ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, которые связывают карциноэмбриональный антиген CEACAM5 (CEA) человека и CD3ε человека (анти-CEAxCD3 биспецифическое антитело). Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим такие биспецифические антитела, а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды. Изобретение также относится к способам выбора и получения таких антител, и к способам применения таких антител в лечении заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Успешное лечение прогрессирующего/метастатического солидного рака, например, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака желудка, рака легких, и так далее, все еще остается сложной задачей. В современной иммунотерапии рака разработаны способы/методики, помогающие иммунным клеткам организма более эффективно атаковать и уничтожать раковые клетки. Например, было разработано несколько методик/способов для усиления атаки опухолевых клеток Т-клетками. Примерами являются ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как, например, моноклональные антитела, ингибирующие PD-1/PD-L1, Т-клеточные биспецифические антитела, связывающие опухоль-ассоциированный антиген (ОАА) и CD3 на Т-клетках или CAR-T-клетках. CAR-T-клетки и биспецифические антитела эффективны при гематологических злокачественных новообразованиях и одобрены, например, для лечения В-клеточных злокачественных новообразований или острого лимфоцитарного лейкоза ОЛЛ, но до настоящего времени применение этих методов в терапии прогрессирующего/метастатического солидного рака не привело к реальному успеху. Моноклональные антитела, а также биспецифические антитела, используемые в терапии, могут вызывать различные побочные эффекты. Важной разновидностью токсичности является синдром высвобождения цитокинов (СВЦ), который, например, был обнаружен при терапии алемтузумабом, муромонабом-CD3, ритуксимабом, тоситузумабом и биспецифическим анти-CD19xCD3 антителом блинатумомабом.

Tabernero с соавторами (J Clin Oncol 35, 2017 (suppl. abstr. 3002)) представили на ASCO 2017 данные клинического испытания фазы 1 по применению для пациентов с распространенным/метастатическим колоректальным раком анти-CEAxCD3 биспецифического антитела (RO 6958688, цибисатамаба, смотри ниже) в монотерапии и в сочетании с анти-PD-L1 антителом атезолизумабом. Цибисатамаб имеет так называемый формат 2+1: один Fab-фрагмент связывается с CD3 и два Fab-фрагмента связываются с CEA. Такие антитела описаны, например, в US20140242079 (WO2014131712) и US20140242080 (WO2014131711).

Используемый в настоящем документе термин «TCB2014» означает биспецифическое антитело, связывающее CEA и CD3 в формате 2+1, которое описано в US20140242080 (полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки), содержащее в качестве областей CDR области CDR с SEQ ID NO:270-276 и 290-296, приведенные в US20140242080 (смотри также области CDR с SEQ ID NO:4-10 и 24-30 в US20140242079, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки). Используемый в настоящем документе термин «TCB2017» означает молекулу B в формате «2+1 IgG кросс-Fab, инвертированные» с модификациями заряда (обмен VH/VL в связывающем CD3 фрагменте, модификация заряда в CEA-связывающем фрагменте, гуманизированный CEA-связывающий фрагмент), описанную в WO2017055389 (содержание которого включено посредством ссылки в полном объеме), которая содержит в качестве областей CDR области CDR с SEQ ID NO:4-6, 8-10 и 14-19, описанные в WO2017055389.

Структура 2+1 довольно сильно отличается от нативных IgG антител. Структура также содержит искусственные аминокислотные (ак) мосты и две различные тяжелые цепи, объединенные ак последовательностями в Fc-части с помощью технологии «выступ во впадину» (смотри, например, US6737056, WO2013055958). Такие биспецифические антитела (например, RO6958688, цибисатамаб) являются иммуногенными и, вследствие этого, вызывают образование направленных против лекарственного средства антител (ADA) и потерю воздействия лекарственного средства вследствие нейтрализации лекарственного средства за счет ADA. Melero с соавторами сообщали о 50 или более % пациентов с ADA и о потере воздействия лекарственного средства у 45% пациентов при использовании доз 60-200 мг (Melero et al., ASCO 2017, Abstract 2549 и Poster No. 41, Abstract смотри Journal of Clinical Oncology 35, no. 15_suppl (May 20, 2017) 2549-2549). Потеря воздействия затрудняет контроль над практической терапией и значительно снижает вероятность успеха. Для минимизации образования ADA цибисатамаб, а именно, комбинация цибисатамаба и атезолизумаба, проходит клинические испытания в сочетании после предварительного лечения анти-CD20 антителом обинутузумабом (смотри ClinicalTrials.gov Trial NCT03866239). Предварительное лечение проводят для истощения В-клеток у пациентов с метастатическими колоректальными карциномами. Истощение В-клеток приводит к снижению уровня иммуноглобулинов у пациента и, следовательно, потенциальных ADA, но в то же время это приводит к ослаблению иммунной системы.

MEDI-565 (AMG211), следующее анти-CEAxCD3 биспецифическое антитело, одноцепочечное антитело, прошло стадию клинической разработки, результаты опубликованы (смотри, например, M. Pishvaian et al. Clin Colorectal Cancer. 2016 DEC; 15(4) 345-351). Сообщено о завершении исследования NCT01284231 (ClinicalTrials.gov), за последние годы не было начато ни одного нового исследования. Это одноцепочечное биспецифическое антитело (два scFv, соединенные ак линкером) имеет крайне низкий период полувыведения из организма от 2,2 до 6,5 часов (Pishvaian et al. Clin Colorectal Cancer. 2016 DEC; 15(4) 345-351) (включено в настоящий документ посредством ссылки).

Настоящее изобретение относится к менее иммуногенному анти-CEAxCD3 биспецифическому антителу с высокой эффективностью. Такое антитело имеет общую тяжелую цепь и в одном варианте осуществления легкую цепь каппа в CEA-связывающем фрагменте и легкую цепь лямбда в CD3-связывающем фрагменте.

