Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6806 C12Q1/6827 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs5762821-G и rs5762821-A гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471), способной участвовать в инициации опухолевого роста и метастазирования [Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: a link between RNA and cancer. Biochim Biophys Acta. 2014 Nov;1839(11):1097-109. doi: 10.1016/j.bbagrm.2014.08.012; Zhou M, Wang X, Li J, Hao D, Wang Z, Shi H, Han L, Zhou H, Sun J. Prioritizing candidate disease-related long non-coding RNAs by walking on the heterogeneous lncRNA and disease network. Mol Biosyst. 2015 Mar;11(3):760-9. doi: 10.1039/c4mb00511b]. Анализ экспрессионного профиля lncRNAs установил вовлеченность длинной некодирующей РНК, кодируемой геном ENSG00000226471, в развитие меланомы кожи [Ma X, He Z, Li L, Yang D, Liu G. Expression profiles analysis of long non-coding RNAs identified novel lncRNA biomarkers with predictive value in outcome of cutaneous melanoma. Oncotarget. 2017 Sep 8;8(44):77761-77770. doi: 10.18632/oncotarget.20780]. Согласно данным транскриптомного анализа GTEx Portal (https://gtexportal.org/home/snp/rs5762821) полиморфный вариант rs5762821 (G>A) ассоциируется с повышением экспрессии гена длинной некодирующей РНК (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) в фибробластах кожи, и в этой связи представляет значительный интерес для анализа риска развития меланомы кожи в группе лиц с наследственной отягощенностью, однако в настоящее время нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs5762821.

Методом, с помощью которого возможно осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs5762821 является секвенирование по Сэнгеру, также известный как метод обрыва цепи. Он используется для определения любых изменений нуклеотидной последовательности, впервые предложенный Ф. Сэнгером в 1977 году. В настоящее время широко используется для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека, так как достаточно точен [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs5762821 гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) возможно методом секвенирования следующего поколения [Hsiao YP, Lu CT, Chang-Chien J, Chao WR, Yang JJ. Advances and Applications of Ion Torrent Personal Genome Machine in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Reveal Novel Gene Mutations. Materials (Basel). 2016 Jun 14;9(6):464. doi: 10.3390/ma9060464], для которого необходимы секвенатор Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM, ThermoFisher Scientific) и специальная панель целевых праймеров AmpliSeq, разработанных с использованием программного обеспечения AmpliSeq версии 4.0 (ThermoFisher Scientific). Для каждой мультиплексной ПЦР-амплификации использовали 25 нанограммов геномной ДНК. Качество библиотеки оценивалось с помощью электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), а библиотеки, прошедшие этот этап, подвергались эмульсионной ПЦР, выполняемой с помощью системы OneTouch2 (ThermoFisher Scientific). Библиотеки загружали на Ion 318chipv2, а затем секвенировали на Ion PGM (ThermoFisher Scientific). Анализ данных, включая сопоставление с референсным геномом и определение вариантов, проводился с использованием программного обеспечения Torrent Suite v.5.0 (ThermoFisher Scientific). Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs5762821 гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471), возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является высокая стоимость оборудования, комплектов реагентов и чипов, а также длительность анализа (не менее 8 часов).

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке оперативного, удобного и финансово выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, используются: прямой праймер lncRNA-F 5'-GGTGGGGAGAATGCTGAGT-3', обратный праймер lncRNA-R 5'-CGGTGGCATTTAGTACATTTGC-3', lncRNA-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-TGGAACTAGACAGAAG-RTQ1-3′, lncRNA-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-TGGAACTAGACAGAAA-BHQ-3′, при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК (генотип rs5762821-G/G) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК (генотип rs5762821-A/A) детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца (генотип rs5762821-G/A) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) длиной 119 пар нуклеотидов, кодирующие аллели rs5762821-G и rs5762821-A. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs5762821 гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs5762821-G/G показаны оранжевым цветом, генотипы rs5762821-G/A показаны зеленым цветом, генотипы rs5762821-A/A показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) длиной 119 пар нуклеотидов: прямой праймер lncRNA-F 5'-GGTGGGGAGAATGCTGAGT-3', обратный праймер lncRNA-R 5'-CGGTGGCATTTAGTACATTTGC-3', lncRNA-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-TGGAACTAGACAGAAG-RTQ1-3′, lncRNA-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-TGGAACTAGACAGAAA-BHQ-3′, подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=22:28822984-28823984;v=rs5762821;vdb=variation;vf=184913940), включающей в положении chr22:28823484 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs5762821 (G>A). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Праймеры lncRNA-F и lncRNA-R инициируют амплификацию участка гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471), включающего локус rs5762821, длиной 119 пар нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=53°С и элонгации 60 сек при 62°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs5762821-G и rs5762821-A гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК (генотип rs5762821-G/G) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК (генотип rs5762821-A/A) детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца (генотип rs5762821-G/A) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 77,9% людей являлись гомозиготами по аллелю G (генотип rs5762821-G/G), 4,2% людей - гомозиготами по аллелю A (генотип rs5762821-A/A), 17,9% - гетерозиготами (генотип rs5762821-G/A). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа 16 минут) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Образец ДНК добровольца Д. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=53°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs5762821-А, что соответствует генотипу rs5762821-А/А гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471).

Пример 2. Образец ДНК добровольца М. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=53°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs5762821-G, и аллеля rs5762821-A, что соответствует гетерозиготному генотипу rs5762821-G/A гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471).

Пример 3. Образец ДНК добровольца A. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=53°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs5762821-G, что соответствует генотипу rs5762821-G/G гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471).

Образцы ДНК добровольцев Д., М. и А. были прогенотипированы по однонуклеотидному варианту rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience): при этом результаты масс-спектрометрического генотипирования трех образцов ДНК полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471) методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа 16 минут сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="rs5762821.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-05-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024101535</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1848</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024101535</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский

государственный медицинский университет» Министерства

здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Постникова Мария

Игоревна</InventorName>

<InventorNameLatin>Postnikova Maria Igorevna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

однонуклеотидного варианта rs5762821 (G&gt;A) гена длинной

некодирующей РНК человека (lncRNA, Ensembl ID: ENSG00000226471)

методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtggggagaatgctgagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggtggcatttagtacatttgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggaactagacagaag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggaactagacagaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека ENSG00000226471. Указанный способ осуществляют методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени с использованием прямого и обратного праймеров lncRNA, а также lncRNA-G-аллель-специфичного и lncRNA-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченых зондов. Изобретение обеспечивает эффективный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs5762821 (G>A) гена длинной некодирующей РНК человека ENSG00000226471 методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются:

прямой праймер lncRNA-F 5'-GGTGGGGAGAATGCTGAGT-3',

обратный праймер lncRNA-R 5'-CGGTGGCATTTAGTACATTTGC-3',

lncRNA-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-FAM-TGGAACTAGACAGAAG-RTQ1-3',

lncRNA-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-ROX-TGGAACTAGACAGAAA-BHQ-3',

при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК (генотип rs5762821-G/G) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК (генотип rs5762821-A/A) детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца (генотип rs5762821-G/A) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена длинной некодирующей РНК человека (lncRNA) в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.