Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs3219493-C и rs3219493-G гена MUTYH. Установлено, что полиморфный вариант rs3219493 (C>G) гена MUTYH ассоциируется с ранним возникновением рака груди [Panigoro SS, Listiyaningsih E, Nurlaila I, Mahesworo B, Hidayat AA, Budiarto A, Sudigyo D, Amirullah D, Simon S, Baurley J, Pardamean B. Intronic Variant of MUTYH Gene Exhibits A Strong Association with Early Onset of Breast Cancer Susceptibility in Indonesian Women Population. Asian Pac J Cancer Prev. 2021 Dec 1;22(12):3985-3991. doi: 10.31557/APJCP.2021.22.12.3985] и рака мочевого пузыря [Zhu G, Su H, Lu L, Guo H, Chen Z, Sun Z, Song R, Wang X, Li H, Wang Z. Association of nineteen polymorphisms from seven DNA repair genes and the risk for bladder cancer in Gansu province of China. Oncotarget. 2016 May 24;7(21):31372-83. doi: 10.18632/oncotarget.9146], что требует разработки простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs3219493 (C>G).

Методом, позволяющим осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs3219493 является секвенирование по Сэнгеру - метод, применяемый для детекции любых изменений нуклеотидной последовательности, разработанный Ф. Сэнгером в 1977 году и широко использующийся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs3219493 гена MUTYH возможно методом секвенирования следующего поколения [Grada A, Weinbrecht K. Next-generation sequencing: methodology and application. J Invest Dermatol. 2013 Aug;133(8):e11. doi: 10.1038/jid.2013.248]. Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs3219493 гена MUTYH, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является длительность анализа - не менее 8 ч, необходимость приобретения дорогостоящего геномного масс-спектрометра и набора чипов и реагентов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке простого, быстрого и экономически выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени используются: прямой праймер rs3219493 5'-CTGTTGGCCCTGATACACAC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219493 5'-AAGTTAAGGGCAGAACACCG-3' (SEQ ID NO 2), rs3219493-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)AGGGCTGGCACTTTTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs3219493-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)AGGGCTGGCACTTTTTG(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), при этом для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219493-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs3219493-G/G детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219493-C/G наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена MUTYH длиной 101 пара нуклеотидов, кодирующие аллели rs3219493-C и rs3219493-G гена MUTYH. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs3219493 гена MUTYH при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs3219493-C/C показаны оранжевым цветом, генотипы rs3219493-C/G показаны зеленым цветом, генотипы rs3219493-G/G показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена MUTYH длиной 101 пара нуклеотидов: прямой праймер rs3219493 5'-CTGTTGGCCCTGATACACAC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219493 5'-AAGTTAAGGGCAGAACACCG-3' (SEQ ID NO 2), rs3219493-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)AGGGCTGGCACTTTTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs3219493-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)AGGGCTGGCACTTTTTG(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена MUTYH (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=1:45330097-45331097;v=rs3219493;vdb=variation;vf=222622), включающей в положении chr1:45330597 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs3219493 (C>G). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Прямой и обратный праймеры инициируют амплификацию участка гена MUTYH, включающего локус rs3219493, длиной 101 пара нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 с при 95°С и 30 с при t=54°С. Идентификация аллелей rs3219493-C и rs3219493-G гена MUTYH проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219493-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs3219493-G/G детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219493-C/G наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 93,7% людей являлись гомозиготами по аллелю C (генотип rs3219493-C/C), 1,1% людей - гомозиготами по аллелю G (rs3219493-G/G), 5,2% - гетерозиготами (генотип rs3219493-C/G). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 ч) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 ч).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Образец ДНК NDM910 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 с при 95°С и 30 с при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs3219493-G, что соответствует генотипу rs3219493-G/G MUTYH.

Пример 2. Образец ДНК NDM849 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 с при 95°С и 30 с при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs3219493-C, и аллеля rs3219493-G, что соответствует гетерозиготному генотипу rs3219493-C/G MUTYH.

Пример 3. Образец ДНК NDM852 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 с при 95°С и 30 с при t=54°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs3219493-C, что соответствует генотипу rs3219493-C/C MUTYH.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК NDM849, NDM852, NDM910 по однонуклеотидному варианту rs3219493 (C>G) гена MUTYH с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 ч сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-09-03"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Способ

генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C˃G) гена MUTYH

человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального

времени.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate>2024-09-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1929</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия

Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

однонуклеотидного варианта rs3219493 (C˃G) гена MUTYH человека

методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgttggccctgatacacac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aagttaagggcagaacaccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agggctggcactttttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agggctggcactttttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан cпособ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются подобранные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды. Для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219493-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs3219493-G/G детектируется сигнал по каналу ROX. Для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219493-C/G наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека. Технический результат заключается в разработке простого и быстрого способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs3219493 (C>G) гена MUTYH человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются: прямой праймер rs3219493 5'-CTGTTGGCCCTGATACACAC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219493 5'-AAGTTAAGGGCAGAACACCG-3' (SEQ ID NO 2), rs3219493-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)AGGGCTGGCACTTTTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs3219493-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)AGGGCTGGCACTTTTTG(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), при этом для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs3219493-C/C детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs3219493-G/G детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs3219493-C/G наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена MUTYH в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.