Способ стимуляции акто-, кардио- и нейропротекции в условиях вынужденной физической нагрузки в эксперименте путем применения аллогенного биоматериала Российский патент 2024 года по МПК A61K35/32 A61K9/08 A61P43/00 

Изобретение относится к биологии и экспериментальной медицине, и может использоваться для разработки методов лечения и реабилитации лиц, деятельность которых связана с интенсивной физической нагрузкой.

Исследование стимуляции актопротекции у людей, выполняющих работу при воздействии вынужденной изнуряющей физической нагрузки (водолазы, профессиональные пловцы, космонавты, спасатели, шахтеры и др.), а также спортсменов в условиях тренировочного и соревновательного процессов, работающих на пределе физических возможностей, определяет задачи разработки способов повышения энергетических ресурсов, защиты от вредных воздействий окружающей среды, поиска недопинговых фармакологических средств коррекции и профилактики осложнений.

Для изучения веществ и методов, способствующих повышению работоспособности и др. качеств, необходимых для достижения высоких спортивных результатов, в доклинических исследованиях имеет смысл обращать внимание на моторные, сенсорные и когнитивные функции лабораторных животных, также патоморфологическое состояние систем органов и тканей.

Спорт высоких достижений, это сфера деятельности, в которой организм спортсмена подвергается экстремальным физическим и психологическим воздействиям. Безграничное увеличение спортивных нагрузок нерационально, потому что негативно воздействует на здоровье спортсменов. Неоправданно большие объемы выполняемой работы и желание повысить тренированность приводят к развитию дистресса. Как следствие - «колебания» иммунной системы, развитие предболезненных состояний и заболеваний. В результате, более 50% из спортсменов имеют отклонения в состоянии здоровья [Гордон Н.Ф. Хроническое утомление и двигательная активность / Н.Ф. Гордон. - К.: Олимпийская литература, 1999. - 126 с.].

В зависимости от характера выполняемой работы выделяют физическое, умственное и сенсорное утомление. В некоторых источниках также возможно встретить такое распределение как физиологическое, нейропсихическое и патологическое утомления [Пизова Н.В. Утомляемость, астения и хроническая усталость. Что это такое? / Н.В. Пизова // Consilium Medicum. - 2012. - Т. 14, №2. - С. 61-64]. Переутомление развивается тогда, когда продолжительность или полноценность периодов отдыха недостаточна для восстановления физиологических функций после функциональных напряжений. При этом происходит истощение внутренних ресурсов организма [Ильин В.Н., Алвани А., Филиппов М.М, Коваль С.Б. Феномен хронического утомления у спортсменов. Ульяновский медико-биологический журнал. №3, 2015].

Симптомы хронической усталости при повреждающих психоэмоциональных и физических нагрузках в спорте высших достижений проявляются, как правило, в нарушениях в скелетной, нервно-мышечной и кардио-респираторной системах, системе периферической крови, в изменениях метаболизма и иммунологической резистентности. В результате прогрессирующее хроническое утомление может привести к развитию синдрома хронической усталости [Скачков Н.Г. Устранение и профилактика умственного и физического утомления / Н.Г. Скачков, В.А. Шкурдода // Термины и понятия в сфере физической культуры: I Междунар. конгресс. - СПб., 2007. - С. 360-361.].

При утомлении в первую очередь изменяются различные функции организма и затем снижаются количественные и качественные показатели работоспособности. При восстановлении нормализация функциональных констант организма служит основой для улучшения прямых показателей работоспособности. На основании этих закономерностей можно прогнозировать уровень работоспособности и в существенной степени управлять процессами утомления и восстановления [Солодков А.С. Особенности утомления и восстановния спортсменов. Ученые записки университета имени П.Ф. Лесгафта, №6 (100) - 2013. 131-143 с.].

Наиболее распространенная центрально-нервная теория утомления связывает возникновение утомления только с деятельностью нервной системы, в частности, коры больших полушарий. При этом предполагалось, что основой механизма утомления является ослабление основных нервных процессов в коре головного мозга, нарушение их уравновешенности с относительным преобладанием процесса возбуждения над более ослабленным процессом внутреннего торможения и развитием охранительного торможения [Ухтомский, А.А. Возбуждение, утомление, торможение / А.А. Ухтомский //Физиологический журнал СССР. - 1934. - №6. - С. 1114-1125.].

Однако современные электрофизиологические и биохимические методы исследования и полученные на их основе экспериментальные данные не позволяют свести причины утомления к изменениям в каком-то одном органе или системе органов, в том числе нервной системе. Следовательно, приписывать возникновение первичного утомления какой-либо одной системе неправомерно. В зависимости от состояния функций организма и характера деятельности человека первичное возникновение утомления вариативно и может наблюдаться в различных органах и системах организма [Солодков, А.С. Физиология спорта: учебное пособие / А.С. Солодков, Е.Б. Сологуб; С.-Петерб. гос. акад. физ. культуры им. П.Ф. Лесгафта. - СПб.: [б. и.], 1999. - 232 с.].

