БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 C07K19/00 C12N15/13 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и, в частности, относится к биспецифическому антителу против EpCAM и CD3 и его применению.

Предпосылки создания изобретения

Биспецифические антитела (BsAb), также известные как антитела двойного нацеливания, могут одновременно распознавать и связываться с двумя разными антигенами или эпитопами, а также блокировать два разных сигнальных пути для проявления своих эффектов. По сравнению с моноклональными антителами (моноклональные Ab, mAb), которые распознают один антиген, биспецифические антитела имеют многочисленные преимущества: (1) способность перенаправлять специфические иммунные эффекторные клетки на соседние опухолевые клетки для усиления киллинга опухоли, чего невозможно достичь при использовании стратегии комбинированного лечении моноклональными антителами; (2) повышенная специфичность связывания за счет взаимодействия с двумя разными антигенами клеточной поверхности; (3) возможность снизить затраты на разработку и бюджеты на клинические испытания и нормативные проверки по сравнению с разработкой препаратов на основе моноклональных антител для комбинированной терапии; (4) способность одновременно блокировать два разных пути, которые имеют уникальные или перекрывающиеся функции в патогенезе по сравнению с препаратами моноклональных антител в комбинированной терапии.

Рак и другие заболевания являются многофакторными и имеют множество сигнальных путей в этиологии, поэтому направленная на одну мишень иммунотерапия не может эффективно уничтожать клетки-мишени. У пациентов, получающих лечение моноклональными антителами, может развиться лекарственная устойчивость, или они могут не отвечать на лечение. Соответственно, биспецифические антитела стали основным вариантом лечения многих заболеваний, таких как рак, воспаления, вирусные инфекции и аутоиммунные заболевания. Однако биспецифические антитела не существуют в природной среде, и для их получения необходимо использовать технологии рекомбинантной ДНК, клеточного слияния или химического связывания, среди которых технология рекомбинантной ДНК в настоящее время является наиболее часто используемой технологией получения BsAb, но существует еще множество препятствий, таких как сложность экспрессии, низкий выход, сложность очистки и низкая стабильность BsAb. Следовательно, крайне необходимо сконструировать новое биспецифическое антитело, которое сможет преодолеть вышеуказанные препятствия, и создать соответствующую животную модель иммуноопосредованного киллинга. Настоящее изобретение представляет новое биспецифическое антитело и описывает методы и результаты его фармакодинамических исследований.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении разработано новое биспецифическое антитело, включающее антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, и антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, и его применение.

Более конкретно, настоящее изобретение включает следующие аспекты:

1. Биспецифическое антитело, включающее антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, и антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3,

где антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, выбран из группы, состоящей из:

1) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с EpCAM, который включает следующие CDR или их варианты:

(i) CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 14, and

(ii) CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13,

при этом предпочтительно, в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 32, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 33, последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 34, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 35, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 36, и последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 37; или

2) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с EpCAM, который включает следующие CDR или их варианты:

(i) CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 16, и

(ii) CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 15,

при этом предпочтительно, в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat и системой определения CDR, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 38, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 39, последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 40, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 41, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 42 и последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 43;

антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, выбран из группы, состоящей из:

антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с CD3, который включает следующие CDR или их варианты:

CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 50, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 51,

при этом предпочтительно, в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 44, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 45, последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 46, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 47, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 48 и последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 49; или

2) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с CD3, который включает следующие CDR или их варианты:

CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 58, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 59,

при этом предпочтительно, в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 52, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 53, последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 54, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 55, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 56 и последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 57; варианты CDR отличаются от соответствующих CDR 3, 2 или 1 аминокислотой или имеют идентичность по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с соответствующими CDR.

2. Биспецифическое антитело в соответствии с пунктом 1, где антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, включает следующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи (или их варианты):

(i) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 13; или

(ii) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15; и

антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, включает следующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи (или их варианты):

(1) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 51, или

(2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 59;

предпочтительно антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, находится в форме Fab-фрагмента, а антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, находится в форме ScFv;

предпочтительно антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, включает следующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи (или их варианты):

(i) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 13; и

антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, выбран из группы, состоящей из:

(1) ScFv, представленного в SEQ ID NO: 18, или его варианта,

(2) ScFv, представленного в SEQ ID NO: 19, или его варианта,

при этом варианты отличаются от соответствующих вариабельных областей или ScFv 3, 2 или 1 аминокислотой или имеют идентичность по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с соответствующими вариабельными областями или ScFv.

3. Биспецифическое антитело в соответствии с пунктом 1 или 2, где биспецифическое антитело включает:

(1) пару легкая цепь-тяжелая цепь, специфически связывающуюся с EpCAM, при этом пара легкая цепь-тяжелая цепь включает или состоит из легкой цепи и тяжелой цепи, где легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи (предпочтительная последовательность представлена в любой из SEQ ID NO: 1 и 60-65), и тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи, CH1 (предпочтительная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2) и первый Fc-фрагмент, при этом предпочтительно первый Fc-фрагмент включает шарнирную область (предпочтительная последовательность представлена в SEQ ID NO: 3), CH2 (предпочтительная последовательность представлена в любой из SEQ ID NO: 6, 7 и 66-71) и CH3a; и

