которые, как опубликовано, являются способными ингибировать RET, растворяли в диметилсульфоксиде для получения концентрации 10 ммоль/л; и далее разводили с использованием среды для 3-мерной культуры клеток, таким образом, чтобы эти соединения имели конечную концентрацию 1000, 333, 111, 37,0, 12,3, 4,12, 1,37 и 0,457 нмоль/л. Затем эти разведенные соединения индивидуально добавляли в каждую лунку (0,01 мл на лунку) планшета, в который рассевали клетки (сутки 1); и клетки инкубировали при 37°C в 5% CO₂ в течение 7 суток. После культивирования (сутки 8), детектирующий реагент для люминесценции внутриклеточного АТФ (реагент CellTiter-Glo 2.0, Promega) добавляли в каждую лунку, и уровень люминесценции (импульсов в секунду: cps) измеряли с использованием люминометра (EnSpire, PerkinElmer). Скорость роста от суток 1 клеток, обработанных соединениями в различных концентрациях, рассчитывали на основании следующего уравнения, в соответствии с значением T_сутки8 и C_сутки1, и определяли концентрацию каждого тестируемого соединения, при которой рост клетки был ингибирован на 50% (GI₅₀(нМ)).

1) Когда T_сутки8 ≥ C_сутки1

Скорость роста (%)=(T_сутки8 - C_сутки1)/(C_сутки8 - C_сутки1)×100

T: cps для лунки, в которую добавляли тестируемое соединение

C: cps для лунки, в которую не добавляли тестируемое соединение

Сутки 1: сутки, на которые добавляли тестируемое соединение

Сутки 8: сутки, на которые проводили оценку

2) Когда T_{сутки 8} < C_сутки1

Скорость роста (%)=(T_сутки8 - C_сутки1)/(C_сутки1)×100

T: cps для лунки, в которую добавляли тестируемое соединение

C: cps для лунки, в которую не добавляли тестируемое соединение

Сутки 1: сутки, на которые добавляли тестируемое соединение

Сутки 8: сутки, на которые проводили оценку[0182]

Таблица 6

No. соединения Структурная формула Химическое наименование No. Международной публикации и No. примера Соединение 1 4-амино-1-(трет-бутил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-1H-пиразолo[3,4-d]пиримидин-3-карбоксамид WO2017/043550, пример соединения 34 Соединение 2 4-амино-7-(трет-бутил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/043550, пример соединения 48 Соединение 3 4-амино-7-(1-фтор-2-метилпропан-2-ил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/043550, пример соединения 50 Соединение 4 4-амино-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7-(1-метилциклопропил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/043550, пример соединения 51 (Продолжение таблицы 6) No. соединения Структурная формула Химическое наименование No. Международной публикации и No. примера Соединение 5 4-амино-7-(2-циклопропилпропан-2-ил)-N-(5-метил-1H-пиразол-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/043550, пример соединения 52 Соединение 6 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-(3-морфолинопро-1-пин-1-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/146116, пример соединения 85 Соединение 7 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)этинил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/146116, пример соединения 87 (Продолжение таблицы 6) No. соединения Структурная формула Химическое наименование No. Международной публикации и No. примера Соединение 8 (R)-4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-7-(1-метилциклопропил)-6-((тетрагидрофуран-2-ил)метокси)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/146116, пример соединения 89 Соединение 9 4-амино-N-[4-(метоксиметил)фенил]-6-((1-метил-1H-пиразол-4-ил)этинил)-7-(1-метилциклопропил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид WO2017/146116, пример соединения 90

[0183]

Результаты показывают, как показано в таблице 7, что кабозантиниб, вандетаниб, ленватиниб и конденсированные соединения пиримидина (соединения 1-9) ингибировали рост экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клеток NIH/3T3.

