Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs71327329-A и rs71327329-G гена ZNRF3, кодирующего Е3 убиквитин-протеинлигазу [Hao HX, Xie Y, Zhang Y, Charlat O, Oster E, Avello M, Lei H, Mickanin C, Liu D, Ruffner H, Mao X, Ma Q, Zamponi R, Bouwmeester T, Finan PM, Kirschner MW, Porter JA, Serluca FC, Cong F. ZNRF3 promotes Wnt receptor turnover in an R-spondin-sensitive manner. Nature. 2012 Apr 29;485(7397):195-200. doi: 10.1038/nature11019]. Анализ результатов исследований последних лет установил вовлеченность ZNPF3 в развитие рака коры надпочечников [Brondani VB, Lacombe AMF, Mariani BMP, Montenegro L, Soares IC, Bezerra-Neto JE, Tanno FY, Srougi V, Chambo JL, Mendonca BB, Almeida MQ, Zerbini MCN, Fragoso MCBV. Low Protein Expression of both ATRX and ZNRF3 as Novel Negative Prognostic Markers of Adult Adrenocortical Carcinoma. Int J Mol Sci. 2021 Jan 27;22(3):1238. doi: 10.3390/ijms22031238] и предстательной железы [Fraser M, Livingstone J, Wrana JL, Finelli A, He HH, van der Kwast T, Zlotta AR, Bristow RG, Boutros PC. Somatic driver mutation prevalence in 1844 prostate cancers identifies ZNRF3 loss as a predictor of metastatic relapse. Nat Commun. 2021 Oct 29;12(1):6248. doi: 10.1038/s41467-021-26489-0]. В этой связи полиморфный вариант rs71327329 (A>G) представляет значительный интерес для анализа риска развития рака надпочечников и предстательной железы в группе лиц с наследственной отягощенностью, однако в настоящее время не найден простой, быстрый и недорогой метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs71327329.