О концепции использования общей тяжелой цепи для получения биспецифических антител упомянуто в Fischer et al., Nature Communications 6 (2015): 6113. https://doi.org/10.1038/ncomms7113 и Magistrelli G. et al., MABS 9 (2017) 231-239. Каппа-лямбда биспецифические антитела описаны, например, в WO2014087248 (включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Их структура практически неотличима от структуры естественного IgG, следствием чего является отсутствие, или в минимальной степени, образование ADA и, таким образом, низкая или минимальная потеря воздействия. Последовательность общей вариабельной области тяжелой цепи VH и последовательность VL анти-huCD3 1A4 по изобретению приведены в WO2019175658 (US2019/0284297) (включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме).

Как упомянуто выше, в WO2017055389 описаны анти-CEAxCD3 биспецифические антитела в формате 2+1, но связывающие иной домен, чем цибисатамаб. Одно из этих антител (RO7172508 или RG 6123) было протестировано в клиническом исследовании у пациентов с местнораспространенными и/или метастатическими CEA-положительными солидными опухолями (ClinicalTrials.gov; смотри RO7172508), а также с предварительным лечением обинутузумабом и в сочетании с атезолизумабом. Согласно описанию клинического исследования на сайте ClinicalTrials.gov, для некоторых когорт уровень сывороточного CEA (растворимого CEACAM5, sCEA) у пациентов, подлежащих лечению, должен был быть ниже определенного порога, чтобы они имели право на лечение, это позволяет предположить, что более высокий уровень растворимого CEACAM5 может снижать эффективность этого анти-CEAxCD3 биспецифического антитела. Для антител по настоящему изобретению характерно минимальное влияние растворимого CEA на эффективность уничтожения ими опухолевых клеток.

Растворимый CEACAM5 является признанным опухолевым маркером. Уровни sCEA в плазме пациентов с раком могут превышать 1000 нг/мл, в то время как концентрации в плазме у здоровых людей составляют менее 10 нг/мл (например, Sandler B. et al. Anticancer Res 1999, 19(5B), 4229-33). Растворимый CEACAM5, таким образом, может конкурировать с мембраносвязанным CEA, находящимся на опухолевых клетках, за связывание с терапевтическими анти-CEA антителами и анти-CEA биспецифическими антителами, потенциально приводя к снижению уровней анти-CEA антитела или анти-CEAxCD3 антитела. TCB2017 и TCB2014 (смотри выше) были протестированы авторами изобретения in vitro в анализе опосредованного T-клетками лизиса CEA-положительных опухолевых клеток в присутствии растворимого CEA. Было обнаружено, что добавление sCEA в аналитическую смесь приводит к смещению кривой лизиса и, следовательно, значения EC50 для TCB2014 и TCB2017 к более высоким концентрациям, это указывает на то, что как TCB2014, так и TCB2017, в значительной степени связывают sCEA.

Семейство CEA человека включает 29 генов, из которых 18 экспрессируются: 7 принадлежат к подгруппе CEA, и 11 к подгруппе специфических для беременности гликопротеинов. Считается, что некоторые члены подгруппы CEA обладают свойствами клеточной адгезии. CEACAM5 экспрессируется не только клетками колоректального рака, но также клетками рака поджелудочной железы, рака желудка, рака легких и рака других видов. Считается, что CEACAM5 играет определенную роль во врожденном иммунитете (Hammarström S., Semin. Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Карциноэмбриональный антиген 5 (CEA, CEACAM5 или CD66e; UniProtKB - P06731) является членом семейства родственных карциноэмбриональным антигенам молекул клеточной адгезии (семейства CEACAM) и опухоль-ассоциированным антигеном (Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Многие моноклональные антитела были получены против CEACAM5 в исследовательских целях, в качестве диагностических средств и в терапевтических целях (смотри, например, WO2012117002). Члены семейства карциноэмбриональных антигенов (CEACAM) широко экспрессируются и, в зависимости от ткани, способны регулировать различные функции, включая развитие опухоли, подавление опухоли, ангиогенез и активацию нейтрофилов. Четыре члена этого семейства, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM6 и CEACAM8, экспрессируются и представлены в изобилии на человеческих нейтрофилах (http://www.proteinatlas.org). Учитывая механизм действия анти-CEAxCD3 биспецифических антител, перекрестная реактивность с другими CEACAM может приводить к истощению важных циркулирующих популяций здоровых клеток. Например, перекрестная реактивность с CEACAM8, который экспрессируется нейтрофилами или гемопоэтическими стволовыми клетками, может приводить к истощению таких клеточных популяций. Изобретение относится к анти-CEAxCD3 биспецифическому антителу с низкой перекрестной реактивностью с одним или более членами семейства CEACAM, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM19, CEACAM20 и CEACAM21.

Мышиное моноклональное анти-CEACAM5 антитело PR1A3 было получено путем слияния клеток миеломы NS1 (P3/NS 1/I-Ag-4-1) с клетками селезенки мышей, иммунизированных нормальным эпителием толстой кишки. В публикации Richman P. I. and Bodmer W. F., Int. J. Cancer, 39:317-328, 1987 описано мышиное моноклональное антитело PR1A3. Картирование эпитопов PR1A3 показало, что антитело направлено на B3-домен и GPI-якорь молекулы CEA (Durbin H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4313-4317, 1994). Эпитоп, который связывает PR1A3, представляет собой конформационный эпитоп, а не линейный эпитоп (Stewart et al., Cancer Immunol. Immunother., 47 (1999) 299-06). Гуманизированные антитела PR1A3 (hPR1A3) описаны, например, в публикации Conaghhan P. J., et al., Br. J. Cancer, 98 (2008)1217-1225 и WO2012117002. CEA-связывающий фрагмент, используемый в TCB2014 (называемый CH1A1A), является гуманизированным, с созревшей аффинностью, генетически модифицированным для стабильности вариантом, полученным из антитела PR1A3. M. Bacac et.al., Clin. Cancer Research 22(13);3286-97 (2016), Conaghan P, et al., Br J Cancer 2008;98:1217-25, и Durbin H, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:4313-7).

