Производные 7-гидроксикумарина, соединенные с остатками монотерпенов через триазольный линкер, как ингибиторы репродукции респираторно-синцитиального вируса (РСВ) Российский патент 2024 года по МПК A61K31/4192 A61K31/37 C07D405/12 C07D311/16 A61P31/14 

Изобретение относится к медицине и фармацевтике, а именно, к соединениям, обладающим антивирусным действием против респираторно-синцитиального вируса (РСВ).

РСВ представляет собой оболочечный РНК-вирус, принадлежащий к семейству Pneumoviridae [1]. РСВ поражает дыхательные пути и вызывает ежегодные эпидемии в холодное время года. Иммунитет к этому вирусу формируется нестойкий, вследствие чего возможно многократное инфицирование в течение жизни. Обычно РСВ вызывает заболевания простудного типа, однако совершенно другая картина развития респираторно-синцитиальной инфекции наблюдается у пациентов в возрасте до 2 лет (особенно у недоношенных младенцев), у детей с пороком сердца, а также у пожилых людей. Для этих возрастных категорий характерно поражение не только верхних, но и нижних дыхательных путей с развитием тяжелых бронхиолитов и пневмоний, вплоть до летального исхода [2-4]. У детей в возрасте до одного года РСВ является наиболее частой причиной бронхита и пневмонии [5]. Считается, что количество детей, погибающих от этого заболевания, составляет до 200 тыс. ежегодно [6].

Терапия респираторно-синцитиальной инфекции, как правило, симптоматическая, а вакцины от РСВ не существует. Одним из немногих вариантов лечения является терапия неспецифическим и малоэффективным противовирусным средством рибавирином [7, 8]. Также, для профилактического применения используется моноклональное антитело Паливизумаб, но оно дорого, демонстрирует лишь умеренную эффективность в снижении частоты госпитализаций и не допущено к использованию в России. Таким образом, поиск низкомолекулярных препаратов против РСВ является важной задачей медицинской химии.

Соединения монотерпен-кумаринового ряда обладают широким спектром биологической активности, в том числе и против вируса RSV [9-11]. Поставленная выше задача решается применением в качестве противовирусных средств производных 7-гидроксикумарина, сочлененных триазольным фрагментом с остатком монотерпена, общей формулы 1 и 2, включая их пространственные изомеры, в том числе, оптически активные формы:

где R¹ может быть CH_3, Ar; n = 1 или 2.

Целевые соединения общей формулы 1 и 2 могут быть получены взаимодействием пропаргиловых эфиров замещенных 7-гидроксикумаринов и его производных общей формулы 3 или 4 с соответствующими азидами, синтезированными из монотерпеноидов (Фиг. 1). Сами пропаргиловые эфиры получают из соответствующих 7-гидроксикумаринов взаимодействием с 3-бромпроп-1-ином.

Синтез геранил азида 5 [12], пара-азидометилкумола 6 [13], миртенил азидов 7 и 8 [14] и 3,7-диметил-1-азидоктана 9 [15] может быть осуществлен через получение соответствующих бромидов с последующим взаимодействием с азидом натрия, например, как показано на Фиг. 2.

Стоит отметить, что азид 8 при хранении изомеризуется по двойной связи. Для получения оптических изомеров можно использовать соответствующие энантиомеры стартовых монотерпеноидов.

На первой стадии биологических экспериментов определяли 50% цитотоксическую дозу (ЦТД₅₀) каждого препарата в культуре клеток HEp2. Далее оценивали противовирусную активность каждого препарата и определяли 50% ингибирующую концентрацию (ЭД₅₀), а также вычисляли химиотерапевтический индекс (ХТИ) - отношение ЦТД₅₀ к ЭД₅₀. Это соотношение отражает эффективность исследуемого соединения как противовирусного средства. Принято считать, что соединения, ХТИ которых превышает 10, проявляют противовирусную активность. Полученные данные сравнивали с соответствующими показателями рибавирина.

Исследования биологической активности соединений 1 и 2 показали их высокую эффективность, как ингибиторов репродукции РСВ (Таблица). Наиболее активные соединения 2а и 2в ингибируют репродукцию вируса с ЭД₅₀ в субмикромолярном диапазоне концентраций, более чем в 70 раз превосходя по активности препарат сравнения рибавирин.

