Диагностическая тест-система для определения биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицинской биохимии. Описана диагностическая тест-система (ДТС) для выявления биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний, в том числе Болезни Альцгеймера или нейродегенеративных нарушений. Тест-система включает: внутренний стандарт, представляющий собой (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 13С2, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 15N, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом D, (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 18О, или их различные сочетания; набор калибраторов, представляющий собой ряд разведений 4S,7S,10S,13S-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты; контроль качества сигнала (QC) - ряд растворов (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты низкой, средней и высокой концентрации. Изобретение позволяет с высокой воспроизводимостью результатов и точностью измерения определять биомаркер, специфический для нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицинской биохимии, к количественному измерению субстанции (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-оваякислота (SRFM) в пробах плазмы крови человека по относительному отклику внутреннего стандарта (ВС) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС).

Уровень техники

Нейродегенеративные заболевания - группа в основном медленно прогрессирующих, наследственных или приобретенных заболеваний нервной системы. Общим для этих заболеваний является прогрессирующая гибель нервных клеток (нейродегенерация), ведущая к различным неврологическим симптомам - прежде всего, к деменции и нарушению движений. Заболевания могут наступить в различном возрасте, протекают диффузно или генерализированно, гистологически определяется специфический тип изменений [Пржедборски С, Вила М., Джексон-Льюис В. Нейродегенерация Архивная копия от 27 сентября 2020 на WaybackMachine. Пер. с англ. Н. Д. Фирсовой (2018)].

Доля нейродегенеративных заболеваний среди всех неврологических расстройств год за годом растет. Это объясняется длительностью латентного периода и манифестацией признаков после гибели около 40-60% нейронов.

По прогнозам ВОЗ в системе здравоохранения XXI века самой большой проблемой будут нейродегенеративные заболевания. Среди них наиболее острейшими можно считать болезни Альцгеймера и Паркинсона [Ф.А. Юсупов, Биомаркеры нейродегенеративных заболеваний, Бюллетень науки и практики, 2021, т.7, №9, с. 341-353].

Болезнь Альцгеймера - форма деменции, впервые описанная в 1907 году [Berchtold N.C., Cotman C.W. Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease: Greco-Roman period to the 1960s (англ.) // Neurobiology of Aging: journal. - 1998.- Vol.19, no. 3.- P. 173-189]. Как правило, она обнаруживается у людей старше 65 лет [Brookmeyer R., Gray S., Kawas С.Projections of Alzheimer's disease in the United States and the public health impact of delaying disease on set (англ.) // American Journal of Public Health (англ.) рус: journal.- 1998.- September (vol. 88, no. 9).- P. 1337- 1342], но существует и ранняя болезнь Альцгеймера- редкая форма заболевания. Общемировая заболеваемость на 2006 год оценивалась в 26,6 млн человек, а к 2050 году число больных может вырасти вчетверо [Brookmeyer R., Johnson Е., Ziegler-Graham К., Arrighi Н.М. Forecasting the global burden of Alzheimer's disease (англ.) // Alzheimer's and Dementia journal.- 2007.- July (vol. 3, no. 3).- P. 186-191].

Болезнь Паркинсона - медленно прогрессирующее хроническое нейродегенеративное неврологическое заболевание, характерное для лиц старшей возрастной группы [Samii A., Nutt J. G., Ransom В. R. Parkinson's disease (англ.) // The Lancet. - Elsevier, 2004. - Vol.363.- P. 1783-1793]. Относится к дегенеративным заболеваниям экстрапирамидной моторной системы. Вызвано прогрессирующим разрушением и гибелью нейронов, вырабатывающих нейромедиатор дофамин - прежде всего в черной субстанции, а также и в других отделах центральной нервной системы. Недостаточная выработка дофамина ведет к тормозному влиянию базальных ганглиев на кору головного мозга. Ведущими (основными, или кардинальными) симптомами являются: мышечная ригидность; гипокинезия; тремор; постуральная неустойчивость.

Боковой амиотрофический склероз (БАС), также известный как болезнь двигательных нейронов или болезнь Лу Герига, является редким и неизлечимым нейродегенеративным заболеванием, которое приводит к прогрессирующей потере двигательных нейронов, контролирующих произвольные мышцы ["Информационный бюллетень по заболеваниям двигательных нейронов", www.ninds.nih.gov. Национальный институт неврологических расстройств и инсульта. Архивировано с оригинала 10 октября 2020 года].

Нейродегенеративные заболевания головного мозга проявляются в разных возрастах, то есть не являются признаком старости. Ключевыми причинами нейродегенеративных заболеваний являются: сосудистые заболевания; генетическая предрасположенность; черепно-мозговые травмы; рак головного мозга; инфекции.

Одним из признаков нейродегенеративных заболеваний является деменция. На начальном этапе деменцию можно принять за рассеянность, которая свойственна многим людям. Таким образом, остро стоит вопрос о своевременном установлении факта начала нейродегенеративного заболевании, так как при своевременной диагностике можно замедлить течение заболевания, либо стабилизировать пациента на определенном уровне.

Диагностика нейродегенеративных заболеваний головного мозга довольно сложна. Диагностика включает анализ крови, МРТ, электроэнцефалограмму и люмбальную пункцию.

Если человек заподозрил у себя или своего члена семьи признаки деменции, для подтверждения диагноза необходимо пройти обследование у невролога, терапевта и окулиста, а также посетить психиатра, так как очень часто начало нейродегенеративного заболевания можно спутать с депрессией, когда также ухудшается память, начинаются проблемы с общением, восприятием, человек затрудняется в подборе слов. Признаками нейродегенеративного заболевания являются также нарушение слуха, иногда галлюцинации и бред. Чтобы поставить диагноз, помимо сдачи всех анализов, необходимо наблюдение пациента в течение полугода. Если в течение этого времени те же самые симптомы будут наблюдаться или же усугубляться, можно говорить о деменции.

Кроме того, симптомы деменции могут возникать на фоне побочных эффектов от некоторых лекарственных препаратов.

Таким образом, в уровне техники существует необходимость в средствах быстрой диагностики нейродегенеративных заболеваний- с помощью которых можно на самом раннем этапе отличить нейродегенеративное заболевание от любого другого состояния или заболевания.

Всегда предпочтительными являются менее инвазивные, атравматические методы, поэтому выявление биомаркеров в крови имеет преимущества перед выявлением в ликворе, получение которого более инвазивно. Удобным для диагностической работы субстратом является кровь. В уровне технике имеется недостаток инструментов, помогающих в установлении диагноза болезнь Альцгеймера, которые могут быть использованы применительно к образцам крови, полученной от пациентов.

Наиболее удобным форматом является ДТС для ВЭЖХ-МС. Существуют несколько специализированных и неспециализированных производителей различных вариантов ДТС для ВЭЖХ-МС, применяемых в области клинической диагностики, криминалистики, мониторинга лекарственных препаратов, допинговом контроле, токсикологии, сельском хозяйстве.

Максимальная автоматизация ДТС является необходимым условием высокой эффективности и воспроизводимости ДТС в условиях минимизации человеческого фактора. Со стороны оператора должны осуществляться строгий контроль над текущими операциями, предусмотренными ДТС и исполнением стандартной операционной процедуры (СОП), поддержание системы ДТС в работоспособном состоянии, а также интерпретация конечных результатов. Автоматизация ДТС не всегда реализуется в полной мере, но в настоящее время доступна с высокой степенью покрытия операций СОП. Автоматизация позволяет проводить контроль ошибок операций, конечных результатов измерения, обеспечивает непредвзятую оценку конечных результатов и их объективную оценку. Автоматизация позволяет значительно сократить время подготовки пробы, что является наиболее критическим и лимитирующим фактором в ДТС, минимизировать расход лабораторного материала, реагентов и ошибки на этапах подготовки биологического материала.