Способ лечения рака сочетанием антагониста оси PD-1 человека и биспецифического анти-CEAxCD3 антитела описан в WO2017118657, и клинические результаты были опубликованы в материалах конференции ASCO 2017 года (Tabernero et al., J Clin Oncol 35, 2017 (suppl. abstr. 3002)). Способ лечения опухолей путем введения антагонистов иммунных контрольных точек, связывающих две или более разных мишеней пути иммунных контрольных точек, и перенаправляющего T-клетки средства, связывающего CEA и T-клеточный поверхностный антиген, описан в WO2015112534. Конъюгат, состоящий из однодоменного анти-CEACAM6 антитела и уриназы, в настоящее время проходит клинические испытания (NCT02309892; WO2016116907). Антитело класса I, связывающее CEACAM5, CEACAM6 и гранулоциты, описано в US20110064653. Биспецифические антитела, содержащие первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, ковалентно связанные друг с другом, описаны в WO2018053328.

Анти-CD3ε антителом, описанным в документах современного уровня техники, является SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 взаимодействует с CD3 как приматов, так и человека. SP34 доступно от компании BD Biosciences. Еще одним анти-CD3 антителом, описанным в документах современного уровня техники, является UCHT-1 (смотри WO2000041474). Еще одним анти-CD3 антителом, описанным в документах современного уровня техники, является BC-3 (Институт исследования рака имени Фреда Хатчинсона; используется в испытаниях I/II фазы у пациентов с РТПХ, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 отличается от UCHT-1 и BC-3 тем, что SP-34 узнает эпитоп, присутствующий исключительно на ε-цепи CD3 (смотри Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047), в то время как UCHT-1 и BC-3 узнают эпитоп, в формировании которого участвуют цепи ε и γ. Анти-CD3 антитела также описаны в WO2007042261, WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837, WO2010037838 и US8236308. Биспецифические антитела, содержащие связывающий фрагмент, специфический для CEA, и связывающий фрагмент, специфический для CD3ε, например, описаны в US20140242079, WO2007071426, WO2013012414, WO2015112534, WO2017118675 и WO2017055389. Анти-CD3 антитело, содержащее последовательности второго связывающего фрагмента антитела по изобретению, описаны в US62/643095 и PCT/US2019/000232, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. В US2012321626 описан мультиспецифический слитый белок Fab, содержащий Fab-фрагмент, который связывает N-конец эпсилон-цепи CD3. В WO2018199593 описаны биспецифические антитела, которые связывают HER3 и CD3.

Как уже упоминалось выше, результаты первых клинических испытаний с T-клеточными биспецифическими антителами против ОААxCD3 (ОАА=опухоль-ассоциированный антиген) у пациентов с прогрессирующими солидными опухолями не оправдали ожиданий, но недавно были опубликованы предварительные результаты исследования фазы 1 для анти-CEAxCD3 биспецифического антитела цибисатамаба (RO6958688, смотри, например, Bacac et al. Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016); и US20140242079), которое при использовании у пациентов с прогрессирующим колоректальным раком в монотерапии и в сочетании с ингибированием PD-L1 привело к частичным ответам и стабилизации заболевания (J.Tabernero et.al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (suppl. Abstr. 3002)). Другой подход для получения лучших результатов может заключаться в добавлении к T-клеточным биспецифическим антителам не только ингибитора оси иммунной контрольной точки PD-1, но также в добавлении других ингибиторов иммунных контрольных точек или агонистов. Но пока считается, что нет перспективных клинических данных для такого комбинированного подхода.

Ограниченная доступность Т-клеток в прогрессирующих солидных опухолях, безусловно, является важным механизмом, ограничивающим эффективность, достижимую при использовании Т-клеточных биспецифических антител плюс ингибиторов оси PD-1.

Вместо добавления к сочетанию Т-клеточного биспецифического антитела и ингибитора оси PD-1 другого терапевтического средства с целью перенаправления Т-клеток на опухолевые клетки прогрессирующих солидных опухолей, более успешным может оказаться добавление терапевтического средства, перенаправляющего на опухолевые клетки другие иммунные клетки, в частности, макрофаги или макрофаги и клетки - естественные киллеры (NK).

Настоящее изобретение относится к новым анти-CEAxCD3 биспецифическим антителам, которые разработаны таким образом, что их можно применять параллельно с анти-CEAxCD47 биспецифическими антителами для перенаправления макрофагов, а также NK-клеток, на CEA-экспрессирующие солидные опухоли. Совместная атака Т-клеток, макрофагов и NK-клеток, направленная на СЕА-экспрессирующие опухоли, открывает широкие возможности для достижения превосходной эффективности/уничтожения и фагоцитоза СЕА-экспрессирующих опухолевых клеток.

Неутешительные результаты применения CAR-T-клеток при солидных опухолях могут иметь простое объяснение - количество CAR-T-клеток, проникающих в солидную опухоль и распределяющихся в ней, просто является недостаточным. Ситуация, безусловно, иная в случае большинства гематологических злокачественных новообразований; CAR-T-клетки имеют хороший доступ к опухолевым клеткам, что объясняет высокую эффективность при этих злокачественных новообразованиях в сравнении с неутешительной эффективностью при солидных опухолях. Кроме того, CAR-T-клетки могут быть сильно подавлены опухолевым микроокружением (TME) солидных опухолей, которое в большинстве случаев является в высокой степени иммуносупрессивным.