Таблица. Результаты тестирования соединений общей формулы 1 и 2 в отношении РСВ

Соединение Структура ЦТД₅₀, µM РСВ ЭД₅₀, µM ХТИ 1а 14.74±2.29 <0.15 >96 1б 85.71±9.08 4.87±0.66 17 1в 43.44±2.65 4.19±0.66 10 1г 13.67±1.76 <0.15 >88 1д 12.29±1.1 0.33±0.13 37 2а 30.12±2.55 0.6±0.14 50 2б 264.43±20.54 1.65±0.19 160 2в 279.09±22.6 0.46±0.09 605 Рибавирин 16768.36±1248.93 127.35±27.44 132

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Общая методика синтеза соединений 1а - 1д и 2а - 2в.

К 0.72 ммоль соединения 3 или 4 в 16 мл эквивалентной по объему смеси воды и трет-бутилового спирта, нагретых до 45°С прибавляли 0.18 ммоль пентагидрата сульфата меди и 0.36 ммоль аскорбата натрия, после чего реакционную смесь перемешивали 15 минут. По истечении этого времени в раствор добавляли 1.08 ммоль одного из соединений 5 - 9 после чего, перемешивание продолжали 36 часов при поддержании температуры в 45°С. По окончании реакции проводили экстракцию этилацетатом. Отобранную органическую фазу промывали водой, высушивали над Na₂SO₄ и упаривали. Полученный продукт 1а - 1д или 2а - 2в очищали методом колоночной хроматографии.

Пример 2. Синтез 7-((1-(2,6-диметилгепта-1,5-диен-1-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-4-метил-2H-хромен-2-она 1а.

Соединения 1а и 1a’ получали взаимодействием азида 5 и кумарина 3а по методике, приведенной в примере 1. Продукты 1а и 1а’ выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 1а составил 43% в пересчете на исходный кумарин, выход продукта 1a’ составил 22%.

1a: Твердое вещество. Т_пл 84.6 - 88.6 °C. Найдено m/z=393.2049 [M]⁺ (C₂₃H₂₇O₃N₃)⁺. Вычислено: 393.2047.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ) 1.52 (s, 3H-C(23)), 1.60 (s, 3H-C(22)), 1.72 (s, 3H-C(17)), 1.99 - 2.10 (m, 4H-C(18, 19)), 2.32 (d, J = 1 Hz, 3H-C(10)), 4.93 (d, J = 7.3 Hz, 2H-C(14)), 4.95 - 5.03 (m, 1H-C(20)), 5.16 (s, 2H-C(11)), 5.37 (t, J = 7.3 Hz, 1H-C(15)), 6.05 (q, J = 1.4 Hz, 1H-C(3)), 6.82 (d, J = 2.6 Hz, 1H-C(9)), 6.88 (dd, J = 2.5, 8.8 Hz, 1H-C(7)), 7.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H-C(6)), 7.60 (s, 1H-C(13)).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃, δ) 16.20 (q, C-17), 17.45 (q, C-22), 18.41 (q, C-10), 25.43 (q, C-23), 25.76 (t, C-19), 39.08 (t, C-18), 47.74 (t, C-14), 62.03 (t, C-11), 101.72 (d, C-9), 111.84 (d, C-3), 112.11 (d, C-7), 113.67 (s, C-5), 116.48 (d, C-15), 122.21 (d, C-13), 123.15 (d, C-20), 125.45 (d, C-6), 131.86 (s, C-21), 142.54 (s, C-12), 143.35 (s, C-16), 152.30 (s, C-4), 154.76 (s, C-1), 160.88 (s, C-2,8).

1a’: Твердое вещество. Т_пл 57°C, с разложением. Найдено m/z=393.2049 [M]⁺ (C₂₃H₂₇O₃N₃)⁺. Вычислено: 393.2047.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ) 1.55 (s, 3H-C(23)), 1.63 (s, 3H-C(22)), 1.77 (s, 3H, C(17), 2.08 (q, J = 7.3 Hz, 2H-C(19)), 2.17 (t, J = 7.3 Hz, 2H-C(18)), 2.35 (s, 3H-C(10)), 4.92 (d, J = 7.4 Hz, 2H-C(14)), 5.03 (t, J = 7.2 Hz, 1H-C(20)), 5.19 (s, 2H-C(11)), 5.39 (t, J = 7.4 Hz, 1H-C(15)), 6.08 (q, J = 2.5 Hz, 1H-C(3)), 6.85 (d, J = 2.8 Hz, 1H-C(9)), 6.90 (dt, J = 2.4, 8.7 Hz, 1H-C(7)), 7.46 (dd, J = 2.1, 8.8 Hz, 1H-C(6)), 7.60 (s, 1H-C(13)).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃, δ) 17.50 (q, C-22), 18.47 (q, C-10), 23.20 (q, C-17), 25.52 (q, C-23), 26.01 (t, C-19), 31.86 (t, C-18), 47.67 (t, C-14), 62.11 (t, C-11), 101.83 (d, C-9), 111.95 (d, C-3), 112.17 (d, C-7), 113.76 (s, C-5), 117.33 (d, C-15), 122.21 (d, C-13), 122.90 (d, C-20), 125.50 (d, C-6), 132.52 (s, C-21), 142.66 (s, C-12), 143.26 (s, C-16), 152.33 (s, C-4), 154.85 (s, C-1), 160.96 (s, C-2, 8).