Эффективность считается первостепенной важностью в производстве и может быть определена как скорость производства, разделенная на такие ресурсы, как рабочая сила, исходные материалы, необходимые для достижения этой скорости. Обзор, проведенный в 2020 году за предшествующее десятилетие, свидетельствует, что до 89% исследований, проведенных в предыдущие годы вручную, могут быть автоматизированы в современных лабораторных условиях.

Использование роботизированных специализированных станций с возможностью программирования модульного или непрерывного цикла операций различной сложности является оптимальным решением автоматизации ДТС. Наиболее крупными и специализированными производителями таких роботизированных станция для медико-биологический исследований являются компании PerkinElmer (США; например, станции ряда JANUS G3 и др.), Hamilton (Швейцария; например, станции Microstar и др.), Agilent (США и Германия; модельный ряд Bravo), компания Gerstel (США; например, станции Maestro), компания Bionex (США; широкий ряд специализированных станций для молекулярной и синтетической биологии), Thermo Scientific (США), VTT совместно с Sartorius.

Раскрытия сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к ДТС для определения биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний и нейродегенеративных состояний, содержащая:

A) внутренний стандарт, представляющий собой (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 13С2, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 15N, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом D, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 18О, или их различные сочетания;

Б) набор калибраторов, представляющий собой ряд разведений (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты;

B) растворы контроля качества сигнала (QC) - ряд растворов (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты низкой, средней и высокой концентрации.

Внутренний стандарт может быть представлен в форме лиофилизата или аликвот.

Как видно, внутренний стандарт идентичен анализируемому соединению по химической структуре, но отличается изотопным составом. Существует несколько традиционных способов получения изотопомеров: метаболический, химический, как твердофазный, так и жидкофазный, и ферментативный. Для получения внутреннего стандарта для настоящего решения, был использован первый способ, который подразумевает добавление в питательную среду аминокислот, меченных стабильными изотопами D, 13С, 15N.

ДТС может быть дополнительно укомплектована растворителями для жидкостной экстракции (депротеинизации) и/или растворителями для твердофазной экстракции, а также инструкцией. Кроме того, ДТС может дополнительно содержать один или более планшетов, которые могут быть представлены планшетами конфигурации 48, 54 или 96 лунок, которые могут иметь идентичную конфигурацию. Один из планшетов может иметь коллектор для сбора фракции и представлять собой планшет с полупроницаемым плоским дном, объемом лунок не менее 2 мл, при этом планшет заполнен твердофазным анионообменным носителем, емкость связывания которого как минимум десятикратно превышает молярную концентрацию измеряемой эндогенной субстанции. Также планшет может представлять собой планшет с круглым или коническим непроницаемым дном.

ДТС может быть дополнительно укомплектована набором реагентов для подготовки пробы и/или набором реагентов для проведения инструментального анализа.

ДТС может быть дополнительно укомплектована программным обеспечением.

При автоматизации важную роль играет скорость аспирации жидкости (растворителей), вязкость и текучесть ввиду того, что в автоматическом режиме подготовки пробы используются большие объемы реагентов и растворителей, которые в рабочем режиме хранятся при комнатной или пониженной температуре. Скорость аспирации будет изменять концентрацию компонентов буферных растворов и изменять их физико-химические свойства (ионную силу, рН). В свою очередь, это будет влиять на конечный результат анализа и весь процесс подготовки пробы. Вязкость растворов и растворителей должна быть учтена для правильного выбора режима пипетирования и отбора пробы и растворителей: растворы с высокой и низкой текучестью или температурой вспышки (давления паров над раствором: например, гидроксид аммония и вода или ацетонитрил) требуют разных подходов к режиму отбора и пипетирования. Таким образом, в качестве зависимого фактора необходимо правильно подобрать объемы растворов и реагентов, стабильность которых будет сохраняться в течение длительного времени без значительных изменений физико-химических свойств в выбранных рабочих условиях.

Критически важным участком автоматизации ДТС является этап твердофазной экстракции. Осуществление этого этапа возможно либо на роботе со встроенной вакуумной станцией, либо на низкоскоростной центрифуге, совместимой с бакетным ротором типа «бабочки». При этом оба варианта предусматривают использование планшетов 48, 54 или 96 луночные или иной подходящей конфигурации с полупроницаемым дном и лунками достаточного объема - 1,5-3 мл, заполненных твердофазным носителем с достаточной емкостью связывания. Например, автоматизированные станции производства Agilent, PerkinElmer, Thermo Scientific предусматривают опциональную интеграцию вакуумной станции для микропланшетов, а станции производства Hamilton предусматривают манипуляторы для переноса микропланшетов в приставной интегрированный модуль низкоскоростной центрифуги. В тоже время, этот этап может быть осуществлен в полуавтоматическом режиме, где микропланшеты в бакетный ротор типа «бабочки» переносит оператор и отслеживает правильность на каждом этапе экстракции. Такой подход допустим, но требует контроля на каждом этапе экстракции, так как твердофазная экстракция характеризуется множественными промывками, элюцией и кондиционированиями носителя, что будет значительно увеличивать общее операционное время подготовки пробы, так как после каждого этапа во время экстракции от оператора требуется обратный перенос планшета в роботизированную станцию для заполнения лунок новым растворителем. Это требует также соблюдения температурных режимов и расстановки временных задержек между этапами, так как они не могут быть автоматизированы ввиду вмешательства оператора между различными этапами экстракции.

Таким образом, конструирование автоматизации ДТС требует вариации как минимум следующих параметров: объемы и режимы хранения, или выдерживания (стабильность) рабочих растворителей; стабильность ежедневных рабочих контрольных растворов; режимов перемешивания, пипетирования и центрифугирования или вакуумизации.

Внутренний стандарт рассчитывают, исходя из емкости (производительности) ДТС и он должен превышать таковую как минимум 10%. В целях сохранения стабильности, внутренний стандарт должен быть поставлен в сухом (лиофилизированном) виде, раствор которого стабилен при пониженной температуре +4°С…+6°С в течение всего срока эксплуатации ДТС. Альтернативно, внутренний стандарт может быть поставлен в виде нескольких аликвот, использование которых возможно по мере необходимости, если срок их хранения после растворения значительно ниже срока эксплуатации ДТС.

Как указано выше, комплектность может быть дополнена рядом других элементов: растворители, необходимые для жидкостной (первичной) экстракции, то есть для депротеинизации, и растворителями для твердофазной экстракции. В обоих случаях растворители могут быть поставлены готовыми или в виде отдельных компонентов для их составления. Однако вариант поставки готовых растворителей является преимущественным, так как исключает допущения, связанные с приготовлением из компонентов. Принципиальных предостережений для поставки готовых растворителей нет, так как они проявляют высокую стабильность в течение длительного времени хранения при пониженной температуре (месяцы, не менее трех месяцев) за исключением растворителей, содержащих гидроксид аммония и муравьиную кислоту. К таким растворителям рекомендуется поставка отдельных компонентов для составления конечной смеси, так как их стабильность значительно ниже из-за слишком большой разницы в температуре испарения среды растворителя и кислоты или основания: хранение таких растворителей в готовом виде в течение длительного времени грозит потерей их свойств.

В числе таких растворителей могут быть: вода, в том числе деионизированная, смесь метанола/ацетонитрила/воды, ацетонитрил, метанол, муравьиная кислота, гидроксид аммония. Поставка ацетонитрила, метанола и воды отдельно является целесообразной, так как каждый из этих компонентов отдельно используются для кондиционирования твердофазного носителя, а также для составления промывочных и элюирующих растворителей в смеси с муравьиной кислотой+ацетонитрил и гидроксидом аммония + вода деионизированная.

В комплектность ДТС необходимо внести набор из калибраторов и растворов ежедневной или по мере необходимости проверки- QC нижнего, среднего и верхнего уровня калибровки, в случае проведения инструментального анализа в той же лаборатории, где осуществляется подготовка биологического материала. Частью комплектации ДТС является отрицательный и положительный контроль.