Настоящее изобретение относится к новым биспецифическим анти-CEAxCD3 антителам, отличающимся высокой эффективностью, слабым влиянием sCEA на эффективность, низкой или отсутствующей перекрестной реактивностью с другими CEACAM, кроме CEACAM5 (= CEA), и, следовательно, пониженной токсичностью, низкой иммуногенностью, возможностью применения в комбинированной терапии с анти-CEAxCD47 антителами, а также обладающим ценными фармакокинетическими свойствами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу (далее также называемому «анти-CEAxCD3 бсАт» или «анти-CEAxCD3 биспецифическое антитело»), содержащему первый связывающий фрагмент, специфически связывающий CEACAM5 человека (далее также называемый «анти-CEA»), и второй связывающий фрагмент, специфически связывающий CD3ε человека (далее также называемый «анти-CD3»).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что указанное антитело является одновалентным для первого связывающего фрагмента и одновалентным для второго связывающего фрагмента.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что каркасные последовательности константной и вариабельной областей являются человеческими.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что каждый из первого и второго связывающих фрагментов содержит тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело имеет первый связывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, и второй связывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, где тяжелая цепь в каждом связывающем фрагменте является одной и той же (то есть, общей тяжелой цепью). В одном варианте осуществления вариабельная область общей тяжелой цепи содержит в качестве областей CDR CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления вариабельная область общей тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:1. В одном варианте осуществления константная область общей тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:30. В одном варианте осуществления общая тяжелая цепь содержит SEQ ID NO:43. В одном варианте осуществления общая тяжелая цепь содержит SEQ ID NO:44. В одном варианте осуществления общая тяжелая цепь содержит SEQ ID NO:45.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием в первом связывающем фрагменте и втором связывающем фрагменте в качестве тяжелой цепи общей тяжелой цепи, содержанием в первом связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкой цепи каппа, и во втором связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкой цепи лямбда. В одном варианте осуществления легкая цепь второго связывающего фрагмента содержит SEQ ID NO:28, и тяжелая цепь второго связывающего фрагмента содержит SEQ ID NO:45 (например, полученные из AB1 и AB-1L3-1/N биспецифические антитела, такие как AB13L3-1/N, AB14L3-1/N, AB15L3-1/N, AB17L3-1/N, AB20L3-1/N, AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N и AB73L3-1/N; для последовательностей CDR и VL смотри список последовательностей).

AB13,14,15, и так далее, обозначают первый связывающий фрагмент (плечи анти-CEACAM5 антитела) и L3-1 обозначает второй связывающий фрагмент (плечо анти-CD3 антитела, также называемое 1A4) биспецифических антител по настоящему изобретению. Любое ABXX анти-CEA плечо может быть объединено с L3-1 анти-CD3 плечом, с образованием биспецифического антитела: например, ABXXL3-1 обозначает анти-CEAxCD3 биспецифическое антитело по изобретению, содержащее Fc-фрагмент чIgG1 ДТ; ABXXL3-1/D обозначает анти-CEAxCD3 биспецифическое антитело по изобретению, содержащее Fc-фрагмент чIgG1, имеющий мутации L234A+L235A; ABXXL3-1/N обозначает анти-CEAxCD3 биспецифическое антитело по изобретению, содержащее Fc-фрагмент чIgG1, имеющий мутации L234A+L235A+P329A.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием в первом связывающем фрагменте и втором связывающем фрагменте в качестве тяжелой цепи общей тяжелой цепи, содержанием в первом связывающем фрагменте в качестве вариабельной области легкой цепи область лямбда-типа и в качестве константной области легкой цепи область каппа-типа («легкая цепь гибридного формата»), и во втором связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь лямбда (например, L3-1AB8 H-CK5/D, смотри Фигуру 2 и описание Фигуры 2).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием в первом связывающем фрагменте и втором связывающем фрагменте в качестве тяжелой цепи общей тяжелой цепи, содержанием в первом связывающем фрагменте в качестве вариабельной области легкой цепи области лямбда-типа и в качестве константной области легкой цепи области лямбда-типа, и во втором связывающем фрагменте в качестве вариабельной области легкой цепи области лямбда-типа и в качестве константной области легкой цепи области каппа-типа («легкая цепь гибридного формата»); например, AB8L3-1 H-CK5/D.

Биспецифические антитела по изобретению проявляют низкую связывающую/перекрестную реактивность с членами семейства CEACAM, отличными от CEACAM5. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что значение СИФ для связывания клеток PEAKrapid (ATCC^® CRL-2828™), экспрессирующих CEACAM, выбранный из группы, состоящей из CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM19, CEACAM20 и CEACAM21, не более чем в 2 раза выше в сравнении со значением СИФ для связывания клеток PEAK ДТ (то есть, не трансфицированных клеток PEAK) в одних и тех же экспериментальных условиях. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что значение СИФ для связывания клеток PEAKrapid, экспрессирующих CEACAM, выбранный из группы, состоящей из CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6 и CEACAM8, не более чем в 2 раза выше в сравнении со значением СИФ для связывания клеток PEAK ДТ в одних и тех же экспериментальных условиях. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что значение СИФ для связывания клеток PEAKrapid, экспрессирующих CEACAM8, не более чем в 2 раза выше в сравнении со значением СИФ для связывания клеток PEAK ДТ в одних и тех же экспериментальных условиях. Экспериментальный метод трансфекции клеток PEAK и количественного определения связывания антител с этими клетками PEAK описан в примерах 1 и 5.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело связывает клетки MKN-45 (DSMZ No: ACC 409) со значением EC50, составляющим от 0,5 нМ до 50 нМ. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело связывает клетки MKN-45 со значением EC50, составляющим от 0,5 нМ до 30 нМ. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению отличается тем, что значение СИФ для связывания клеток MKN-45 при концентрации 200 нМ, 1000 нМ и 5000 нМ по меньшей мере в два раза больше значения СИФ, полученного для TCB2014. Анализ связывания описан в примере 7a. В одном варианте осуществления значение EC50 для уничтожения опухолевой линии клеток MKN-45, измеренное в анализе с использованием человеческих МКПК, для биспецифических антител по настоящему изобретению на 40% или более ниже, чем значение EC50, измеренное для TCB2014. В одном варианте осуществления значение EC50 для уничтожения опухолевой линии клеток LS-174T, измеренное в анализе с использованием человеческих МКПК, для биспецифических антител по настоящему изобретению на 40% или более ниже, чем значение EC50, измеренное для TCB2014.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело уничтожает клетки LS-174T в анализе с использованием человеческих МКПК зависимым от концентрации образом со значением EC50, составляющим 0,01-10 нМ. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело уничтожает клетки LS-174T в анализе с использованием человеческих МКПК зависимым от концентрации образом со значением EC50, составляющим 0,01-1 нМ.