Любые физические упражнения вовлекают в работу все системы и органы человека, но наибольшая нагрузка приходится на сердечнососудистую, нервную, мышечную системы. В большинстве случаев переутомление и перетренированность наслаиваются друг на друга, давая симптомокомплекс нарушений деятельности организма. Переутомление нарушает слаженность взаимодействия между корой головного мозга, нижележащими отделами нервной системы и внутренними органами [Ильин В.Н., Алвани А., Филиппов М.М, Коваль С.Б. Феномен хронического утомления у спортсменов. Ульяновский медико-биологический журнал. №3, 2015]. Нарушения функций центральной нервной и иммунной систем являются одним из важных факторов дисбаланса нейрогуморальной регуляции гомеостаза в целом [Nieman D.С. Current perspective on exercise immunology / D.С. Nieman // Current Sports Medicine Reports. - 2003. - N 2. - P. 239-242.].

Спорт наивысших достижений часто приводит к травматизму. Экспериментально показано, изнуряющие физические нагрузки вызывают микроповреждения мышечных волокон. Чрезмерное напряжение саркомера, разрушение внеклеточной или внутриклеточной мембраны, гидролиз структурных белков являются основной причиной повреждения мышечных волокон. Воспаление, возникающее после травмы, приводит к дальнейшей деградации ткани, но предотвращение воспаления приводит к долгосрочной потере мышечной функции [Lieber R.L., Friden J. Mechanisms of muscle injury gleaned from animal models. R Am J Phys Med Rehabil. 2002; 81(11): 70-79. doi: 10.1097/00002060-200211001-00008]. В настоящее время терапия миофасциального синдрома направлена на нивелирование болевого синдрома, расслабление и растяжение поврежденных мышц, а не стимуляцию регенерации.

Предшествующий уровень техники

На сегодняшний день известны актопротекторы, адаптогены, витаминно-минеральные комплексы - соединения, которые могут иметь различное происхождение - от природного до синтетического. Среди природных актопротекторов выделяют синтетические соединения (бромантан, левамизол, афобазол, беметил и др.) или экстракты растений, обладающие способностью повышать устойчивость организма к физическим нагрузкам без увеличения потребления кислорода. Экстракты женьшеня Panax, элеутерококка колючего, левзеи сафлоровидной, родиолы розовой и лимонника китайского, продукты пчеловодства считаются природными адаптогенами [Хабибуллин P.M., Миронова И.В., Хабибуллин И.М., Мусина Л.А., Хабибуллин И.М. Влияние адаптогенов на состояние внутренней среды организма животных. Курск,изд. ЗАО Университетская книга. 2022: 183 с.]. Хотя сейчас многие люди принимают растительные адаптогены, клинические испытания на людях ограничены. Механизм действия растительных адаптогенов сложен и до конца не изучен. Ксеногенные препараты могут иметь низкую специфичность и биологическую активность, высокую иммуногенность, вызывать аллергические реакции [Todorova V, Ivanov K, Delattre С, Nalbantova V, Karcheva-Bahchevanska D, Ivanova S. Plant Adaptogens-History and Future Perspectives. Nutrients. 2021 Aug 20; 13(8): 2861. doi: 10.3390/nu13082861]. Помимо этого, существующие препараты используются без учета риска травматизма и микротравм, хронических ишемических повреждений тканей и органов после изнуряющей физической нагрузки. Для этого используют фармакологические средства (миорелаксанты, нестероидные противовоспалительные средства, анальгетики) и нефармакологические методы воздействия (приемы постизометрической релаксации, массаж, мануальная терапия, лечебная физкультура, иглоукалывание, электростимуляция и другие физиотерапевтические методы) [Fricton J. Myofascial Pain: Mechanisms to Management. Oral Maxillofac. Surg. Clin. North Am. 2016; 28(3): 289-311.]. Микроповреждения мышечного волокна восстанавливаются за счет внутриклеточной регенерации. При значительных повреждениях на протяжении мышечного волокна наблюдается усиленная пролиферация миосателлитоцитов, которые мигрируют в область дефекта и формируют миотрубку. Тем не менее, при миграции фибробластов и нарушении двигательной иннервации мышечных волокон развивается соединительнотканный рубец [Шурыгин М.Г., Болбат А.В., Шурыгина И.А. Миосателлиты как источник регенерации мышечной ткани. Фундаментальные исследования. 2015; 1(8): 1741-1746.].

