Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs12169782-G и rs12169782-A гена TTC28-AS1, кодирующего длинную некодирующую РНК [Zhang J., Ding J., Yu M., Li F., Zhou X., Shuai H. Long non-coding RNA TTC28-AS1 attenuates high glucose-induced damage in HK-2 cells depending on the regulation of miR-320a/CD2AP axis. Genes Genomics. 2021 Dec;43(12):1471-1482. doi: 10.1007/s13258-021-01167-z]. Согласно литературным данным, длинная некодирующая РНК TTC28-AS1 играет роль посттрансляционного регулятора экспрессии генов, и увеличение уровня РНК TTC28-AS1 имеет патогенетическое значение в развитии сахарного диабета 2 типа [Mohamadi M., Ghaedi H., Kazerouni F., Erfanian Omidvar M., Kalbasi S., Shanaki M., Miraalamy G., Rahimipour A. Deregulation of long noncoding RNA SNHG17 and TTC28-AS1 is associated with type 2 diabetes mellitus. Scand J Clin Lab Invest. 2019 Nov;79(7):519-523. doi: 10.1080/00365513.2019.1664760], диабетической нефропатии [Zhang J., Ding J., Yu M., Li F., Zhou X., Shuai H. Long non-coding RNA TTC28-AS1 attenuates high glucose-induced damage in HK-2 cells depending on the regulation of miR-320a/CD2AP axis. Genes Genomics. 2021 Dec;43(12):1471-1482. doi: 10.1007/s13258-021-01167-z], а также влияет на выживаемость пациентов с глиомой [Liu G., Li H., Ji W., Gong H., Jiang Y., Ji G., Liu G. Construction of a ceRNA network in glioma and analysis of its clinical significance. BMC Genomics. 2021 Oct 6;22(1):722. doi: 10.1186/s12864-021-08035-w] и колоректальным раком [Zhang X., Zhang X., Shen L., Song L., Wu J., Cao G., Chen X., Zhu B. Comprehensive analysis of differentially expressed lncRNAs as diagnostic and prognostic markers for colorectal cancer. Exp Ther Med. 2019 Dec;18(6):4481-4489. doi: 10.3892/etm.2019.8067]. Результаты транскриптомного анализа тканей человека, депонированные в онлайн ресурсе GTEx Portal (https://gtexportal.org/home/snp/rs12169782), свидетелствуют о том, что однонуклеотидный вариант rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 обладает выраженным регуляторным потенциалом и ассоциируется с изменением экспрессии различных генов в крови, сосудах, нервах, поджелудочной железе, однако в настоящее время нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs12169782.

Методом, с помощью которого возможно осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs12169782 является секвенирование по Сэнгеру, также известный как метод обрыва цепи. Он используется для определения любых изменений нуклеотидной последовательности, впервые предложенный Ф. Сэнгером в 1977 году. В настоящее время широко используется для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека, так как достаточно точен [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P. 237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs12169782 гена TTC28-AS1 человека возможно методом секвенирования следующего поколения [Hsiao Y.P., Lu C.T., Chang-Chien J., Chao W.R., Yang J.J. Advances and Applications of Ion Torrent Personal Genome Machine in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Reveal Novel Gene Mutations. Materials (Basel). 2016 Jun 14;9(6):464. doi: 10.3390/ma9060464], для которого необходимы секвенатор Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM, ThermoFisher Scientific) и специальная панель целевых праймеров AmpliSeq, разработанных с использованием программного обеспечения AmpliSeq версии 4.0 (ThermoFisher Scientific). Для каждой мультиплексной ПЦР-амплификации использовали 25 нанограммов геномной ДНК. Качество библиотеки оценивалось с помощью электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), а библиотеки, прошедшие этот этап, подвергались эмульсионной ПЦР, выполняемой с помощью системы OneTouch2 (ThermoFisher Scientific). Библиотеки загружали на Ion 318chipv2, а затем секвенировали на Ion PGM (ThermoFisher Scientific). Анализ данных, включая сопоставление с референсным геномом и определение вариантов, проводился с использованием программного обеспечения Torrent Suite v.5.0 (ThermoFisher Scientific). Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs12169782 гена TTC28-AS1 человека, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W., Wurmbach J.H., Thiele H., Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является высокая стоимость оборудования, комплектов реагентов и чипов, а также длительность анализа (не менее 8 часов).