(2) слитый пептид, специфически связывающийся с CD3, при этом слитый пептид включает или состоит из ScFv, специфически связывающегося с CD3, и второго Fc-фрагмента, при этом предпочтительно ScFv включает, в последовательности от N-конца к C-концу, вариабельную область тяжелой цепи, линкерный пептид (предпочтительная последовательность представлена в SEQ ID NO: 4) и вариабельную область легкой цепи, и второй Fc-фрагмент включает, в последовательности от N-конца к C-концу, шарнирную область (предпочтительная последовательность представлена в SEQ ID NO: 3), CH2 (предпочтительная последовательность представлена в любой из SEQ ID NO: 6, 7 и 66-71) и CH3b, при этом предпочтительно C-конец вариабельной области легкой цепи связан с шарнирной областью второго Fc-фрагмента через линкерный пептид (предпочтительная последовательность представлена в SEQ ID NO: 5);

предпочтительно первый Fc-фрагмент и второй Fc-фрагмент являются человеческими или гуманизированными Fc-фрагментами, такими как Fc-фрагменты IgG человека, например, Fc-фрагменты IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgG5;

предпочтительно, по сравнению с антителом дикого типа, первый Fc-фрагмент и/или второй Fc-фрагмент включают одну или несколько замен, которые образуют пару, представляющую собой структуру «выступ во впадину» между тяжелой цепью и слитым пептидом, например, T366 в одном домене CH3 заменен относительно более крупным аминокислотным остатком, таким как тирозин (Y) или триптофан (W), при этом Y407 в другом домене CH3 заменен относительно меньшим аминокислотным остатком, таким как треонин (T), аланин (A) или валин (V); например, первый Fc-фрагмент и/или второй Fc-фрагмент включают одну или несколько замен, показанных в Таблице 6;

предпочтительно первый Fc-фрагмент и/или второй Fc-фрагмент включают одну или несколько замен, при этом 1) замена образует пару, представляющую собой солевой мостик между тяжелой цепью и слитым пептидом, например, один домен CH3 включает одну или несколько замен аминокислотным остатком, который положительно заряжен в физиологических условиях, при этом другой домен CH3 включает одну или несколько замен одним или несколькими аминокислотными остатками, которые отрицательно заряжены в физиологических условиях, при этом положительно заряженный аминокислотный остаток представляет собой, например, аргинин (R), гистидин (H) или лизин (K), отрицательно заряженный аминокислотный остаток может представлять собой, например, аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (E), и заменяемые аминокислотные остатки включают, например, один или несколько из D356, L368, K392, D399 и K409, например, одну или несколько замен, показанных в Таблице 7; 2) замена образует дисульфидную связь между тяжелой цепью и слитым пептидом, например замены, показанные в Таблице 8; и/или 3) замена приводит к значительному снижению способности к связыванию между Fc и белком A, например H435 и Y436 в домене CH3 заменены аргинином и фенилаланином, соответственно, как показано в Таблице 9;

при этом предпочтительно:

a) CH3b слитого пептида и CH3a тяжелой цепи имеют заменяющую пару, которая образует структуру «выступ во впадину»;

b) CH3b слитого пептида и CH3a тяжелой цепи имеют заменяющую пару, которая образует ионную связь;

c) CH3b слитого пептида и CH3a тяжелой цепи имеют заменяющую пару, которая образует дисульфидную связь; и/или

d) CH3b слитого пептида и CH3a тяжелой цепи имеют замену, которая приводит к пониженной способности к связыванию с белком A;

предпочтительно CH1 включает последовательность SEQ ID NO: 2; и/или CL включает последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1 и 60-65;

предпочтительно первый Fc-фрагмент и/или второй Fc-фрагмент включают CH2 последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 6, 7 и 66-71, и/или CH3 последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 8, 9, 11, 12 и 72-76;

предпочтительно последовательности CH3a и CH3b выбраны из группы, состоящей из:

(1) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 8, а другая представлена в SEQ ID NO: 11;

(2) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 9, а другая представлена в SEQ ID NO: 12;

(3) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 72, а другая представлена в SEQ ID NO: 74;

(4) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 9, а другая представлена в SEQ ID NO: 75;

(5) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 73, а другая представлена в SEQ ID NO: 76;

предпочтительно биспецифическое антитело выбрано из группы, состоящей из:

(1) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(2) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(3) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(4) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(5) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(6) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(7) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(8) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(9) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(10) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(11) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1; и

(12) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1.

4. Нуклеиновокислотная композиция, включающая нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую биспецифическое антитело в соответствии с любым из пунктов 1-3, при этом предпочтительно нуклеиновокислотная композиция включает:

a) первый вектор экспресии, включающий первую нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенсвязывающий домен или пару легкая цепь-тяжелая цепь, специфически связывающиеся с EpCAM, как определено в любом из пунктов 1-3;

b) второй вектор экспресии, включающий вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенсвязывающий домен или слитый пептид, специфически связывающиеся с CD3, как определено в любом из пунктов 1-3.

5. Вектор экспресии, включающий нуклеиновокислотную композицию в соответствии с пунктом 4.

6. Клетка-хозяин, включающая вектор экспресии в соответствии с пунктом 5.

7. Фармацевтическая композиция, включающая биспецифическое антитело в соответствии с любым из пунктов 1-3 и фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, лекарственное средство (например, низкомолекулярное лекарственное средство или высокомолекулярное лекарственное средство) для лечения рака (EpCAM-положительной опухоли, такой как колоректальный рак, гастральный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, ретинобластома, рак пищевода, рак почки, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома кожи, базальноклеточная карцинома кожи, саркома, эстезионейробластома, краниофарингеома, рак щитовидной железы, холангиокарцинома, рак мочевого пузыря, опухоль головы и шеи, рак шейки матки, рак полости рта и т.п.) и/или злокачественного асцита, злокачественного выпота, злокачественного плеврального выпота и т.п., при этом предпочтительно лекарственная форма фармацевтической композиции включает лекарственную форму для гастроинтестинального введения или лекарственную форму для парентерального введения; и более предпочтительно лекарственная форма фармацевтической композиции представляет собой инъекционную форму, включая внутривенную инъекцию, внутривенное капельное введение, подкожную инъекцию, местную инъекцию, внутримышечную инъекцию, интратуморальную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, интракраниальную инъекцию или внутриполостную инъекцию.