Поиск оптимальных фармакологических средств, стимулирующих раннее и эффективное восстановление поврежденных мышечных тканей вследствие пересокращения, длительного утомления, влияния оксидативного стресса является актуальной задачей для специалистов медико-биологического профиля. Аллогенный биоматериал известен как стимулятор регенерации различных тканей и органов при его местном применении. Он изготавливается из соединительнотканных образований и подвергается физико-химической обработке [Патент на изобретение 2780831, 2022].

Известен способ кардиопротекции и нейро протекции внутривенным введением галогенсодержащего летучего анестезирующего средства, включающий парентеральное введение препарата, в состав которого входит галогенсодержащий анестетик в суб-анестетических дозах. В качестве галогенсодержащих анестетиков вводят дезфлуран, изофлуран, галотан или севофлуран [патент RU 2350323, 2009]. Известен способ кардиопротекции, характеризующийся тем, что осуществляют направленную доставку в подвергшийся ишемии-реперфузии миокард лекарственного вещества. В качестве носителя лекарственного вещества используют аминированные кремнеземные наночастицы диаметром 10 нм, к которым прививают спейсер. На функциональную группу спейсера иммобилизируют лекарственное вещество одним из методов: ковалентное связывание, координационно-ионное взаимодействие, адсорбционная иммобилизация [патент RU 2456024, 2012].

Наиболее близким аналогом изобретения является способ нейропротекции в эксперименте на клеточной модели, инкубируемой в физиологических условиях, включающий введение в среду культивирования 30 мкМ средства с допустимым отклонением от указанной величины не более чем на 10%, содержащего биодеградируемый полимерный матрикс на основе фиброина шелка Bombyx mori с иммобилизированным пептидом-агонистом рецептора ПАР1, освобождаемого активированным протеином С, в соотношении 99-99.9 мас. %: 0.1-1 мас. % фиброин: пептид. При этом в качестве модели могут быть использованы клетки мозга животных (астроциты) или тучные клетки в условиях стресса, которые создают посредством введения в клеточную модель провоспалительного агента - тромбина в конечной концентрации от 45-50 нМ или 1 мкг/мл соответственно [патент RU 2616509, 2017].

Общим недостатком аналогов является отсутствие разработанного механизма действия in vivo акто- кардио- и нейропротекции в условиях вынужденной физической нагрузки.

Задачей изобретения является разработка способа стимуляции акто-кардио- и нейропротекции в условиях вынужденной физической нагрузки в эксперименте.

Для этого исследовано локальное и системное воздействие аллогенного биоматериала на организм, исследована биологическая обратная связь, выявлены морфофункциональные особенности скелетной мышечной ткани, сенсомоторной коры головного мозга, миокард.

Техническим результатом при использовании изобретения является улучшение физиологических показателей, раннее и полноценное восстановление структуры тканей миокарда, скелетной мышечной ткани, неокортекса головного мозга.

Предлагаемый способ стимуляции акто- кардио- и нейропротекции в условиях вынужденной физической нагрузки в эксперименте осуществляется следующим образом. Проводят однократное введение 0.2% суспензии диспергированного аллогенного биоматериала, изготовленного из сухожилий крыс [согласно ТУ 9398-001-04537642-2011] в физиологическом растворе внутримышечно по 0,5 мл в мышцы передних и задних конечностей и/или акупунктурно в биологически-активные точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо по 0.2 мл.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 представлена электрокардиография сердца животных, где: А - интактные крысы, Б - крысы после изнуряющей физической нагрузки; на фиг. 2 - ЭКГ после вынужденной физической нагрузки и внутримышечного введения аллогенного биоматериала (БМА).

Результаты, получаемые на моделях животных с использованием теста Порсолта с утяжелением, хорошо экстраполируется на человека в силу высокой гомологичности механизмов. Для выявления фармакологического воздействия БМА на ткани скелетной мускулатуры, головного мозга, сердца было проведено экспериментальные исследования - тест Порсолта (Porsolt) «отчаяния» или вынужденного плавания до полного утомления с грузом 10% от массы тела. Тест принудительного плавания представляет собой комбинированный жесткий вид стресса, сочетающий физический и эмоциональный компоненты. В эксперименте использованы половозрелые крысы - самцы линии Wistar массой 200-250 г. Плавательный тест проводился ежедневно в течение тридцати дней подряд для всех экспериментальных групп животных параллельно в одно и то же время суток. Вес груза был подобран в соответствии с весом животного в данном периоде времени. По истечению 30 суток плавания было сформировано 6 групп животных, в каждой группе находились по 10 крыс. В I (опытной) группе вводили суспензию БМА. БМА был изготовлен из сухожилий крыс. Способ введения - внутримышечно. Для этого 1 флакон (10 мг) был разведен 5-ю мл физиологического раствора для получения 0.2%) суспензии. Произведено суммарно 8 инъекций в мышцы передних конечностей и задних конечностей по 0.5 мл суспензии БМА. В (контрольной) группе животным введен физиологический раствор в аналогичные зоны и том же объеме.