[0184]

Таблица 7

Соединение GI₅₀ (нмоль/л) Соединение 1
Соединение 2
Соединение 3
Соединение 4
Соединение 5
Соединение 6
Соединение 7
Соединение 8
Соединение 9
Кабозантиниб
Вандетаниб
Ленватиниб
Алектиниб 8,50
5,80
5,40
5,70
4,20
3,60
11,40
17,90
4,80
91,10
68,70
50,30
>1000

[0185]

Результаты выше позволяют предполагать потенциальную полезность этих ингибиторов RET в качестве лекарственного средства против злокачественных опухолей, в которых детектирован слитый ген DCTN1-RET. Результаты позволяют предполагать также, что использование экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET-клеток NIH/3T3 позволяет скрининг соединения, ингибирующего DCTN1-RET.

[0186]

Пример 9: Ингибирование фосфорилирования RET в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках

Затем проверяли, ингибировано ли фосфорилирование RET в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках посредством существующих лекарственных средств, как опубликовано, ингибирующих RET, в соответствии со способом, описанным ниже. Экспрессирующие слитый ген DCTN1-RET клетки NIH/3T3 для использования получали посредством культивирования в среде для 2-мерной культуры клеток при 37°C в 5% CO₂. За сутки до обработки клеток лекарственным средством, клетки рассевали в 6-луночный планшет (Iwaki), 3×10⁵ клеток/2 мл, и инкубировали при 37°C в 5% CO₂ в течение ночи. Кабозантиниб, вандетаниб, алектиниб и ленватиниб растворяли в диметилсульфоксиде для получения концентрации 10 ммоль/л, и далее разводили с использованием PBS, таким образом, чтобы эти соединения имели конечную концентрацию 1000, 100 и 10 нмоль/л. Разведенные соединения индивидуально добавляли в каждую лунку, в которую предварительно рассевали клетки, 20 мкл на лунку (сутки 1), и инкубировали при 37°C в 5% CO₂ в течение 1 час. После инкубации, образец клеток для анализа экспрессии белка отбирали таким же способом, как в примере 7, и анализировали экспрессию белка. Результаты показывают, как показано на фиг. 9, что уровни фосфорилированного RET в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3 были заметно уменьшены посредством кабозантиниба и ленватиниба. Кроме того, ингибирование фосфорилирования RET посредством конденсированных соединений пиримидина также оценивали таким же способом, как выше, и подтвердили также, что фосфорилирование RET было заметно уменьшено посредством конденсированных соединений пиримидина. Эти результаты позволяют предполагать, что лекарственное средство, способное заметно уменьшать уровни фосфорилированного RET, может представлять собой соединение, которое может ингибировать рост экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клеток NIH/3T3, и что соединение является потенциально полезным в качестве лекарственного средства против злокачественных опухолей, в которых детектирован слитый ген DCTN1-RET. Результаты также позволяют предполагать, что использование уровней фосфорилированного RET в экспрессирующих слитый ген DCTN1-RET клетках NIH/3T3 позволяет скрининг ингибитора RET.

Список последовательностей в произвольном текстовом формате

[0187]

SEQ ID NO: 1 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из варианта 1 (v1) DCTN1 (часть из SEQ ID NO: 25) и варианта 2 (v2) RET (часть из SEQ ID NO: 31).

SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v1 и RET v2.

SEQ ID NO: 3 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v1 и варианта 4 (v4) RET (часть из SEQ ID NO: 32).

SEQ ID NO: 4 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v1 и RET v4.

SEQ ID NO: 5 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из варианта 2 (v2) DCTN1 (часть из SEQ ID NO: 26) и RET v2.

SEQ ID NO: 6 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v2 и RET v2.

SEQ ID NO: 7 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v2 и RET v4.

SEQ ID NO: 8 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v2 и RET v4.

SEQ ID NO: 9 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из варианта 3 (v3) DCTN1 (часть из SEQ ID NO: 27) и RET v2.

SEQ ID NO: 10 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v3 и RET v2.

SEQ ID NO: 11 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v3 и RET v4.