Пример 3. Синтез 7-((1-(4-изопропилбензил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-4-фенил-2H-хромен-2-она 1б.

Соединение 1б получали взаимодействием азида 6 и кумарина 3б по методике, приведенной в примере 1. Продукт 1б выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 1б составил 76%.

Твердое вещество. Т_пл 143.6-145.6 °C. Найдено m/z=451.1887 [M]⁺ (C₂₈H₂₅O₃N₃)⁺. Вычислено: 451.1890.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ) 1.21 (d, J = 6.9 Hz, 6H-C(27, 28)), 2.88 (sp, J = 6.9 Hz, 1H-C(26)), 5.21 (s, 2H-C(16)), 5.49 (s, 2H-C(19)), 6.20 (s, 1H-C(3)), 6.84 (dd, J = 2.5, 9.0 Hz, 1H-C(7)), 6.95 (d, J = 2.5 Hz, 1H-C(9)), 7.16 - 7.26 (m, 4H-C(21, 22, 23, 24)), 7.37 (d, J = 8.9 Hz, 1H-C(6)), 7.39 - 7.44 (m, 2H-C(11, 15)), 7.45 - 7.53 (m, 3H-C(12, 13, 14)), 7.56 (s, 1H-C(18)).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃ δ) 23.75 (q, C-27, 28), 33.71 (d, C-26), 53.99 (t, C-19), 62.16 (t, C-16), 102.12 (d, C-9), 112 (d, C-3), 112.32 (d, C-7), 112.81 (s, C-5), 122.75 (d, C-18), 127.11 (d, C-21, 25), 128 (d, C-22, 24), 128.14 (d, C-6), 128.22 (d, C-11, 15), 128.7 (d, C-12, 14), 129.49 (d, C-13), 131.44 (s, C-20), 135.29 (s, C-10), 143.05 (s, C-17), 149.66 (s, C-23), 155.58 (s, C-4), 155.65 (s, C-1), 160.99 (s, C-2), 161.11 (s, C-8).

Пример 4. Синтез 7-((1-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-4-фенил-2H-хромен-2-она 1в.

Соединение 1в получали взаимодействием азида 7 и кумарина 3б по методике, приведенной в примере 1. Продукт 1в выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 1в составил 64%.

Аморфное вещество. = +10.98 (с=0.46, CHCl₃). Найдено m/z=452.1962 ([M-1H]⁺-C₂₈H₂₆O₃N₃)⁺. Вычислено: 452.1969).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ) 0.77 (s, 3H-C(27)), 1.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H-C(26a)), 1.16 (s, 3H-C(28)), 1.98 (td, J = 1.6, 5.6 Hz, 1H-C(25)), 2.08 (tdt, J = 3.2, 5.0, 6.6 Hz, 1H-C(23)), 2.18 - 2.39 (m, 3H-C(22, 26b)), 4.85 (q, J = 1.5 Hz, 2H-C(19)), 5.25 (s, 2H-C(16)), 5.59 (tq, J = 1.4, 3.0 Hz, 1H-C(21)), 6.20 (s, 1H-C(3)), 6.85 (dd, J = 2.5, 8.9 Hz, 1H-C(7)), 6.96 (d, J = 2.5 Hz, 1H-C(9)), 7.37 (d, J = 8.9 Hz, 1H-C(6)), 7.38 - 7.42 (m, 2H-C(11, 15)), 7.45 - 7.52 (m, 3H-C(12, 13, 14)), 7.58 (s, 1H-C(18)).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃, δ) 20.71 (q, C-27), 25.64 (q, C-28), 31.07 (t, C-22), 31.44 (t, C-26), 37.78 (s, C-24), 40.15 (d, C-23), 43.15 (d, C-25), 55.25 (t, C-19), 62.18 (t, C-16), 102.23 (d, C-9), 111.94 (d, C-3), 112.35 (d, C-7), 112.76 (s, C-5), 122.61 (d, C-18), 123.15 (d, C-21), 127.96 (d, C-6), 128.18 (d, C-11, 15), 128.68 (d, C-12, 14), 129.48 (d, C-13), 135.26 (s, C-10), 141.67 (s, C-20), 142.9 (s, C-17), 155.58 (s, C-4), 155.61 (s, C-1), 160.97 (s, C-2), 161.06 (s, C-8).

