Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и может быть использовано для генотипирования человека по аллелям rs2269578-G и rs2269578-C гена XBP1, кодирующего транскрипционный фактор, участвующий в восстановлении протеостаза клетки в условиях стресса эндоплазматического ретикулума [Luo X, Alfason L, Wei M, Wu S, Kasim V. Spliced or Unspliced, That Is the Question: The Biological Roles of XBP1 Isoforms in Pathophysiology. Int J Mol Sci. 2022 Mar 2;23(5):2746. doi: 10.3390/ijms23052746]. Исследования последних лет доказали, что стресс эндоплазматического ретикулума является важным патогенетическим механизмом развития сахарного диабета 2 типа [Mustapha S, Mohammed M, Azemi AK, Jatau AI, Shehu A, Mustapha L, Aliyu IM, Danraka RN, Amin A, Bala AA, Ahmad WANW, Rasool AHG, Mustafa MR, Mokhtar SS. Current Status of Endoplasmic Reticulum Stress in Type II Diabetes. Molecules. 2021 Jul 19;26(14):4362. doi: 10.3390/molecules26144362], сердечно-сосудистых заболеваний [Hotamisligil GS. Endoplasmic reticulum stress and atherosclerosis. Nat Med. 2010 Apr;16(4):396-9. doi: 10.1038/nm0410-396], рака [Corazzari M, Gagliardi M, Fimia GM, Piacentini M. Endoplasmic Reticulum Stress, Unfolded Protein Response, and Cancer Cell Fate. Front Oncol. 2017 Apr 26;7:78. doi: 10.3389/fonc.2017.00078], нейродегенеративных заболеваний [Kim S, Kim DK, Jeong S, Lee J. The Common Cellular Events in the Neurodegenerative Diseases and the Associated Role of Endoplasmic Reticulum Stress. Int J Mol Sci. 2022 May 24;23(11):5894. doi: 10.3390/ijms23115894]. Согласно данным ресурса GTEx Portal [https://gtexportal.org/home/snp/rs2269578], полиморфный вариант rs2269578 (G>C) ассоциирован со снижением экспрессии гена XBP1 в поджелудочной железе. Однако на сегодняшний день нет простого, быстрого и недорогого метода генотипирования человека по полиморфному локусу rs293795 (A>G).

Методом, позволяющим осуществить определение нуклеотидной последовательности в локусе rs2269578 является секвенирование по Сэнгеру - метод, применяемый для детекции любых изменений нуклеотидной последовательности, разработанный Ф. Сэнгером в 1977 году и широко использующийся для изучения нуклеотидной последовательности ДНК человека [Sanger F. "Determination of nucleotide sequences in DNA". Biosci Rep. - 2004. - V. 24(4-5). - P.237-253]. Недостатками данного метода являются его трудоемкость, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, значительно более долгое получение результатов и повышенные риски контаминации лаборатории продуктами полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и реакций секвенирования.

Генотипирование rs2269578 гена XBP1 возможно методом секвенирования следующего поколения [Hu T, Chitnis N, Monos D, Dinh A. Next-generation sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 2021 Nov;82(11):801-811. doi: 10.1016/j.humimm.2021.02.012; Slatko BE, Gardner AF, Ausubel FM. Overview of Next-Generation Sequencing Technologies. Curr Protoc Mol Biol. 2018 Apr;122(1):e59. doi: 10.1002/cpmb.59], для которого необходимы секвенатор Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM, ThermoFisher Scientific) и специальная панель целевых праймеров AmpliSeq, разработанных с использованием программного обеспечения AmpliSeq версии 4.0 (ThermoFisher Scientific). Качество библиотеки оценивается с помощью электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), а библиотеки, прошедшие этот этап, подвергаются эмульсионной ПЦР, выполняемой с помощью системы OneTouch2 (ThermoFisher Scientific). Библиотеки загружаются на Ion 318chipv2, а затем секвенируются на Ion PGM (ThermoFisher Scientific). Анализ данных, включая сопоставление с референсным геномом и определение вариантов, проводится с использованием программного обеспечения Torrent Suite v.5.0 (ThermoFisher Scientific). Недостатком метода является его высокая трудоемкость, длительность анализа и необходимость приобретения дорогостоящего секвенатора.

