Способ изготовления биокерамики с использованием соединений кальция Российский патент 2024 года по МПК C04B35/117 C04B35/447 A61L27/12 A61L27/40 

Изобретение относится к биосовместимым композитным материалам на основе керамики и может быть использовано при изготовлении имплантов для регенеративной и реконструктивной костной хирургии.

Известен способ получения пористого биокерамического волластонита, в котором порошок из геля, полученного из растворов, помещают в графитовую пресс-форму и подпрессовывают при давлении 20,7 МПа, далее полученную заготовку помещают в вакуумную камеру и подвергают искровому плазменному спеканию (ИПС) (см. патент РФ № 2743834, МПК С04В 35/22, A61L 27/12, С04В 35/624, С04В 38/06, дата публикации 26.02.2021 г.).

Керамика, полученная указанным способом, отличается бактериальной предрасположенностью, вследствие чего возрастает риск развития инфекционного процесса при применении данного материала в импланталогии.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят способ получения композиционной керамики с биоактивными свойствами, включающий приготовление спекаемой смеси из оксида алюминия и материала на основе фосфата кальция (гидроксиапатита), формование изделия прессованием и спекание при температуре 900-1300°С (см. патент US5306673, МПК С04В35/10, дата публикации 26.04.1994 г.).

Готовое спеченное изделие содержит от 10 до 25 об.% материала на основе фосфата кальция.

Технология, описанная в прототипе, отличается относительно высокой максимальной температурой спекания, обуславливающей повышенные энергозатраты.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка технологии изготовления биокерамики с использованием соединений кальция.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в получении биокерамики, обладающей:

1. биосовместимыми и антибактериальными свойствами;

2. высокими физико-механическими характеристиками;

3. бимодальной мезо- и макропористой структурой.

Поставленная задача решается тем, что способ изготовления биокерамики с использованием соединений кальция, в котором смешивают порошок оксида алюминия с порошками оксида кальция и гидрофосфата кальция при соотношении в них Са/Р равном 1,66 в планетарной мельнице в течение 30 минут со скоростью 600 об./мин, причем порошки оксида алюминия, оксида кальция и гидрофосфата кальция берут в соотношении, обеспечивающем образование биоактивной фазы в количестве 50 масс.% от общей массы образующегося композитного материала, готовую спекаемую смесь помещают в графитовую пресс-форму и подпрессовывают при давлении 20,7 МПа, далее полученную заготовку помещают в вакуумную камеру и подвергают искровому плазменному спеканию, при котором давление прессования на образец составляет 50 МПа, скорость нагрева составляет 300°С/мин при температуре до 650°С и 90°С/мин при температуре не менее 650°С, образец выдерживают при температуре 1000°С в течение 5 минут и охлаждают до температуры 20-25°С.

Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

При этом отдельные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.

Признаки «порошки оксида алюминия, оксида кальция и гидрофосфата кальция берут в соотношении, обеспечивающем образование биоактивной фазы в количестве 50 масс.% от общей массы образующегося композитного материала» описывают компоненты спекаемой смеси и их соотношение между собой, причем выбор состава реакционной смеси (PC), состоящей из оксида кальция и гидрофосфата кальция, основывался на возможности инициирования «in situ» взаимодействия компонентов с образованием фазы кристаллического гидроксиапатита в составе А1₂О₃ непосредственно при его спекании в условиях ИПС по уравнению реакции:

4СаО + 6СаНР0₄ = Са,о(Р0₄)б(ОН)₂ + 2Н₂0 (1)

Известно, что керамика, содержащая в своем составе резорбируемые фазы, может участвовать в процессе восстановления кости за счет активации остеосинтеза, что доказано в ряде работ на примере синтеза А1₂0з (см. Nandha Kumar, Р.; Ferreira, Kannan, S. Phase Transition Mechanisms Involved in the Formation of Structurally Stable P-Ca3(P04)2-a-A1203 Composites. J. Eur. Ceram. Soc. 2017, 37, 2953-2963; Bezzina, S.; Khoshaim, A.B. Effects of the Sintering Process on the Different Properties of Alumina/Hydroxyapatite Nanobiocomposites. Appl. Phys. A 2021, 127,428, doi: 10.1007/s00339-021-04557- y; Djouallah, S.; Belhouchet, H.; Kenzour, A.; Kherifi, D. Sintering Behavior of Fluorapatite-Based Composites Produced from Natural Phosphate and Alumina. Ceram. Int. 2021, 47, 3553-3564, doi: 10.1016/j.ceramint.2020.09.202).