Анализ для количественного определения T-клеточного перенаправленного лизиса/уничтожения CEA-положительных клеток описан в примере 8.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что значение EC50 в том же анализе (уничтожение CEA-положительных опухолевых клеток LS-174T) не увеличивается более чем в 20 раз, в одном варианте осуществления не более чем в 15 раз, и в одном варианте осуществления не более чем в 10 раз в присутствии 5 мкг/мл растворимого CEACAM5, в сравнении со значением EC50 для лизиса без растворимого CEACAM5 в одних и тех же экспериментальных условиях.

В другом варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что значение EC50 в том же анализе не увеличивается более чем в 10, в одном варианте осуществления не более чем в 5 раз в присутствии 1 мкг/мл растворимого CEACAM5, в сравнении со значением EC50 для лизиса без растворимого CEACAM5 в одних и тех же экспериментальных условиях.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что указанное биспецифическое антитело ингибирует рост объема опухоли в модели HPAF-II до дня 18 на 25% или более, в сравнении с ростом объема опухоли в группе введения растворителя в одних и тех же экспериментальных условиях. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается тем, что указанное биспецифическое антитело ингибирует рост объема опухоли в модели HPAF-II до дня 18 аналогичным, и статистически не отличающимся образом, в сравнении с TCB2014 в одних и тех же экспериментальных условиях. Мышиная модель опухоли описана в примере 9a.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело имеет в каждой субъединице Fc-домена аминокислотные замены, уменьшающие связывание с активирующим Fc-рецептором и/или снижающие эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A и L235A и/или замену P329, выбранную из группы, состоящей из P329A, P329G и P329R (нумерация Kabat EU-индекс). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело имеет в каждой субъединице Fc-домена аминокислотные замены L234A и L235A, и P329A (нумерация Kabat EU-индекс). L234A и L235A (LALA) означает, что аминокислота лейцин в положении 234/235 заменена на аланин. P329A (PA) означает, что аминокислота пролин в положении 329 заменена на аланин.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит общую тяжелую цепь. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит общую тяжелую цепь, содержащую в качестве областей CDR CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит во втором связывающем фрагменте область легкой цепи, содержащую в качестве областей CDR CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит в первом связывающем фрагменте в качестве константной области легкой цепи область с SEQ ID NO:39. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит в первом связывающем фрагменте в качестве константной области легкой цепи область с SEQ ID NO:41. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит в первом связывающем фрагменте в качестве константной области легкой цепи область с SEQ ID NO:58. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:43 или общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:44, или общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:45. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит в первом связывающем фрагменте в качестве константной области легкой цепи область с SEQ ID NO:39 и общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:45.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит во втором связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:25, 26, 27, 28 и 29, или из группы легких цепей гибридного формата (LC) с SEQ ID NO:67, 68, 69, 70 и 71.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело содержит в первом связывающем фрагменте в качестве константной области легкой цепи область с SEQ ID NO:39, общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:45, и во втором связывающем фрагменте легкую цепь с SEQ ID NO:28.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело конкурирует с анти-CEA антителом, выбранным из группы, состоящей из анти-CEA антитела, содержащего в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:48 и 49 (анти-CEA антитело MEDI), содержащего в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:46 и 47 (антитело SM3E), содержащего в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:56 и 57 (лабетузумаб (Lab)), содержащего в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:50 и 51 (SAR), содержащего в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:54 и 55 (T86.66) и содержащего в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:52 и 53 (CH1A1A). Смотри также Фигуру 1 и пример 5c).

Примерами антител, которые можно использовать в качестве VL или CL-областей для CEA в биспецифических антителах по изобретению, и конкурирующих с MEDI за связывание рекомбинантного CEA, являются анти-CEA антитело AB1 и антитела, полученные путем оптимизации направленности из AB1 (смотри пример 11 для экспериментального метода). Анти-CEA антитела AB13, 14, 15, 17, 20, 54, 60, 66, 71, 72, 73 и соответствующие биспецифические анти-CEAxCD3 антитела AB13L3-1, AB14L3-1, AB15L3-1, AB17L3-1, AB20L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1 и AB73L3-1 конкурируют так же, как антитело AB1, соответствующее AB1L3-1. Примерами антител, которые можно использовать в качестве VL или CL-областей для CEA в биспецифических антителах по изобретению, и конкурирующих с SM3E за связывание рекомбинантного CEA, являются анти-CEA антитело AB8 и антитела, полученные путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза из AB8 с использованием вырожденных олигонуклеотидов. Примерами антител, которые можно использовать в качестве VL или CL-областей для CEA в биспецифических антителах по изобретению, и конкурирующих с T84.66 за связывание рекомбинантного CEA, являются анти-CEA антитело 1B4 и антитела, полученные путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза из 1B4 с использованием вырожденных олигонуклеотидов.

Примерами антител, которые можно использовать в качестве VL или CL-областей для CEA в биспецифических антителах по изобретению, но не конкурирующих ни с одним из эталонных антител за связывание рекомбинантного CEA, являются анти-CEA антитело C11 и антитела, полученные путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза из C11 с использованием вырожденных олигонуклеотидов.

AB1 представляет собой анти-CEA антитело с HC SEQ ID NO:43 и каппа LC SEQ ID NO:40, закодированное нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:80 и 78, соответственно.

AB8 представляет собой анти-CEA антитело с HC SEQ ID NO:43 и лямбда LC SEQ ID NO:42, закодированное нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:80 и 79, соответственно.

1B4 представляет собой анти-CEA антитело с HC SEQ ID NO:43 и лямбда LC SEQ ID NO:74, закодированное нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:80 и 77, соответственно.

C11 представляет собой анти-CEA антитело с HC SEQ ID NO:43 и каппа LC SEQ ID NO:73, закодированное нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:80 и 76, соответственно.