SEQ ID NO: 12 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v3 и RET v4.

SEQ ID NO: 13 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из варианта 4 (v4) DCTN1 (часть из SEQ ID NO: 28) и RET v2.

SEQ ID NO: 14 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v4 и RET v2.

SEQ ID NO: 15 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v4 и RET v4.

SEQ ID NO: 16 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v4 и RET v4.

SEQ ID NO: 17 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из варианта 5 (v5) DCTN1 (часть из SEQ ID NO: 29) и RET v2.

SEQ ID NO: 18 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v5 и RET v2.

SEQ ID NO: 19 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v5 и RET v4.

SEQ ID NO: 20 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v5 и RET v4.

SEQ ID NO: 21 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v6 и RET v2.

SEQ ID NO: 22 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v6 и RET v2.

SEQ ID NO: 23 показывает последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего слитый пептид из DCTN1 v6 и RET v4.

SEQ ID NO: 24 показывает аминокислотную последовательность слитого пептида из DCTN1 v6 и RET v4.

SEQ ID NO: 33 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 34 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 35 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 36 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 37 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 38 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 39 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 40 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 41 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 42 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 43 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 44 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 45 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 46 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 47 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 48 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 49 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 50 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 51 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 52 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 53 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 54 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 55 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 56 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 57 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 58 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 59 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 60 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 61 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 62 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 63 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 64 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 65 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 66 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 67 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 68 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 69 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 70 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 71 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 72 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 73 показывает последовательность оснований праймера.

SEQ ID NO: 74 показывает последовательность оснований миРНК RET.

SEQ ID NO: 75 показывает последовательность оснований миРНК RET.

SEQ ID NO: 76 показывает последовательность оснований миРНК RET.

SEQ ID NO: 77 показывает последовательность оснований миРНК RET.

Таблица последовательностей

P17-158WOPCT_DCTN1 PROTEIN_20180820_115457_8.txt

--->

SEQUENCE LISTING

<110> ТАЙХО ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

<120> СЛИТЫЙ БЕЛОК ИЗ БЕЛКА DCTN1 С БЕЛКОМ RET

<130> P17-158WO

<150> JP 2017-158796

<151> 2017-08-21

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4908

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодирующая последовательность слитого пептида