Во II (опытной) группе введена 0.2% суспензия БМА акупунктурно, в такой же концентрации и введено по 0.2 мл в каждую точку подкожно. Были задействованы точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо [Белоусов ПВ. Акупунктурные точки китайской чжэньцзю-терапии. Алматы, 2004: 448 с. ISBN 9965-9452-5-Х.]. Таких точек было 16. Суммарный объем суспензии 3.2 мл. Предварительно все акупунктурные точки тестированы с помощью аппарата-ручки для нахождения и стимуляции точек акупунктуры «Поиск-02» (ООО Магнитон, Россия). После нахождения усиленного сигнала (непрерывного свечения индикатора и подачи звукового сигнала) в биологически активных точках вводили суспензию БМА. В соответствующей контрольной группе в те же акупунктурные точки был введен физ. раствор в аналогичном количестве.

В III (опытной) группе введена 0.2% суспензия БМА внутримышечно в мышцы передних и задних конечностей в количестве по 0.5 мл в каждую мышцу (см. I группа) и акупунктурно (см. II группа) в количестве 0.2 мл подкожно в каждую точку (16 точек). Суммарный объем вводимой суспензии составил 7.2 мл. В контрольной группе введен физиологический раствор по аналогичной схеме в объеме 7.2 мл как в мышцы передних и задних конечностей, так и акупунктурно. Все инъекции проведены однократно.

На 5 и 21 сутки после инъекций из каждой экспериментальной группы было отобрано по 10 особей и проведено: гистологическое исследование. Предварительно проводили тестирование толерантной нагрузки - плавание без груза (мин.). ЭКГ проводили на аппарате EGG 1001 VET под наркозом. Для наркоза использовали хлоралгидрат 300 мг/кг внутрибрюшинно, однократно. Для проведения гистологического исследования из опыта животных выводили путем инсуфляции летальной дозы паров хлороформа. Иссекали бедренную мышцу, икроножную мышцу, головной мозг, миокард. После чего было проведено общегистологическое (окраски гематоксилином и эозином, по ван-Гизону, по Маллори), иммуногистохимическое (CD 68, Gfap, Bcl-2, PCNA) и электронномикроскопическое исследования. Использовали непараметрические методы - ранговый дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллесу для общей оценки изменчивости числа клеток в серии опытов: медиана (Me) и квартили (Q1 - 25%; Q3- 75%) и критерий Манна-Уитни для сравнения результатов отдельных сроков наблюдения внутри одной серии опытов или между ними. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Использовали статистический пакет программ Statistica 10,0.

В результате исследования толерантной нагрузки животных в основной группе на 5-й и 21-й день различия уровней кратности между всеми тремя вариантами введения БМА оказались статистически недостоверными при уровне значимости от р>0.13 до р>0.66. В те же сроки незначимыми (от р>0.15 до р>0.99) оказались и различия между вариантами введения физ. раствора между контрольными группами. Но, уровни кратности между всеми тремя опытными группами с различными вариантами введения БМА и соответствующими контрольными группами были выше во всех сроках наблюдения.

При морфологическом исследовании скелетной мышечной ткани задних конечностей в контрольной группе экспериментальных животных обнаруживались признаки дистрофических изменений мышечных волокон, выражающиеся в контрактурах III, IV степеней, нарушении микроциркуляции. Также наблюдались признаки мозаичного некроза мышечных волокон, воспалительно-клеточная инфильтрация. Через 21 сутки происходило разрастание коллагеновых волокон - периваскулярный и интерстициальный фиброз. Ультраструктурная организация мышечных волокон характеризовалась потерей поперечной исчерченности, дезорганизацией Z-, М-линий, разрывом и фрагментацией волокон. Митохондрии в межфибриллярном пространстве находились в состоянии выраженной вакуолизации, набухания с потерей и лизисом крист. Каналы саркоплазматического ретикулюма и межмиофибриллярные пространства были расширены.

В опытных группах внутримышечная имплантация БМА способствовала рабдомиогенезу уже в ранние сроки наблюдений, гиперплазии мышечных волокон, снижению численности некротизированных мышечных волокон, ингибированию фиброза, повышению толерантной нагрузки. А сам биоматериал подвергался биодеградации макрофагами и через 21 сутки не обнаруживался. Морфологическая структура мышечной ткани была без патоморфологических признаков и приближена к интактной. Просвет сосудов свободный. Явления фиброза или избыточного отложения коллагена отсутствовали.