Легкая цепь для CEA, которую можно использовать в качестве легкой цепи каппа, содержит SEQ ID NO:40. Легкая цепь для CEA, которую можно использовать в качестве легкой цепи каппа, содержит SEQ ID NO:73. Легкая цепь для CEA, которую можно использовать в качестве легкой цепи лямбда, содержит SEQ ID NO:74. Легкая цепь для CEA, которую можно использовать в качестве гибридной легкой цепи каппа, содержит SEQ ID NO:75.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело имеет в каждой субъединице Fc-домена до трех аминокислотных замен, которые уменьшают связывание с активирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A, L235A и замену P329, выбранную из группы, состоящей из P329A, P329G и P329R (нумерация Kabat EU-индекс). В одном варианте осуществления общая тяжелая цепь антитела по изобретению содержит SEQ ID NO:43, 44 или 45. В одном варианте осуществления общая тяжелая цепь антитела по изобретению содержит SEQ ID NO:45 (L234A, L235A и P329A).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет одно или более свойств, выбранных из группы, включающей: a) связывание клеток MKN-45 со значением EC50, составляющим от 0,5 нМ до 50 нМ; b1) конкуренцию с анти-CEA антителом, содержащим в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:48 и 49 (MEDI), или b2) конкуренцию с анти-CEA антителом, содержащим в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:46 и 47 (SM3E), или b3) конкуренцию с анти-CEA антителом, содержащим в качестве VL и VH-доменов VL и CH с последовательностями SEQ ID NO:54 и 55 (T84.66), или b4) отсутствие конкуренции с любым из инструментальных антител (смотри пример 5c для инструментальных антител); c) наличие в каждой субъединице Fc-домена аминокислотных замен, которые уменьшают связывание с активирующим Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, где указанные аминокислотные замены представляют собой L234A и L235A и замену P329, выбранную из группы, состоящей из P329A, P329G и P329R (нумерация Kabat EU-индекс); d) уничтожение клеток MKN-45, HPAF-II и/или LS-174T в анализе с использованием человеческих МКПК зависимым от концентрации образом со значением EC50, составляющим 0,01-10 нМ.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет одно или более свойств, выбранных из группы, включающей:

a) связывание клеток MKN-45 со значением EC50, составляющим от 0,5 нМ до 50 нМ,

b) уничтожение клеток MKN-45, HPAF-II или LS-174T в анализе с использованием человеческих МКПК зависимым от концентрации образом со значением EC50, составляющим 0,01-10 нМ,

c) связывание CEACAM5-экспрессирующих клеток PEAK, но без перекрестного реагирования с CEACAM8-экспрессирующими клетками PEAK,

d) EC50 уничтожения в анализе TDCC (пример 8) при использовании опухолевых клеток LS-174T в качестве клеток-мишеней не увеличивается более чем в 5 раз в присутствии 1 мкг/мл sCEA,

e) ингибирование роста опухоли в модели HPAF-II на 25% или более в сравнении с контрольной группой (только растворитель),

f) конкуренцию с анти-CEA антителом, содержащим в качестве VL и VH-доменов VL и VH с последовательностями SEQ ID NO:48 и 49 (MEDI), и

g) наличие в каждой субъединице Fc-домена аминокислотных замен L234A, L235A и P329A (нумерация Kabat EU-индекс).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет свойства a) - d). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет все свойства из a) - f). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет свойства a) - d) и g). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет свойства a) - d) и f), и g). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело проявляет все свойства из a) - g).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что

a) каждый из первого связывающего фрагмента и второго связывающего фрагмента содержит в качестве тяжелой цепи общую тяжелую цепь (cHC) и содержит в качестве вариабельной области вариабельную область, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит

i) константную область легкой цепи каппа (CL) и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3; CDRL1 с SEQ ID NO:32, CDRL2 с SEQ ID NO:33 и CDRL3 с SEQ ID NO:34, или вариабельную область легкой цепи, полученную из SEQ ID NO:31 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов,

c) второй связывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3, группу областей CDR, выбранных из группы, состоящей из

I) CDRL1 с SEQ ID NO:6, CDRL2 с SEQ ID NO:7 и CDRL3 с SEQ ID NO:8,

II) CDRL1 с SEQ ID NO:10, CDRL2 с SEQ ID NO:11 и CDRL3 с SEQ ID NO:12,

III) CDRL1 с SEQ ID NO:14, CDRL2 с SEQ ID NO:15 и CDRL3 с SEQ ID NO:16,

IV) CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20, и

V) CDRL1 с SEQ ID NO:22, CDRL2 с SEQ ID NO:23 и CDRL3 с SEQ ID NO:24.

d) второй связывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи лямбда.

В одном варианте осуществления второй связывающий фрагмент в c) содержит легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:25, 26, 27, 28 и 29.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что

a) каждый из первого связывающего фрагмента и второго связывающего фрагмента содержит в качестве тяжелой цепи тяжелую цепь, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую в качестве областей CDR CDRL1, полученную из SEQ ID NO:32 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов и имеющую до четырех аминокислотных замен, CDRL2, полученную из SEQ ID NO:33 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов и имеющую до четырех аминокислотных замен, CDRL3, полученную из SEQ ID NO:34 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов и имеющую до четырех аминокислотных замен,

c) второй связывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3; CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20.