Одной из таких биоактивных фаз является гидроксиапатит (ГАП) (см. Stevens, М.М. Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Mater. Today 2008, 11, 18-25, doi: 10.1016/S1369-7021 (08)70086-5; Zhou, G.S.; Su, Z.Y.; Cai, Y.R.; Liu, Y.; Yan, W.; Hu, Q.; Tao, J.; Zhang, M.; Shi, Z.; Tang, R. Role of Hydroxyapatite Nanoparticle Size in Bone Cell Proliferation. J. Mater. Chem. 2007, 17, 3780, doi:10.1039/b705129h).

Например, дисперсный керамический композит Al₂O₃-ГАП, полученный гидротермальным синтезом (см. Vignesh Raj, S.; Rajkumar, M.; Meenakshi Sundaram, N.; Kandaswamy, A. Synthesis and Characterization of Hydroxyapatite/Alumina Ceramic Nanocomposites for Biomedical Applications. Bull. Mater. Sci. 2018, 41, 93, doi:10.1007/s12034-018-1612-4), проявляет превосходную совместимость (80%) с клетками, подобными остеобластам человека MG63.

Аналогично биокомпозиты Al₂O₃-ГАП превосходно согласуются с натуральными ксеногенными трансплантатами проявляя отличные биосовместимые свойства, доказанные при тестировании образцов в контакте с клеточными линиями L929 (см. Yelten, A.; Karal-Yilmaz, O.; Akguner, Z.P.; Bal-Ozturk, A.; Yilmaz, S. In-Vitro Bioactivity Investigation of Sol-Gel Derived Alumina-Bovine Hydroxyapatite (Bha) Composite Powders. Gazi Univ. J. Sci. 2020, 33, 690-700, doi:10.35378/gujs.541345).

Признаки «при искровом плазменном спекании скорость нагрева составляет 300 °С/мин при температуре до 650°С и 90°С/мин при температуре не менее 650°С, а давление прессования на образец составляет 50 МПа» описывают оптимальные режимные характеристики искрового плазменного спекания, обеспечивающие протекание основных реакций при «in situ» твердофазном взаимодействии реакционной смеси (CaO и CaHPO₄) в объеме спекаемого Al₂O₃.

На фиг. 1 показан гранулометрический состав спекаемой смеси.

На фиг. 2 приведено РЭМ изображение спекаемой смеси.

На фиг. 3 приведена карта распределения элементов (ЭДС анализ) спекаемой смеси по поверхности.

На фиг. 4 приведены результаты термогравиметрического анализа (на воздухе) спекаемой смеси.

На фиг. 5 приведены дилатометрические зависимости кинетики консолидации спекаемой смеси.

На фиг. 6 приведены дифрактограммы образцов биокерамики, полученных при различных температурах ИПС.

На фиг. 7 приведены кривые низкотемпературной (77°К) адсорбции-десорбции азота, снятые для образцов биокерамики, полученных при различных температурах ИПС:

а-а* - при температуре 900°C;

б-б* - при температуре 1000°C;

в-в* - при температуре 1100°C.

На фиг. 8 приведены РЭМ изображения образцов биокерамики, полученных при различных температурах ИПС:

а-а* - при температуре 900°C;

б-б* - при температуре 1000°C;

в-в* - при температуре 1100°C;

г-г* - при температуре 1200°C.

На фиг. 9 приведена карта распределения элементов (ЭДС анализ) по поверхности образцов биокерамики, полученных в результате ИПС при температуре 900°С.

На фиг. 10 приведены графики зависимости прочности при сжатии и относительной плотности от температуры спекания для образцов биокерамики, полученных при различных температурах ИПС.

На фиг. 11 показана микротвердость образцов биокерамики (полученных при различных температурах ИПС), измеренная при нагрузке HV0,1 (980,7 mN).

На фиг. 12 изображена процедура имплантации образцов биокерамики в мягкие ткани лабораторного животного: а - область имплантации; б - имплантация образцов биокерамики; в - выемка имплантированных образцов спустя 3 месяца.