Методом, с помощью которого возможно осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs71327329 является секвенирование по Сэнгеру, также известный как метод обрыва цепи. Он используется для определения любых изменений нуклеотидной последовательности, впервые предложенный Ф. Сэнгером в 1977 году. В настоящее время широко используется для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека, так как достаточно точен [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs71327329 гена ZNRF3 возможно методом секвенирования следующего поколения [Vatrano S, Volante M, Duregon E, Giorcelli J, Izzo S, Rapa I, Votta A, Germano A, Scagliotti G, Berruti A, Terzolo M, Papotti AM. Detailed genomic characterization identifies high heterogeneity and histotype-specific genomic profiles in adrenocortical carcinomas. Mod Pathol. 2018 Aug;31(8):1257-1269. doi: 10.1038/s41379-018-0042-6], для которого необходимы секвенатор Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM, ThermoFisher Scientific) и специальная панель целевых праймеров AmpliSeq, разработанных с использованием программного обеспечения AmpliSeq версии 4.0 (ThermoFisher Scientific). Для каждой мультиплексной ПЦР-амплификации использовали 25 нанограммов геномной ДНК. Качество библиотеки оценивалось с помощью электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), а библиотеки, прошедшие этот этап, подвергались эмульсионной ПЦР, выполняемой с помощью системы OneTouch2 (ThermoFisher Scientific). Библиотеки загружали на Ion 318chipv2, а затем секвенировали на Ion PGM (ThermoFisher Scientific). Анализ данных, включая сопоставление с референсным геномом и определение вариантов, проводился с использованием программного обеспечения Torrent Suite v.5.0 (ThermoFisher Scientific). Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs71327329 гена ZNRF3, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является высокая стоимость оборудования, комплектов реагентов и чипов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке оперативного, удобного и финансово выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что для генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, используются: прямой праймер ZNRF3-F 5'-TGCACTGATGTTCATACCTTGA-3', обратный праймер ZNRF3-R 5'-GGGCCAAAACTGGGAGATTC-3', ZNRF3-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-TAAAATGGAGCAGATCCAA-RTQ1-3′, ZNRF3-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX- TAAAATGGAGCAGATCCAG-BHQ-3′, при этом для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК (генотип rs71327329-A/A) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК (генотип rs71327329-G/G) детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца (генотип rs71327329-A/G) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена ZNRF3 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена ZNRF3 длиной 151 пар нуклеотидов, кодирующие аллели rs71327329-A и rs71327329-G гена ZNRF3. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs71327329 гена ZNRF3 при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs71327329-A/A показаны оранжевым цветом, генотипы rs71327329-A/G показаны зеленым цветом, генотипы rs71327329-G/G показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена ZNRF3 длиной 151 пар нуклеотидов: прямой праймер ZNRF3-F 5'-TGCACTGATGTTCATACCTTGA-3' и обратный праймер ZNRF3-R 5'-GGGCCAAAACTGGGAGATTC-3', ZNRF3-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM- TAAAATGGAGCAGATCCAA-RTQ1-3′, ZNRF3-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-TAAAATGGAGCAGATCCAG-BHQ-3′, подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена ZNRF3 (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Explore?db=core;r=22:28930859-28931859;v=rs71327329;vdb=variation;vf=186242171), включающей в положении chr22:28931359 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs71327329 (A>G). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Праймеры ZNRF3-F и ZNRF3-R инициируют амплификацию участка гена ZNRF3, включающего локус rs71327329, длиной 151 пар нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=54°С и элонгации 60 сек при 62°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs71327329-A и rs71327329-G гена ZNRF3 проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК (генотип rs71327329-A/A) детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК (генотип rs71327329-G/G) детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготного образца (генотип rs71327329-A/G) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена ZNRF3 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 71,6% людей являлись гомозиготами по аллелю A (генотип rs71327329-A/A), 2,1% людей - гомозиготами по аллелю G (генотип rs71327329-G/G), 26,3% - гетерозиготами (генотип rs71327329-A/G). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа 16 минут) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Образец ДНК добровольца П. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=54°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs71327329-G, что соответствует генотипу rs71327329-G/G ZNRF3.

Пример 2. Образец ДНК добровольца Г. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=54°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs71327329-A, и аллеля rs71327329-G, что соответствует гетерозиготному генотипу rs71327329-A/G ZNRF3.

Пример 3. Образец ДНК добровольца Н. из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: денатурация 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, состоящая из денатурации 15 сек при 95°С, отжига 30 сек при t=54°С и элонгации 60 сек при 62°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs71327329-A, что соответствует генотипу rs71327329-A/A ZNRF3.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК добровольцев П., Г. и Н. по однонуклеотидному варианту rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа 16 минут сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC

"-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-03-30" softwareVersion="2.3.0"

softwareName="WIPO Sequence" fileName="rs71327329 .xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023131657/10/(070118)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-02</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023131657/10/(070118)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-02</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования «Курский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской

Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования однонуклеотидного

варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной

реакции в режиме реального времени </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcactgatgttcataccttga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggccaaaactgggagattc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taaaatggagcagatccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taaaatggagcagatccag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. Способ включает использование разработанных олигонуклеотидных праймеров. Технический результат заключается в разработке оперативного и удобного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs71327329 (A>G) гена ZNRF3 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются:

прямой праймер ZNRF3-F 5'-TGCACTGATGTTCATACCTTGA-3',

обратный праймер ZNRF3-R 5'-GGGCCAAAACTGGGAGATTC-3',

ZNRF3-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-FAM-TAAAATGGAGCAGATCCAA-RTQ1-3′,

ZNRF3-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-ROX-TAAAATGGAGCAGATCCAG-BHQ-3′,

при этом для гомозиготных по аллелю A образцов ДНК с генотипом rs71327329-A/A детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs71327329-G/G детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs71327329-A/G наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена ZNRF3 в анализируемом образце ДНК и соответственно генотип человека.