Растворы ежедневной или по мере необходимости проверки представляют собой раствор внутреннего стандарта в известной концентрации. Растворы ежедневной или по мере необходимости проверки должны максимально охватывать диапазон калибровочной кривой и лежать внутри линейной области калибровочной кривой, то есть охватывать два или три уровня калибровочный кривой при этом нижний уровень всегда является обязательным. Контроль сигнала осуществляется путем расчета относительного коэффициента сигнала уровней друг к другу или путем относительного сигнала стандартов с различной изотопной композицией в случае, если растворы ежедневной или по мере необходимости проверки представляет собой смесь внутреннего стандарта, содержание которой варьирует в зависимости от уровня, а содержание внутреннего стандарта остается неизменным на каждом уровне. Растворы ежедневной проверки могут быть приготовлены в органических растворителях или их водных растворах в зависимости от назначения: стоковый или рабочий раствор, и должны быть протестированы предварительно на стабильность в течение длительного времени.

Калибраторы могу быть поставлены вместе с ДТС в том случае, если лаборатория, осуществляющая подготовку пробы, также может проводить дальнейший инструментальный анализ. Как минимум пять уровней калибраторов необходимы в комплектации ДТС для построения калибровочной кривой.

Для приготовления контрольных проб может быть использована истощенная коммерческая плазма крови, например, Ultra-low steroid, drag-depleted DDC Mass Spect Gold® Serum (производства Sigma-Aldrich), доступная в объемах по 100, 300 или 1000 мл. Альтернативно, может быть использован лиофилизат нормальной или патологической плазмы крови для приготовления контрольных растворов матрицы отечественного производства (Российская Федерация), например, плазма-Н, приготовленная из пула образцов плазмы крови здоровых добровольцев (назначение препарата- ежедневные проверки контроля качества системы) или патологическая плазма-МК2- оба препарата отечественного производства НПО «Ренам». Этот вариант является более удобным, так как лиофилизат не требует строгих условий хранения, тогда как раствор DDC MassSpectGoldSerum® поставляется в виде плазмы и требует соблюдения строгих условий хранения и стабилизации. Однако приготовление положительного и отрицательного контролей на основе плазмы крови человека может быть проблемой в виде того, что измеряемая субстанция является эндогенной и может присутствовать a priori в коммерческом препарате, таким образом, величина сигнала после добавления известной концентрации интактной молекулы (экзогенная субстанция) и внутреннего стандарта, может варьировать от серии к серии при производстве. Поэтому в качестве матрицы целесообразно использовать животную плазму крови, в которой по предварительным данным отсутствует измеряемая субстанция, либо дополнительная проверка и контроль на наличие эндогенной субстанции в коммерческой плазме крови человека, как указано выше при этом в каждом лоте ad hoc необходимо вводить поправку на концентрацию уже присутствующей эндогенной субстанции. Выбор матрицы должен быть сделан должным образом ad libitum, так как от него зависит матриксный эффект и корректировка расчетной концентрации измерений эндогенной субстанции в биологическом материале.

Планшет для депротеинизации с конфигураций 48, 54 или 96 лунок или иной конфигурации может входить в комплектацию ДТС, так как является неотъемлемой частью процесса подготовки биологического материала. Планшет должен быть с полупроницаемым плоским дном, объемом лунок не менее 2 мл и заполнен твердофазным анионообменным носителем, емкость связывания которого должна как минимум десятикратно превышать молярную концентрацию измеряемой эндогенной субстанции. Планшет должен быть совместим как с адаптером вакуумной станции роботизированной рабочей станции, так и с бакетным ротором типа «бабочки» для низкоскоростной центрифуги. Планшет должен быть оснащен коллектором для сбора фракции с эндогенной субстанцией после элюции на последнем этапе твердофазной экстракции и должен иметь объем не менее 500 мкл на каждую лунку.

Планшет для первичной жидкостной экстракции должен иметь конфигурацию, идентичную планшету для твердофазной экстракции и должен иметь круглое или коническое непроницаемое дно с объемом лунок не менее десяти объемов исходного объема биологической пробы. Планшет должен быть совместим с бакетным ротором типа «бабочки» центрифуги. Отбор надосадочной жидкости из лунок после депротеинизации и центрифугирования должен осуществляться роботизированной станцией строго количественно с выбором режима, наиболее оптимального для отбора смеси органических текучих растворителей.

Выбор температурного режима и рН проведения различных операционных процедур в автоматизированном режиме требует отдельной проверки, так как эти параметры могут отличаться от тех, что были установлены в исследовательском режиме. Проверка этих параметров имеет большую важность, так как они влияют на растворимость белков во время преципитации и кинематические параметры подвижной фазы во время твердофазной экстракции: скорость и реологическая вязкость, что как следствие будет оказывать определенной влияние на форму (морфологию) хроматографического пика измеряемой субстанции и корректность ее количественного измерения.

Во внутреннем стандарте и калибраторе используется SRFM. SRFM является физиологически активным веществом, которое секретируют нейроны. SRFM представляет собой вещество брутто-формулой C21H31N709, химическим наименованием в соответствие с номенклатурой ИЮПАК (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота и точной молекулярной массой 525.218328 атомных единиц массы. Авторами настоящего изобретения показано, что культивируемые нейроны человека секретируют физиологически активное вещество SRFM в культуральную среду, где концентрация SRFM достигает значения насыщения на уровне около ста пикограммов на миллилитр. Таким образом, секреция SRFM является нормальной функцией нейронов человека.

Было определено, что уровень секретируемого вещества SRFM в плазме крови здоровых людей находится на уровне 237-771 пг/мл в возрастной группе от 31 до 50 полных лет и на уровне 135-495 пг/мл в возрастной группе от 51 до 80 полных лет. Широкий разброс значений обусловлен вариацией возраста, генетикой, перенесенными ранее заболеваниями, образом жизни и другими биологическими и социокультурными факторами, поэтому физиологические пределы концентрации вещества SRFM в крови могут быть больше и составлять от 1 до 5000 пг/мл.

Определение концентрации SRFM в плазме крови определяли в двух возрастных группах здоровых людей: от 31 года до 50 полных лет и от 51 года до 80 полных лет, что обусловлено особенностями дебюта, проявления и манифестации нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Так, болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Паркинсона (БП) проявляются в возрасте после 60 лет и лишь у 5%- 10% людей дебют может проявляться в более раннем возрасте, однако в таком случае чаще всего он обусловлен наследственными причинами (данные по всему миру от Национального Института Старения (США) NIH National Institute on Aging в последней редакции от 14 апреля 2022 года и Медицинского Института Джона Хопкинса (США)). В тоже время возраст диагностики и дебюта бокового амиотрофического склероза (БАС) составляет от 40 лет и в некоторых случаях (до 10%) даже ранее этого возраста (данные специалистов Национальной Клиники Специальной Хирургии США (HSS, Hospital for Special Surgery of the USA), дата доступа 02 марта 2023 года, ссылка https://www.hss.edu/condition-list_amyotrophic-lateral-sclerosis.asp) и Медицинского Институт Джона Хопкинса (США), дата доступа 02 марта 2023 года, ссылка https://www.hopkinsmedicine.org/health/conditions-and-diseases/amvotrophic-lateral-sclerosis-als). Причины черепно-мозговых травм (ЧМТ) лежат за пределами возрастных ограничений, так как они возникают вследствие либо механических травм и повреждения, либо как следствие инфекционных заболеваний, в том числе, перенесенных субклинических инфекций. Таким образом, ЧМТ охватывает широкий круг возрастных групп и укладывается в общий диапазон от 31 до 80 лет целевой потенциальной аудитории.

Измерение уровня секретируемого SRFM в плазме крови основано на применении метода ВЭЖХ-МС с детектированием молекулярных ионов SRFM и его фрагментов.