Генотипирование ДНК-полиморфизмов, включая rs2269578 гена XBP1, возможно осуществить методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537]. Недостатком метода является длительность анализа - не менее 8 часов, необходимость приобретения дорогостоящего геномного масс-спектрометра и набора чипов и реагентов.

Прототипом является метод анализа ДНК путем проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени в присутствии меченых флуорофорами, аллель-специфичных (TaqMan) зондов и праймеров по патенту на изобретение США №5538848 (Kenneth J. Livak, Susan J., A. Flood, Jeffrey Marmaro, Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe, 23.07.1996). Недостатком прототипа является то, что для использования описанного в прототипе метода на практике, с целью исследования различных полиморфизмов, требуется разработка TaqMan зондов и праймеров для каждого отдельного исследуемого полиморфизма.

Технический результат заключается в разработке простого, быстрого и экономически выгодного способа генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Технический результат достигается тем, что cпособ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени состоит в том, что используются: прямой праймер XBP1-F 5'-CCATCCGGAGTGACAGAATT-3', обратный праймер XBP1-R 5'-GGCGCACGAGATAAAATGTTG-3', XBP1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-AATTTAATTCCAAACCG-RTQ1-3′, XBP1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-AATTTAATTCCAAACCC-BHQ-3′, при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs2269578-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs2269578-C/C детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs2269578-G/C наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена XBP1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Изобретение поясняется двумя фигурами. На фигуре 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена OGG1 длиной 112 пар нуклеотидов, кодирующие аллели rs2269578-G и rs2269578-C гена XBP1. Жирным шрифтом и подчеркиванием отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.

На фигуре 2 представлен пример детекции генотипов по локусу rs2269578 гена XBP1 при генотипировании методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени: генотипы rs2269578-G/G показаны оранжевым цветом, генотипы rs2269578-G/C показаны зеленым цветом, генотипы rs2269578-C/C показаны синим цветом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени использовали два общих для аллельных вариантов праймера, фланкирующих участок гена XBP1 длиной 112 пары нуклеотидов: прямой праймер XBP1-F 5'-CCATCCGGAGTGACAGAATT-3', обратный праймер XBP1-R 5'-GGCGCACGAGATAAAATGTTG-3', XBP1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-FAM-AATTTAATTCCAAACCG-RTQ1-3′, XBP1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-ROX-AATTTAATTCCAAACCC-BHQ-3′, подобранные на основе нуклеотидной последовательности гена XBP1 (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Sequence?db=core;r=22:28800355-28801355;v=rs2269578;vdb=variation;vf=1093745733), включающей в положении chr22:28800855 (GRCh38.p14) однонуклеотидный вариант rs2269578 (G>C). Для подбора праймеров использовали программу Primer3web version 4.1.0 (https://primer3.ut.ee/). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Праймеры XBP1-F и XBP1-R инициируют амплификацию участка гена XBP1, включающего локус rs2269578, длиной 112 пар нуклеотидов. Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=52°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Идентификация аллелей rs2269578-G и rs2269578-C гена XBP1 проводится на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей FAM и ROX, соответственно. Для определения генотипа человека используются конечные значения флуоресценции красителей FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1, которое представляет результаты генотипирования в виде распределения аллелей (фиг. 2). Для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs2269578-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs2269578-C/C детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs2269578-G/C наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена XBP1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.

Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК человека из коллекции биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. По результатам генотипирования 76,9% людей являлись гомозиготами по аллелю G (генотип rs2269578-G/G), 4,2% людей - гомозиготами по аллелю C (генотип rs2269578-C/C), 18,9% - гетерозиготами (генотип rs2269578-G/C). Валидацию способа проводили с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF [Pusch W, Wurmbach JH, Thiele H, Kostrzewa M. MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping. Pharmacogenomics. 2002 Jul;3(4):537-48. doi: 10.1517/14622416.3.4.537] на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью совпали, однако патентуемый способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени позволяет значительно (до 1 часа) сократить время проведения анализа по сравнению с методом генотипирования на основе MALDI-TOF (8 часов).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Образец ДНК NDM552 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=52°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs2269578-C, что соответствует генотипу rs2269578-C/C XBP1.

Пример 2. Образец ДНК NDM545 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=52°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM и ROX между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце и аллеля rs2269578-G, и аллеля rs2269578-C, что соответствует гетерозиготному генотипу rs2269578-G/C XBP1.

Пример 3. Образец ДНК NDM541 из биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ, был подвергнут генотипированию по однонуклеотидному варианту rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. К 1 мкл раствора ДНК с концентрацией 10 нг/мкл добавляли 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, амплификация 38 циклов, включающая 15 сек при 95°С и 1 мин при t=52°С. При регистрации сигнала флуоресценции наблюдали экспоненциальный рост флуоресценции по FAM между 18 и 38 циклами, что свидетельствует о наличии в образце только аллелей rs2269578-G, что соответствует генотипу rs2269578-G/G XBP1.

Результаты генотипирования трех образцов ДНК NDM552, NDM545, NDM541 по однонуклеотидному варианту rs2269578 (G>C) гена XBP1 с помощью матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF на геномном масс-спектрометре MassArray Analyzer 4 (Agena Bioscience) полностью совпали с результатами генотипирования методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени.

Таким образом, разработан простой, быстрый и экономически выгодный способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, который позволяет до 1 часа сократить время проведения анализа и дает возможность провести генотипирование по указанному полиморфному варианту в лаборатории, укомплектованной стандартным оборудованием - амплификатором для проведения ПЦР.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-

//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-06-18" softwareVersion="2.3.0"

softwareName="WIPO Sequence" fileName="SNP_42_rs2269578 гена

XBP1.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode/>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate>2024-06-18</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1921</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования «Курский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical University</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Азарова Юлия Эдуардовна</InventorName>

<InventorNameLatin>Azarova Yulia Eduardovna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования однонуклеотидного

варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной

реакции в режиме реального времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatccggagtgacagaatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggcgcacgagataaaatgttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttaattccaaaccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttaattccaaaccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики. Предлагается способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. Заявленный способ осуществляют с использованием праймеров XBP1-F 5'-CCATCCGGAGTGACAGAATT-3', XBP1-R 5'-GGCGCACGAGATAAAATGTTG-3' и зондов XBP1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-FAM-AATTTAATTCCAAACCG-RTQ1-3', XBP1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-ROX-AATTTAATTCCAAACCC-BHQ-3'. Изобретение позволяет упростить генотипирование человека по аллелям rs2269578-G и rs2269578-C гена XBP1, сократить время проведения анализа. 2 ил., 3 пр.

Способ генотипирования однонуклеотидного варианта rs2269578 (G>C) гена XBP1 человека методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что используются:

прямой праймер XBP1-F 5'-CCATCCGGAGTGACAGAATT-3',

обратный праймер XBP1-R 5'-GGCGCACGAGATAAAATGTTG-3',

XBP1-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-FAM-AATTTAATTCCAAACCG-RTQ1-3',

XBP1-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5'-ROX-AATTTAATTCCAAACCC-BHQ-3',

при этом для гомозиготных по аллелю G образцов ДНК с генотипом rs2269578-G/G детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных по аллелю C образцов ДНК с генотипом rs2269578-C/C детектируется сигнал по каналу ROX, для гетерозиготных образцов с генотипом rs2269578-G/C наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей FAM и ROX позволяет определить присутствие каждого из исследуемых аллелей гена XBP1 в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип человека.