Способ получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека Российский патент 2024 года по МПК C12N5/07 C12N5/09 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в области биомедицинских исследований и разработок для поиска новых подходов к лечению социально значимых заболеваний. Изобретение позволяет получить стандартизированную и способную к пролонгированному культивированию тканеинженерную модель опухолевой ткани, в которой в качестве 3D скаффолда использован криопреципитат, а в качестве клеточного компонента использованы опухолевые клеточные линии или культуры плоскоклеточного рака головы и шеи или не подверженные экспансии ex vivo клетки, изолированные из опухолевой ткани пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи.

Уровень техники

Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения в 2019 году онкологические заболевания стали лидирующей причиной смерти людей в возрасте от 30 до 70 лет в 57 развитых и развивающихся странах мира; прогнозы предполагают, что к 2040 году количество умерших от этой группы болезней превысит 16 млн в год [1, 2]. В последние годы зафиксировано увеличение выживаемости пациентов со злокачественными новообразованиями, однако в большей мере это связано с усовершенствованием методов диагностики, которые позволяют выявить заболевание на ранних стадиях, а не с прорывами в эффективности лечения, даже несмотря на значительные достижения в сфере противоопухолевой терапии [2].

Плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) входит в десятку наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире: для этого типа опухоли характерны поздняя диагностика, быстрое прогрессирование и резистентность к противоопухолевым стратегиям лечения [3]. Отчасти это связано с особенностями анатомического расположения, которое усложняет выполнение радикального хирургического вмешательства. Кроме того, у пациентов с ПРГШ наблюдается высокая вариабельность реакции на лучевое и лекарственное лечение, а на поздних стадиях большинству пациентов требуется комбинация хирургического вмешательства, лучевой терапии и химиотерапии [4]. Но даже при использовании нескольких видов противоопухолевого лечения частота рецидивов ПРГШ достигает 50% [5].

До сих пор не существует стандартных биомаркеров ответа ПРГШ на противоопухолевую терапию, что связано с недостатком релевантных прогностических моделей ПРГШ. Надежные доклинические in vitro модели имеют решающее значение для лучшего понимания молекулярных механизмов, участвующих в развитии резистентности к лечению и прогрессировании ПРГШ, а также для разработки более эффективных терапевтических стратегий [6].

Таким образом, к настоящему времени в экспериментальной и клинической онкологии сформировался запрос на создание доступной, воспроизводимой и релевантной in vitro доклинической модели ПРГШ. Известно несколько аналогичных по своему назначению изобретений, представляющих собой способы получения клеточных моделей ПРГШ человека.

Первичные опухолевые культуры из клинического материала пациентов с ПРГШ начали успешно выделять почти полвека назад [7]; сотни из них были позже иммортализованы и криобанкированы [8]. Преимущества 2D клеточных культур или линий в качестве максимально упрощенной in vitro модели опухоли несомненны: удобство использования, точный контроль за экзогенными факторами, экономическая доступность, широкий спектр применения. Примером является изобретение «Способ индукции цитотоксического действия на опухолевые клетки» (патент RU 2468447 С1, дата публикации 27.11.2012), которое описывает возможность применения первичной культуры, полученной из раковых клеток полости рта человека, для оценки противоопухолевой активности коллоидного раствора наночастиц серебра в сочетании с СВЧ-о6лучением. К недостаткам описанного способа in vitro моделирования ПРГШ следует отнести несоответствие модели 3D архитектуре нативной опухолевой ткани, обеспечивающей градиенты кислорода, нутриентов и биологически-активных веществ, что может привести к искажению результатов оценки лекарственной устойчивости клеток [9].

Для воспроизведения тканевого уровня организации опухолевые клетки трансплантируют подкожно или органотопически иммунодефицитным животным, получая объемные новообразования [10]. Возможность получения таких ксенотрансплантатов показана для многих клеточных линий ПРГШ и активно используется для изучения механизмов канцерогенеза или оценки эффективности противоопухолевых агентов. Одним из примеров использования такого типа модели является изобретение «Ингибиторы фукозидазы» (патент RU 2765202 С2, дата публикации 26.01.2022 г.), которое описывает способ оценки функциональной активности противоопухолевых агентов на модели ксенотрансплантатов подкожной опухоли, для чего 6-8 недельным мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) трансплантировали опухолевые линии, в том числе линии рака головы и шеи человека RPMI-2650, Detroit 562, FaDu или HSC-3. Однако описанный способ обладает рядом существенных недостатков и ограничений: иммунодефицитные животные требуют колоссальных финансовых и трудовых затрат, получение достаточного для исследовательской работы объема опухоли (150-300 мм³) занимает несколько недель, а часть запланированных исследований может оказаться и вовсе недоступными, например, вследствие высокой радиочувствительности некоторых линий мышей (NOD-SCID), исключающей проведение экспериментов с использованием лучевой терапии [11].