Пробоподготовка заключается в выделении SRFM из плазмы крови. Предварительно в пробу плазмы крови добавляют химически идентичный молекуле SRFM, но отличный по изотопной композиции, внутренний стандарт в известной концентрации до конечной концентрации от 500 пг/мл до 1000 пг/мл. К образцу плазмы крови с внутренним стандартом добавляют семь объемов смеси органических растворителей (метанол, ацетонитрил и вода в объемных отношениях 7:2:1) и инкубируют в течение 10 минут при температуре 40°С в течение 10 минут. Затем полученную взвесь центрифугируют при 15000 g при температуре 10°С в течение 10 минут, полученную надосадочную жидкость переносят к 5 мл охлажденного 2,5% водного раствора гидроксида аммония для получения первичного экстракта. Из полученного раствора экстрагируют SRFM вместе с внутренним стандартом методом твердофазной экстракции на смешанном анионообменном крупнопористом носителе. При этом количество носителя не должно быть менее 30 мг. Носитель предварительно кондиционируют последовательно в метаноле, затем в ацетонитриле, затем в воде. Все растворители однократно по 1 мл. Затем сенсибилизируют в 2 мл водного раствора 2,5% гидроксида аммония, который используют не охлажденный. После чего наносят первичный экстракт на сенсибилизированный носитель. Затем носитель промывают последовательно в 1 мл 2,5% гидроксида аммония, также не охлажденном, в 1 мл воды, в 2 мл 60% метанола (охлажденного). Носитель немного подсушивают при-5 мм. рт.ст., а затем проводят элюцию SRFM и внутреннего стандарта в 700 мкл 3% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Полученный экстракт переводится в водную фазу через выпаривание органической фазы (ацетонитрила) под вакуумом при температуре не выше 45°С, затем восстановленный в водном растворе 0,5% муравьиной кислоты сухой остаток можно использовать для ВЭЖХ-МС анализа. Нижним пределом количественного обнаружения SRFM в условиях ВЭЖХ-МС является 25 пг/мл, нижним пределом обнаружения сигнала (предел детекции) является 10 пг/мл.

В проведенном исследовании уровень секретируемого SRFM в плазме крови у пациентов в возрасте от 62 до 84 лет с диагнозом болезни Альцгеймера определяли в диапазоне 39-111 пг/мл. На умеренной стадии развития болезни Альцгеймера уровень секреции SRFM в плазме крови определяли в диапазоне 67-111 пг/мл. На тяжелой стадии развития болезни Альцгеймера уровень секреции SRFM в плазме крови определялся в диапазоне 39-83 пг/мл. При этом уровень секретируемого SRFM в плазме крови недементных добровольцев в возрасте от 51 до 80 лет определялся в диапазоне от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови дементных пациентов с прижизненным диагнозом болезни Альцгеймера значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты, и при этом возможно выявить степень тяжести данного заболевания.

В проведенном исследовании уровень секретируемого SRFM у пациентов с диагнозом болезнь Паркинсона в возрасте от 55 до 77 лет составлял от 35 до 101 пг/мл. При этом уровень SRFM в плазме крови недементных добровольцев в возрасте от 51 до 80 лет составлял от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови пациентов с прижизненным диагнозом болезни Паркинсона значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты.

В проведенном исследовании уровень секретируемого SRFM у пациентов с диагнозом бокового амиотрофического склероза (БАС) в возрасте от 31 до 47 лет составлял от 51 до 118 пг/мл. У пациентов на II стадии БАС уровень концентрации SRFM был выше 90 пг/мл, а у пациентов на III и IVa стадиях БАС этот уровень не превышал 76 пг/мл. При этом уровень секретируемого SRFM в плазме крови здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 50 лет составил от 237 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови пациентов с клиническим диагнозом БАС значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами, и при этом имеется различие в уровне концентрации SRFM между стадиями заболевания- чем выше стадия БАС, тем меньше уровень SRFM.

В проведенном исследовании уровень секретируемого SRFM у пациентов с черепно-мозговыми травмами в возрасте от 32 до 68 лет уровень секреции SRFM составлял от 61 до 98 пг/мл. При этом уровень SRFM в плазме крови здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 73 лет составил 135 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови пациентов с черепно-мозговыми травмами значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами.

В проведенном исследовании четырех пациентов с первоначальным диагнозом синдрома мягкого когнитивного снижения (МКС) определяли концентрацию секретируемого SRFM в образцах плазмы крови на протяжении пяти лет каждые полгода (всего 10 визитов с допустимым окном в 20 (двадцать) календарных дней, или ±10 (десять) календарных дней от даты очередного планового визита). Через пять лет двум пациентам из этой группы был поставлен диагноз болезнь Альцгеймера, другие два пациента оставались с диагнозом МКС. Из анализа изменений уровня секреции SRFM у пациентов с диагнозом МКС с течением времени установлено, что монотонное падение уровня концентрации SRFM в крови пациентов ассоциировано с прогрессированием деменции от мягкого когнитивного снижения (МКС) до ранних стадий болезни Альцгеймера. Показано, что по уровню SRFM можно выявить динамику развития заболевания и тяжесть его течения.

Таким образом, было показано, что нейроны способны к секреции SRFM, а секретируемый SRFM обнаруживается в крови человека, при этом уровень секретируемого SRFM зависит от состояния человека. Под действием нейротоксичного вещества происходит частичная или полная утрата способности нейронов секретировать SRFM.

Техническим результатом заявленного решения является высокая воспроизводимость результатов и точность измерения. Также техническим результатом является создание средства- ДТС определенного назначения-определение биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний.

Осуществления изобретения продемонстрировано следующими примерами

Пример 1. Получение (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты (SRFM)

SRFM получали из зрелых нейронов, которые получали из фибробластов кожи здорового человека через индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки и долгоживущие самообновляющиеся нейроэпителиоподобные стволовые клетки по нижеследующей схеме.

Индуцируемые плюрипотентные стволовые (iPS) клетки (iPS-клетки) были получены репрограммированием фибробластов с использованием SENDAI вируса согласно протоколу производителя (STEMCELL Techonogies). Затем iPS-клетки были дифференцированы согласно опубликованному методу (Koch Р, Opitz Т, Steinbeck JA, Ladewig J, BriistleO (2009) A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3225-3230) в долгоживущие самообновляющиеся нейроэпителиоподобные стволовые клетки (lt-NES-клетки). Полученные lt-NES-клетки далее по протоколу (Falk, A., P.Koch, J. Kesavan, Y. Takashima, J. Ladewig, M. Alexander, O. Wiskow, J. Tailor, M. Trotter, S. Pollard, A. Smithand O. Briistle (2012). Capture of Neuroepithelial-Like Stem Cells from Pluripotent Stem Cells Provides a Versatile System for in Vitro Production of Human Neurons. PLOS ONE 7(1): e29597) были с помощью удаления факторов роста индуцированы для дифференцирования в функциональные нейроны GABA-эргического фенотипа (около 90% от общего числа клеток) и в астроциты (около 10% от общего числа клеток). После окончания процессов дифференцирования полученная культура (нейронов и астроцитов) поддерживалась в течение 30 сут. Смена культуральной среды проводилась через каждые три дня, и в удаляемой среде определяли концентрацию секретируемого SRFM методом ВЭЖХ-МС. Было установлено, что в культуральной среде концентрация секретируемого SRFM оставалась на уровне в среднем около 100 пикограммов на миллилитр в течение всего срока наблюдений (30 сут).

Пример 2. Получение (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты, меченной изотопом 13С

Аналогично примеру 1 с добавлением в питательную среду аминокислот, меченных стабильным изотопом 13С.

Пример 3. Получение (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты, меченной изотопом 15N

Аналогично примеру 1 с добавлением в питательную среду аминокислот, меченных стабильным изотопом 15N.

Пример 4. Получение (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты, меченной изотопом D

Аналогично примеру 1 с добавлением в питательную среду аминокислот, меченных стабильным изотопом D.

Пример 5. (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты, меченной изотопом 18О.

Аналогично примеру 1 с добавлением в питательную среду аминокислот, меченных стабильным изотопом 18О.