Пример 5. Синтез 7-((1-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-4-фенил-2H-хромен-2-она 1г.

Соединение 1г получали взаимодействием азида 8 и кумарина 3б по методике, приведенной в примере 1. Продукт 1г выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 1г составил 60%.

Аморфное вещество. = -10.22 (c=0.45, CHCl₃). Найдено m/z=452.1970 [M-1H]⁺ (C₂₈H₂₆O₃N₃)⁺. Вычислено: 452.1969.

Спектры ¹H и ¹³C соответствуют спектрам другого энантиомера, соединения 1в.

Пример 6. Синтез 7-((1-(3,7-диметилокта-2,6-диен-1-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-4-фенил-2H-хромен-2-она 1д.

Соединения 1д и 1д’ получали взаимодействием азида 5 и кумарина 3б по методике, приведенной в примере 1. Смесь изомеров 1д и 1д’ выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта составил 66%, транс-изомер преобладает с соотношением 2:1.

Смесь изомеров представляет собой аморфное вещество. Найдено m/z=455.2203 [M]⁺ (C₂₈H₂₉O₃N₃)⁺. Вычислено: 455.2205.

1д: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δ) 1.56 (s, 3H-C(28)), 1.65 (s, 3H-C(27)), 1.76 (s, 3H-C(22)), 2.06 - 2.14 (m, 4H-C(23, 24)), 4.97 (d, J = 7.3 Hz, 2H-C(19)), 5.00 - 5.09 (m, 1H-C(25)), 5.23 (s, 2H-C(16)), 5.42 (t, J = 7.4 Hz, 1H-C(20)), 6.20 (s, 1H-C(3)), 6.87 (dd, J = 2.5, 8.8 Hz, 1H-C(7)), 6.98 (d, J = 2.3 Hz, 1H-C(9)), 7.38 (d, J = 8.9 Hz, 1H-C(6)), 7.39 - 7.43 (m, 2H-C(11, 15)), 7.45 - 7.53 (m, 3H-C(12, 13, 14)), 7.59 (s, 1H-C(18)).

¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃, δ) 16.34 (q, C-22), 17.59 (q, C-27), 25.57 (q, C-28), 25.9 (t, C-24), 39.23 (t, C-23), 47.9 (t, C-19), 62.25 (t, C-16), 102.19 (d, C-9), 112.01 (d, C-3), 112.31 (d, C-7), 112.83 (d, C-6), 116.54 (d, C-20), 122.19 (d, C-18), 123.26 (d, C-25), 128.01 (s, C-5), 128.23 (d, C-11, 15), 128.71 (d, C-12, 14), 129.5 (d, C-13), 132.08 (s, C-26), 135.32 (s, C-10), 142.68 (s, C-17), 143.61 (s, C-21), 155.61 (s, C-4), 155.68 (s, C-1), 161.02 (s, C-2), 161.19 (s, C-8).

1д’: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δ) 1.58 (s, 3H-C(28)), 1.65 (s, 3H-C(27)), 1.79 (s, 3H-C(22)), 2.06 - 2.14 (m, 2H-C(24)), 2.18 (t, J = 7.4 Hz, 2H-C(23)), 4.94 (d, J = 7.3 Hz, 2H-C(19)), 5.00 - 5.09 (m, 1H-C(25)), 5.23 (s, 2H-C(16)), 5.42 (t, J = 7.4 Hz, 1H-C(20)), 6.20 (s, 1H-C(3)), 6.87 (dd, J = 2.5, 8.8 Hz, 1H-C(7)), 6.98 (d, J = 2.3 Hz, 1H-C(9)), 7.38 (d, J = 8.9 Hz, 1H-C(6)), 7.39 - 7.43 (m, 2H-C(11, 15)), 7.45 - 7.53 (m, 3H-C(12, 13, 14)), 7.61 (s, 1H-C(18)).

¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃, δ) 17.59 (q, C-27), 23.28 (q, C-22), 25.6 (q, C-28), 26.09 (t, C-24), 31.95 (t, C-23), 47.76 (t, C-19), 62.25 (t, C-16), 102.19 (d, C-9), 112.01 (d, C-3), 112.31 (d, C-7), 112.83 (s, C-5), 117.38 (d, C-20), 122.19 (d, C-18), 122.95 (d, C-25), 128.01 (d, C-6), 128.23 (d, C-11, 15), 128.71 (d, C-12, 14), 129.5 (d, C-13), 132.64 (s, C-26), 135.32 (s, C-10), 142.68 (s, C-17), 143.4 (s, C-21), 155.61 (s, C-4), 155.68 (s, C-1), 161.02 (s, C-2), 161.19 (s, C-8).

Пример 7. 3-((1-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6H-бензо[c]хромен-6-она 2а.

Соединение 2а получали взаимодействием азида 8 и кумарина 4а по методике, приведенной в примере 1. Продукт 2а выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 2а составил 80%.

Твердое вещество. Т_пл 75.8°C с последующим разложением. = -17.30 (c=0.55, CHCl₃). Найдено m/z=430.2122 [M-1H]⁺ (C₂₆H₂₈O₃N₃)⁺. Вычислено: 430.2125.

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃, δ) 0.67 (s, 3H-C(25)), 1.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H-C(24a)), 1.16 (s, 3H-C(26)), 1.73 - 1.79 (m, 2H-C(11)), 1.79 - 1.85 (m, 2H-C(12)), 1.98 (td, J = 1.6, 5.6 Hz, 1H-C(23)), 2.07 (ddt, J = 2.6, 5.7, 8.4 Hz, 1H-C(21)), 2.20 - 2.33 (m, 2H-C(20)), 2.31 - 2.36 (m, 1H-C(24b)), 2.52 (tt, J = 2.0, 6.3 Hz, 2H-C(10)), 2.71 (tt, J = 1.8, 6.5 Hz, 2H-C(13)), 4.84 (q, J = 1.6 Hz, 2H-C(17)), 5.21 (s, 2H-C(14)), 5.58 (tt, J = 1.6, 3.1 Hz, 1H-C(19)), 6.85 (d, J = 2.5 Hz, 1H-C(9)), 6.88 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H-C(7)), 7.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H-C(6)), 7.56 (s, 1H-C(16)).

¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃, δ) 20.73 (q, C-25), 21.23 (t, C-11), 21.53 (t, C-12), 23.71 (t, C-10), 25.07 (t, C-13), 25.68 (q, C-26), 31.11 (t, C-20), 31.48 (t, C-24), 37.82 (s, C-22), 40.24 (d, C-21), 43.24 (d, C-23), 55.25 (t, C-17), 62.19 (t, C-14), 101.85 (d, C-9), 111.99 (d, C-7), 114.09 (s, C-5), 120.73 (s, C-3), 122.52 (d, C-16), 123.1 (d, C-19), 124.09 (d, C-6), 141.78 (s, C-18), 143.21 (s, C-15), 147.01 (s, C-4), 153.22 (s, C-1), 159.76 (s, C-8), 161.9 (s, C-2).

Пример 8. Синтез 7-((1-(3,7-диметилоктил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-2,3-дигидроциклопента[c]хромен-4(1H)-она 2б.

Соединение 2б получали взаимодействием азида 9 и кумарина 4б по методике, приведенной в примере 1. Продукт 2б выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 2б составил 60%.