Попытка найти баланс между доступностью и воспроизводимостью простых моделей на основе 2D опухолевых культур и релевантностью трудоемких in vivo моделей в итоге привела исследователей к созданию трехмерных in vitro клеточных моделей. Многоклеточные сфероиды, собранные из опухолевых клеток, считаются наиболее простой и воспроизводимой in vitro моделью опухоли, имитирующей характерные для опухолевой ткани патофизиологические градиенты [12] и способной отражать ответ опухолевой ткани на терапию [13]. Для воспроизведения гетерогенного состава опухолевой ткани предложено использовать гетеросфероиды, состоящие из раковых клеток и дополнительного клеточного компонента, обычно ассоциированного с опухолевыми клетками in vivo, например, иммунных клеток, фибробластов или эндотелиальных клеток [14]. В настоящее время идет активная исследовательская работа с использованием гетеросфероидов, однако в большинстве случаев их применяют для моделирования опухолей печени и поджелудочной железы, и лишь несколько исследований выполнено с гетеросфероидами на основе опухолевых линий ПРГШ. Известно изобретение «Способ получения многокомпонентных сфероидов для in vitro моделирования высоко- и умеренно дифференцированного плоскоклеточного рака кожи или органов головы и шеи человека» (патент RU 2798548 С1, дата публикации 23.06.2023 г.), которое описывает способ получения трехмерных клеточных конструктов (сфероидов), в которых воспроизведены качественный состав и взаимное расположение основных клеточных компонентов плоско клеточного рака кожи или органов головы и шеи человека из нескольких клеточных культур или линий. Однако, сфероиды и гетеросфероиды, как и 2D клеточные культуры, в качестве in vitro модели обладают существенным недостатком, а именно нивелированием такого важного фактора туморогенеза как взаимодействие опухолевых клеток и внеклеточного матрикса, играющего ключевую роль в инициации и прогрессировании ПРГШ [15]. Кроме того, не все клетки способны формировать в условиях ультранизкой адгезии стабильные сфероиды, поскольку часть клеток погибает из-за отсутствия контакта с внеклеточным матриксом или культуральной подложкой (аноикис).

Наиболее близким к заявляемому является изобретение «Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи» (патент RU 2787378 С1, дата публикации 09.01.2023), которое позволяет получить трехмерные клеточные конструкты (органоиды) из плоскоклеточных опухолей органов головы и шеи с использованием гелированной аутоплазмы, выступающей в роли субститута ксеногенного матрикса базальной мембраны, традиционно используемого для получения органоидов. К достоинствам данного изобретения стоит отнести возможность получения in vitro модели, обладающей высокой генетической и фенотипической схожестью с нативной тканью. Однако существенным недостатком указанного способа является значительная вариабельность полученных клеточных моделей по таким параметрам как линейные размеры, клеточный состав отдельного органоида и возможность пролонгированного культивирования, что существенно ограничивает возможность применения модели для рутинных in vitro исследований, предполагающих стандартизацию объектов воздействия.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой является отсутствие способа получения улучшенной трехмерной клеточной модели плоскоклеточного рака головы и шеи: стандартизированной, контролируемой, стабильной в условиях in vitro, доступной и простой в исполнении, но при этом сохранившей архитектонику нативной опухолевой ткани и обеспечивающей взаимодействие клеток и внеклеточного матрикса.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является возможность получения стандартизированной и способной к пролонгированному культивированию тканеинженерной in vitro модели опухолевой ткани, в которой в качестве 3D скаффолда используют криопреципитат, а в качестве клеточного компонента используют опухолевую клеточную линию или культуру плоскоклеточного рака головы и шеи или не подверженные экспансии ex vivo клетки, изолированные из опухолевой ткани пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи.