8. Конъюгат или слитый белок, включающий биспецифическое антитело в соответствии с любым из пунктов 1-3, предпочтительно включающий вещество А, конъюгированное или слитое с биспецифическим антителом, при этом вещество А выбрано из терапевтического средства, пролекарства, белка (например, фермента), вируса, липида, модификатора биологического ответа (например, иммуномодулятора), ПЭГ, гормона, олигонуклеотида, диагностического средства, цитотоксического средства, которое может представлять собой лекарственное средство или токсин, усилителя ультразвука, нерадиоактивной метки, детектируемой метки, такой как хемилюминесцентное метящее соединение (например, люминол, изолюминол, тероматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и оксалат) или флуоресцентный люминесцентный металл (например, 152Eu или лантанидная метка).

9. Набор, включающий биспецифическое антитело в соответствии с любым из пунктов 1-3 и, необязательно, лекарственное средство (например, низкомолекулярное лекарственное средство или высокомолекулярное лекарственное средство) для лечения рака (EpCAM-положительной опухоли, такой как колоректальный рак, гастральный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, ретинобластома, рак пищевода, рак почки, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома кожи, базальноклеточная карцинома кожи, саркома, эстезионейробластома, краниофарингеома, рак щитовидной железы, холангиокарцинома, рак мочевого пузыря, опухоль головы и шеи, рак шейки матки, рак полости рта и т.п.) и/или злокачественного асцита, злокачественного выпота, злокачественного плеврального выпота и т.п.

10. Применение биспецифического антитела в соответствии с любым из пунктов 1-3 в лечении рака или для получения лекарственного средства или набора для лечения рака и/или злокачественного асцита, злокачественного выпота, злокачественного плеврального выпота и т.п., при этом рак представляет собой, например, EpCAM-положительную опухоль, такую как колоректальный рак, гастральный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, ретинобластома, рак пищевода, рак почки, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома кожи, базальноклеточная карцинома кожи, саркома, эстезионейробластома, краниофарингеома, рак щитовидной железы, холангиокарцинома, рак мочевого пузыря, опухоль головы и шеи, рак шейки матки или рак полости рта.

11. Способ лечения рака и/или злокачественного асцита, злокачественного выпота или злокачественного плеврального выпота, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела в соответствии с любым из пунктов 1-3, при этом рак представляет собой EpCAM-положительную опухоль, такую как колоректальный рак, гастральный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, ретинобластома, рак пищевода, рак почки, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома кожи, базальноклеточная карцинома кожи, саркома, эстезионейробластома, краниофарингеома, рак щитовидной железы, холангиокарцинома, рак мочевого пузыря, опухоль головы и шеи, рак шейки матки или рак полости рта.

Следует понимать, что в рамках настоящего изобретения вышеуказанные технические особенности настоящего изобретения и технические особенности, конкретно описанные ниже (как в примерах), могут быть объединены друг с другом, чтобы составить новое или предпочтительное техническое решение. Из-за ограниченности места такие решения не описаны в настоящей заявке.

Термины, используемые в настоящем изобретении, имеют общепринятые значения, понятные специалистам в данной области техники. Когда термин имеет два или более определений, используемых и/или приемлемых в данной области техники, предполагается, что определение термина, используемое в настоящей заявке, включает все значения.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что CDR антитела ответственны за специфичность связывания антитела с антигеном. Для данной последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела существует несколько методов определения CDR антитела, включая системы нумерации по Kabat, IMGT, Chothia и AbM. Однако применение всех определений CDR для антитела или его вариантов должно входить в объем терминов, определенных и используемых в настоящей заявке. Если дана аминокислотная последовательность вариабельной области антитела, специалисты в данной области обычно могут определить конкретную CDR, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные помимо самой последовательности.

Как используется в настоящей заявке, “антитело” или “антигенсвязывающий фрагмент” относится к полипептиду или полипептидному комплексу, который специфически распознает антиген и связывается с ним. Термин “антитело” используется в широком смысле и включает иммуноглобулины или молекулы антител, включая моноклональные или поликлональные человеческие, гуманизированные, комплексные и химерные антитела и фрагменты антител. Таким образом, термин “антитело” включает любой белок или пептид, включающий специфическую молекулу, которая включает меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, обладающую биологической активностью для связывания с антигеном. Такие примеры включают, но не ограничиваются этим, определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи или их лигандсвязывающую часть, вариабельные области тяжелой или легкой цепи, константные области тяжелой или легкой цепи, каркасные области (FR) или любые их части, или по меньшей мере часть связывающего белка. В настоящем изобретении антитело включает мышиные, химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела, полученные с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, включая человеческие и нечеловеческие части, можно получить с использованием технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известной специалистам в данной области. Молекулы иммуноглобулинов или молекулы антител по настоящей заявке могут быть молекулами иммуноглобулинаов любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) или любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Термин “фрагмент антитела” или “антигенсвязывающий фрагмент” включает, но не ограничивается этим, F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, Fd, dAb, Fab/c, определяющую комплементарность область (CDR), одноцепочечный Fv (ScFv), дисульфид-стабилизированный Fv-фрагмент (dsFv), (dsFv)₂, биспецифический dsFv (dsFv-dsFv'), диатело, дисульфид-стабилизированное диатело (ds-диатело), ScFv мультимер (например, димер ScFv и тример ScFv), мультиспецифическое антитело, образованное из части антитела, включающей одну или несколько CDR, нанотело, однодоменное антитело (sdab), доменное антитело, бивалентное доменное антитело или любой другой фрагмент антитела, который связывается с антигеном, но не включает структуру интактного антитела. Независимо от структуры антигенсвязывающий фрагмент включает любой полипептид или полипептидный комплекс, способный связываться с тем же антигеном, с которым связывается родительское антитело или фрагмент родительского антитела. Термин «фрагмент антитела» включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин «фрагмент антитела» также включает любой синтетический или генно-инженерный белок, который, как и антитела, связывается со специфическим антигеном с образованием комплекса. Обычно фрагмент антитела содержит по меньшей мере около 50 последовательных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере около 50 последовательных аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере около 80 последовательных аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 100 последовательных аминокислот антитела по настоящему изобретению. изобретению.