В неокортексе головного мозга в контрольных группах животных происходили морфофункциональные изменения, которые можно расценивать по совокупности факторов как деструктивные изменения необратимого характера, о чем свидетельствовал реактивный глиоз, отек нейропиля, перинуклеарных и периваскулярных пространств, редукция синаптического аппарата, усиление хроматолиза нейроцитов, снижение уровня ингибитора апоптоза Вс1-2⁺ в клетках.

Во всех основных экспериментальных группах спустя 21 сутки обнаруживались признаки нейропротекции. Определялись все 6 слоев нейронов в неокортексе. Определялись клетки Беца с длинными отростками. Нейропиль был плотный. В гемокапиллярах головного мозга периваскулярное пространство было без особенностей. Признаки отека не обнаруживались. Выявлялись олигодендроциты в непосредственном плотном контакте с базальной мембраной гемокапилляров. Структура макроглиальных клеток была с признаками морфо-функциональной активации.

После акупунктурного введения БМА при иммуногистохимическом исследовании на 21-й день в основной группе уровень численности Gfap-клеток, оказался значимо ниже, чем в контрольной группе Z=4.52 (р<0.0001). В основной группе количество Вс1-2⁺ клеток оказалась значимо выше, чем в контрольной группе (Z=3.5÷Z=4.25, р<0.0005 ÷ р<0.0001). Количество микроглиальных клеток CD-68⁺ в основной группе оказалась значимо (р<0.004 и менее) выше, чем в контрольной группе (Z=5.49÷Z=5.83, р<0.0001). Численность клеток-теней в основной группе через 21 день значимо ниже, чем в контрольной группе (Z=5.56÷Z=5.68, р<0.0001). Количество синапсов в нейропиле в основных группах как через 5, так и через 21 сутки было достоверно выше, чем в контрольных группах (Z=5.51÷Z=5.73, р<0.001). Причем, со временем численность синапсов в полях зрения в контрольных группах снижалась на два порядка (Z=5.3; р<0.02) (Таблица). В опытных группах с внутримышечным и сочетанным введением БМА определялась аналогичная тенденция.

Акупунктурное воздействие БМА тесно связано с регуляцией нейрогенеза, синаптической пластичностью и выживаемостью нейронов. Нейропротекторные свойства выражались в восстановлении архитектоники слоев нервных клеток неокортекса, увеличении численности синапсов, микроглиальных клеток (CD-68⁺), Bcl-2⁺ клеток - ингибитора апоптоза клеток, снижении количества клеток теней и Gfap⁺клеток - маркера астроцитов, восстановлении нейроваскулярной единицы, обеспечивающего работу гематоэнцефалического барьера.

Динамическое наблюдение миокарда спустя 30 суток ежедневных физических нагрузок и применения физ. раствора показало гетероморфизм кардиомиоцитов правого и левого желудочков. Сердечные мышечные клетки находились в состоянии пересокращения, наблюдались контрактурные изменения II и III степеней. Нарастал размер и полиморфизм ядер кардиомиоцитов, выявлялись ядра с опустошенной светлой кариоплазмой, либо с ее конденсацией. Обнаруживалась инфильтрация кардиомиоцитов макрофагами и сидерофагами. Также наблюдались зоны с признаками жировой дистрофии. У всех животных наблюдались нарушения гемодинамики, выражающиеся в венозном и капиллярном полнокровии, стазе эритроцитов. В межуточных пространствах определялись признаки кровоизлияния и гемморагического пропитывания, отека. Определялись признаки зернистой дистрофии кардиомицитов. Наблюдались участки некроза миокарда и признаки миоцитолизиса. Спустя 21 сутки в периваскулярном пространстве возле артерий и вен выявлялись отложения коллагеновых волокон, которые распространялись и в интерстициальное пространство.

После применения БМА при различных способах введения обнаружено, что через 21 сутки признаки периваскулярного и межуточного отека отсутствовали. В саркомерах мышечных клеток отмечалась регулярная поперечная исчерченность. Клетки плотно прилегали друг к другу. Состояние кровеносных сосудов было без особенностей. Степень выраженности интерстициального и периваскулярного фиброза была значительно меньше или отсутствовала совсем.

При морфометрическом анализе литически измененных кардиомиоцитов (ЛИ КМЦ) выявлены определенные различия между экспериментальными и контрольными группами. При внутримышечном введении БМА через 21-й день имело место значимое (Z=4.43, р<<0.0001) снижение численности ЛИ КМЦ до Ме=2 кл. (Q1=1, Q3=3 кл.). В контрольной группе напротив имело место значимое (Z=2.68, р<0.08) увеличение численности ЛИ КМЦ до Ме=25 кл. (Q1=20 кл., Q3=28 кл.), что кратно выше, чем в основной группе.