На фиг. 13 изображены гистологические исследования соединительных капсул (при окраске гематоксилином и эозином и увеличении х1(Ю) после контакта с образцами биокерамики:

а - участок капсулы с умеренным фиброзом, утолщение внутренней оболочки капсулы за счет псевдоворсинок (показано стрелкой);

б - утолщение внутренней оболочки капсулы в месте интимного прикрепления импланта (показано стрелкой);

в - имплант, окруженный фиброзной капсулой с переходом в жировую ткань (показано стрелкой);

г - псевдоворсинки внутренней оболочки капсулы с формированием гигантоклеточной реакции.

На фиг. 14 приведена динамика формирования бактериальной пленки Pseudomonas aeruginosa на поверхности образцов керамики, полученных ИПС, в зависимости от времени инкубации: а-а** - Аl₂О₃ без добавок; б-б** - Аl₂О₃ с добавкой 50 масс.% ГАП; в-в** - синтетический ГАП.

Для приготовления спекаемой смеси использовали порошки оксида алюминия (чистота 99,98%), оксида кальция (чистота 99,98%) и гидрофосфата кальция (чистота 99,98%).

Заявляемый способ осуществляют на стандартном оборудовании.

На планетарной мельнице готовят спекаемую смесь, для чего порошок оксида алюминия смешивают с порошками оксида кальция и гидрофосфата кальция со скоростью 600 об./мин в течение 30 минут.

При этом порошки оксида алюминия, оксида кальция и гидрофосфата кальция берут в соотношении по массе 5: 1,7: 3,8, обеспечивающем образование биоактивной фазы в количестве 50 масс.% от общей массы образующегося композитного материала, а соотношение Са/Р в порошках оксида кальция и гидрофосфата кальция составляет 1,66.

Готовую спекаемую смесь массой 1 г помещают в графитовую пресс- форму (рабочий диаметр 10,5 мм), которую предварительно оборачивают в теплоизолирующую ткань для снижения потерь тепла при разогреве.

Для предотвращения припекания консолидируемого порошка к пресс- форме и плунжерам, а также для беспрепятственного извлечения полученного образца дополнительно используют графитовую фольгу толщиной 200 мкм.

Графитовую пресс-форму с размещенной в ней спекаемой смесью подпрессовывают при давлении 20,7 МПа, далее полученную заготовку помещают в вакуумную камеру (10-5 атм.) и подвергают искровому плазменному спеканию на установке SPS-515S фирмы «Dr.Sinter-LAB™» (Япония) при давлении прессования на образец 50 МПа.

Разогрев спекаемого материала осуществляли униполярным низковольтным импульсным током в режиме On/Off, с периодичностью 12 импульсов / 2 паузы (т.е. длительность пакета импульсов составляла 39,6 мс и пауза 6,6 мс) со скоростью 300°С/мин при температуре до 650°С и 90°С/мин при температуре не менее 650°С.

Температуру ИПС процесса контролировали с помощью оптического пирометра (нижний предел определения 650°С), сфокусированного на отверстии, расположенном на середине плоскости внешней стенке пресс- формы глубиной 5,5 мм.

Образец выдерживают при температуре 1000°С в течение 5 минут и охлаждают до температуры 20-25°С в течение 30 минут.

Геометрические размеры полученных образцов матриц цилиндрического типа: диаметр 10,3 мм, высота 4-6 мм (в зависимости от режимов ИПС).

Исследовали полученные образцы.

Гранулометрический анализ порошка проводили на лазерном анализаторе частиц Analysette-22 NanoTec/MicroTec/XT «Fritsch» (Германия) с числом измерений по 3 анализа для каждого образца, далее результаты усреднялись.

Идентификацию фаз полученных образцов осуществляли с помощью рентгенофазового анализа (РФА) CuKα-излучение, Ni-фильтр, средняя длина волны (λ) 1,5418 Å, диапазон углов съемки 10-80°, шаг сканирования 0,02°, скорость регистрации спектров - 5°/мин. на многоцелевом рентгеновском дифрактометре D8 Advance «Bruker AXS» (Германия).

Термогравиметрические кривые снимали на приборе DTG-60H «Shimadzu» (Япония) в платиновых тиглях с проколотой крышкой в токе сухого аргона (20 мл/мин) в интервале температур 35-1300°C и скорости нагрева 10°C/мин.