<400> 1

atggcacaga gcaagaggca cgtgtacagc cggacgccca gcggcagcag gatgagtgcg 60

gaggcaagcg cccggcctct gcgggtgggc tcccgtgtag aggtgattgg aaaaggccac 120

cgaggcactg tggcctatgt tggagccaca ctgtttgcca ctggcaaatg ggtaggcgtg 180

attctggatg aagcaaaggg caaaaatgat ggaactgttc aaggcaggaa gtacttcact 240

tgtgatgaag ggcatggcat ctttgtgcgc cagtcccaga tccaggtatt tgaagatgga 300

gcagatacta cttccccaga gacacctgat tcttctgctt caaaagtcct caaaagagag 360

ggaactgata caactgcaaa gactagcaaa ctgcggggac tgaagcctaa gaaggcaccg 420

acagcccgaa agaccacaac tcggcgaccc aagcccacgc gcccagccag tactggggtg 480

gctggggcca gtagctccct gggcccctct ggctcagcgt cagcaggtga gctgagcagc 540

agtgagccca gcaccccggc tcagactccg ctggcagcac ccatcatccc cacgccggtc 600

ctcacctctc ctggagcagt ccccccgctt ccttccccat ccaaggagga ggagggacta 660

agggctcagg tgcgggacct ggaggagaaa ctagagaccc tgagactgaa acgggcagaa 720

gacaaagcaa agctaaaaga gctggagaaa cacaaaatcc agctggagca ggtgcaggaa 780

tggaagagca aaatgcagga gcagcaggcc gacctgcagc ggcgcctcaa ggaggcgaga 840

aaggaagcca aggaggcgct ggaggcaaag gaacgctata tggaggagat ggctgatact 900

gctgatgcca ttgagatggc cactttggac aaggagatgg ctgaagagcg ggctgagtcc 960

ctgcagcagg aggtggaggc actgaaggag cgggtggacg agctcactac tgacttagag 1020

atcctcaagg ctgagattga agagaagggc tcagatggcg ctgcatccag ttatcagctc 1080

aagcagcttg aggagcagaa tgcccgcctg aaggatgccc tggtgaggat gcgggatctt 1140

tcttcctcag agaagcagga gcatgtgaag ctccagaagc tcatggaaaa gaagaaccaa 1200

gagctggaag ttgtgaggca acagcgggag cgtctgcagg aggagctaag ccaggcagag 1260

agcaccattg atgagctcaa ggagcaggtg gatgctgctc tgggtgctga ggagatggtg 1320

gagatgctga cagatcggaa cctgaatctg gaagagaaag tgcgcgagtt gagggagact 1380

gtgggagact tggaagcgat gaatgagatg aacgatgagc tgcaggagaa tgcacgtgag 1440

acagaactgg agctgcggga gcagctggac atggcaggcg cgcgggttcg tgaggcccag 1500

aagcgtgtgg aggcagccca ggagacggtt gcagactacc agcagaccat caagaagtac 1560

cgccagctga ccgcccatct acaggatgtg aatcgggaac tgacaaacca gcaggaagca 1620

tctgtggaga ggcaacagca gccacctcca gagacctttg acttcaaaat caagtttgct 1680

gagactaagg cccatgccaa ggcaattgag atggaattga ggcagatgga ggtggcccag 1740

gccaatcgac acatgtccct gctgacagcc ttcatgcctg acagcttcct tcggccaggt 1800

ggggaccatg actgcgttct ggtgctgttg ctcatgcctc gtctcatttg caaggcagag 1860

ctgatccgga agcaggccca ggagaagttt gaactaagtg agaactgttc agagcggcct 1920

gggctgcgag gagctgctgg ggagcaactc agctttgctg ctggactggt gtactcgctg 1980

agcctgctgc aggccacgct acaccgctat gagcatgccc tctctcagtg cagtgtggat 2040

gtgtataaga aagtgggcag cctgtaccct gagatgagtg cccatgagcg ctccttggat 2100

ttcctcattg aactgctgca caaggatcag ctggatgaga ctgtcaatgt ggagcctctc 2160

accaaggcca tcaagtacta tcagcatctg tacagcatcc accttgccga acagcctgag 2220

gactgtacta tgcagctggc tgaccacatt aagttcacgc agagtgctct ggactgcatg 2280

agtgtggagg taggacggct gcgtgccttc ttgcagggtg ggcaggaggc tacagatatt 2340

gccctcctgc tccgggatct ggaaacttca tgcagtgaca tccgccagtt ctgcaagaag 2400