Пример 6. Получение смеси (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой, меченной изотопом 13С, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой, меченной изотопом 15N, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой, меченной изотопом D, (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислоты, меченной изотопом 18О.

Аналогично примеру 1 с добавлением в питательную среду смеси аминокислот, меченных стабильными изотопами 13С, 15N, 18О и D.

Пример 7. Определение концентрации секретируемого SRFM в плазме крови

Забор венозной крови проводили у здоровых добровольцев (возрастные группы от 31 до 50 полных лет и от 51 до 80 полных лет; возрастной интервал генерализованной выборки от 31 до 80 полных лет) и затем готовили аликвоты плазмы крови (ЭДТА-2К+), которые замораживали для длительного хранения.

Перед замораживанием образец крови каждого пациента был разделен на два для проверки воспроизводимости и точности результатов. Таким образом, каждый из образцов был проверен дважды. При этом были получены идентичные результаты для каждого из образцов.

Регистрацию сигнала секретируемого SRFM в плазме крови (ЭДТА-2К+) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) в режиме положительной электростатической ионизации и тандемного или адресного сканирования по прекурсорному и фрагментным ионам. Количественную оценку проводили по площади или высоте хроматографического пика изолированного ионного тока прекурсорного иона или базового фрагментного иона-квантора секретируемого SRFM и внутреннего стандарта SRFM, меченного изотопом 13С2, отличающегося от SRFM по изотопному составу из-за включения двух изотопов [13С2] атома углерода, то есть отличного от SRFM на +2.00671 атомных единиц массы.

Использование внутреннего стандарта приводит к точности получаемых результатов.

Пример 8. Использование SRFM, меченного стабильным изотопом, на примере 13С2

Выделение секретируемого SRFM проводили из плазмы крови, предварительно добавив в нее внутренний стандарт SRFM, меченный изотопом 13С2, в известной концентрации, в пределах от 100 пг/мл до 1000 пг/мл. Следует указать, какие конкретно концентрации были использованы. Были использованы концентрации 100 пг/мл, 1000 пг/мг, также 300 пг/мл, 400 пг/мл, 500 пг/мл или 600 пг/мл. Выделение секретируемого SRFM вместе с внутренним стандартом SRFM, меченным изотопом 13С2, осуществляли последовательно путем жидкостной экстракции в смеси растворителей: метанол, ацетонитрил, вода и твердофазной экстракции на смешанном анион-обменном крупнопористом носителе с конечной элюцией в закисленном органическом растворителе (ацетонитриле). Полученный экстракт переводили в водную фазу через выпаривание органической фазы в вакууме, затем восстановленный в слабом кислом водном растворе сухой остаток использовали для ВЭЖХ-МС анализа.

Таким образом, аликвота плазмы крови после необходимых лабораторных процедур, направленных на получение обогащенной по SRFM и внутреннему стандарту фракции, анализировалась количественным методом масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и внутреннего изотопно-меченного стандарта.

Было определено, что концентрация секретируемого SRFM в исследованных образцах (N=30) составляла от 135 до 771 пг/мл. Погрешность всех измерений составляла не более 10% на нижних уровнях измерение от 25 до 100 пг/мл и не более 5% на средних и верхних уровнях измерений, более 100 пг/мл, но менее 5000 пг/мл.

У десяти пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера в возрасте от 62 до 84 лет уровень концентрации SRFM составил от 39 до 111 пг/мл.

Аналогичный анализ концентрации SRFM в крови пятнадцати здоровых добровольцев в возрасте от 51 года до 80 лет выявил, что у таких добровольцев концентрация секретируемого SRFM составляла от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови дементных пациентов с прижизненным диагнозом болезни Альцгеймера значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты, и при этом имеется существенное различие между альцгеймеровскими пациентами на умеренной и тяжелой стадиях заболевания.

С использованием количественного метода анализа концентрации секретируемого SRFM установлено, что у девяти пациентов с диагнозом болезни Паркинсона в возрасте от 55 до 77 лет уровень концентрации SRFM составил от 35 до 101 пг/мл.

Аналогичный анализ концентрации секретируемого SRFM в крови пятнадцати недементных добровольцев в возрасте от 51 года до 80 лет выявил, что концентрация SRFM составляла от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови пациентов с прижизненным диагнозом болезни Паркинсона значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты.

С использованием количественного метода анализа концентрации SRFM установлено, что у десяти пациентов с диагнозом БАС в возрасте от 31 до 47 лет уровень концентрации SRFM составил от 51 до 108 пг/мл. При этом у пациентов на II стадии БАС (N=5) уровень секреции SRFM был выше 90 пг/мл, а у пациентов на III и IVa стадиях БАС (N=5) этот уровень не превышал 76 пг/мл.

Аналогичный анализ концентрации SRFM в крови пятнадцати здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 50 лет выявил, что у таких добровольцев концентрация SRFM составляла от 237 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови пациентов с клиническим диагнозом БАС значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами, и при этом имеется различие в уровне концентрации секретируемого SRFM между стадиями заболевания-чем выше стадия БАС, тем меньше уровень SRFM.

С использованием количественного метода анализа концентрации SRFM установлено, что у двенадцати пациентов с ЧМТ в возрасте от 32 до 68 лет уровень концентрации SRFM составлял от 61 до 98 пг/мл.

Аналогичный анализ концентрации секретируемого SRFM в крови восемнадцати здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 73 лет выявил, что у таких добровольцев концентрация SRFM составляла от 135 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация секретируемого SRFM в крови пациентов с ЧМТ значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами.

С использованием метода ВЭЖХ-МС аналогично определяли уровень секреции SRFM во времени в плазме крови у пациентов с синдромом МКС.

Были отобраны четверо пациентов с установленным синдромом МКС, которых наблюдали в течение 5 лет (всего 10 визитов) с интервалом 6 месяцев (с допустимым окном в 20 дней от даты очередного планового визита). Во время каждого планового визита у каждого пациента проверяли уровень SRFM и наличие прогрессирования синдрома МКС. Оценивали память, внимание, концентрация, восприятие информации, логическое мышление и др.

У двух пациентов (001, 003) с синдромом МКС при их осмотре когнитивные функции не снижались с течением времени на протяжении 5 лет обследования. При этом у пациента 001 уровень секреции SRFM упал с 141 до 120 пг/мл за все время наблюдения. У пациента 003 уровень SRFM упал с 125 до 96 пг/мл. Изменения уровня секреции SRFM для пациентов составила примерно не более 20% за каждые 6 месяцев наблюдения.

У двух пациентов (002, 004) с синдромом МКС при их осмотрах на протяжении 5 лет когнитивные функции были снижены по сравнению с нулевым (контрольным) обследованием, при этом уровень секреции SRFM падал более чем на 20% между обследованиями. Через 2 года исследования в 2019 году пациентам был поставлен диагноз болезнь Альцгеймера (G30.0 по МКБ-10), а уровень секретируемого SRFM за это время снизился в 2 раза для пациента 002 ив 1,5 раза для пациента 004. Причем концентрация секретируемого SRFM продолжила снижаться при дальнейшем наблюдении, а на полугодовых осмотрах наблюдалось прогрессивное снижение когнитивных функций.

Таким образом, по изменению уровня секреции SRFM во времени можно выявить динамику развития заболевания и тяжесть его течения.

Пример 9. Определение концентрации секретируемого SRFM в культуральной среде нейрональных клеток человека в норме

Зрелые нейроны были получены из фибробластов кожи здорового человека через индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки (in English: induced pluripotent stem cells, iPScells) и долгоживущие самообновляющиеся нейроэпителиоподобные стволовые клетки (in English: long-term self-renewing neuroepithelial-like stem cells, lt-NES cells) по нижеследующей схеме.