«Одноцепочечный вариабельный фрагмент» или «ScFv» относится к слитому белку вариабельных областей тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) иммуноглобулина. В некоторых аспектах эти области связаны посредством короткого линкерного пептида, содержащего от 10 до примерно 25 аминокислот. Линкер может быть богат глицином для обеспечения гибкости, может также содержать серин или треонин для обеспечения растворимости и способен связывать N-конец VH с C-концом VL и наоборот. Этот белок сохраняет свойства исходного иммуноглобулина за исключением удаления константной области и введения линкера. Молекулы ScFv известны в данной области техники, например, описанные в патенте США № 5892019.

Антигенсвязывающий домен, связывающийся с EpCAM и CD3, представляет собой Fab, или ScFv, или нековалентную пару (Fv) между вариабельной областью тяжелой цепи (VH) и вариабельной областью легкой цепи (VL). Любое из вышеуказанных антител или полипептидов может также включать дополнительные полипептиды, например, сигнальный пептид на N-конце антитела, который используется для управления секрецией, или другие гетерологичные полипептиды, описанные в настоящей заявке, такие как метка 6×His, используемая для очистки. Помимо интактных антител, настоящее изобретение также включает фрагменты иммунокомпетентных антител или слитые белки, образованные антителами и другими последовательностями. Настоящее изобретение также обеспечивает другие белки или слитые продукты экспрессии, содержащие антитело настоящего изобретения. В частности, настоящее изобретение включает любой белок или белковый конъюгат и слитый продукт экспрессии (т.е. иммуноконъюгат и слитый продукт экспрессии), имеющий тяжелые и легкие цепи с вариабельными областями, при условии, что вариабельные области идентичны или имеют гомологию по меньшей мере 90%, предпочтительно гомологию по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно гомологию 96%, 97%, 98%, 99% или более с вариабельными областями тяжелой и легкой цепей антитела по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение включает молекулы, имеющие вариабельные области легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела с CDR-областями, при условии, что CDR имеют гомологию 90% или более (предпочтительно 95% или более, наиболее предпочтительно 96%, 97%, 98%, 99% или более) с CDR по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также включает фрагменты, варианты, производные и аналоги антител. Антитело, антигенсвязывающий фрагмент или их варианты или производные по настоящей заявке включают, но не ограничиваются этим, поликлональное антитело, моноклональное антитело, мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело, триспецифическое антитело и т.п.), человеческое антитело, антитело животного происхождения, гуманизированное антитело, приматизированное антитело или химерное антитело, CDR-привитое и/или модифицированное антитело, одноцепочечное антитело (например, ScFv), диатело, эпитоп-связывающие фрагменты, такие как Fab, Fab' и F (ab')₂, Fd, Fv, одноцепочечный Fv (ScFv), одноцепочечныеое антитело, дисульфид-стабилизированный Fv (dsFv), фрагменты, включающие домены VL или VH, фрагменты, полученные из библиотек экспрессии Fab, и антиидиотипическое (анти-Id) антитело. Фрагмент антитела, антигенсвязывающий фрагмент, производное или аналог по настоящему изобретению может представлять собой (i) полипептид, в котором один или несколько консервативных или неконсервативных аминокислотных остатков (предпочтительно консервативных аминокислотных остатков) заменены, и такие аминокислотные замены могут кодироваться или не кодироваться генетическими кодами, или (ii) полипептид, имеющий замещенную группу в одном или нескольких аминокислотных остатках, или (iii) полипептид, образованный путем слияния зрелого полипептида с другим соединением (таким как соединение, которое продлевает период полужизни полипептида, например, полиэтиленгликоль), или (iv) полипептид, образованный путем слияния дополнительной аминокислотной последовательности с полипептидной последовательностью (такой как лидерная последовательность, секреционная последовательность, последовательность для очистки полипептида, протеиногенная последовательность или слитый белок, образованный с 6×His меткой). Такие фрагменты, производные и аналоги хорошо известны специалистам в данной области согласно раскрытию настоящего изобретения.