atccgaaggc gaatgccagg gacagatgct cctgggatcc cagctgcact ggcctttgga 2460

ccacaggtat ctgacacgct cctagactgc aggaaacact tgacgtgggt cgtggctgtg 2520

ctgcaggagg tggcagctgc tgctgcccag ctcattgccc cactggcaga gaatgagggg 2580

ctacttgtgg ctgctctgga ggaactggct ttcaaagcaa gcgagcagat ctatgggacc 2640

ccctccagca gcccctatga gtgtctgcgc cagtcatgca acatcctcat cagtaccatg 2700

aacaagctgg ccacagccat gcaggagggg gagtatgatg cagagcggcc ccccagcaag 2760

cctccaccgg ttgaactgcg ggctgctgcc cttcgtgcag agatcacaga tgctgaaggc 2820

ctgggtttga agctcgaaga tcgagagaca gttattaagg agttgaagaa gtcactcaag 2880

attaagggag aggagctaag tgaggccaat gtgcggctga gcctcctgga gaagaagttg 2940

gacagtgctg ccaaggatgc agatgagcgc atcgagaaag tccagactcg gctggaggag 3000

acccaggcac tgctgcgaaa gaaggagaaa gagtttgagg agacaatgga tgcactccag 3060

gctgacatcg accagctgga ggcagagaag gcagaactaa agcagcgtct gaacagccag 3120

tccaaacgca cgattgaggg actccggggc cctcctcctt caggcattgc tactctggtc 3180

tctggcattg ctggtgaaga acagcagcga ggagccatcc ctgggcaggc tccagggtct 3240

gtgccaggcc cagggctggt gaaggactca ccactgctgc ttcagcagat ctctgccatg 3300

aggctgcaca tctcccagct ccagcatgag aacagcatcc tcaagggagc ccagatgaag 3360

gcatccttgg catccctgcc ccctctgcat gttgcaaagc tatcccatga gggccctggc 3420

agtgagttac cagctggagc gctgtatcgt aagaccagcc agctgctgga gacattgaat 3480

caattgagca cacacacgca cgtagtagac atcactcgca ccagccctgc tgccaagagc 3540

ccgtcggccc aacttatgga gcaagtggct cagcttaagt ccctgagtga caccgtcgag 3600

aagctcaagg atgaggtcct caaggagaca gtatctcagc gccctggagc cacagtaccc 3660

actgactttg ccaccttccc ttcatcagcc ttcctcaggg aggatccaaa gtgggaattc 3720

cctcggaaga acttggttct tggaaaaact ctaggagaag gcgaatttgg aaaagtggtc 3780

aaggcaacgg ccttccatct gaaaggcaga gcagggtaca ccacggtggc cgtgaagatg 3840

ctgaaagaga acgcctcccc gagtgagctt cgagacctgc tgtcagagtt caacgtcctg 3900

aagcaggtca accacccaca tgtcatcaaa ttgtatgggg cctgcagcca ggatggcccg 3960

ctcctcctca tcgtggagta cgccaaatac ggctccctgc ggggcttcct ccgcgagagc 4020

cgcaaagtgg ggcctggcta cctgggcagt ggaggcagcc gcaactccag ctccctggac 4080

cacccggatg agcgggccct caccatgggc gacctcatct catttgcctg gcagatctca 4140

caggggatgc agtatctggc cgagatgaag ctcgttcatc gggacttggc agccagaaac 4200

atcctggtag ctgaggggcg gaagatgaag atttcggatt tcggcttgtc ccgagatgtt 4260

tatgaagagg attcctacgt gaagaggagc cagggtcgga ttccagttaa atggatggca 4320

attgaatccc tttttgatca tatctacacc acgcaaagtg atgtatggtc ttttggtgtc 4380

ctgctgtggg agatcgtgac cctaggggga aacccctatc ctgggattcc tcctgagcgg 4440

ctcttcaacc ttctgaagac cggccaccgg atggagaggc cagacaactg cagcgaggag 4500

atgtaccgcc tgatgctgca atgctggaag caggagccgg acaaaaggcc ggtgtttgcg 4560

gacatcagca aagacctgga gaagatgatg gttaagagga gagactactt ggaccttgcg 4620

gcgtccactc catctgactc cctgatttat gacgacggcc tctcagagga ggagacaccg 4680

ctggtggact gtaataatgc ccccctccct cgagccctcc cttccacatg gattgaaaac 4740