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке оперативного, удобного и финансово выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, используются: прямой праймер TTC28-AS1-F 5'-TGAGTTCAGGCAAGACAGTAAA-3', обратный праймер TTC28-AS1-R 5'-GACCAGCTTTTCCCCTTTGA-3', TTC28-AS1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-FAM-CTCTTTACAAATCTGACG-RTQ1-3', TTC28-AS1-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-ROX-CTCTTTACAAATCTGACA-BHQ-3', при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs12169782-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs12169782-A/A детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца с генотипом rs12169782-G/A наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена TTC28-AS1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена TTC28-AS1 человека длиной 111 пар нуклеотидов, кодирующие аллели rs12169782-G и rs12169782-A. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом – последовательности зондов.

На фиг. 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs12169782 гена TTC28-AS1 человека при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs12169782-G/G показаны оранжевым цветом, генотипы rs12169782-G/A показаны зеленым цветом, генотипы rs12169782-A/A показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена TTC28-AS1 длиной 111 пар нуклеотидов: прямой праймер TTC28-AS1-F 5'-TGAGTTCAGGCAAGACAGTAAA-3', обратный праймер TTC28-AS1-R 5'-GACCAGCTTTTCCCCTTTGA-3', TTC28-AS1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-FAM-CTCTTTACAAATCTGACG-RTQ1-3', TTC28-AS1-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-ROX-CTCTTTACAAATCTGACA-BHQ-3', подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена TTC28-AS1 человека (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=22:27959384-27960384;v=rs12169782;vdb=variation;vf=185505959), включающей в положении chr22:27959884 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs12169782 (G>A). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Праймеры TTC28-AS1-F и TTC28-AS1-R инициируют амплификацию участка гена TTC28-AS1 человека, включающего локус rs12169782, длиной 111 пар нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=52°С и элонгации 60 сек при 62°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs12169782-G и rs12169782-A гена TTC28-AS1 человека проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs12169782-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs12169782-A/A детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца с генотипом rs12169782-G/A наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена TTC28-AS1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 68,4% людей являлись гомозиготами по аллелю G с генотипом rs12169782-G/G, 4,2% людей - гомозиготами по аллелю A с генотипом rs12169782-A/A, 27,4% - гетерозиготами с генотипом rs12169782-G/A. Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W., Wurmbach J.H., Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа 16 минут) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1. Образец ДНК добровольца К. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=52°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs12169782-А, что соответствует генотипу rs12169782-А/А гена TTC28-AS1 человека.

Пример 2. Образец ДНК добровольца И. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=52°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs12169782-G, и аллеля rs12169782-A, что соответствует гетерозиготному генотипу rs12169782-G/A гена TTC28-AS1 человека.

Пример 3. Образец ДНК добровольца Ш. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=52°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs12169782-G, что соответствует генотипу rs12169782-G/G гена TTC28-AS1 человека.

Образцы ДНК добровольцев К., И. и Ш. были прогенотипированы по однонуклеотидному варианту rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience): при этом результаты масс-спектрометрического генотипирования трех образцов ДНК полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа 16 минут сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием – амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-05-03"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence"

fileName="rs12169782.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024101539</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1849</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024101539</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-01-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Постникова Мария

Игоревна</InventorName>

<InventorNameLatin>Postnikova Maria Igorevna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека

методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagttcaggcaagacagtaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaccagcttttcccctttga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctctttacaaatctgacg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctctttacaaatctgaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, предполагающий применение подобранных олигонуклеотидных праймеров и зондов. Технический результат заключается в разработке оперативного и удобного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs12169782 (G>A) гена TTC28-AS1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются:

прямой праймер TTC28-AS1-F 5'-TGAGTTCAGGCAAGACAGTAAA-3',

обратный праймер TTC28-AS1-R 5'-GACCAGCTTTTCCCCTTTGA-3',

TTC28-AS1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-FAM-CTCTTTACAAATCTGACG-RTQ1-3',

TTC28-AS1-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-ROX-CTCTTTACAAATCTGACA-BHQ-3',

при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs12169782-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs12169782-A/A детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца с генотипом rs12169782-G/A наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена TTC28-AS1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.