Для достижения указанного технического результата в способе получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека клеточный компонент конструкции, в качестве которого используют культивированную в базовой ростовой среде, состоящей из DMEM/F12 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, иммортализованную линию плоскоклеточного рака головы и шеи или первичную клеточную культуру, полученную из биоптата опухолевой ткани плоскоклеточного рака головы и шеи, или суспензию клеток, изолированных из биоптата опухолевой ткани плоскоклеточного рака головы и шеи без последующей экспансии ех vivo, соединяют с матриксом конструкции, в качестве которого используют криопреципитат, полученный из хранившейся при -20°С плазмы крови путем ее размораживания при 3°С и концентрирования белков плазмы в 5 раз после осаждения при 5000g, из расчета 200 тысяч живых клеток на 100-300 мкл криопреципитата, инкубируют 2 минуты при комнатной температуре, затем доводят общий объем суспензии базовой ростовой средой до 2 мл, которые переносят в лунку 24-луночного планшета с ультранизким адгезивным покрытием, после чего помещают планшет на орбитальный шейкер, работающий в режиме 50 оборотов в минуту и расположенный в СО₂-инкубаторе, обеспечивающем стандартные условия культивирования, а именно 37°С, 5% СО₂ и насыщенную влажность, и культивируют не менее 2 суток.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется фигурами, где на фиг. 1 представлен внешний вид тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи, на фиг. 2 представлено распределение клеток в объеме конструкции при использовании различных объемный долей криопреципитата (5, 10 или 15%), на фиг. 3 представлено подтверждение жизнеспособности клеток в составе модели спустя 1 неделю после начала культивирования, на фиг. 4 представлено подтверждение стандартизации модели по количеству жизнеспособных клеток спустя 1 неделю после начала культивирования, на фиг. 5 приведено подтверждение сохранности СК17+ фенотипа опухолевых клеток спустя 1 неделю после начала культивирования, и таблицей 1, в которой представлены данные об успешном получении тканеинженерных моделей плоскоклеточного рака головы и шеи человека с использованием различных вариантов клеточных компонентов конструкции.

Позициями на фигурах обозначены: 1 - внешний вид тканеинженерной in vitro модели (макрофотография); 2 - микрофотография окрашенного гематоксилином и эозином криосреза модели, в которой в качестве скаффолда использован 5% (v/v) криопреципитат (панорамный снимок); 3 - микрофотография окрашенного маркером ядер DAPI криосреза модели, в которой в качестве скаффолда использован 5% (v/v) криопреципитат (панорамный снимок); 4 - микрофотография окрашенного гематоксилином и эозином криосреза модели, в которой в качестве скаффолда использован 10% (v/v) криопреципитат (панорамный снимок); 5 - микрофотография окрашенного маркером ядер DAPI криосреза модели, в которой в качестве скаффолда использован 10% (v/v) криопреципитат (панорамный снимок); 6 - микрофотография окрашенного гематоксилином и эозином криосреза модели, в которой в качестве скаффолда использован 15%) (v/v) криопреципитат (панорамный снимок); 7 - микрофотография окрашенного маркером ядер DAPI криосреза модели, в которой в качестве скаффолда использован 15% (v/v) криопреципитат (панорамный снимок); 8 - микрофотография культивируемой в течение 1 недели тканеинженерной модели, полученная с помощью флуоресцентной микроскопии, на которой синим цветом обозначена локализация ядер клеток, меченных красителем Hoechst 33258, красным цветом обозначена локализация мертвых клеток, окрашенных йодидом пропидия, зеленым цветом обозначена локализация живых клеток, окрашенных кальцеином AM (панорамный снимок); 9 - результаты ХТТ-теста, показывающие количественную оценку суммарной метаболической активности клеточного компонента культивируемой в течение 1 недели модели, измеренную при длине волны 450 нм (данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения); 10 - микрофотография окрашенного с антителами к маркеру опухолевых клеток СК17 криосреза модели, полученная с помощью флуоресцентной микроскопии при увеличении ×200.