При акупунктурном введении физ. раствора на пятый день численность ЛИ КМЦ оказалась значимо (Z=4.98, р<<0.0001) выше, чем в основной группе - Ме=70 кл. (Q1=55 кл., Q3=78 кл.) против Ме=38 кл., (Q1=15 кл., Q3=64 кл.). А в опытной группе отмечена тенденция к понижению данных клеток к 21-й дню (Ме=2 кл., Q1=1 кл., Q3=3 кл.) против контрольной (Ме=15 кл., Q1=8 кл., Q3=20 кл.) (Z=4.68, р<<0.0001).

При сочетанном введении физ. раствора или БМА численность ЛИ КМЦ в ранние сроки в основной и контрольной группе не различалась (Z=1.5, р>0.12). А через 21-й день в основной группе было значимое снижение численности ЛИ КМЦ до уровня Ме=3 кл., (Q1=2 кл., Q3=5 кл.) (Z=3.94, р<<0.0001). В контрольной группе на этом этапе наблюдения напротив происходило значимое повышение численности ЛИ КМЦ до уровня Ме=54 кл. (Q1=19 кл., Q3=63 кл.), что было кратно выше (Z=2.94, р<0.003).

ЭКГ у интактных крыс показало, что у всех животных был правильный синусовый ритм с частотой сердечных сокращений (ЧСС) 420±25 уд/мин, отсутствовали нарушения проводимости и изменения в комплексе QRS-T (фигура 1А). ЭКГ экспериментальных животных в контрольной группе показала ЧСС 265 уд/мин. Зубец Р отрицательный, зубец U отсутствовал, большой вольтаж зубца S что, связано с нарушением метаболизма миокарда и его проводящей системы (фигура 1Б). Частота сердечных сокращений после применения БМА была 347±25 уд/мин. ЭКГ без особенностей, приближено к норме (фигура 2).

Следовательно, в группе животных после изнуряющей физической нагрузки и введения физ. раствора обнаружены контрактурные изменения кардиомиоцитов II и III степеней, миоцито лизис и некробиоз кардиомиоцитов, признаки умеренного липоматоза, нарушение микроциркуляции и обменных процессов, интерстициальное и периваскулярное фиброзное перерождение миокарда, что приводило к нарушению физиологической работы сердца, брадикардии. Спустя 21 сутки самопроизвольного полноценного восстановления ткани миокарда не происходило. Устойчивость животных к физической нагрузке была значимо ниже, чем у крыс основной группы.

После применения БМА при всех видах введения определены признаки кардиопротективного воздействия на миокард. Восстанавливалась микроциркуляция, снижалось количество ЛИ КМЦ, нивелировались некробиотические процессы, предупреждалось фиброзирование миокарда.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет повысить эффективность восстановления скелетной мускулатуры, неокортекса, миокарда, сократить время реабилитации лиц, выполняющих вынужденную физическую нагрузку.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Крысе-самцу линии Wistar массой 200 г ввели 0.2% суспензию диспергированного аллогенного биоматериала, полученного из сухожилий крыс, в физиологическом растворе внутримышечно по 0.5 мл в мышцы передних и задних конечностей после 30-ти дневного плавания с грузом. Общий объем суспензии составил 4.0 мл. После этого длительность плавания крысы через пять дней составила 7.5 минут, а на 21-й день 10.2 минут.При гистологическом исследовании в мышечных тканях снижалась воспалительно-клеточная инфильтрация, восстанавливалась полигональность профилей мышечных волокон, нивелировались отечные явления. Численность некротизированных мышечных волокон в бедренной мышце на поперечных срезах в полях зрения составила через 5 суток 0.94±0.1 волокна, через 21 сутки 0.25±0.02. ЭКГ показала правильный синусовый ритм с ЧСС 360±25 уд/мин, отсутствовали нарушения проводимости и изменения в комплексе QRS-T. Через 21 сутки морфогистологическая структура миокарда была приближена к норме. Деструктивных кардиомиоцитов не выявлено, признаков отека и воспаления не отмечено. Литически поврежденных кардиомиоцитов обнаруживалось 2±0.1 клетки в полях зрения. В нервной ткани коры головного мозга обнаружены все формы морфологической изменчивости нервных клеток, но многочисленную группу составили нормохромные и гипохромные нейроны, отражающие признаки морфофункциональной активности, по-сравнению с контрольной группой. Выявлено большое количество аксо-дендритных и аксо-аксонных синапсов, восстановление гематоэнцефалического барьера, сохранение структуры миелиновых облочек нейроцитов.