Индуцируемые плюрипотентные стволовые (iPS) клетки (iPS-клетки) были получены репрограммированием фибробластов с использованием SENDAI вируса согласно протоколу производителя (STEMCELL Techonogies). Затем iPS-клетки были дифференцированы согласно опубликованному методу (Koch Р, Opitz Т, Steinbeck JA, Ladewig J, Briistle О (2009) A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3225-3230) в долгоживущие самообновляющиеся нейроэпителиоподобные стволовые клетки (lt-NES-клетки). Полученные lt-NES-клетки далее по протоколу (Falk, A., P.Koch, J. Kesavan, Y. Takashima, J. Ladewig, M. Alexander, O. Wiskow, J. Tailor, M. Trotter, S. Pollard, A. Smithand O. Briistle (2012). Capture of Neuroepithelial-Like Stem Cells from Pluripotent Stem Cells Provides a Versatile System for in Vitro Production of Human Neurons. PLOS ONE 7(1): e29597) были с помощью удаления факторов роста индуцированы для дифференцирования в функциональные нейроны GABA-эргического фенотипа (около 90% от общего числа клеток) и в астроциты (около 10% от общего числа клеток). После окончания процессов дифференцирования полученная культура (нейронов и астроцитов) поддерживалась в течение 30 сут. Смена культуральной среды проводилась через каждые три дня, и в удаляемой среде определяли концентрацию секретируемого в культуральную среду SRFM методом ВЭЖХ-МС. Было установлено, что в культуральной среде концентрация SRFM оставалась на уровне в среднем около 100 пикограммов на миллилитр в течение всего срока наблюдений (30 сут).

Смена культуральной среды проводилась через каждые три дня, и для проведения измерений концентрации секретируемого в культуральную среду SRFM удаляемая среда анализировалась на содержание в ней SRFM методом ВЭЖХ-МС.

Было установлено, что в культуральной среде концентрация SRFM оставалась на уровне около 100 пикограммов на миллилитр в течение всего срока наблюдений (30 дней).

Таким образом, показано, что физиологически активное вещество SRFM является продуктом, секретируемым нейронами человека в норме.

Пример 10. Определение концентрации SRFM, секретируемого в культуральную среду нейрональными клетками человека после воздействия нейротоксичным веществом isoAp.

Нейроны человека, полученные в соответствии с Примером 8 настоящего изобретения, были использованы для анализа возможных изменений в секреции SRFM при добавлении в культуральную среду синтетического аналога бета-амилоида с изомеризованным остатком Asp7 (isoAP) так, чтобы концентрация isoAp в растворе составляла 100 нанограммов в миллилитре.

Было показано, что под воздействием isoAp уровень концентрации SRFM, секретируемого нейронами в культуральную среду, снижался ниже пределов количественного обнаружения (ниже 25 пг/мл) и не восстанавливался в течение всего времени наблюдений (30 дней).

Пример 11. Конкретные воплощения ДТС

Набор реагентов предназначен для определения концентрации SRFM в ЭДТА-плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией.

SRFM представляет собой низкомолекулярный тетрапептид с молекулярной массой 525 Да и предположительно принадлежит к семейству гормоноподобных иммунорегуляторов, то есть цитокинов, играющего роль межклеточного медиатора при физиологических и патологических реакциях нервной системы человека. Уровень SRFM снижается у больных, страдающих нейродегенеративными заболеваниями и нарушениями, вызванными врожденными (наследуемыми), физиологическими, токсическими и механистическими причинами.

Количественное определение SRFM в плазме крови человека позволяет проводить дифференциальную диагностику нейродегенеративных заболеваний и нарушений функции нервной системы человека.

Набор рассчитан на 86 тестов, 5 калибровочных образцов, 2 образца положительного контроля (при независимых постановках), 2 образца отрицательного контроля (при независимых постановках) и 1 образец системного бланка.

В наборе используется внутренний стандарт SRFM с включением одного из стабильных изотопов водорода 2Н, углерода 13С, азота 15N или кислорода 18О или их различной количественной и качественной комбинации.

Чувствительность. Минимальная количественная чувствительность составляет 25 пг/мл.

Линейность. Отклонение от расчетной величины концентрации SRFM при разведении анализируемых проб ЭДТА плазмы крови человека составляет 2.87%.

Воспроизводимость. Коэффициент вариации внутридневной воспроизводимости результатов измерения не превышает 1.027%; коэффициент вариации между различными сериями измерений не превышает 1.037%.

Точность. Проверка проводилась тестом на соответствие измеренной концентрации SRFM, предписанной в образце, калибровочному раствору. Точность измерения не превышает 10% в пределах от 90% до 110%.

Клиническая проверка. Концентрация SRFM, измеренная в ЭДТА плазме крови, взятой у 100 здоровых добровольцев (50 мужчин и 50 женщин в возрасте 49.3±13.8 лет) составила 342 пг/мл с 95% CI [300.25, 383.75]. Статистических отличий между мужской и женской частями исследованной популяции не обнаружено.

Вариант комплектации:

А: Внутренний стандарт - пробирка стеклянная с коническим дном, 1 мкг сухого вещества; 1 шт.

В1: Положительный контроль - пробирка стеклянная с коническим дном, 50 мг сухого вещества; 1 шт.

В2: Отрицательный контроль - пробирка стеклянная с коническим дном, 50 мг сухого вещества; 1 шт.

С1: верхний стандарт качества сигнала - пробирка стеклянная с коническим дном, 4 нг сухого вещества, 1 шт.

С2: средний стандарт качества сигнала - пробирка стеклянная с коническим дном, 2.5 нг сухого вещества, 1 шт.

С3: нижний стандарт качества сигнала - пробирка стеклянная с коническим дном, 1 нг сухого вещества, 1 шт.

D1 - D5: калибровочные образцы на основе ЭДТА плазмы крови человека, аттестованные относительно стандарта ВОЗ, содержащие известные количества SRFM- 50 пг/мл, 250 пг/мл, 500 пг/мл, 1000 пг/мл и 2000 пг/мл; 5 шт. Концентрации калибровочных растворов могут отличаться от величин, указанных в Инструкции: необходимо смотреть точные величины на этикетках калибровочных растворов.

Е1: раствор для депротеинизации- флакон из темного стекла объемом 150 мл; 1 шт.

Е2: стоковый раствор для сенситизации и уравновешивания- флакон из темного стекла объемом 30 мл; 1 шт.

F1: раствор для кондиционирования- флакон из темного стекла объемом 150 мл; 1 шт.

F2: раствор для кондиционирования- флакон из темного стекла объемом 150 мл; 1 шт.

F3: компонент для приготовления раствора для элюции- флакон из темного стекла объемом 5 мл; 1 шт.

Планшет разборный (12 восьмилуночных стрипов) или неразборный (96 лунок) с твердофазным анион-обменным носителем- 1 шт.

Планшет неразборный для сбора элюата- 1 шт.

Пленка для заклеивания планшета- 2 шт.

Другие варианты комплектации:

Комплектация 1:

(1) методическое руководство стандартных операционных процедур и рекомендаций;

(2) внутренний стандарт, рассчитанный, исходя из емкости (производительности) ДТС и превышающий таковую как минимум 10%, в сухом (лиофилизированном) виде, раствор которого стабилен при пониженной температуре от +4°С до +6°С;

(3) растворители, необходимые для жидкостной экстракции (первичной экстракции), то есть для депротеинизации;

(4) растворители для твердофазной экстракции;

(5) калибраторы;

(6) растворы проверки калибровки (QC нижнего, среднего и верхнего уровня калибровки);

(7) отрицательный и положительный контроль;

(8) планшет для депротеинизации в конфигурации 48, 54 или 96 лунок с полупроницаемым плоским дном, объем лунок 2 мл, заполнен анион-обменным твердофазным носителем, емкость связывания которого десятикратно превышает молярную концентрацию измеряемой эндогенной субстанции, оснащен коллектором для сбора фракции с эндогенной субстанцией после элюции на последнем этапе твердофазной экстракции и имеет объем 500 мкл на каждую лунку;

(9) планшет для первичной жидкостной экстракции имеет конфигурацию, идентичную планшету для твердофазной экстракции (8) и имеет круглое или коническое непроницаемое дно.