Антитело по настоящему изобретению относится к полипептиду, обладающему активностью связывания с EpCAM и CD3 человека и включающему вышеуказанные CDR. Термин также включает варианты полипептидов, имеющих ту же функцию, что и антитело по настоящему изобретению, и содержащих вышеуказанные CDR. Эти варианты включают (но не ограничиваются этим): делецию, вставку и/или замену одной или более (обычно 1-50, предпочтительно 1-30, более предпочтительно 1-20 и наиболее предпочтительно 1-10) аминокислот, и добавление одной или более (обычно в пределах 20, предпочтительно в пределах 10 и более предпочтительно в пределах 5) аминокислот к С-концу и/или N-концу. Например, в данной области техники замены аминокислотами со схожими свойствами обычно не изменяют функцию белка. В качестве другого примера, добавление одной или нескольких аминокислот к С-концу и/или N-концу обычно не изменяет функцию белка. Термин также включает активные фрагменты и активные производные антитела по настоящему изобретению. Варианты полипептида включают: гомологичные последовательности, консервативные варианты, аллельные варианты, природные мутанты, индуцированные мутанты, белки, кодируемые ДНК, способной гибридизоваться с ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, в условиях высокой или низкой жесткости, а также полипептиды или белки, полученные с использованием антисыворотки против антитела по настоящему изобретению.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой (i) полипептид, в котором один или несколько консервативных или неконсервативных аминокислотных остатков (предпочтительно консервативных аминокислотных остатков) заменены, или (ii) полипептид, имеющий замещенную группу в одном или нескольких аминокислотных остатках, или (iii) полипептид, образованный путем слияния зрелого полипептида с другим соединением (таким как соединение, которое продлевает период полужизни полипептида, например, полиэтиленгликоль), или (iv) полипептид, образованный путем слияния дополнительной аминокислотной последовательности с полипептидной последовательностью (такой как лидерная последовательность, секреционная последовательность, последовательность для очистки полипептида, протеиногенная последовательность или слитый белок, образованный с 6His меткой). Такие фрагменты, производные и аналоги хорошо известны специалистам в данной области согласно раскрытию настоящего изобретения.

“Консервативная аминокислотная замена” представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин и цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан), разветвленные β-боковые цепи (например, треонин, валин и изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин). Таким образом, заменимые аминокислотные остатки полипептида иммуноглобулина предпочтительно заменяются другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей. В других вариантах осуществления цепочка аминокислот может быть заменена структурно схожей цепочкой аминокислот, которая отличается по последовательности и/или составу семейства боковых цепей.

Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен представлены в следующей таблице, где показатель сходства 0 или выше указывает на наличие консервативной замены между двумя аминокислотами.

В некоторых вариантах осуществления консервативная замена предпочтительно представляет собой замену, при которой одна аминокислота из следующих групп (a)-(e) заменена другим аминокислотным остатком из той же группы: (a) небольшие алифатические неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly, (b) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln, (c) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys, (d) объемные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys, и (e) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

Особенно предпочтительными консервативными заменами являются следующие: Ala заменяется на Gly или Ser; Arg заменяется на Lys; Asn заменяется на Gln или His; Asp заменяется на Glu; Cys заменяется на Ser; Gln заменяется на Asn; Glu заменяется на Asp; Gly заменяется на Ala или Pro; His заменяется на Asn или Gln; Ile заменяется на Leu или Val; Leu заменяется на Ile или Val; Lys заменяется на Arg, Gln или Glu; Met заменяется на Leu, Tyr или Ile; Phe заменяется на Met, Leu или Tyr; Ser заменяется на Thr; Thr заменяется на Ser; Trp заменяется на Tyr; Tyr заменяется на Trp; и/или Phe заменяется на Val, Ile или Leu.

Для нумерации Fc аминокислот используется система нумерации по Kabat. “Система нумерации по Kabat” относится к системе нумерации, описанной по Kabat et al., содержание которой представлено в United States Department of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Конкретная нумерация показана в следующей таблице:

Нумерация Fc аминокислот в соответствии с системой нумерации по Kabat

где

аминокислоты в положениях 221-227 образуют шарнирный домен,

аминокислоты в положениях 228-340 образуют второй домен CH2 константной области тяжелой цепи, и

аминокислоты в положениях 341-447 образуют третий домен CH3 константной области тяжелой цепи.

Антитела можно модифицировать для повышения эффективности спаривания гетеродимеров. Например, в некоторых аспектах, по сравнению с фрагментом антитела дикого типа, Fc-фрагмент моновалентной единицы тяжелой цепи и/или Fc-фрагмент слитого пептида может содержать одну или несколько замен, которые образуют пару, имеющую структуру «выступ во впадину». Конфигурация «выступ во впадину» известна в данной области техники. См., например, Ridgway et al., “‘Knob-into-holes’ engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization,” Protein Engineering 9(7):617-21 (1996).

В одном аспекте T366 в одном домене CH3 заменен относительно более крупным аминокислотным остатком, таким как тирозин (Y) или триптофан (W), а Y407 в другом домене CH3 тогда может быть заменен относительно меньшим аминокислотным остатком, таким как треонин (T), аланин (A) или валин (V).

Таблица 6
Комбинации аминокислотных замен в Fc, которые образуют структуры «выступ во впадину» между моновалентными и одноцепочечными единицами для повышения эффективности спаривания гетеродимеров Комбинация № Замена в одном CH3 Замена в другом CH3 1 T366W Y407A 2 T366W Y407V 3 T366Y Y407A 4 T366Y Y407V 5 T366W T366S, L368A, Y407V

В одном аспекте один из CH3 доменов включает одну или несколько замен аминокислотным остатком, который положительно заряжен в физиологических условиях, при этом другой домен CH3 включает одну или несколько замен одним или несколькими аминокислотными остатками, которые отрицательно заряжены в физиологических условиях. В одном аспекте положительно заряженный аминокислотный остаток может представлять собой аргинин (R), гистидин (H) или лизин (K). В другом аспекте отрицательно заряженный аминокислотный остаток может представлять собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (E). Аминокислотные остатки, которые могут заменяться, включают, но не ограничиваются этим, D356, L368, K392, D399 и K409.