Осуществление изобретения

В процессе проведения исследований была установлена весомость следующих шагов на различных этапах реализации изобретения:

• в качестве клеточного компонента используют опухолевые линии плоскоклеточного рака головы и шеи человека, первичные клеточные культуры плоскоклеточного рака головы и шеи, либо клетки, выделенные из опухолевого материала пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи;

• в качестве скаффолда (матрикса конструкции) используют криопреципитат - концентрат высокомолекулярных белков плазмы крови человека;

• для получения криопреципитата предварительно замороженную и хранившуюся при -20°С плазму размораживают при температуре 3°С, осаждают белки плазмы при 5000g, отбирают 80% супернатанта и ресуспендируют осадок белков в оставшихся 20% объема плазмы, концентрируя их тем самым в 5 раз;

• в качестве базовой ростовой среды используют DMEM/F12, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки;

• при сборке модели клетки сначала смешивают с криопреципитатом для обеспечения более эффективного образования контактов «клетка-внеклеточный матрикс», а уже после добавляют необходимое количество базовой ростовой среды;

• объемная доля криопреципитата в итоговой культуральной среде составляет от 5 до 15%, доля базовой ростовой среды, соответственно, составляет от 95 до 85%;

• конечная концентрация клеток в итоговой культуральной среде составляет 100 тысяч в 1 мл;

• в процессе создания модели используют культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием для предотвращения адгезии клеток к подложке;

• в процессе создания модели используют метод динамического культивирования для формирования стабильного цельного конструкта;

• необходимое для формирования in vitro модели время составляет 2 суток.

Соблюдение всех указанных особенностей процесса позволяет получить технический результат, а именно создать тканеинженерную in vitro модель плоскоклеточного рака головы и шеи человека.

Примеры реализации изобретения

Возможность объективного достижения технического результата подтверждена данными, приведенными в примере, представляющем собой протокол получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека (пример 1), в примере, содержащем сведения экспериментального характера, касающиеся характеристики модели, полученной с использованием представленного в примере 1 протокола (пример 2), а также в примере, содержащем сведения экспериментального характера, касающиеся возможности получения тканеинженерных моделей плоскоклеточного рака головы и шеи при использовании различных вариантов клеточного компонента конструкции (пример 3).

Пример 1. Протокол получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) человека

1. Получение клеточного компонента модели

1.1. Экспансия опухолевых линий ПРГШ

Для культивирования опухолевых клеток иммортализованных линий ПРГШ используют среду DMEM/F12, дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой (далее - базовая ростовая среда). После достижения субконфлуентного монослоя клетки открепляют от подложки 0,25%) раствором трипсина-ЭДТА. После осаждения при 200g клетки ресуспендируют в базовой ростовой среде, определяют их концентрацию и жизнеспособность с помощью клеточного анализатора, отбирают необходимое количество суспензии из расчета 200 тысяч живых клеток на единицу конструкции и вновь осаждают центрифугированием при 200g.

1.2. Экспансия первичных клеточных культур ПРГШ

Первичные клеточные культуры из биоптатов опухолевой ткани ПРГШ получают методом эксплантатов. Допускается пассирование клеточных культур для наращивания необходимого количества клеток. Для культивирования клеток используют базовую ростовую среду. После достижения субконфлуентного монослоя клетки открепляют от подложки 0,25%) раствором трипсина-ЭДТА. После осаждения при 200g клетки ресуспендируют в базовой ростовой среде, определяют их концентрацию и жизнеспособность с помощью клеточного анализатора, отбирают необходимое количество из расчета 200 тысяч живых клеток на единицу конструкции и вновь осаждают центрифугированием при 200g.

1.3. Изолирование суспензии клеток из биоптатов ПРГШ

Для получения суспензии клеток без последующей экспансии ex vivo биоптат опухолевой ткани ПРГШ измельчают механически с помощью хирургических инструментов и подвергают ферментативной дезагрегации. Суспензию клеток пропускают через сита с размером ячеек 100 мкм и отмывают от ферментов в 10-кратном растворе Хэнкса. После осаждения при 200g клетки ресуспендируют в базовой ростовой среде, определяют их концентрацию и жизнеспособность с помощью клеточного анализатора, отбирают необходимое количество из расчета 200 тысяч живых клеток на единицу конструкции и вновь осаждают центрифугированием при 200g.

2. Подготовка скаффолда (матрикса) модели

Кровь забирают в пробирку, содержащую 3,2% цитрата натрия в качестве антикоагулянта, и транспортируют в культуральную лабораторию. Для отделения плазмы пробирки центрифугируют при 1200g в течение 10 минут при 22°С. Плазму аккуратно отбирают, аликвотят по 1 мл и хранят при температуре -20°С до использования.

Размораживание плазмы проводят при температуре 3°С. После полного исчезновения кристаллов льда пробирку центрифугируют при 5000g в течение 15 минут при 3°С. Верхние 800 мкл супернатанта удаляют, осадок ресуспендируют в оставшихся 200 мкл, получая криопреципитат.

3. Соединение компонентов тканеинженерной модели

Клеточный осадок (200 тысяч клеток) ресуспендируют в 100-300 мкл криопреципитата и инкубируют 2 минуты при комнатной температуре, после чего доводят общий объем до 2 мл базовой ростовой средой.

Суспензию клеток переносят в лунки 24-луночного планшета с ультранизким адгезивным покрытием из расчета 2 мл среды, содержащей 200 тысяч живых клеток и от 5% до 15% (v/v) криопреципитата, на 1 лунку. Культуральную посуду помещают на орбитальный шейкер (50 оборотов/мин.), расположенный в СО₂-инкубаторе (стандартные условия 37°С, 5% СО₂, насыщенная влажность).

4. Формирование модели

Через 2 суток после начала культивирования происходит формирование цельной конструкции в центре лунки.

Длительность культивирования зависит от задач исследования.

Пример 2. Характеристика модели, полученной с использованием представленного в примере 1 Протокола получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека

При использовании протокола, представленного в примере 1, были успешно получены тканеинженерные in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) человека.

Внешний вид тканеинженерной модели ПРГШ представлен на фиг. 1.

Возможность контроля содержания внеклеточного матрикса и распределение клеток в объеме тканеинженерной конструкции при использовании различных объемный долей криопреципитата (5, 10 или 15%) представлено на фиг. 2.

Возможность пролонгированного культивирования, а именно подтверждение сохранности жизнеспособности клеток в составе тканеинженерной in vitro модели спустя 1 неделю после начала культивирования представлено на фиг. 3.

Подтверждение стандартизации модели по количеству жизнеспособных клеток на единицу конструкции спустя 1 неделю после начала культивирования представлено на фиг. 4.

Подтверждение сохранности СК17+ фенотипа опухолевых клеток спустя 1 неделю после начала культивирования представлено на фиг. 5.

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают воспроизводимость представленного в примере 1 Протокола, который позволяет получать стандартизированные тканеинженерные in vitro модели ПРГШ, в которых сохранена жизнеспособность клеточного компонента конструкции при длительном культивировании, присутствует возможность регулирования содержания внеклеточного матрикса, воспроизведена архитектоника опухолевой ткани ПРГШ.

Пример 3. Получение тканеинженерных in vitro моделей плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) при использовании различных вариантов клеточного компонента в соответствии с представленным в примере 1 Протоколом получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека

При воспроизведении протокола, представленного в примере 1, были успешно получены тканеинженерные in vitro модели с использованием различных вариантов клеточных компонентов конструкции: 1) иммортализованных опухолевых клеточных линий ПРГШ, 2) первичных клеточных культур ПРГШ, 3) изолированных из биоптата опухолевой ткани ПРГШ клеток, не подвергавшихся экспансии ex vivo (таблица 1).

Список литературы

1. https://www.iarc.who.int/

2. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019 Jan;69(1):7-34.

3. Barsouk A, Aluru JS, Rawla P, Saginala K, Barsouk A. Epidemiology, Risk Factors, and Prevention of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Med Sci (Basel). 2023 Jun 13;11(2):42.

4. Johnson DE, Burtness B, Leemans CR, Lui VWY, Bauman JE, Grandis JR. Head and neck squamous cell carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2020 Nov 26;6(l):92.

5. Nissi L, Suilamo S, Kytö E, Vaittinen S, Irjala H, Minn H. Recurrence of head and neck squamous cell carcinoma in relation to high-risk treatment volume. Clin Transl Radiat Oncol. 2021 Feb 3;27:139-146.

6. Chaves P, Garrido M, Oliver J, Pérez-Ruiz E, Barragan I, Rueda- Domínguez A. Preclinical models in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 2023 May;128(10):1819-1827.

7. Easty DM, Easty GC, Carter RL, Monaghan P, Butler LJ. Ten human carcinoma cell lines derived from squamous carcinomas of the head and neck. Br J Cancer. 1981 Jun;43(6):772-85.

8. Lin CJ, Grandis JR, Carey ТЕ, Gollin SM, Whiteside TL, Koch WM, Ferris RL, Lai SY. Head and neck squamous cell carcinoma cell lines: established models and rationale for selection. Head Neck. 2007 Feb;29(2):163-88.