Комплектация 2:

(1) методическое руководство стандартных операционных процедур и рекомендаций;

(2) внутренний стандарт, рассчитанный, исходя из емкости (производительности) ДТС и превышающий таковую как минимум 10%, в виде нескольких аликвот;

(3) растворители, необходимые для жидкостной экстракции (первичной экстракции), то есть для депротеинизации;

(4) растворители для твердофазной экстракции;

(5) калибраторы;

(6) растворы проверки калибровки (QC нижнего, среднего и верхнего уровня калибровки);

(7) отрицательный и положительный контроль. Комплектация 3:

(1) внутренний стандарт, рассчитанный, исходя из емкости (производительности) ДТС и превышающий таковую как минимум 10%, в сухом (лиофилизированном) виде, раствор которого стабилен при пониженной температуре от +4°С до +6°С;

(2) калибраторы;

(3) растворы проверки калибровки (QC нижнего, среднего и верхнего уровня калибровки).

Комплектация 4:

(1) методическое руководство стандартных операционных процедур и рекомендаций;

(2) внутренний стандарт, рассчитанный, исходя из емкости (производительности) ДТС и превышающий таковую как минимум 10%, в сухом (лиофилизированном) виде, раствор которого стабилен при пониженной температуре от +4°С до +6°С;

(3) растворители, необходимые для жидкостной экстракции (первичной экстракции), то есть для депротеинизации;

(4) растворители для твердофазной экстракции;

(5) калибраторы;

(6) растворы проверки калибровки (QC нижнего, среднего и верхнего уровня калибровки);

(7) отрицательный и положительный контроль;

(8) две спин-колонки. Комплектация 5:

(1) внутренний стандарт, рассчитанный, исходя из емкости (производительности) ДТС и превышающий таковую как минимум 10%, в сухом (лиофилизированном) виде, раствор которого стабилен при пониженной температуре от +4°С до +6°С.

Пример 12. Способ использования тест-системы

При осуществлении способа было использовано следующее оборудование и материалы:

Шейкер термостатируемый орбитального типа, позволяющий производить встряхивание при температуре 40±1°С при скорости 1100-1300 об/мин;

Холодильник бытовой;

Пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками для отбора жидкости объемом 10, 100, 1000 мкл или пипетки полуавтоматические многоканальные со сменными наконечниками для отбора жидкости объемом 10, 100, 1000 мкл;

Центрифуга термостатируемая с угловым ротором для пробирок на 1.5 мл и возможностью поддержки температуры не выше 10°С и ускорения не менее 15000 g;

Вакуумная станция для планшетов или бакетный ротор «бабочка» для планшетов;

Бутыль вместимостью до 1 л и вместимостью до 500 мл; Вода деионизованная; Перчатки одноразовые неопудренные; Дезинфицирующие растворы.

Анализируемый образец- плазма крови, полученная с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта.

Образец ЭДТА плазмы крови хранили при температуре 2°С-8°С менее суток.

Второй образец хранили при температуре минус 20°С три месяца.

Образцы тщательно перемешали и центрифугировали с ускорением не менее 2000 g в течение 5 минут при температуре 18°С-25°С.

Перед проведением анализа все компоненты набора за исключением компонента Е2 выдержали при температуре 18°С-25°С 30 минут. Компонент Е2 хранили при температуре минус 20°С.

Подготовка планшета. Вскрыли пакет и извлекли планшет.

Приготовление раствора MS1: подготовили в емкость объемом 1 л деионизованную воду.

Здесь и далее приведен расчет подготовки растворов при полном заполнении всего планшета для анализа.

Приготовление раствора MS2: в емкость объемом 100 мл налили 60 мл раствора F1 и довели до 100 мл раствором MS1. Хранили при температуре 2°С… 8°С не более 10 суток.

Приготовление раствора MS3: в емкость объемом 100 мл налили 48.5 мл раствора F2 и добавили 1.5 мл раствора F3. Хранили при температуре 2°С… 8°С не более 10 суток.

Приготовление раствора MS4: в емкость объемом 1 Л налили 975 мл раствора MS1 и добавили 25 мл холодного раствора Е2. Хранили при температуре 2°С… 8°С не более 3-х суток.

Приготовление раствора MS5: в емкость объемом 5 мл внесли 2.997 мл раствора MS1 и 3 мкл раствора F3. Хранили при температуре 2°С…8°С не более 30 суток.

Приготовление контрольных образцов: добавили по 1 мл деионизованной воды во флакон с положительным и отрицательным контролем. Содержимое тщательно перемешали и встряхнули, чтобы капли со стенок и крышки опустились на дно. Хранили при температуре 2°С…8°С не более 3-х суток.

Приготовление калибровочных растворов: добавили во флаконы с калибраторами по 20 мкл раствора F2, 5 мкл раствора F3 и 975 мкл раствора MS1. Содержимое тщательно перемешали и встряхнули, чтобы капли со стенок и крышки опустились на дно. Хранили при температуре 2°С…8°С не более 3-х суток.

Приготовление растворов контроля качества: добавили по995 мкл раствора MS1 и 5 мкл раствора F3 в каждый флакон. Содержимое тщательно перемешали и встряхнули, чтобы капли со стенок и крышки опустились на дно. Хранили при температуре 2°С… 8°С не более 10 суток.

Проведение анализа

Во все лунки планшета с круглым дном для проб с ЭДТА плазмой крови, а также с положительным (В1) и отрицательным контролем (В2) внесли по 5 мкл стандарта А. В лунки с калибраторами (Dl-D5) и в лунку для системного бланка стандарт А не вносят.

Внесли в соответствующие лунки по 50 мкл пробы ЭДТА плазмы крови, положительного контроля, отрицательного контроля и калибраторов. В лунку для системного бланка внесли 50 мкл деионизованной воды.

Часть образцов перемешали на орбитальном шейкере в течение 1 минуты при 500 об/мин при комнатной температуре. Часть образцов перемешали пипетированием.

Внесли в каждую лунку по 300 мкл раствора Е1. Перемешали интенсивно на орбитальном шейкере в течение 10 минут при температуре 40°С на скорости 1100-1300 об/мин.

Перенесли планшет в бакетный ротор и центрифугировали с ускорением 4000 g в течение 10 минут при температуре 15°С.

Перенесли содержимое лунок (надосадочную жидкость) к 1.6 мл раствора MS4. Перемешали в течение 1-2 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре при 500 об/мин.

Установили планшет с твердофазным носителем на вакуумную станцию и внесли в каждую лунку по 1 мл раствора F1; открыли вакуумный клапан (-5…-7 мм. рт.ст.) и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1 мл раствора F2 и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1 мл раствора MS1, подняли вакуум до-7…-9 мм. рт.ст., и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1 мл раствора MS4, подняли вакуум до-10…-12 мм. рт.ст., и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1.8 мл пробы из этапа- надосадочная жидкость с 1.6 мл раствора MS4. Перемешали в течение 1-2 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре при 500 об/мин., увеличили вакуум до-15 мм. рт.ст. при дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1 мл раствора MS4, и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1 мл раствора MS1, опустили вакуум до-9…-12 мм. рт.ст., и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Внесли в каждую лунку по 1 мл раствора MS2, опустили вакуум до-7…-9 мм. рт.ст. и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в сливной планшет.

Перекрыли вакуумный клапан и заменили сливной планшет на коллектор фракций.

Открыли вакуумный клапан и снизили вакуум до-3…-5 мм. рт.ст. Просушили носитель под установленным вакуумом в течение 30-40 секунд.

Внесли в каждую лунку по 500 мкл раствора MS3 и дождались, пока жидкость не уйдет из лунок в коллектор.

Перекрыли вакуумный клапан, выключили насосную станцию.

Размонтировали планшет с твердофазным носителем, сняли коллектор фракций.

Установили коллектор фракций в бакетный ротор «бабочка» и поставили в вакуумный концентратор для высушивания при температуре 45°С в течение не более одного часа.