Удельную поверхность определи низкотемпературной адсорбцией азота при 77 К на приборе Autosorb IQ «Quantochrome» (США), для расчета результатов применяли модель БЭТ и BJH.

Механическую прочность образцов цилиндрической формы (диаметр 10,3 мм и высота 4-6 мм) определяли путем раздавливания со скоростью 0,5 мм/мин на разрывной машине Autograph AG-X plus 100 kN «Shimadzu» (Япония).

Изображения структуры исследуемых материалов были получены растровой электронной микроскопией (РЭМ) на приборе CrossBeam 1540 XB «Carl Zeiss» (Германия) с приставкой для энергодисперсионного спектрального анализа (ЭДС) «Bruker» (Германия).

Измерение удельной плотности (ρ_уд.) проводили методом гидростатического взвешивания на весах Adventurer™ «OHAUS Corporation» (США).

Микротвердость по Виккерсу (HV) определяли при нагрузке 0,2 Н на микротвердомере HMV-G-FA-D «Shimadzu» (Япония).

Прочность при сжатии (σ_сж) образцов цилиндрической формы (диаметр 10,3 мм и высота 4-6 мм) определяли путем раздавливания со скоростью 0,5 мм/мин на разрывной машине Autograph AG-X plus 100 кН «Shimadzu» (Япония).

Согласно данным гранулометрического состава (см. фиг.1), спекаемая смесь состоит из частиц широкой фракции с размером частиц в диапазоне 0,2-5 мкм (50 об. %) и 5-15 мкм (50 об. %).

Полидисперсность частиц спекаемой смеси подтверждена данными РЭМ (см. фиг.2).

На ЭДС карте (см. фиг.3) видно, что крупная фракция частиц спекаемой смеси представлена Al₂O₃, а мелкая фракция представляет собой частицы РС (CaO и CaHPO₄), равномерно распределенные согласно ЭДС карте распределения P и Ca.

Согласно данным термогравиметрического анализа (ТГА) установлено, что на начальном этапе термоокислительного прокаливания образца исходного порошка Al₂O₃ в составе с РС в пределах 100-120°С наблюдается убыль массы в пределах 4,5-5 масс.% на кривых ТГ и ДТГ при максимуме температуры 440°С на кривой ДТА, которая обусловлена удалением остаточной влаги из порошковой смеси (см. фиг.4).

Дальнейшее прокаливание приводит к изменению массы вещества в пределах 1 масс.%, максимум приходится на 680°С, что, вероятно, связано с частичной термической деструкцией ГАП с образованием ТКФ по реакции (2) (см. Ergun, C. Enhanced Phase Stability in Hydroxylapatite/Zirconia Composites with Hot Isostatic Pressing. Ceram. Int. 2011, 37, 935-942, doi:10.1016/j.ceramint.2010.11.001). В указанной работе отмечено, что температура и степень разложения ГАП зависят от газовой среды.

Общая убыль массы составляет около 8 масс.%.

Таким образом, полученные результаты подтверждают протекание реакции формирования ГАП и продуктов его распада в виде трикальцийфосфата (ТКФ) из исследуемой РС, в том числе в составе с Al₂O₃ при термообработке.

Анализ данных дилатометрии (см. фиг.5), полученных в ходе исследования процесса консолидации образцов исходных порошков Al₂O₃ в составе с РС в условиях ИПС в интервале температур 900-1200°С позволил установить, что спекание керамики с одновременным «in situ» взаимодействием компонентов РС протекает в две основные стадии.

Стадия I начинается в пределах 1-2 минут разогрева и прессования при температуре до 680°С. Стадия I короткая по длительности и имеет низкую скорость усадки порошка. Данная стадия обусловлена перегруппировкой и упаковкой частиц под механическим воздействием прессования, а также химическим взаимодействием компонентов РС с образованием ГАП.

Стадия II основана на уплотнении при термическом воздействии на спекаемый порошок наряду с приложенным давлением прессования. Температурный интервал составляет 850-1200°С, а временной промежуток 4-10 минут от начала процесса. Видно, что наиболее высокая скорость усадки порошка достигается при 1200°С, но не выходит на максимум. Стадия II обусловлена общим спеканием порошка Al₂O₃ в составе с образованным ГАП, а также с продуктами его частичной деструкции, в частности ТКФ.