Таблица 7
Комбинации аминокислотных замен в CH3, которые образуют ионные связи между моновалентными и одноцепочечными единицами для повышения эффективности спаривания гетеродимеров Комбинация № Замена в одном CH3 Замена в другом CH3 1 D356K D399K K392D K409D 2 L368R D399K K392D K409D 3 L368K D399K K392D K409D 4 L368R D399K K409D 5 L368K D399K K409D 6 L368R K409D 7 L368K K409D

В одном аспекте S354 в одном домене CH3 заменен цистеином, а Y349 в другом домене CH3 также заменен цистеином, при этом остатки в этих двух положениях, где произошла заменена, образуют дисульфидную связь.

Таблица 8
Комбинация аминокислотных замен в CH3, которая образует дисульфидную связь между моновалентной и одноцепочечной единицами для повышения эффективности спаривания гетеродимеров Комбинация № Замена в одном CH3 Замена в другом CH3 1 S354C Y349C

В одном аспекте H435 и Y436 в одном домене CH3 заменены на аргинин и фенилаланин, соответственно, что приводит к значительному снижению способности к связыванию между Fc и белком A, приводя таким образом к различиям в белок A-связывающей активности между гетеродимером и гомодимером, что делает возможным их разделение в процессе аффинной хроматографии.

Таблица 9
Аминокислотные замены в одном CH3, которые приводят к пониженной способности к связыванию с белком A Комбинация № Замены в CH3 1 H435R, Y436F

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность CH3 Fc, образующего гетеродимер, показана в следующей таблице:

Аминокислотная последовательность CH3a SEQ ID NO: Аминокислотная последовательность CH3b SEQ ID NO: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 72 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 74 GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9 GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 12 GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9 GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK 75 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYDTTPPVLDSDG SFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 11 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 73 GQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 76 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 74 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 72 GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 12 GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9 GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK 75 GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK 11 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYDTTPPVLDSD GSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8 GQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 76 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 73

Один вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает гетеродимерное антитело, включающее две разные антигенсвязывающие полипептидные единицы. В некоторых аспектах гетеродимер отличается по размеру от его соответствующего гомодимера, и разницу в размере можно использовать для облегчения отделения гетеродимера от гомодимера.

В некоторых аспектах, как показано на Фиг. 1, одна из двух антигенсвязывающих полипептидных единиц включает пару легкая цепь-тяжелая цепь, аналогичную паре антитела дикого типа. В настоящей заявке эта единица также называется «моновалентной единицей». В некоторых аспектах, как показано на Фиг. 1, другая антигенсвязывающая полипептидная единица включает одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv). Такой ScFv может быть слит с N-концом константного фрагмента (Fc) антитела, называемый слитым пептидом. В настоящей заявке этот слитый пептид также называют «одноцепочечной единицей».

Любые из вышеуказанных антител или полипептидов также могут включать дополнительные полипептиды, например, пептиды, кодируемые, как описано в настоящей заявке, сигнальный пептид константной области антитела, который используется для управления секрецией, или другие гетерологичные полипептиды, описанные в настоящей заявке. Описанные в настоящей заявке антитела могут быть модифицированы таким образом, чтобы их аминокислотные последовательности отличались от встречающихся в природе связывающих полипептидов, из которых они получены. Например, полипептидная или аминокислотная последовательность данного белка может быть подобна исходной последовательности, например, может иметь определенный процент идентичности, такой как 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности исходной последовательности. Кроме того, могут быть произведены замены, делеции или вставки нуклеотидов или аминокислот для осуществления консервативных замен или изменений в «несущественных» аминокислотных областях. Например, полипептидная или аминокислотная последовательность данного белка может быть идентична исходной последовательности, за исключением одной или нескольких независимых аминокислотных замен, вставок или делеций, таких как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более независимых аминокислотных замен, вставок или делеций. В некоторых вариантах осуществления полипептидная или аминокислотная последовательность данного белка имеет от 1 до 5, от 1 до 10, от 1 до 15 или от 1 до 20 независимых аминокислотных замен, вставок или делеций относительно исходной последовательности.

Как используется в настоящей заявке, термин “детектируемая метка” относится к соединению или композиции, которые можно обнаружить непосредственно или опосредованно, которые прямо или косвенно связываются с композицией (например, полинуклеотидом или белком, таким как антитело), подлежащей обнаружению, с получением «меченой» композиции. Этот термин также включает последовательности, связывающиеся с полинуклеотидом, которые обеспечивают сигналы посредством экспрессии вставленных последовательностей, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и т.п. Метка сама по себе может быть детектируемой (например, радиоизотопная метка или флуоресцентная метка) или, в случае ферментной метки, может катализировать детектируемое химическое изменение в соединении или композиции субстрата. Метку можно использовать для низкомасштабной детекции, или она больше подходит для высокопроизводительного скрининга. Аналогичным образом, подходящие метки включают, но не ограничиваются этим, радиоизотопы, флуоресцентные красители, хемилюминесцентные соединения, красители и белки (включая ферменты). Метка может быть просто детектируемой или также поддается количественному измерению. Реакции, которые можно только лишь обнаружить, обычно включают реакции, которые можно только подтвердить, в то время как реакции, которые поддаются количественному определению, обычно включают реакции, имеющие поддающиеся количественному измерению (например, поддающиеся численному измерению) значения, такие как интенсивность, поляризация и/или другие свойства. При люминесцентном или флуоресцентном анализе в детектируемой реакции может непосредственно использоваться люминофор или флуорофор, который связан с аналитическим компонентом и фактически вовлечен в связывание, или люминофор или флуорофор могут использоваться не напрямую и могут быть связаны с другим компонентом (например, репортерной молекулой или индикатором).

