Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs2304277-G и rs2304277-A гена OGG1. Полиморфный вариант rs2304277 (G>A) гена OGG1 ассоциируется с раком мочевого пузыря [Ahmed T, Nawaz S, Noreen R, Bangash KS, Rauf A, Younis M, Anwar K, Khawaja MA, Azam M, Qureshi AA, Akhter S, Kiemeney LA, Qamar R, Ali SHB. A 3' untranslated region polymorphism rs2304277 in the DNA repair pathway gene OGG1 is a novel risk modulator for urothelial bladder carcinoma. Ann Hum Genet. 2018 Mar;82(2):74-87. doi: 10.1111/ahg.12225], однако на сегодняшний день нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs2304277 (G>A).

Методом, позволяющим осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs2304277, является секвенирование по Сэнгеру - метод, применяемый для детекции любых изменений нуклеотидной последовательности, разработанный Ф. Сэнгером в 1977 году и широко использующийся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs2304277 гена OGG1 возможно методом секвенирования следующего поколения [Grada A, Weinbrecht K. Next-generation sequencing: methodology and application. J Invest Dermatol. 2013 Aug;133(8):e11. doi: 10.1038/jid.2013.248]. Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs2304277 гена OGG1, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является длительность анализа - не менее 8 часов, необходимость приобретения дорогостоящего геномного масс-спектрометра и набора чипов и реагентов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченных флуорофорами аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке простого, быстрого и экономически выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени используются: прямой праймер rs2304277 5'-TCTGGAATAGAGAAGGTGTTGGG-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs2304277 5'-GGACTCCTCCCCATCCCTA-3' (SEQ ID NO 2), rs2304277-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченный зонд 5′-(FAM)AGTTACTGTGTGCCCAG(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs2304277-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченный зонд 5′-(ROX)AGTTACTGTGTGCCCAA(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs2304277-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs2304277-A/A детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs2304277-G/A наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена OGG1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена OGG1 длиной 150 пар нуклеотидов, кодирующие аллели rs2304277-G и rs2304277-A гена OGG1. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs2304277 гена OGG1 при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs2304277-G/G показаны оранжевым цветом, генотипы rs2304277-G/A показаны зеленым цветом, генотипы rs2304277-A/A показаны синим цветом, черным ромбом показан отрицательный контроль.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена OGG1 длиной 150 пар нуклеотидов: прямой праймер rs2304277 5'-TCTGGAATAGAGAAGGTGTTGGG-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs2304277 5'-GGACTCCTCCCCATCCCTA-3' (SEQ ID NO 2), rs2304277-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченный зонд 5′-(FAM)AGTTACTGTGTGCCCAG(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs2304277-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченный зонд 5′-(ROX)AGTTACTGTGTGCCCAA(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена OGG1 (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population?db=core;r=3:9758896-9759896;v=rs2304277;vdb=variation;vf=183366348), включающей в положении chr3:9759396 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs2304277 (G>A). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Прямой и обратный праймеры инициируют амплификацию участка гена OGG1, включающего локус rs2304277, длиной 150 пар нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=56°С. Идентификация аллелей rs2304277-G и rs2304277-A гена OGG1 проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs2304277-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs2304277-A/A детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs2304277-G/A наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена OGG1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 69,5% людей являлись гомозиготами по аллелю G (генотип rs2304277-G/G), 3,1% людей - гомозиготами по аллелю A (rs2304277-A/A), 27,4% - гетерозиготами (генотип rs2304277-G/A). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1. Образец ДНК DM908 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=56°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs2304277-A, что соответствует генотипу rs2304277-A/A OGG1.

Пример 2. Образец ДНК DM953 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=56°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs2304277-G, и аллеля rs2304277-A, что соответствует гетерозиготному генотипу rs2304277-G/A OGG1.

Пример 3. Образец ДНК DM950 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=56°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs2304277-G, что соответствует генотипу rs2304277-G/G OGG1.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК DM950, DM953, DM908 по однонуклеотидному варианту rs2304277 (G>A) гена OGG1 с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-09-04"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Способ

генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 гена OGG1

человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального

времени.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate>2024-09-04</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1935</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия

Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом

полимеразно-цепной реакции в режиме реального

времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tctggaatagagaaggtgttggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggactcctccccatcccta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agttactgtgtgcccag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agttactgtgtgcccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся применением разработанных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат заключается в разработке простого и быстрого способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G>A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2304277 (G˃A) гена OGG1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются: прямой праймер rs2304277 5'-TCTGGAATAGAGAAGGTGTTGGG-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs2304277 5'-GGACTCCTCCCCATCCCTA-3' (SEQ ID NO 2), rs2304277-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)AGTTACTGTGTGCCCAG(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs2304277-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)AGTTACTGTGTGCCCAA(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4), при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs2304277-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs2304277-A/A детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs2304277-G/A наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена OGG1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.