По данным РФА (см. фиг.6) установлено, что консолидация спекаемой смеси, состав которой представлен основными фазами Al₂O₃, CaO и CaHPO₄, протекает с инициированием химического взаимодействия не только компонентов РС, но и Al₂O₃. Фазовый состав биокерамики включает смесь ТКФ и ГАП.

При температуре 900°С наряду с образованной фазой ГАП в составе Al₂O₃ наблюдается некоторая примесь фазы CaO. Наличие данной фазы оксида обусловлено, во-первых, его неполным расходованием в ходе реакции по уравнению реакции (1) при образовании ГАП из-за высокой скорости разогрева в условиях ИПС, а во-вторых, он может быть продуктом частичной деструкции ГАП по уравнению реакции (2).

При температуре 1200°С наблюдается наличие фазы ГАП. Очевидно, что большое количество ГАП не подвергается полной деструкции в связи с высокими скоростями разогрева, значительная его часть не успевает полностью разложится. Подобные явления отмечены в различных работах, где устойчивость ГАП частично сохраняется до 1300°С (см. Epure, L.M.; Dimitrievska, S.; Merhi, Y.; Yahia, L.H. The Effect of Varying Al2O3 Percentage in Hydroxyapatite/Al2O3 Composite Materials: Morphological, Chemical and Cytotoxic Evaluation. J. Biomed. Mater. Res. Part A 2007, 1009-1023, doi:10.1002/jbm.a.31377).

Причем при деструкции ГАП образуется CaO, который вступает во взаимодействие с Al₂O₃ c образованием кристаллического алюмината кальция CaAl₂O₄ при 1100°С, согласно уравнению реакции:

Низкотемпературная (Т) полиморфная модификация чистого Ca₃(PO₄)² [β-Ca₃(PO₄)₂] термически стабильна до 1180°С и далее превращается в β-Ca₃(PO₄)₂ (см. Quillard, S.; Paris, M.; Deniard, P.; Gildenhaar, R.; Berger, G.; Obadia, L.; Bouler, J.M. Structural and Spectroscopic Characterization of a Series of Potassium- and/or Sodium-Substituted β-Tricalcium Phosphate. Acta Biomater. 2011, 7, 1844-1852, doi:10.1016/j.actbio.2010.12.016), который и наблюдался в составе исследуемого образца биокерамики, полученного при 1200°С.

Кристаллические фазы ГАП и ТКФ одинаково важны для биомедицинских приложений. Однако если термодеструкцию ГАП невозможно предотвратить при температурах более 1000°С, то фаза ТКФ может быть устойчива в модификации α-Ca₃(PO₄)₂ до 1400°С (см. Nandha Kumar, P.; Mishra, S.K.; Udhay Kiran, R.; Kannan, S. Preferential Occupancy of Strontium in the Hydroxyapatite Lattice in Biphasic Mixtures Formed from Non-Stoichiometric Calcium Apatites. Dalt. Trans. 2015, 44, 8284-8292, doi:10.1039/C5DT00173K; Kumar, P.N.; Mishra, S.K.; Kannan, S. Probing the Limit of Magnesium Uptake by β-Tricalcium Phosphate in Biphasic Mixtures Formed from Calcium Deficient Apatites. J. Solid State Chem. 2015, 231, 13-19, doi:10.1016/j.jssc.2015.07.051).

Для исследования пористой структуры биокерамики применяли методы низкотемпературной 77 K адсорбции-десорбции азота.

Изотермы низкотемпературной адсорбции-десорбции азота для полученных образцов биокерамики соответствуют изотермам IV типа классификации IUPAC с переходом ко II типу при повышении температуры спекания (см. фиг.7).

IV тип изотрем характерен для мезопористых структур с узким распределением пор по размерам. В частности, для образцов, полученных при низкой температуре ИПС (до 900°C), наблюдается наличие увеличенного сорбционного гистерезиса в области средних давлений газа, что указывает на наличие мезопор в образцах (см. фиг.7а). Это подтверждено данными BJH распределения пор по размерам, где средний размер мезопор составляет около 10 нм, а весь диапазон пор в пределах 5-40 нм (см. фиг.7а*).

При увеличении температуры ИПС величина сорбционного гистерезиса уменьшается с изменением формы изотермы, которая становится более похожей на изотерму II типа по классификации IUPAC (см. фиг.7б).