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с терапевтическим средством (например, химиотерапевтическим средством, таким как цисплатин и карбоплатин), пролекарством, пептидом, белком, ферментом, вирусом, липидом, модификатором биологического ответа, фармацевтическим средством или ПЭГ. Антитело по настоящему изобретению может быть связано или слито с терапевтическим средством, и терапевтическое средство может включать детектируемую метку, такую как радиоактивная метка, иммуномодулятор, гормон, фермент, олигонуклеотид, фотоактивное терапевтическое или диагностическое средство, цитотоксическое средство, которое может представлять собой лекарственное средство или токсин, агент, усиливающий ультразвук, нерадиоактивная метка, их комбинация и другие подобные ингредиенты, известные в данной области.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид включает аминокислотную последовательность или одну или несколько групп, которые обычно не связываются с антителом. Например, одноцепочечный Fv-фрагмент антитела по настоящему изобретению может включать гибкую линкерную последовательность или может быть модифицирован для добавления функциональной группы (например, полиэтиленгликоля (ПЭГ), лекарственного средства, токсина или метки). Антитело и его варианты или производные по настоящему изобретению включают модифицированные производные, т.е. любой тип молекулы ковалентно связан с антителом, и эта ковалентная связь не препятствует связыванию антитела с эпитопом. Кроме того, антитело может включать одну или несколько неканонических аминокислот.

Следует отметить, что описание объекта с неопределенным количеством должно означать один или несколько (типов) этого объекта; например, «мультифункциональное антитело» следует понимать как означающее один или несколько (типов) многофункциональных антител. Аналогично, термины «один или несколько» и «по меньшей мере один», которые не указывают точное количество, используются в настоящей заявке взаимозаменяемо.

Как используется в настоящей заявке, термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, когда у субъекта следует предотвратить или замедлить (облегчить) нежелательное физиологическое изменение или заболевание, например, развитие рака. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются этим, облегчение симптомов, уменьшение тяжести заболевания, стабилизацию (например, предотвращение ухудшения) болезненного состояния, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), выявляемую или невыявляемую. «Лечение» может также относиться к продлению выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью без лечения. Состояния, требующие лечения, включают случаи, когда субъект уже имеет расстройство или симптом, а также когда субъект подвержен этому расстройству или симптому, или когда расстройство или симптом необходимо предотвратить.

Под «субъектом», или «индивидуумом», или «животным», или «пациентом», или «млекопитающим» подразумевается любой субъект, особенно субъекты-млекопитающие, нуждающийся в диагностике, прогнозе или лечении. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных из зоопарков, спорткомплексов или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы, приматы (например, люди, обезьяны, такие как обезьяны cynomolgus, макаки, бабуины и шимпанзе и т.д.) и т.п.

Как описано в настоящей заявке, антигенсвязывающие полипептиды, варианты или производные по настоящему изобретению можно использовать в некоторых терапевтических и диагностических способах, связанных с раком или инфекционными заболеваниями. Настоящая заявка также относится к терапии на основе антител, включающей введение биспецифического антитела по настоящему изобретению пациенту, такому как животное, млекопитающее и человек, для лечения одного или более заболеваний или состояний, описанных в настоящей заявке. Терапевтические средства по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются этим, антитело по настоящему изобретению (включая его варианты и производные, как описано в настоящей заявке) и нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды, кодирующие антитело по настоящему изобретению (включая его варианты и производные, как описано в настоящей заявке). Антитело по настоящему изобретению также можно использовать для лечения, ингибирования или предотвращения заболевания, расстройства или состояния, включая злокачественное заболевание или расстройство, или состояние, связанное с таким заболеванием или расстройством, такое как заболевание, связанное с иммунным ответом. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению можно использовать в качестве иммунодепрессанта. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания. Антигенсвязывающие полипептиды по настоящему изобретению и их варианты или производные полезны для ингибирования роста, развития и/или метастазирования рака, особенно те, которые перечислены выше или в следующих параграфах.

Другие заболевания или состояния, связанные с повышенной выживаемостью клеток, которые можно лечить, предотвращать, диагностировать и/или прогнозировать с использованием антитела или его вариантов или производных по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, рак или опухоли, включая развитие и/или метастазирование злокачественных опухолей, а также родственные заболевания (например, злокачественный асцит, злокачественный плевральный выпот и злокачественный выпот), такие как EpCAM-положительные опухоли.

Способы введения антитела или его вариантов или производных включают, но не ограничиваются этим, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Антитело или композицию можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, или путем абсорбции через эпителий или слизистую оболочку и внутренние слои кожи (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и можно вводить с другими биологически активными средствами. Таким образом, фармацевтическую композицию, включающую антитело по настоящему изобретению, можно вводить перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, интравагинально, интраперитонеально, местно (например, в виде порошка, мази, капель или чрескожного пластыря), буккально или в виде перорального или назального спрея. Используемый в настоящей заявке термин «парентеральный» относится к путям введения, которые включают внутривенные, внутримышечные, интраперитонеальные, интрастернальные, подкожные и внутрисуставные инъекции и инфузии. Введение может быть системным или местным. Также может быть желательно локально ввести антигенсвязывающий полипептид или композицию по настоящему изобретению в область, нуждающуюся в лечении; этого можно достичь, например, но не ограничиваясь этим, местной перфузией во время операции, местным нанесением, например, в сочетании с послеоперационной повязкой на рану, введением инъекции, через катетер, введением суппозитория или имплантата, при этом имплантат представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая мембраны или волокна. Предпочтительно при введении белков (включая антитело) по настоящему изобретению необходимо соблюдать осторожность и использовать материалы, которые не абсорбируют белки.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает схематическую структурную диаграмму антитела YBODY.