Твердое вещество. Т_пл 78.6 - 82.2 °C. Найдено m/z=423.2519 [M]⁺ (C₂₅H₃₃O₃N₃)⁺. Вычислено: 423.2516.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ) 0.82 (d, J = 6.6 Hz, 6H-C(24, 25)), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H-C(19)), 1.01 - 1.33 (m, 2H-C(17)), 1.07 - 1.32 (m, 2H-C(21)), 1.13 - 1.33 (m, 2H-C(20)), 1.17 - 1.23 (m, 2H-C(22)), 1.36 - 1.52 (m, 2H-C(23)), 1.61 - 1.79 (m, 1H-C(16a)), 1.85 - 2.00 (m, 1H-C(16b)), 2.10 - 2.23 (m, 2H-C(11)), 2.85 (t, J = 8.3 Hz, 2H-C(16)), 3.00 (t, J = 8.3 Hz, 2H-C(10)), 5.21 (s, 2H-C(13)), 6.90 (d, J = 8.2 Hz, 1H-C(7)), 6.91 (s, 1H-C(9)), 7.31 (d, J = 8.2 Hz, 1H-C(6)), 7.64 (s, 1H-C(15)).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃, δ) 19.09 (q, C-19), 22.36 (t, C-11), 22.4 (q, C-25), 22.5 (q, C-24), 24.33 (t, C-21), 27.73 (d, C-23), 30.14 (d, C-18), 30.19 (t, C-10), 31.88 (t, C-12), 36.66 (t, C-22), 37.15 (t, C-20), 38.9 (t, C-17), 48.6 (t, C-16), 62.11 (t, C-13), 101.77 (d, C-9), 112.14 (s, C-5), 112.66 (d, C-7), 122.67 (d, C-15), 124.63 (s, C-3), 125.58 (d, C-6), 142.88 (s, C-14), 155.38 (s, C-1), 156.13 (s, C-4), 160.27 (s, C-2), 160.3 (s, C-8).

Пример 9. Синтез 3-((1-(3,7-диметилокта-2,6-диен-1-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6H-бензо[с]хромен-6-она 2в.

Соединения 2в и 2в’ получали взаимодействием азида 5 и кумарина 4а по методике, приведенной в примере 1. Смесь изомеров 2в и 2в’ выделяли хроматографией на SiO₂. Выход продукта 2в составил 60%, транс-изомер преобладает с соотношением 20:1.

Смесь изомеров представляет собой твердое вещество с Т_пл 56.0 - 64.1°C. Найдено m/z=433.2356 [M]⁺ (C₂₆H₃₁O₃N₃)⁺. Вычислено: 433.2360.

2в: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, δ) 1.55 (s, 3H-C(26)), 1.63 (s, 3H-C(25)), 1.75 (s, 3H-C(20)), 1.69 - 1.88 (m, 4H-C(11, 12)), 2.01-2.14 (m, 4H-C(21, 22)), 2.45-2.54 (m, 2H-C(10)), 2.64 - 2.74 (m, 2H-C(13)), 4.95 (d, J = 7.3 Hz, 2H-C(17)), 4.97 - 5.07 (m, 1H-C(23)), 5.19 (s, 2H-C(14)), 5.36 - 5.44 (br.t, J = 7.4 Hz, 1H-C(18)), 6.85 (d, J = 2.4 Hz, 1H-C(9)), 6.89 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H-C(7)),7.42 (d, J = 8.8 Hz, 1H-C(6)), 7.58 (s, 1H-C(16)).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃, δ) 16.31 (q, C-20), 17.56 (q, C-25), 21.18 (t, C-11), 21.48 (t, C-12), 23.67 (t, C-10), 25.04 (t, C-13), 25.54 (q, C-26), 25.88 (t, C-22), 39.2 (t, C-21), 47.87 (t, C-17), 62.1 (t, C-14), 101.67 (d, C-9), 111.92 (d, C-7), 114.05 (s, C-5), 116.54 (d, C-18), 120.66 (s, C-3), 122.15 (d, C-16), 123.23 (d, C-23), 124.11 (d, C-6), 132.04 (s, C-24), 142.9 (s, C-15), 143.53 (s, C-19), 147.09 (s, C-4), 153.16 (s, C-1), 159.79 (s, C-8), 161.93 (s, C-2).

2в’: ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, δ) 1.57 (s, 3H-C(26)), 1.66 (s, 3H-C(25)), 1.75 (s, 3H-C(20)), 1.69 - 1.88 (m, 4H-C(11, 12)), 2.01 - 2.21 (m, 4H-C(21, 22)), 2.51 (t, J = 5.7 Hz, 2H-C(10)), 2.70 (t, J = 6.3 Hz, 2H-C(13)), 4.95 (d, J = 7.2 Hz, 2H-C(17)), 4.98 - 5.06 (m, 1H-C(23)), 5.21 (s, 2H-C(14)), 5.40 (t, J = 7.4 Hz, 1H-C(18)), 6.80 - 6.96 (m, 2H-C(7, 9)), 7.40 (d, J = 8.8 Hz, 1H-C(6)), 7.60 (d, J = 3.8 Hz, 1H-C(16)).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃, δ) 17.56 (q, C-25), 21.18 (t, C-11), 21.48 (t, C-12), 23.25 (q, C-20), 23.67 (t, C-10), 25.04 (t, C-13), 25.54 (q, C-26), 26.06 (t, C-22), 31.92 (t, C-21), 47.72 (t, C-17), 62.1 (t, C-14), 101.67 (d, C-9), 111.92 (d, C-7), 114.05 (s, C-5), 117.38 (d, C-18), 120.66 (s, C-3), 122.15 (d, C-16), 122.94 (d, C-23), 124.11 (d, C-6), 132.04 (s, C-24), 142.9 (s, C-15), 143.53 (s, C-19), 147.09 (s, C-4), 153.16 (s, C-1), 159.79 (s, C-8), 161.93 (s, C-2).