aaactctatg gcatgtcaga cccgaactgg cctggagaga gtcctgtacc actcacgaga 4800

gctgatggca ctaacactgg gtttccaaga tatccaaatg atagtgtata tgctaactgg 4860

atgctttcac cctcagcggc aaaattaatg gacacgtttg atagttaa 4908

<210> 2

<211> 1635

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый пептид

<400> 2

Met Ala Gln Ser Lys Arg His Val Tyr Ser Arg Thr Pro Ser Gly Ser

1. 5 10 15

Arg Met Ser Ala Glu Ala Ser Ala Arg Pro Leu Arg Val Gly Ser Arg

20 25 30

Val Glu Val Ile Gly Lys Gly His Arg Gly Thr Val Ala Tyr Val Gly

35 40 45

Ala Thr Leu Phe Ala Thr Gly Lys Trp Val Gly Val Ile Leu Asp Glu

50 55 60

Ala Lys Gly Lys Asn Asp Gly Thr Val Gln Gly Arg Lys Tyr Phe Thr

65 70 75 80

Cys Asp Glu Gly His Gly Ile Phe Val Arg Gln Ser Gln Ile Gln Val

85 90 95

Phe Glu Asp Gly Ala Asp Thr Thr Ser Pro Glu Thr Pro Asp Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Lys Val Leu Lys Arg Glu Gly Thr Asp Thr Thr Ala Lys Thr

115 120 125

Ser Lys Leu Arg Gly Leu Lys Pro Lys Lys Ala Pro Thr Ala Arg Lys

130 135 140

Thr Thr Thr Arg Arg Pro Lys Pro Thr Arg Pro Ala Ser Thr Gly Val

145 150 155 160

Ala Gly Ala Ser Ser Ser Leu Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ser Ala Gly

165 170 175

Glu Leu Ser Ser Ser Glu Pro Ser Thr Pro Ala Gln Thr Pro Leu Ala

180 185 190

Ala Pro Ile Ile Pro Thr Pro Val Leu Thr Ser Pro Gly Ala Val Pro

195 200 205

Pro Leu Pro Ser Pro Ser Lys Glu Glu Glu Gly Leu Arg Ala Gln Val

210 215 220

Arg Asp Leu Glu Glu Lys Leu Glu Thr Leu Arg Leu Lys Arg Ala Glu

225 230 235 240

Asp Lys Ala Lys Leu Lys Glu Leu Glu Lys His Lys Ile Gln Leu Glu

245 250 255

Gln Val Gln Glu Trp Lys Ser Lys Met Gln Glu Gln Gln Ala Asp Leu

260 265 270

Gln Arg Arg Leu Lys Glu Ala Arg Lys Glu Ala Lys Glu Ala Leu Glu

275 280 285

Ala Lys Glu Arg Tyr Met Glu Glu Met Ala Asp Thr Ala Asp Ala Ile

290 295 300

Glu Met Ala Thr Leu Asp Lys Glu Met Ala Glu Glu Arg Ala Glu Ser

305 310 315 320

Leu Gln Gln Glu Val Glu Ala Leu Lys Glu Arg Val Asp Glu Leu Thr

325 330 335

Thr Asp Leu Glu Ile Leu Lys Ala Glu Ile Glu Glu Lys Gly Ser Asp

340 345 350

Gly Ala Ala Ser Ser Tyr Gln Leu Lys Gln Leu Glu Glu Gln Asn Ala

355 360 365

Arg Leu Lys Asp Ala Leu Val Arg Met Arg Asp Leu Ser Ser Ser Glu

370 375 380

Lys Gln Glu His Val Lys Leu Gln Lys Leu Met Glu Lys Lys Asn Gln

385 390 395 400

Glu Leu Glu Val Val Arg Gln Gln Arg Glu Arg Leu Gln Glu Glu Leu

405 410 415

Ser Gln Ala Glu Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Glu Gln Val Asp Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Ala Glu Glu Met Val Glu Met Leu Thr Asp Arg Asn Leu

435 440 445

Asn Leu Glu Glu Lys Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val Gly Asp Leu

450 455 460

Glu Ala Met Asn Glu Met Asn Asp Glu Leu Gln Glu Asn Ala Arg Glu

465 470 475 480

Thr Glu Leu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Asp Met Ala Gly Ala Arg Val