После высушивания извлекли коллектор из бакетного ротора и вакуумного концентратора, добавили в каждую лунку по 30 мкл раствора MS5. Накрыли коллектор защитной пленкой и тщательно перемешали на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут при скорости 300-400 об/мин.

Перенесли содержимое каждой лунки во флаконы из деактивированного стекла для дальнейшего инструментального анализа.

Закрытый пленкой коллектор с восстановленными фракциями хранили при температуре 2°С…8°С не более 72 часов без потери качества результатов.

Регистрацию результатов производили путем измерения площади, высоты хроматографического пика, числа зарядов за единицу времени дискретизации на масс-спектрометре в режиме мониторинга множественных реакций формирования фрагментных ионов по четырем транзициям для внутреннего стандарта А (528.2329→182.0841; 528.2329→154.0893; 528.2329→253.0855; 528.2329→382.1641) и четырем транзициям для SRFM (526.2256→180.0768; 526.2256→152.0818; 526.2256→251.1139;

526.2256→380.1565) с энергией активации от 19 эВ до 36 эВ. При регистрации результатов относительное время удержания по иону-квантору между внутренним стандартом А и SRFM должны совпадать в пределах ±1%.

Построили в линейных координатах калибровочный график зависимости площади хроматографического пика, высоты хроматографического пика, числа зарядов за единицу времени дискретизации от заданной концентрации (пг/мл) для SRFM и для внутреннего стандарта А в калибраторах D1-D5. Так как концентрация (пг/мл) внутреннего стандарта А постоянна во всех калибраторахВ1-05, кривая зависимости для стандарта А должна идти параллельно оси абсцисс, а по дополнительной оси ординат отметили величины относительного отклика SRFM (без размерная величина) в калибраторах к внутреннему стандарту напротив соответствующих концентраций (пг/мл) калибраторовВ1-05.

Определили величины содержания SRFM в образцах положительного контроля (В1), отрицательного контроля (В2) и в образцах верхнего, среднего и нижнего контроля качества сигнала (C1, С2 и С3). Определили уровень фонового шума в пробе системного бланка и в пробе отрицательного контроля. Уровень шума (SNR) по площади или высоте хроматографического пика в пробе системного бланка составил не более 10% от уровня шума в пробе отрицательного контроля, им можно пренебречь, в противном случае его необходимо вычитать из всех последующих результатов. Определили относительную ошибку измерения по воспроизводимости сигнала в образцах контроля качества; ошибка измерения не превышает 10%.

Определили содержание SRFM в пробах плазмы крови человека по относительному отклику площади, высоты пика SRFM в пробе к площади, высоте пика стандарта А в пробе. Провели окончательный расчет с поправкой на абсолютную концентрацию стандарта А в пробах плазмы крови человека и точность измерения по калибровочной кривой. Результаты выражены в единицах пг/мл.

Положительный, отрицательный контроль и пробы системного бланка использовали для каждой серии измерений.

Диагностическая чувствительность способа составила 81%.

Диагностическая специфичность способа составила 87%. Диагностическая точность способа составила 84%. Положительная прогностическая ценность составили 86% Отрицательная прогностическая ценность составила 82%.

Изобретение относится к медицинской биохимии. Описаны диагностическая тест-система (ДТС) для определения биомаркера и способ определения биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера, или нейродегенеративных нарушений, а также применение указанной ДТС для диагностики нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений, включая болезнь Альцгеймера. Тест-система включает: внутренний стандарт, представляющий собой (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 13С2, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 15N, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом D, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 18O, или их комбинации; набор калибраторов, представляющий собой ряд разведений 4S,7S,10S,13S-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты; контроль качества сигнала (QC) - ряд растворов (48,78,108,138)-4-((1Н-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты низкой, средней и высокой концентрации. Изобретение позволяет с высокой воспроизводимостью результатов и точностью измерения определять биомаркер, специфический для нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (БАС). 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 12 пр.

1. Диагностическая тест-система для определения биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений, содержащая:

А) внутренний стандарт, представляющий собой (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, выбранную из группы: (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом 13C2, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом 15N, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом D, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом 18O, или их комбинации;

Б) набор калибраторов, представляющий собой ряд разведений (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты;

В) растворы контроля качества сигнала (QC), представляющие собой ряд растворов (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты низкой, средней и высокой концентрации в диапазоне от 100 пг/мл до 1000 пг/мл.

2. Диагностическая тест-система для определения биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений, содержащая: внутренний стандарт, представляющий собой (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, выбранную из группы: (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом 13C2, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом 15N, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом D, или (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота, меченная изотопом 18O, или их комбинации.

3. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что внутренний стандарт представлен в форме лиофилизата или аликвот.

4. Диагностическая тест-система по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что она дополнительно укомплектована растворителями для жидкостной экстракции и/или растворителями для твердофазной экстракции.

5. Диагностическая тест-система по п. 4, отличающаяся тем, что жидкостная экстракция представляет собой депротеинизацию.

6. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она дополнительно укомплектована одним или несколькими планшетами или спин-колонками, при этом планшеты могут быть планшетами конфигурации 48, 54 или 96 лунок.

7. Диагностическая тест-система по п. 6, отличающаяся тем, что один из планшетов является планшетом с коллектором для сбора фракции и имеет полупроницаемое плоское дно с объёмом лунок не менее 2 мл, при этом планшет заполнен твердофазным анионообменным носителем, ёмкость связывания которого как минимум десятикратно превышает молярную концентрацию измеряемой эндогенной субстанции.

8. Диагностическая тест-система по п. 6, отличающаяся тем, что один из планшетов является планшетом с круглым или коническим непроницаемым дном.

9. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что ДТС дополнительно укомплектована набором реагентов и материалов для подготовки пробы и/или набором реагентов для проведения инструментального анализа.

10. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она дополнительно укомплектована программным обеспечением и/или инструкцией.

11. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она дополнительно укомплектована отрицательным и положительным контролем.

12. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2 отличающаяся тем, что нейродегенеративные заболевания представляют собой болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром мягкого когнитивного снижения, синдром бокового амиотрофического склероза.

13. Диагностическая тест-система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что нейродегенеративные нарушения представляют собой черепно-мозговые травмы.

14. Способ определения биомаркера, специфического для нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений, включающий следующие этапы:

- вносят в соответствующие лунки пробы ЭДТА плазмы крови, положительного контроля, отрицательного контроля и калибраторов - ряд разведений (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты, в лунку для системного бланка вносят деионизованную воду, при этом в лунки планшета с положительным и отрицательным контролем вносят стандарт - (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овую кислоту, меченную изотопом 13C2, или 15N, или D, или 18O, при этом в лунки с калибраторами и в лунку для системного бланка стандарт не вносят;

- осуществляют жидкостную экстракцию;

- осуществляют твердофазную экстракцию;

- осуществляют регистрацию результатов хроматографии, для чего определяют величины содержания SRFM в образцах положительного контроля, отрицательного контроля и в образцах верхнего, среднего и нижнего контроля качества сигнала - ряд растворов (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овой кислоты низкой, средней и высокой концентрации в диапазоне от 100 пг/мл до 1000 пг/мл, при этом содержание SRFM в пробах плазмы крови человека определяют по относительному отклику площади, высоты пика SRFM в пробе к площади, высоте пика стандарта в пробе.

15. Способ по п. 14, в котором нейродегенеративные заболевания или нейродегенеративные нарушения выбраны из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза и черепно-мозговых травм.

16. Применение диагностической тест-системы по любому из пп. 1-13 для диагностики нейродегенеративных заболеваний или нейродегенеративных нарушений.

17. Применение по п. 16, в котором нейродегенеративные заболевания выбраны из бокового амиотрофического склероза и болезни Паркинсона.

18. Применение диагностической тест-системы по любому из пп. 1-13 для диагностики нейродегенеративного заболевания, представляющего собой болезнь Альцгеймера.