Пример 10. Изучение цитотоксичности соединений 1 и 2.

Препараты взвешивали в количестве 2 мг и растворяли в 100 мкл ДМСО. Далее доводили полученный раствор средой до концентрации 1000 мкг/мл, и готовили из него серию 2-кратных разведений.

Односуточную культуру клеток HEp2, выращенную на 96-луночных планшетах, концентрация клеток 3*10⁵/лунку планшета, проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. В работу отбирали планшеты, где сомкнутость клеток составляла 60-80%. В планшет вносили разведения препаратов в соответствующей концентрации в объеме 100 мкл в каждую лунку в 2 повторах на каждую тестируемую концентрацию. Планшеты инкубировали 24 часа при температуре 37°С в присутствии 5% СО₂.

Оценка жизнеспособности клеток велась при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). МТТ-тест основан на восстановлении МТТ (желтый водорастворимый тетразолиевый краситель) под действием дегидрогеназ живых клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется спектрофотометрически. Раствор МТТ готовили на поддерживающей среде в концентрации 0.5 мг/мл. Далее вносили 0.1 мл раствора МТТ в каждую лунку. После 1.5 часа контакта МТТ при 37°С при концентрации СО₂ 5% с клетками лунки сбрасывали МТТ и заливали 0.1 мл этилового спирта 96%, после чего оптическую плотность в лунках измеряли на ридере Victor 2 1440 (Perkin Elmer, США) при длине волны 535 нм.

Основываясь на полученных данных, рассчитывали ЦТД₅₀, то есть дозу препарата в лунке, при которой погибает 50% клеток.

Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 11. Изучение противовирусной активности соединений 1 и 2.

Для определения противовирусной активности в отношении респираторно-синцитиального вируса готовили серию 3-кратных разведений препаратов, начиная от ½ ЦТД₅₀, после чего наносили на культуру клеток НЕр-2 по 100 мкл на лунку в двойной концентрации и сразу же добавляли по 100 мкл вируса РСВ А в серии 10-кратных разведений, после чего снова инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С и 5% СО₂, далее вирус отмывали и снова наносили препараты в одинарной концентрации и инкубировали в течение 6 суток при температуре 37°С и 5% СО₂.

Для проведения иммуноферментного анализа (cell-ELIZA) клеточную культуру фиксировали холодным 80%-м ацетоном в течение 15 минут на -20°С, после чего ее промывали с помощью фосфатно-солевого буферного раствора с добавлением Tween 20 до 0.05 %. Далее на культуру наносили раствор первичных мышиных антител к белку F респираторно-синцитиального вируса, после чего инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при непрерывном перемешивании.

Далее клетки снова промывали буфером и наносили вторичные антимышиные антитела, после чего снова инкубировали в течение 2 часов при непрерывном перемешивании. Далее антитела отмывали и наносили субстрат-хромогенную смесь с тетраметилбензидином. Через 5 минут реакцию останавливали с помощью 0.1М серной кислоты и оценивали оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм. Лунки, в которых значение абсорбции превышало таковое в лунках с контролем клеток в два и более раза, считаются зараженными. Титр вируса считали по методу Рида и Менча.

На основании полученных данных рассчитывали значение ЭД₅₀ - дозу препарата, которая уменьшает инфекционную активность вируса вдвое, а также ХТИ- отношение ЦТД₅₀ к ЭД_50. Полученные результаты приведены в таблице.

Литература.

1. Afonso, C.L.; Amarasinghe, G.K.; Banyai K, et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Arch Virol. 2016, 161, 2351-2360.

2. Karron, R.A. Preventing respiratory syncytial virus (RSV) disease in children. Science, 2021, 372, 686-687.

3. Lozano, R.; Naghavi, M.; Foreman, K.; Lim, S.; Shibuya, K.; Aboyans, V.; et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet 2012, 380, 2095-2128.