Данный тип изотерм характерен для непористых или макропористых материалов корпускулярной структуры, у которых форма и размер пор неоднородны. В данных образцах снижается количество мезопор с увеличением их размерного диапазона и появлением некоторого количества макропор в образцах. Это также подтверждено данными BJH распределения пор по размерам, где отчетливо видно снижение общего количества мезопор в диапазоне 5-40 нм и появление макропор размером 50 нм и более (см. фиг.7б*-в*).

Изменение пористой структуры образцов при повышении температуры также подтверждается значительным снижением величины удельной площади поверхности с 25 до 3,6 м²/г. Это обусловлено активацией деформационных явлений в твердой фазе при спекании материала, что сопровождается ростом зерна и схлопыванием пористого объема.

Изменения структуры образцов биокерамики представлены и на РЭМ снимках (см. фиг.8). Видно, что низкотемпературные образцы (900°C) имеют рыхлую пористую структуру, сформированную межчастичной переориентацией и уплотнением консолидированных частиц (см. фиг.8а-а* и 8б-б*). Повышение температуры до 1100°C и выше сопровождается интенсивным спеканием частиц с исключением объемной пористости и образованием монолитной поверхности (см. фиг.8в-в*,8г-г*).

Показано, что образование ГАП в составе образцов биокерамики сопровождается формированием монолитных агломератов (см. фиг.8a*-г*). ГАП занимает свободный пористый объем в образцах, тем самым снижает количество открытых пор, что уже было подтверждено и показано выше на основе данных БЭТ (см. фиг.6 и 7).

Согласно ЭДС анализу (см. фиг.9) распределение основных элементов в составе образцов гомогенное.

Авторы изучали физико-механические характеристики образцов биокерамики (см. фиг.10). Определено, что в условиях ИПС формируются образцы высокой относительной плотности (до 95,1% от теоретической) и высокой прочности при сжатии (>640 МПа), в зависимости от температуры ИПС. Очевидно, что наличие ГАП способствует более эффективному спеканию частиц Al₂O₃, выступая в качестве спекающей добавки в композите.

По данным диаграммы разброса (см. фиг.11) установлено, что микротвердость для исследуемых образцов биокерамики равномерна по их объему, а разброс значений минимален для каждого образца.

С повышением температуры микротвердость увеличивается, при этом содержание ГАП положительно влияет на эффективность спекания.

Наиболее активное спекание протекает при температуре выше 1100°С. Резкое увеличение микротвердости при 1200°С обусловлено спеканием именно частиц Al₂O₃. В образце с меньшим содержанием фосфатов кальция количество Al₂O₃ больше, что соответственно определяет его повышенную микротвердость. Также при данной температуре формируется монолитная структура образцов, как было показано выше на снимках РЭМ (см. фиг.6 и 7).

Исследовали биосовместимые свойства «in vivo».

В качестве лабораторного животного использовали кролика - самку породы «Новозеландский белый» весом 3 кг и возрастом 1,5 года.

Методология исследования реализовывалась в соответствии с требованиями «Директивы Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях» (2010/63/EU). При содержании животных и выведении их из эксперимента руководствовались законом «О защите животных от жестокого обращения» (гл. V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.), Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 года и «Правилами содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» ГОСТ 33216-2014.

Имплантацию образцов биокерамики в лабораторное животное проводили под медикаментозным наркозом: 2 % ксилазин (5 мг/кг) и 5 % гидрохлорид кетамина (30 мг/кг) внутримышечно.

Лабораторному животному выбривался участок кожи в области холки и далее после обработки антисептиком (бетадин) производился кожный разрез (см. фиг.12а).

Стерилизованные образцы биокерамики (температура стерилизации 120°С) помещались в мягкие ткани под поверхностную фасцию грудной клетки в области грудной части трапецивидной мышцы и широчайшей мышцы спины, в искусственно сформированную полость (см. фиг.12б).

Кожный разрез ушивался нерассасывающимся монофильным материалом Пролен «Ethicon» (США).

В послеоперационном периоде животному внутримышечно вводили анальгетик трамадол (10 мг/кг) единожды. Ежедневный туалет послеоперационного шва проводился раствором диоксидина глюкороната один раз в сутки в течение 10 дней.