Такие биспецифические антитела включают, но не ограничиваются ими, биспецифические анти-CEAxCD3 антитела AB13L3-1, AB14L3-1, AB15L3-1, AB17L3-1, AB20L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1 и AB73L3-1.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что:

a) первый связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит в качестве вариабельной области легкой цепи вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDRL, выбранный из группы, состоящей из

b1) CDRL1 с SEQ ID NO:32, CDRL2 с SEQ ID NO:33 и CDRL3 с SEQ ID NO:34,

b2) CDRL1 с SEQ ID NO:81, CDRL2 с SEQ ID NO:82 и CDRL3 с SEQ ID NO:83,

b3) CDRL1 с SEQ ID NO:84, CDRL2 с SEQ ID NO:85 и CDRL3 с SEQ ID NO:86,

b4) CDRL1 с SEQ ID NO:87, CDRL2 с SEQ ID NO:88 и CDRL3 с SEQ ID NO:89,

b5) CDRL1 с SEQ ID NO:90, CDRL2 с SEQ ID NO:91 и CDRL3 с SEQ ID NO:92,

b6) CDRL1 с SEQ ID NO:93, CDRL2 с SEQ ID NO:94 и CDRL3 с SEQ ID NO:95,

b7) CDRL1 с SEQ ID NO:96, CDRL2 с SEQ ID NO:97 и CDRL3 с SEQ ID NO:98,

b8) CDRL1 с SEQ ID NO:99, CDRL2 с SEQ ID NO:100 и CDRL3 с SEQ ID NO:101,

b9) CDRL1 с SEQ ID NO:102, CDRL2 с SEQ ID NO:103 и CDRL3 с SEQ ID NO:104,

b10) CDRL1 с SEQ ID NO:105, CDRL2 с SEQ ID NO:106 и CDRL3 с SEQ ID NO:107,

b11) CDRL1 с SEQ ID NO:108, CDRL2 с SEQ ID NO:109 и CDRL3 с SEQ ID NO:110, и

b12) CDRL1 с SEQ ID NO:111, CDRL2 с SEQ ID NO:112 и CDRL3 с SEQ ID NO:113, и

c) второй связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содержащую CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4, и вариабельную область легкой цепи VL, содержащую CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что:

a) первый связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит в качестве вариабельной области легкой цепи вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDRL, выбранный из группы, состоящей из

b1) CDRL1 с SEQ ID NO:90, CDRL2 с SEQ ID NO:91 и CDRL3 с SEQ ID NO:92,

b2) CDRL1 с SEQ ID NO:96, CDRL2 с SEQ ID NO:97 и CDRL3 с SEQ ID NO:98,

b3) CDRL1 с SEQ ID NO:99, CDRL2 с SEQ ID NO:100 и CDRL3 с SEQ ID NO:101,

b4) CDRL1 с SEQ ID NO:102, CDRL2 с SEQ ID NO:103 и CDRL3 с SEQ ID NO:104,

b5) CDRL1 с SEQ ID NO:105, CDRL2 с SEQ ID NO:106 и CDRL3 с SEQ ID NO:107, и

b6) CDRL1 с SEQ ID NO:111, CDRL2 с SEQ ID NO:112 и CDRL3 с SEQ ID NO:113, и

c) второй связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содержащую CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4, и вариабельную область легкой цепи VL, содержащую CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что:

a) первый связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит в качестве вариабельной области легкой цепи вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDRL, выбранный из группы, состоящей из

b1) CDRL1 с SEQ ID NO:90, CDRL2 с SEQ ID NO:91 и CDRL3 с SEQ ID NO:92,

b2) CDRL1 с SEQ ID NO:105, CDRL2 с SEQ ID NO:106 и CDRL3 с SEQ ID NO:107, и

b3) CDRL1 с SEQ ID NO:111, CDRL2 с SEQ ID NO:112 и CDRL3 с SEQ ID NO:113, и

c) второй связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH, содержащую CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4, и вариабельную область легкой цепи VL, содержащую CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20.

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу по изобретению, отличающемуся содержанием

a) в первом связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:1, и содержащей CDR1 с SEQ ID NO:2, CDR2 с SEQ ID NO:3 и CDR3 с SEQ ID NO:4, и

b) вариабельной области легкой цепи VL, выбранной из группы, состоящей из

b1) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:31, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:32, CDRL2 с SEQ ID NO:33 и CDRL3 с SEQ ID NO:34,

b2) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:114, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:81, CDRL2 с SEQ ID NO:82 и CDRL3 с SEQ ID NO:83,

b3) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:115, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:84, CDRL2 с SEQ ID NO:85 и CDRL3 с SEQ ID NO:86,

b4) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:116, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:87, CDRL2 с SEQ ID NO:88 и CDRL3 с SEQ ID NO:89,

b5) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:117, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:90, CDRL2 с SEQ ID NO:91 и CDRL3 с SEQ ID NO:92,

b6) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:118, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:93, CDRL2 с SEQ ID NO:94 и CDRL3 с SEQ ID NO:95,

b7) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:119, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:96, CDRL2 с SEQ ID NO:97 и CDRL3 с SEQ ID NO:98,

b8) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:120, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:99, CDRL2 с SEQ ID NO:100 и CDRL3 с SEQ ID NO:101,

b9) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:121, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:102, CDRL2 с SEQ ID NO:103 и CDRL3 с SEQ ID NO:104,

b10) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:122, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:105, CDRL2 с SEQ ID NO:106 и CDRL3 с SEQ ID NO:107, и

b11) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:123, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:108, CDRL2 с SEQ ID NO:109 и CDRL3 с SEQ ID NO:110, и

b12) вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:124, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:111, CDRL2 с SEQ ID NO:112 и CDRL3 с SEQ ID NO:113,

c) во втором связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:1, и содержащей CDR1 с SEQ ID NO:2, CDR2 с SEQ ID NO:3 и CDR3 с SEQ ID NO:4, и вариабельной области легкой цепи VL, имеющей 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:17, и содержащей CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20.

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу по изобретению, отличающемуся содержанием

a) в первом связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и

b) вариабельной области легкой цепи VL, выбранной из группы, состоящей из

b1) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:31,

b2) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:114,

b3) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:115,

b4) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:116,

b5) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:117,

b6) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:118,

b7) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:119,

b8) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:120,

b9) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:121,

b10) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:122,

b11) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:123 и

b12) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:124, и

c) во втором связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:17.

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу по изобретению, отличающемуся содержанием

a) в первом связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и

b) вариабельной области легкой цепи VL, выбранной из группы, состоящей из

b1) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:117,

b2) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:119,

b3) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:120,

b4) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:121,

b5) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:122 и

b6) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:124, и

c) во втором связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:17.

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу по изобретению, отличающемуся содержанием

a) в первом связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и

b) вариабельной области легкой цепи VL, выбранной из группы, состоящей из

b1) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:117,

b2) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:122 и

b3) вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:124, и

c) во втором связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и вариабельной области легкой цепи VL с SEQ ID NO:17.

