Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs3219484-C и rs3219484-T гена MUTYH. Известно, что полиморфный вариант rs3219484 (C>T) гена MUTYH ассоциируется со снижением токсичности при проведении химиотерапии рака яичников [Khrunin AV, Khokhrin DV, Moisseev AA, Gorbunova VA, Limborska SA. Pharmacogenomic assessment of cisplatin-based chemotherapy outcomes in ovarian cancer. Pharmacogenomics. 2014 Feb;15(3):329-37. doi: 10.2217/pgs.13.237], однако на сегодняшний день нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs3219484 (C>T).

Методом, позволяющим осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs3219484 является секвенирование по Сэнгеру, широко использующееся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs3219484 гена MUTYH возможно методом секвенирования следующего поколения [Grada A, Weinbrecht K. Next-generation sequencing: methodology and application. J Invest Dermatol. 2013 Aug;133(8):e11. doi: 10.1038/jid.2013.248]. Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs3219484 гена MUTYH, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является длительность анализа - не менее 8 часов, необходимость приобретения дорогостоящего геномного масс-спектрометра и набора чипов и реагентов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке простого, быстрого и экономически выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени используются: прямой праймер rs3219484 5'-GCTTGGCCTGACTGTTGTTC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219484 5'-TGGCCTCATTGTGACTGACT-3' (SEQ ID NO 2), rs3219484-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)TGTGACCACTTCCCAC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs3219484-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)TGTGACCACTTCCCAT(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), при этом для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219484-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs3219484-T/T детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219484-C/T наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена MUTYH длиной 152 пары нуклеотидов, кодирующие аллели rs3219484-C и rs3219484-T гена MUTYH. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs3219484 гена MUTYH при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs3219484-C/C показаны оранжевым цветом, генотипы rs3219484-C/T показаны зеленым цветом, генотипы rs3219484-T/T показаны синим цветом, черным ромбом показан отрицательный контроль.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена MUTYH длиной 152 пары нуклеотидов: прямой праймер rs3219484 5'-GCTTGGCCTGACTGTTGTTC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219484 5'-TGGCCTCATTGTGACTGACT-3' (SEQ ID NO 2), rs3219484-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)TGTGACCACTTCCCAC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs3219484-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)TGTGACCACTTCCCAT(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена MUTYH (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=1:45333984-45334984;v=rs3219484;vdb=variation;vf=222613), включающей в положении chr1:45334484 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs3219484 (C>T). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Прямой и обратный праймеры инициируют амплификацию участка гена MUTYH, включающего локус rs3219484, длиной 152 пары нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=54°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs3219484-C и rs3219484-T гена MUTYH проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219484-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs3219484-T/T детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219484-C/T наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 86,3% людей являлись гомозиготами по аллелю C (генотип rs3219484-C/C), 1,1% людей - гомозиготами по аллелю T (rs3219484-T/T), 12,6% - гетерозиготами (генотип rs3219484-C/T). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Образец ДНК DM266 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs3219484-T, что соответствует генотипу rs3219484-T/T MUTYH.

Пример 2. Образец ДНК DM200 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs3219484-C, и аллеля rs3219484-T, что соответствует гетерозиготному генотипу rs3219484-C/T MUTYH.

Пример 3. Образец ДНК DM1477 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs3219484-C, что соответствует генотипу rs3219484-C/C MUTYH.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК DM200, DM266, DM1477 по однонуклеотидному варианту rs3219484 (C>T) гена MUTYH с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-

//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-09-03" softwareVersion="2.3.0"

softwareName="WIPO Sequence" fileName="Способ генотипирования однонуклеотидного

варианта rs3219484 (C˃T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции

в режиме реального времени.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate>2024-09-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1933</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Азарова Юлия Эдуардовна</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования однонуклеотидного

варианта rs3219484 (C˃T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной

реакции в режиме реального времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcttggcctgactgttgttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcctcattgtgactgact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtgaccacttcccac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtgaccacttcccat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 C>T гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся применением разработанных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат заключается в разработке простого и быстрого способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 C>T гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются: прямой праймер rs3219484 5'-GCTTGGCCTGACTGTTGTTC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219484 5'-TGGCCTCATTGTGACTGACT-3' (SEQ ID NO 2), rs3219484-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(FAM)TGTGACCACTTCCCAC(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3), rs3219484-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(ROX)TGTGACCACTTCCCAT(BHQ)-3' (SEQ ID NO 4), при этом для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219484-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю T образцов ДНК с генотипом rs3219484-T/T детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219484-C/T наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.