485 490 495

Arg Glu Ala Gln Lys Arg Val Glu Ala Ala Gln Glu Thr Val Ala Asp

500 505 510

Tyr Gln Gln Thr Ile Lys Lys Tyr Arg Gln Leu Thr Ala His Leu Gln

515 520 525

Asp Val Asn Arg Glu Leu Thr Asn Gln Gln Glu Ala Ser Val Glu Arg

530 535 540

Gln Gln Gln Pro Pro Pro Glu Thr Phe Asp Phe Lys Ile Lys Phe Ala

545 550 555 560

Glu Thr Lys Ala His Ala Lys Ala Ile Glu Met Glu Leu Arg Gln Met

565 570 575

Glu Val Ala Gln Ala Asn Arg His Met Ser Leu Leu Thr Ala Phe Met

580 585 590

Pro Asp Ser Phe Leu Arg Pro Gly Gly Asp His Asp Cys Val Leu Val

595 600 605

Leu Leu Leu Met Pro Arg Leu Ile Cys Lys Ala Glu Leu Ile Arg Lys

610 615 620

Gln Ala Gln Glu Lys Phe Glu Leu Ser Glu Asn Cys Ser Glu Arg Pro

625 630 635 640

Gly Leu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Gln Leu Ser Phe Ala Ala Gly Leu

645 650 655

Val Tyr Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Leu His Arg Tyr Glu His