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу по изобретению, отличающемуся содержанием в первом связывающем фрагменте

a) вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и

b) легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из

b1) легкой цепи с SEQ ID NO:40

b2) легкой цепи с SEQ ID NO:125,

b3) легкой цепи с SEQ ID NO:126,

b4) легкой цепи с SEQ ID NO:127,

b5) легкой цепи с SEQ ID NO:128,

b6) легкой цепи с SEQ ID NO:129,

b7) легкой цепи с SEQ ID NO:130,

b8) легкой цепи с SEQ ID NO:131

b9) легкой цепи с SEQ ID NO:132,

b10) легкой цепи с SEQ ID NO:133 и

b11) легкой цепи с SEQ ID NO:134 и

b12) легкой цепи с SEQ ID NO:135, и

c) во втором связывающем фрагменте вариабельной области тяжелой цепи VH с SEQ ID NO:1 и легкой цепи с SEQ ID NO:28.

В одном варианте осуществления изобретение относится к биспецифическому антителу по изобретению, отличающемуся содержанием в первом связывающем фрагменте

a) общей тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из

a1) тяжелой цепи с SEQ ID NO:43,

a2) тяжелой цепи с SEQ ID NO:44 или

a3) тяжелой цепи с SEQ ID NO:45 и

b) легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из

b1) легкой цепи с SEQ ID NO:40

b2) легкой цепи с SEQ ID NO:125,

b3) легкой цепи с SEQ ID NO:126,

b4) легкой цепи с SEQ ID NO:127,

b5) легкой цепи с SEQ ID NO:128,

b6) легкой цепи с SEQ ID NO:129,

b7) легкой цепи с SEQ ID NO:130,

b8) легкой цепи с SEQ ID NO:131

b9) легкой цепи с SEQ ID NO:132,

b10) легкой цепи с SEQ ID NO:133

b11) легкой цепи с SEQ ID NO:134 или

b12) легкой цепи с SEQ ID NO:135, и

c) во втором связывающем фрагменте легкой цепи с SEQ ID NO:28.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению (AB17L3-1/N) содержит общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:45 (/N) и во втором связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь с SEQ ID NO:28 (1A4 LC, соответственно, L3-1), и в первом связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь с SEQ ID NO:128 (AB17). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению (AB71L3-1/N) содержит общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:45 (/N) и во втором связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь с SEQ ID NO:28 (L3-1), и в первом связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь с SEQ ID NO:133 (AB71). В одном варианте осуществления биспецифическое антитело по изобретению (AB73L3-1/N) содержит общую тяжелую цепь с SEQ ID NO:45 (/N) и во втором связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь с SEQ ID NO:28 (L3-1), и в первом связывающем фрагменте в качестве легкой цепи легкую цепь с SEQ ID NO:135 (AB73).

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что

a) каждый из первого связывающего фрагмента и второго связывающего фрагмента содержит в качестве тяжелой цепи общую тяжелую цепь, и содержит в качестве вариабельной области вариабельную область, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит

i) константную область легкой цепи лямбда (CL) и

ii) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3; CDRL1 с SEQ ID NO:36, CDRL2 с SEQ ID NO:37 и CDRL3 с SEQ ID NO:38, или вариабельную область легкой цепи, полученную из SEQ ID NO:35 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов,

c) второй связывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3, группу областей CDR, выбранных из группы, состоящей из

I) CDRL1 с SEQ ID NO:6, CDRL2 с SEQ ID NO:7 и CDRL3 с SEQ ID NO:8,

II) CDRL1 с SEQ ID NO:10, CDRL2 с SEQ ID NO:11 и CDRL3 с SEQ ID NO:12,

III) CDRL1 с SEQ ID NO:14, CDRL2 с SEQ ID NO:15 и CDRL3 с SEQ ID NO:16,

IV) CDRL1 с SEQ ID NO:18, CDRL2 с SEQ ID NO:19 и CDRL3 с SEQ ID NO:20, и

V) CDRL1 с SEQ ID NO:22, CDRL2 с SEQ ID NO:23 и CDRL3 с SEQ ID NO:24.

d) второй связывающий фрагмент содержит константную область гибридной цепи каппа.

В одном варианте осуществления второй связывающий фрагмент в c) содержит легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:67, 68, 69, 70 и 71.

В одном варианте осуществления второй связывающий фрагмент может содержать в качестве константной области легкой цепи константную область легкой цепи лямбда с SEQ ID NO:41; в этом случае первый связывающий фрагмент содержит, в одном варианте осуществления, в качестве константной области легкой цепи область гибридной легкой цепи каппа с SEQ ID NO:58. В одном варианте осуществления выбор плеча, содержащего константную область гибридной легкой цепи, основан на общих свойствах бсАт, включая, но без ограничения, стабильность и продуктивность.

В одном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи первого связывающего фрагмента получена из SEQ ID NO:35 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов, общая тяжелая цепь содержит SEQ ID NO:45, и вариабельная область общей тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:1.

В одном варианте осуществления биспецифическое антитело отличается содержанием первого связывающего фрагмента, специфически связывающего CEACAM5 человека, и второго связывающего фрагмента, специфически связывающего CD3ε человека, и отличается тем, что

a) каждый из первого связывающего фрагмента и второго связывающего фрагмента содержит в качестве тяжелой цепи общую тяжелую цепь, и содержит в качестве вариабельной области вариабельную область, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3; CDRH1 с SEQ ID NO:2, CDRH2 с SEQ ID NO:3 и CDRH3 с SEQ ID NO:4,

b) первый связывающий фрагмент содержит

i) константную область легкой цепи каппа (CL) и

ii) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3; CDRL1 с SEQ ID NO:64, CDRL2 с SEQ ID NO:65 и CDRL3 с SEQ ID NO:66, или вариабельную область легкой цепи, полученную из SEQ ID NO:63 путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза,