Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>T) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs4660852-G и rs4660852-T гена TESK2, кодирующего протеинкиназу, катализирующую фосфорилирование экзогенных субстратов по остаткам серина, треонина и тирозина.

По данным транскриптомного анализа GTex Portal однонуклеотидный вариант rs4660852 (G>T) пищеводе, толстом кишечнике, поджелудочной железе ассоциирован со снижением экспрессии гена MUTYH, тогда как в печени, легких, большеберцовой артерии и нерве, аорте, подкожной и висцеральной жировой ткани rs4660852 (G>T) ассоциируется со снижением экспрессии гена PRDX1 [https://www.gtexportal.org]. Ген MUTYH вовлечен в развитие колоректального рака [Kantor M., Sobrado J., Patel S., Eiseler S., Ochner C. Hereditary Colorectal Tumors: A Literature Review on MUTYH-Associated Polyposis. Gastroenterol Res Pract. 2017;2017:8693182. doi: 10.1155/2017/8693182], рака яичников [Hutchcraft M.L., Gallion H.H., Kolesar J.M. MUTYH as an Emerging Predictive Biomarker in Ovarian Cancer. Diagnostics (Basel). 2021 Jan 6; 11(1): 84. doi: 10.3390/diagnostics11010084]. Согласно данным литературы, важную роль в канцерогенезе и формировании резистентности к химиотерапии принадлежит гену пероксиредоксина 1 [Nicolussi A., D'Inzeo S., Capalbo C., Giannini G., Coppa A. The role of peroxiredoxins in cancer. Mol Clin Oncol. 2017 Feb; 6(2): 139-153. doi: 10.3892/mco.2017.1129. Epub 2017 Jan 10. PMID: 28357082; PMCID: PMC5351761].

Однако на сегодняшний день нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs4660852 (G>T).

Методом, позволяющим осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs4660852 является секвенирование по Сэнгеру - метод, применяемый для детекции любых изменений нуклеотидной последовательности, разработанный Ф. Сэнгером в 1977 году и широко использующийся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P. 237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs4660852 гена TESK2 возможно методом секвенирования следующего поколения [Horpaopan S., Spier I., Zink A.M., Altmüller J., Holzapfel S., Laner A., Vogt S., Uhlhaas S., Heilmann S., Stienen D., Pasternack S.M., Keppler K., Adam R., Kayser K., Moebus S., Draaken M., Degenhardt F., Engels H., Hofmann A., Nöthen M.M., Steinke V., Perez-Bouza A., Herms S., Holinski-Feder E., Fröhlich H., Thiele H., Hoffmann P., Aretz S. Genome-wide CNV analysis in 221 unrelated patients and targeted high-throughput sequencing reveal novel causative candidate genes for colorectal adenomatous polyposis. Int J Cancer. 2015 Mar 15; 136(6): E578-89. doi: 10.1002/ijc.29215. Epub 2014 Sep 30. PMID: 25219767], для которого необходимы секвенатор Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM, ThermoFisher Scientific) и специальная панель целевых праймеров AmpliSeq, разработанных с использованием программного обеспечения AmpliSeq версии 4.0 (ThermoFisher Scientific). Качество библиотеки оценивалось с помощью электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), а библиотеки, прошедшие этот этап, подвергались эмульсионной ПЦР, выполняемой с помощью системы OneTouch2 (ThermoFisher Scientific). Библиотеки загружали на Ion 318chipv2, а затем секвенировали на Ion PGM (ThermoFisher Scientific). Анализ данных, включая сопоставление с референсным геномом и определение вариантов, проводился с использованием программного обеспечения Torrent Suite v.5.0 (ThermoFisher Scientific). Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs4660852 гена TESK2, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W., Wurmbach J.H., Thiele H., Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul; 3(4): 537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является длительность анализа - не менее 8 часов, необходимость приобретения дорогостоящего геномного масс-спектрометра и набора чипов и реагентов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке простого, быстрого и экономически выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>T) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>T) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, используются: прямой праймер TESK2-F 5'-GACAAGCATTCCACCAACTGA-3', обратный праймер TESK2-R 5'-TGATGGCATAGGTCTTTCGAG-3', TESK2-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-FAM-ATCCTTACCATATAGTTGTG-RTQ1-3', TESK2-Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-ATCCTTACCATATAGTTGTT-BHQ-3', при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs4660852-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs4660852-T/T детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs4660852-G/T наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена TESK2 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена TESK2 длиной 170 пар нуклеотидов, кодирующие аллели rs4660852-G и rs4660852-T гена TESK2. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фиг. 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs4660852 гена TESK2 при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs4660852-G/G показаны оранжевым цветом, генотипы rs4660852-G/T показаны зеленым цветом, генотипы rs4660852-Т/Т показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>Т) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена TESK2 длиной 170 пар нуклеотидов: прямой праймер TESK2-F 5'-GACAAGCATTCCACCAACTGA-3', обратный праймер TESK2-R 5'-TGATGGCATAGGTCTTTCGAG-3', TESK2-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-FAM-ATCCTTACCATATAGTTGTG-RTQ1-3', TESK2-Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-ATCCTTACCATATAGTTGTT-BHQ-3', подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена TESK2 (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=1:45382759-45383759;v=rs4660852;vdb=variation;vf=276461), включающей в положении chr1:45383259 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs4660852 (G>Т). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Праймеры TESK2-F и TESK2-R инициируют амплификацию участка гена TESK2, включающего локус rs4660852, длиной 170 пар нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=53°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs4660852-G и rs4660852-Т гена TESK2 проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs4660852-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs4660852-T/T детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs4660852-G/T наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена TESK2 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 54,7% людей являлись гомозиготами по аллелю G (генотип rs4660852-G/G), 7,4% людей - гомозиготами по аллелю Т (rs4660852-T/T), 37,9% - гетерозиготами (генотип rs4660852-G/T). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul; 3(4): 537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>Т) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1. Образец ДНК Е31 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs4660852 (G>Т) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=53°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs4660852-Т, что соответствует генотипу rs4660852-Т/Т TESK2.

Пример 2. Образец ДНК Е37 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs4660852 (G>Т) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=53°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs4660852-G, и аллеля rs4660852-Т, что соответствует гетерозиготному генотипу rs4660852-G/Т TESK2.

Пример 3. Образец ДНК Е50 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs4660852 (G>Т) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=53°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs4660852-G, что соответствует генотипу rs4660852-G/G TESK2.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК Е31, Е37, Е50 по однонуклеотидному варианту rs4660852 (G>Т) гена TESK2 с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>Т) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="Способ генотипирования однонуклеотидного

варианта rs4660852 гена TESK2 .xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-06-13">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1914</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-13</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1914</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1914</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-06-13</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский

государственный медицинский университет» Министерства

здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия

Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

однонуклеотидного варианта rs4660852 (G&gt;T) гена TESK2 человека

методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacaagcattccaccaactga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgatggcataggtctttcgag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atccttaccatatagttgtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atccttaccatatagttgtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>T) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, включающий использование подобранных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов. Технический результат заключается в разработке простого и быстрого способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>T) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs4660852 (G>T) гена TESK2 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются:

прямой праймер TESK2-F 5'-GACAAGCATTCCACCAACTGA-3',

обратный праймер TESK2-R 5'-TGATGGCATAGGTCTTTCGAG-3',

TESK2-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-FAM-ATCCTTACCATATAGTTGTG-RTQ1-3',

TESK2-Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-ROX-ATCCTTACCATATAGTTGTT-BHQ-3′,

при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs4660852-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs4660852-T/T детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs4660852-G/T наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена TESK2 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.