9. Méry B, Rancoule C, Guy JB, Espenel S, Wozny AS, Battiston-Montagne P, Ardail D, Beuve M, Alphonse G, Rodriguez-Lafrasse C, Magné N. Preclinical models in HNSCC: A comprehensive review. Oral Oncol. 2017 Feb;65:51-56.

10. Tinhofer I, Braunholz D, Klinghammer K. Preclinical models of head and neck squamous cell carcinoma for a basic understanding of cancer biology and its translation into efficient therapies. Cancers Head Neck. 2020 Jul 23;5:9.

11.Cekanova M, Rathore K. Animal models and therapeutic molecular targets of cancer: utility and limitations. Drag Des Devel Ther. 2014 Oct 14;8:1911-21.

12. Costa EC, Moreira AF, de Melo-Diogo D, Caspar VM, Carvalho MP, Correia IJ. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 2016 Dec;34(8):1427-1441.

13. Mehta G, Hsiao AY, Ingram M, Luker GD, Takayama S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drag delivery and efficacy. J Control Release. 2012 Dec 10;164(2):192-204.

14. Vakhshiteh F, Bagheri Z, Soleimani M, Ahvaraki A, Pournemat P, Alavi SE, Madjd Z. Heterotypic tumor spheroids: a platform for nanomedicine evaluation. J Nanobiotechnology. 2023 Aug 2;21(1):249.

15. He Y, Deng P, Yan Y, Zhu L, Chen H, Li T, Li Y, Li J. Matrisome provides a supportive microenvironment for oral squamous cell carcinoma progression. J Proteomics. 2022 Feb 20;253:104454.

Способ получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека, характеризующемуся тем, что клеточный компонент конструкции, в качестве которого используют культивированную в базовой ростовой среде, состоящей из DMEM/F12 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, иммортализованную линию плоскоклеточного рака головы и шеи или первичную клеточную культуру, полученную из биоптата опухолевой ткани плоскоклеточного рака головы и шеи, или суспензию клеток, изолированных из биоптата опухолевой ткани плоскоклеточного рака головы и шеи без последующей экспансии ex vivo, соединяют с матриксом конструкции, в качестве которого используют криопреципитат, полученный из хранившейся при -20°С плазмы крови путем ее размораживания при 3°С и концентрирования белков плазмы в 5 раз после осаждения при 5000g, из расчета 200 тысяч живых клеток на 100-300 мкл криопреципитата, инкубируют 2 минуты при комнатной температуре, затем доводят общий объем суспензии базовой ростовой средой до 2 мл, которые переносят в лунку 24-луночного планшета с ультранизким адгезивным покрытием, после чего помещают планшет на орбитальный шейкер, работающий в режиме 50 оборотов в минуту и расположенный в СО₂-инкубаторе, обеспечивающем стандартные условия культивирования, а именно 37°С, 5% СО₂ и насыщенную влажность, и культивируют не менее 2 суток. Изобретение обеспечивает получение стандартизированной и способной к пролонгированному культивированию тканеинженерной in vitro модели опухолевой ткани и может найти применение в области биомедицинских исследований и разработок для поиска новых подходов к лечению социально значимых заболеваний. 5 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека, характеризующийся тем, что клеточный компонент конструкции, в качестве которого используют культивированную в базовой ростовой среде, состоящей из DMEM/F12 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, иммортализованную линию плоскоклеточного рака головы и шеи или первичную клеточную культуру, полученную из биоптата опухолевой ткани плоскоклеточного рака головы и шеи, или суспензию клеток, изолированных из биоптата опухолевой ткани плоскоклеточного рака головы и шеи без последующей экспансии ex vivo, соединяют с матриксом конструкции, в качестве которого используют криопреципитат, полученный из хранившейся при -20°С плазмы крови путем ее размораживания при 3°С и концентрирования белков плазмы в 5 раз после осаждения при 5000g, из расчета 200 тысяч живых клеток на 100-300 мкл криопреципитата, инкубируют 2 минуты при комнатной температуре, затем доводят общий объем суспензии базовой ростовой средой до 2 мл, которые переносят в лунку 24-луночного планшета с ультранизким адгезивным покрытием, после чего помещают планшет на орбитальный шейкер, работающий в режиме 50 оборотов в минуту и расположенный в СО₂-инкубаторе, обеспечивающем стандартные условия культивирования, а именно 37°С, 5% СО₂ и насыщенную влажность и культивируют не менее 2 суток.