Крысе-самцу линии Wistar массой 200 г ввели физиологический раствор в общем объеме 4 мл внутримышечно по 0.5 мл в мышцы передних и задних конечностей после 30-ти дневного плавания с грузом. У крысы длительность плавания составила через 5 дней 2.5 минут, через 21-й день 6.3 минут. Скелетная мышечная ткань бедренных мышц характеризовалась выраженной реакцией со стороны сосудистого русла в виде расширения просвета сосудов и набухания сосудистой стенки, сопровождающимися периваскулярным отеком, стазом крови, дистрофическими изменениями мышечных волокон, связанными с контрактурами III и IV степени и их частичной фрагментацией. Численность некротизированных мышечных волокон через 5 суток составила 2.7±0.01 волокна, через 21 сутки - 2.1±0.03 волокно. ЭКГ обнаружила ЧСС 235±64 уд.мин. Зубец Р отрицательный, зубец U отсутствовал, определялся большой вольтаж зубца S. В миокарде сердца обнаруживались контрактурные изменения кардиомиоцитов II и III степеней, миоцитолизис и некробиоз кардиомиоцитов, признаки умеренного липоматоза, нарушение микро циркуляции и обменных процессов. Литически поврежденных кардиомиоцитов обнаруживались в количестве 25±1.1 клеток в полях зрения. В коре головного мозга определялись признаки дезорганизации архитектоники нейроцитов. Структура всех слоев нервных клеток четко не определялась. Обнаруживались деструктивные пикнотически измененные нейроциты, внутриклеточный отек нейроцитов и клетки - тени. Отмечены признаки нарушения гематоэнцефалического барьера: периваскулярные отеки, набухание базальной мембраны. Нейропиль характеризовался разволокнением профилей миелинизированных нервных волокон, выявлялся дефицит синаптических межклеточных контактов.

Пример 2.

Крысе-самцу линии Wistar массой 200 г ввели 0,2% суспензию диспергированного аллогенного биоматериала, полученного из сухожилий крыс, в физиологическом растворе акупунктурно по 0.2 мл в подкожно в следующие точки: Да-чжуй, парные точки Синь-нгу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо после 30-ти дневного плавания с грузом. Таких точек было 16. Суммарный объем суспензии 3.2 мл. После этого длительность плавания крысы через 5 дней составила 8.45 минут, а через 21-й 9.16 минут. В скелетной мышечной ткани бедренных мышц наблюдались признаки отека в ранних сроках, высокое содержание ядер мышечных клеток, умеренная воспалительно-клеточная инфильтрация, контрактильные изменения I степени. Численность некротизированных мышечных волокон в бедренной мышце на поперечных срезах в полях зрения составила через 5 суток 2.05±0.2 волокна, через 21 сутки 1.5±0.1. В миокарде крысы в периваскулярном пространстве обнаруживались тонкие прослойки коллагеновых волокон, что можно расценивать как отражение компенсаторных процессов замещения некротизированных кардиомиоцитов с целью поддержания механических свойств миокарда. В интерстиции признаки фиброза отсутствовали. Литически поврежденных кардиомиоцитов обнаруживалось 2±0.2 клетки в полях зрения. ЭКГ показала правильный синусовый ритм с ЧСС 370±28 уд/мин, отсутствовали нарушения проводимости и изменения в комплексе QRS-T. В нервной ткани коры головного мозга предцентральной извилины обнаруживались все слои нейроцитов, обнаруживались признаки морфофункциональной активации нервных клеток и синаптического аппарата.

Крысе-самцу линии Wistar массой 200 г ввели физиологический раствор акупунктурно в следующие точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо после 30-ти дневного плавания с грузом по 0.2 мл подкожно. Таких точек было 16. Суммарный объем физиологического раствора составил 3.2 мл. Длительность плавания у крысы через 5 дней составила 2.25 минут, на 21-й день 2.52 минут.В скелетной мышечной ткани бедренных мышц обнаруживались признаки дезорганизации мышечных волокон: отек, набухание, изменения тинкториальных свойств экстра- и интрафузальных мышечных волокон, воспалительно-клеточная инфильтрация. Численность некротизированных мышечных волокон в бедренной мышце через 5 суток составила 3.2±0.1 волокна, через 21 сутки - 2.7±0.3 волокно. В миокарде обнаруживались признаки интерстициального и периваскулярного фиброза миокарда, признаки интерстициального миокардита и ишемии. Численность литически поврежденных кардиомиоцитов составляла 38±2.1 клеток в полях зрения. ЭКГ в контрольной группе обнаружила ЧСС 220±64 уд/мин. Зубец Р отрицательный, зубец U отсутствует, большой вольтаж зубца S. В нервной ткани неокортекса определялась дезорганизация слоев нервных клеток, которая сохранялась на протяжении 21 суток. Обнаруживалось нарушение гемато-энцефалического барьера, пикнотические патоморфологические изменения нейроцитов, очаговый глиоз, вакуолизация нейропиля, низкая степень выраженности синаптического аппарата.

Пример 3.