Удаление хирургических швов проводили на 12 день.

Выемку образцов проводили после эвтаназии животных на 90 сутки (3 месяца выдержки) путем введения внутримышечно 2% ксилазина (5 мг/кг) и 5% кетамина (40 мг/кг). Спустя 15 минут внутривенно вводили 1% пропофол (5 мг/кг) и 19,1% хлористого калия (1 мл/кг). Механическим путем у животного вырезали фрагмент ткани с каждым вживленным образцом отдельно (см. фиг.12в).

В ходе выемки имплантированных образцов биокерамики было отмечено, что их расположение после вживления не изменилось. Образцы не мигрировали и были зафиксированы в объеме мягких тканей сформированных капсул из соединительной ткани (см. фиг.12в).

При визуальном осмотре области имплантации никаких изменений и воспалительных образований в окружающих тканях выявлено не было. Капсулы соединительной ткани для имплантированных образцов биокерамики были светло-серого цвета и характеризовались маленькой толщиной. В объеме капсул просматривались отдельные структурные части и контуры имплантов.

Далее мягкие ткани капсул, сформированные вокруг каждого имплантированного образца биокерамики, отделяли и фиксировали их в 10%-ном забуференном формалине. Из изъятого биоматериала изготавливали парафиновые блоки и делали срезы толщиной 16-20 мкм, которые окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином с последующим гистологическим исследованием на микроскопе CX41, оснащенном цифровой камерой U-TV0.35XC-2 «Olympus» (Япония).

Гистологически изучали состояние тканей капсулы, сформированных вокруг имплантированных образцов биокерамики, с целью выявления возможных воспалительных процессов, метаболических поражений, спаечных и рубцовых образований в области их контакта.

При гистологическом исследовании капсул, сформированных вокруг имплантированных образцов биокерамики, были отмечены сходные закономерности стратификации капсул на три слоя.

Внутренняя оболочка капсул представлена волокнами с низкой клеточностью, с формированием псевдоворсинок и утолщения капсулы в местах плотного прилегания имплантированных образцов биокерамики (см. фиг.13a, б).

Средняя часть капсулы была представлена оформленной гомогенной соединительной тканью с сосудами капиллярного типа.

Наружная часть капсулы представлена соединительно-тканными волокнами с умеренной клеточностью и переходом в жировую ткань (см. фиг.13в).

На внутренней поверхности капсулы прослеживались гигантские многоядерные клетки (см. фиг.13г).

Таким образом, при гистологическом анализе объектов в капсулах вокруг имплантов выявленные явления можно отнести к асептической воспалительной реакции продуктивного характера с неспецифической гигантоклеточной реакцией.

Такая реакция не носит специфического характера и встречается в капсулах, формируемых организмом вокруг инородных тел (см. Anderson, J.M.; Rodriguez, A.; Chang, D.T. Foreign Body Reaction to Biomaterials. Semin. Immunol. 2008, 20, 86-100, doi:10.1016/j.smim.2007.11.004).

Гигантоклеточная реакция тканей организма реципиента характерна для различных видов керамик, содержащих гидроксиаппатит, оксиды титана, циркония и кальция.

Исследовали антибактериальные свойства.

Микробиологические исследования основывались на оценке формирования биопленок Pseudomonas aeruginosa на образцах керамики разного состава.

Данный вид бактерий обитает во внешней среде (воде, почве), и является одним из ведущих представителей возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в том числе инфекционного процесса после хирургических вмешательств (см. Callejas-Díaz, A.; , C.; Ramos-Martínez, A.; , E.; I.; Vargas J.A. Impact of Pseudomonas Aeruginosa Bacteraemia in a Tertiary Hospital: Mortality and Prognostic Factors. Med. Clin. (Barc). 2018, 152, 83-89, doi:10.1016/j.medcli.2018.04.020).

Образцы керамик помещали в жидкую питательную среду (МПБ, Оболенск, Россия) с P. aeruginosa (0,5 стандарт McFarland) на 10 минут, после этого их размещали в чашках Петри на поверхности 5% кровяного агара, засеянного этими же микроорганизмами. Культивирование проводили при 37°С в течение 18, 24 и 48 часов. Фиксация биопленки на образце керамики осуществлялась путем промывки в 4% формальдегиде с 1% раствором фосфатного буфера и последующим воздействием 1% раствором осмия тетроксида в течение 1 часа. Обезвоживание проводили с помощью последовательной обработки в этаноле различной концентрации и при соответствующей экспозиции (30% - 10 минут; 50% - 10 минут; 70% - 10 минут; 96% - 10 минут; 100% - 20 минут), а затем в ацетоне 20 минут.