4. Falsey, A.R.; Hennessey, P.A.; Formica, M.A.; Cox, C.; Walsh, E.E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 1749-1759.

5. Huang, H.; Chen, S.; Zhang, X.; Hong, L.; Zeng, Y.; Wu, B. Detection and clinical characteristics analysis of respiratory viruses in hospitalized children with acute respiratory tract infections by a GeXP-based multiplex-PCR assay. J Clin Lab Anal. 2020, 34, e23127.

6. Nair, H.; Nokes, D.J.; Gessner, B.D.; Dherani, M.; Madhi, S.A.; Singleton, R.J.; O'Brien, K.L.; Roca, A.; Wright, P.F.; Bruce, N.; Chandran, A.; Theodoratou, E.; Sutanto, A.; Sedyaningsih, E.R.; Ngama, M.; Munywoki, P.K.; Kartasasmita, C.; Simoes, E.A.; Rudan, I.; Weber, M.W.; Campbell, H. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet 2010, 375, 1545-1555.

7. Wainwright, C. Acute viral bronchiolitis in children - a very common condition with few therapeutic options. Paediatr. Respir. Rev. 2010, 11, 39-45.

8. Empey, K.M.; Peebles, R.S., Jr.; Kolls, J.K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin. Infect. Dis. 2010, 50, 1258-1267.

9. Khomenko, T.M.; Zarubaev, V.V.; Orshanskaya, I.R.; Kadyrova, R.A.; Sannikova, V.A.; Korchagina, D.V.; Volcho, K.P.; Salakhutdinov, N.F. Anti-influenza activity of monoterpene-containing substituted coumarins. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2017, 27, 2920-2925.

10. Khomenko, T.; Zakharenko, A.; Odarchenko, T.; Arabshahi, H.J.; Sannikova, V.; Zakharova, O.; Korchagina, D.; Reynisson, J.; Volcho, K.; Salakhutdinov, N.; Lavrik, O. New inhibitors of tyrosyl-DNA phosphodiesterase I (Tdp 1) combining 7-hydroxycoumarin and monoterpenoid moieties. Bioorg. Med. Chem. 2016, 24, 5573.

11. Khomenko T.M., Shtro A.A., Galochkina A.V., Nikolaeva Y.V., Petukhova G.D., Borisevich S.S., Korchagina D.V., Volcho K.P., Salakhutdinov N.F. Monoterpene-Containing Substituted Coumarins as Inhibitors of Respiratory Syncytial Virus (RSV) Replication. Molecules 2021, 26(24), 7493.

12. Giovani Simone, Singh Ritesh, Fasan Rudi. Efficient conversion of primary azides to aldehydes catalyzed by active site variants of myoglobin. Chemical Science 2016, 7, 234-239.

13. Yoon-Suk Lee, Sun Min Park, Hwan Mook Kim, Song-Kyu Park, Kiho Lee, Chang Woo Lee, Byeang Hyean Kim. C5-Modified nucleosides exhibiting anticancer activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2009, 9, 4688-4691

14. Concepción, O.; Belmar, J.; F. de la Torre, A.; M. Muñiz, F.; Pertino, M.W.; Alarcón, B.; Ormazabal, V.; Nova-Lamperti, E.; Zúñiga, F.A.; Jiménez, C.A. Synthesis and Cytotoxic Analysis of Novel Myrtenyl Grafted Pseudo-Peptides Revealed Potential Candidates for Anticancer Therapy. Molecules 2020, 25, 1911.

15. Kajitha Suthagara, Antony J. Fairbanks. A new way to do an old reaction: highly efficient reduction of organic azides by sodium iodide in the presence of acidic ion exchange resin. Chemical Communications 2017, 4.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики. Предложено применение производных 7-гидроксикумарина с триазольным фрагментом общей формулы 1 или 2, где R¹ представляет собой CH₃ или фенил, n = 1 или 2, в качестве ингибитора репродукции респираторно-синцитиального вируса. 2 ил., 1 табл., 11 пр.

Применение производных 7-гидроксикумарина с триазольным фрагментом общей формулы 1 или 2, включая их пространственные изомеры, в том числе оптически активные формы

где R¹ представляет собой CH₃ или фенил, n = 1 или 2, в качестве ингибитора репродукции респираторно-синцитиального вируса.