Крысе-самцу линии Wistar массой 200 г ввели 0.2% суспензию диспергированного аллогенного биоматериала, полученного из сухожилий крыс, в физиологическом растворе акупунктурно по 0.2 мл в следующие точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо и внутримышечно по 0.5 мл в мышцы передних конечностей и задних конечностей после 30-ти дневного плавания с грузом. Суммарный объем суспензии составил 7.2 мл. После сочетанного введения суспензии БМА длительность плавания крысы через 5 дней составила 8.09 минут, а через 21-й 8.47 минут.При гистологическом исследовании в мышечной ткани патоморфологических признаков выявлено не было как в начальных, так и отдаленных сроках. Ультраструктура миосимпластов отражала сохранение энергетического баланса клеток и контрактильных структур. Признаки фиброза отсутствовали. Численность некротизированных мышечных волокон в бедренной мышце на поперечных срезах в полях зрения составила в опытной группе через 5 суток 0.8±0.1 волокна, через 21 сутки 0. 2±0.01. ЭКГ в опытной группе показала правильный синусовый ритм с ЧСС 400±30 уд/мин, отсутствовали нарушения проводимости и изменения в комплексе QRS-T. В миокарде у крысы спустя 21 сутки признаки периваскулярного и межуточного отека отсутствовали. В саркомерах мышечных клеток отмечалась регулярная поперечная исчерченность. Клетки плотно прилегали друг к другу. Состояние кровеносных сосудов было без особенностей. Литически поврежденных кардиомиоцитов обнаруживалось 3±0.1 клетки в полях зрения. В нервной ткани коры головного мозга спустя 21 сутки отмечались признаки повышенной функциональной активности гипер- и нормохромных нейронов, восстановление гематоэнцефалического барьера, усиление синаптического аппарата. Нейропиль был плотный, признаки отека не обнаруживались.

Крысе-самцу линии Wistar массой 205 г ввели физиологический раствор акупунктурно по 0.2 мл в следующие точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо и внутримышечно по 0.5 мл в мышцы передних конечностей и задних конечностей после 30-ти дневного плавания с грузом. Суммарный объем физиологического раствора составил 7.2 мл. У крысы в контрольной группе длительность плавания через 5 день составила 4.01 минут, на 21-й день 6.11 минут. При гистологическом анализе скелетной мышечной ткани выявлялись признаки жировой трансформации ткани на фоне периваскулярного склероза. Сосудистые стенки были инфильтрированы воспалительными клетками: эозинофилами, макрофагами с присутствием фибробластичесих клеток. Наблюдался отек периваскулярной зоны и перимизия. Численность некротизированных мышечных волокон в контрольной группе через 5 суток 3.2±0.1 волокна, через 21 сутки - 1.5±0.2 волокно. В миокарде выявлялись признаки воспалительно-клеточной инфильтрации возле некротически измененных кардиомиоцитов, а также признаки периваскулярного и интерстициального фиброза. Литически поврежденных кардиомиоцитов обнаруживалось 54±0.1 клетки в полях зрения. ЭКГ показала ЧСС 300±64 уд/мин. Зубец Р отрицательный, зубец U отсутствовал, большой вольтаж зубца S. В нервной ткани коры головного мозга спустя 21 сутки сохранялись признаки нарушения трофики, гематоэнцефалического барьера. В нейронах определялась деструкция пластинчатых структур, накопление пигмента старения, отек нейропиля. Отмечались апоптически измененные клетки, разрастание глии.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к кардиологии, физиологии. Крысе-самцу линии Wistar однократно вводят 0,2% суспензию диспергированного аллогенного биоматериала, изготовленного из сухожилий крыс. Биоматериал вводят в физиологическом растворе внутримышечно по 0,5 мл в мышцы передних и задних конечностей и/или подкожно в биологически активные точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо по 0,2 мл. Способ обеспечивает улучшение физиологических показателей, раннее и полноценное восстановление структуры тканей миокарда, скелетной мышечной ткани, неокортекса головного мозга, что в свою очередь дает возможность разработать методы лечения и реабилитации лиц, деятельность которых связана с интенсивной физической нагрузкой. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ стимуляции акто-, кардио- и нейропротекции в условиях вынужденной физической нагрузки в эксперименте, включающий использование биодеградируемого матрикса, отличающийся тем, что крысе-самцу линии Wistar в качестве биодеградируемого матрикса однократно вводят 0,2% суспензию диспергированного аллогенного биоматериала, изготовленного из сухожилий крыс, в физиологическом растворе внутримышечно по 0,5 мл в мышцы передних и задних конечностей и/или подкожно в биологически активные точки: Да-чжуй, парные точки Синь-шу, парные точки Ге-шу, парные точки Хуань-тяо, Чан-цян, парные точки Ян-лин-цюань, парные точки Шэнь-май, парные точки Вай-гуань, парные точки Чжоу-ляо по 0,2 мл.