Морфологию сформированных биопленок изучали с помощью РЭМ.

По результатам исследования выявлена заметная разница в скорости и интенсивности формирования бактериальной биопленки на образцах керамик с разным составом.

При времени инкубации 18 часов на всех образцах керамик видны несвязанные между собой одиночные бактериальные клетки (см. фиг.14а-в).

Спустя 24 часа биопленка сформировалась на образце Al₂O₃ с добавкой 50 масс.% ГАП и синтетическом ГАП - чуть более обильный рост, чем через 18 часов, но так же в виде единичных бактерий (см. фиг.14б* и 14в*).

По истечении 48 часов наиболее плотная биопленка с большим количеством внеклеточного матрикса была сформирована на образцах чистого Al₂O₃ (без добавок фосфатов кальция), Al₂O₃ с добавкой 50 масс. % ГАП (см. фиг.14а**-б**). Бактерии погружены в толстый слой матрикса, это является признаком более устойчивой биопленки и большей защиты бактерий в ее составе от воздействия негативных факторов окружающей среды. Особенно внеклеточный матрикс выражен на образце Al₂O₃ без ГАП (см. фиг.14a**).

Бактериальная биопленка формируется наиболее интенсивно и с большим количеством внеклеточного матрикса на образцах Al₂O₃ без добавок фосфатов и Al₂O₃ с добавкой 50 масс. % ГАП.

Синтетический ГАП без Al₂O₃ обладает более ярко выраженным противобактериальным воздействием по сравнению с чистым Al₂O₃. Таким образом, его присутствие в образцах биокерамики представляет перспективу для снижения риска развития инфекционного процесса при имплантации.

Изобретение относится к биосовместимым композитным материалам на основе керамики и может быть использовано при изготовлении имплантов для регенеративной и реконструктивной костной хирургии. Для изготовления керамического материала смешивают порошок оксида алюминия с порошками оксида кальция и гидрофосфата кальция при соотношении в них Са/Р, равном 1,66, в планетарной мельнице в течение 30 минут со скоростью 600 об/мин, причем порошки оксида алюминия, оксида кальция и гидрофосфата кальция берут в соотношении, обеспечивающем образование биоактивной фазы в количестве 50 масс.% от общей массы образующегося композитного материала. Готовую спекаемую смесь помещают в графитовую пресс-форму и подпрессовывают при давлении 20,7 МПа, далее полученную заготовку помещают в вакуумную камеру и подвергают искровому плазменному спеканию, при котором давление прессования на образец составляет 50 МПа, скорость нагрева составляет 300°С/мин при температуре до 650°С и 90°С/мин при температуре не менее 650°С. Образец выдерживают при температуре 1000°С в течение 5 минут и охлаждают до температуры 20-25°С. Технический результат выражается в получении биокерамики, обладающей биосовместимыми и антибактериальными свойствами, высокими физико-механическими характеристиками и бимодальной мезо- и макропористой структурой. 14 ил.

Способ изготовления биокерамики с использованием соединений кальция, в котором смешивают порошок оксида алюминия с порошками оксида кальция и гидрофосфата кальция при соотношении в них Са/Р, равном 1,66, в планетарной мельнице в течение 30 минут со скоростью 600 об/мин, причем порошки оксида алюминия, оксида кальция и гидрофосфата кальция берут в соотношении, обеспечивающем образование биоактивной фазы в количестве 50 масс.% от общей массы образующегося композитного материала, готовую спекаемую смесь помещают в графитовую пресс-форму и подпрессовывают при давлении 20,7 МПа, далее полученную заготовку помещают в вакуумную камеру и подвергают искровому плазменному спеканию, при котором давление прессования на образец составляет 50 МПа, скорость нагрева составляет 300°С/мин при температуре до 650°С и 90°С/мин при температуре не менее 650°С, образец выдерживают при температуре 1000°С в течение 5 минут и охлаждают до температуры 20-25°С.