660 665 670

Ala Leu Ser Gln Cys Ser Val Asp Val Tyr Lys Lys Val Gly Ser Leu

675 680 685

Tyr Pro Glu Met Ser Ala His Glu Arg Ser Leu Asp Phe Leu Ile Glu

690 695 700

Leu Leu His Lys Asp Gln Leu Asp Glu Thr Val Asn Val Glu Pro Leu

705 710 715 720

Thr Lys Ala Ile Lys Tyr Tyr Gln His Leu Tyr Ser Ile His Leu Ala

725 730 735

Glu Gln Pro Glu Asp Cys Thr Met Gln Leu Ala Asp His Ile Lys Phe

740 745 750

Thr Gln Ser Ala Leu Asp Cys Met Ser Val Glu Val Gly Arg Leu Arg

755 760 765

Ala Phe Leu Gln Gly Gly Gln Glu Ala Thr Asp Ile Ala Leu Leu Leu

770 775 780

Arg Asp Leu Glu Thr Ser Cys Ser Asp Ile Arg Gln Phe Cys Lys Lys

785 790 795 800

Ile Arg Arg Arg Met Pro Gly Thr Asp Ala Pro Gly Ile Pro Ala Ala

805 810 815

Leu Ala Phe Gly Pro Gln Val Ser Asp Thr Leu Leu Asp Cys Arg Lys

820 825 830

His Leu Thr Trp Val Val Ala Val Leu Gln Glu Val Ala Ala Ala Ala

835 840 845

Ala Gln Leu Ile Ala Pro Leu Ala Glu Asn Glu Gly Leu Leu Val Ala

850 855 860

Ala Leu Glu Glu Leu Ala Phe Lys Ala Ser Glu Gln Ile Tyr Gly Thr

865 870 875 880

Pro Ser Ser Ser Pro Tyr Glu Cys Leu Arg Gln Ser Cys Asn Ile Leu

885 890 895

Ile Ser Thr Met Asn Lys Leu Ala Thr Ala Met Gln Glu Gly Glu Tyr

900 905 910

Asp Ala Glu Arg Pro Pro Ser Lys Pro Pro Pro Val Glu Leu Arg Ala

915 920 925

Ala Ala Leu Arg Ala Glu Ile Thr Asp Ala Glu Gly Leu Gly Leu Lys

930 935 940

Leu Glu Asp Arg Glu Thr Val Ile Lys Glu Leu Lys Lys Ser Leu Lys

945 950 955 960

Ile Lys Gly Glu Glu Leu Ser Glu Ala Asn Val Arg Leu Ser Leu Leu

965 970 975

Glu Lys Lys Leu Asp Ser Ala Ala Lys Asp Ala Asp Glu Arg Ile Glu

980 985 990

Lys Val Gln Thr Arg Leu Glu Glu Thr Gln Ala Leu Leu Arg Lys Lys

995 1000 1005

Glu Lys Glu Phe Glu Glu Thr Met Asp Ala Leu Gln Ala Asp Ile

1010 1015 1020

Asp Gln Leu Glu Ala Glu Lys Ala Glu Leu Lys Gln Arg Leu Asn

1025 1030 1035

Ser Gln Ser Lys Arg Thr Ile Glu Gly Leu Arg Gly Pro Pro Pro

1040 1045 1050

Ser Gly Ile Ala Thr Leu Val Ser Gly Ile Ala Gly Glu Glu Gln

1055 1060 1065

Gln Arg Gly Ala Ile Pro Gly Gln Ala Pro Gly Ser Val Pro Gly

1070 1075 1080

Pro Gly Leu Val Lys Asp Ser Pro Leu Leu Leu Gln Gln Ile Ser

1085 1090 1095

Ala Met Arg Leu His Ile Ser Gln Leu Gln His Glu Asn Ser Ile

1100 1105 1110

Leu Lys Gly Ala Gln Met Lys Ala Ser Leu Ala Ser Leu Pro Pro

1115 1120 1125

Leu His Val Ala Lys Leu Ser His Glu Gly Pro Gly Ser Glu Leu

1130 1135 1140

Pro Ala Gly Ala Leu Tyr Arg Lys Thr Ser Gln Leu Leu Glu Thr

1145 1150 1155

Leu Asn Gln Leu Ser Thr His Thr His Val Val Asp Ile Thr Arg

1160 1165 1170

Thr Ser Pro Ala Ala Lys Ser Pro Ser Ala Gln Leu Met Glu Gln

1175 1180 1185

Val Ala Gln Leu Lys Ser Leu Ser Asp Thr Val Glu Lys Leu Lys

1190 1195 1200

Asp Glu Val Leu Lys Glu Thr Val Ser Gln Arg Pro Gly Ala Thr

1205 1210 1215

Val Pro Thr Asp Phe Ala Thr Phe Pro Ser Ser Ala Phe Leu Arg

1220 1225 1230

Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly

1235 1240 1245

Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Lys Val Val Lys Ala Thr

1250 1255 1260

Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr Thr Thr Val Ala Val

1265 1270 1275

Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu Leu Arg Asp Leu

1280 1285 1290

Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His Pro His Val

1295 1300 1305

Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu Leu Leu

1310 1315 1320

Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu Arg

1325 1330 1335

Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser

1340 1345 1350

Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr

1355 1360 1365

Met Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met

1370 1375 1380

Gln Tyr Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

1385 1390 1395

Arg Asn Ile Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp

1400 1405 1410

Phe Gly Leu Ser Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys

1415 1420 1425

Arg Ser Gln Gly Arg Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser

1430 1435 1440

Leu Phe Asp His Ile Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe

1445 1450 1455

Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr

1460 1465 1470

Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly

1475 1480 1485

His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys Ser Glu Glu Met Tyr Arg

1490 1495 1500

Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro Asp Lys Arg Pro Val

1505 1510 1515

Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met Met Val Lys Arg

1520 1525 1530

Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro Ser Asp Ser Leu

1535 1540 1545

Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr Pro Leu Val Asp

1550 1555 1560

Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro Ser Thr Trp Ile

1565 1570 1575

Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Met Ser Asp Pro Asn Trp Pro Gly Glu

1580 1585 1590

Ser Pro Val Pro Leu Thr Arg Ala Asp Gly Thr Asn Thr Gly Phe

1595 1600 1605

Pro Arg Tyr Pro Asn Asp Ser Val Tyr Ala Asn Trp Met Leu Ser

1610 1615 1620

Pro Ser Ala Ala Lys Leu Met Asp Thr Phe Asp Ser

1625 1630 1635

<210> 3

<211> 4782

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодирующая последовательность слитого пептида

<400> 3