Фиг. 2 показывает детекцию связывающего взаимодействия между клетками HCT116 и Jurkat, опосредованного биспецифическими антителами. A: график проточной цитометрии для отрицательного контроля (HCT116+Jurkat без антител), где Q1 - для клеток Jurkat, окрашенных CFSE, Q2 - для связанных вместе клеток Jurkat и HCT116, Q3 - для PKH26-окрашенных клеток HCT116, и Q4 - для неокрашенных клеток; B: график проточной цитометрии для экспериментальной группы (HCT116+Jurkat+M701A, 10 мкг/мл), где изображение в каждом секторе означает то же, что и на предыдущем графике; и C: кривые градиента концентрации для связывания HCT116 с клетками Jurkat, опосредованного различными антителами.

Фиг. 3 показывает детекцию биологической активности биспецифических антител (система репортерных генов).

Фиг. 4 показывает детекцию опосредованного биспецифическими антителами киллинг-эффекта in vitro. А: киллинг B16-EpCAM in vitro при помощи M701A; B: киллинг B16 in vitro при помощи M701A; C: киллинг HCT116 in vitro при помощи M701A; D: киллинг OVCAR-3 in vitro при помощи M701A; E: киллинг CHO-K1-huEpCAM in vitro различными биспецифическими антителами; и F: киллинг HCT116 in vitro различными биспецифическими антителами.

Фиг. 5 показывает эффективность биспецифических антител in vivo на модели рака толстой кишки человека HCT116. А: изменения в росте объема опухоли мыши; и B: изменения массы тела мыши.

Фиг. 6 показывает эффективность биспецифических антител in vivo на модели рака яичников человека OVCAR-3. А: изменения в росте объема опухоли мыши; и B: изменения массы тела мыши.

Подробное описание изобретения

Способ и применение настоящего изобретения описаны ниже со ссылкой на чертежи, а приведенные примеры предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение, могут сделать различные простые выводы или осуществить замены без отступления от сущности настоящего изобретения, которые следует рассматривать как входящие в объем настоящего изобретения.

Пример 1: Конструирование векторов экспрессии биспецифических антител

Каждая структура биспецифического антитела, нацеленная на EpCAM и CD3, содержала область связывания анти-EpCAM и область связывания анти-CD3, где моновалентная единица представляла собой пару, образованную тяжелой и легкой цепями анти-EpCAM, а одноцепочечная единица представляла собой форму анти-CD3 ScFv-Fc. Структура была определена как структура YBODY (как показано на Фиг. 1), в которой VL-области анти-CD3 связаны с шарнирной областью и CH2 через линкер. В этой структуре Fc тяжелой цепи моновалентной единицы и Fc одноцепочечной единицы (с Fc тяжелой цепи IgG человека в качестве основной цепи) подвергались модификациям, таким как аминокислотные мутации, что делало их менее склонными к образованию гомодимеров и более склонными к образованию гетеродимеров. Используя существующую плазмиду или синтетический генный фрагмент в качестве матрицы, каждую цепь, соответствующую биспецифическому антителу, амплифицировали методом ПЦР и перекрывающейся ПЦР, и каждую цепь антитела клонировали в вектор pcDNA3.1 (Invitrogen) путем ферментативного расщепления и лигирования или рекомбинантными методами. Конкретная информация о последовательностях каждой цепи антитела представлена в Таблице 1 и перечне последовательностей.

Таблица 1
Информация об аминокислотных последовательностях, соответствующих каждой молекуле антитела Биспецифическое антитело № Легкая цепь
анти-EpCAM
SEQ ID NO: Тяжелая цепь
анти-EpCAM
SEQ ID NO: Одноцепочечное анти-CD3
SEQ ID NO: VL CL VH CH1 Шарнир CH2 CH3a ScFv L2 Шарнир CH2 CH3b M701 13 1 14 2 3 6 8 17 5 3 6 10 M701A 13 14 6 8 18 6 11 M701B 13 14 6 8 19 6 11 M701C 13 14 6 8 20 6 11 M701D 13 14 6 8 21 6 11 M701E 13 14 6 8 22 6 11 M701F 13 14 6 8 23 6 11 M701G 13 14 6 8 24 6 11 M701H 15 16 6 8 18 6 11 M701I 15 16 6 8 19 6 11 M701J 13 14 7 9 18 7 12 M701K 13 14 7 9 19 7 12

Пример 2: Экспресия и очистка биспецифических антител

Плазмиду экстрагировали обычным методом экстракции плазмиды и использовали для химической трансфекции клеток CHO-S (от Gibco). Трансфицированные клетки культивировали в шейкере с 5% CO₂ при 37°C в течение 7-10 дней. Супернатант собирали центрифугированием при 3000× g, фильтровали через 0,22-мкм фильтр и подвергали аффинной хроматографии с белком А для получения предварительно очищенного биспецифического антитела. Концентрацию очищенного белка определяли по УФ-поглощению при 280 нм и соответствующему коэффициенту экстинкции, чистоту антитела проверяли методом высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (ВЭЖХ-SEC) и рассчитывали уровень экспрессии, соответствующий каждому белку. Молекулы биспецифических антител показали уровни экспрессии в диапазоне от 40 мг/л до 91 мг/л и начальную чистоту в диапазоне от 45% до 81%, и уровни экспрессии и начальная чистота M701A, M701B, M701C, M701D, M701E, M701F, M701G, M701H, M701I, M701J и M701K значительно превосходили уровень экспрессии M701. Затем образцы, полученные после аффинной очистки, дополнительно очищали катионообменной хроматографией с получением биспецифических антител с чистотой ВЭЖХ-SEC >95%. Процент выделения после очистки биспецифических антител показан в Таблице 2.

Таблица 2
Уровни экспрессии и исходная ВЭЖХ-SEC чистота биспецифических антител Антитело № Уровень экспресии ВЭЖХ-SEC Процент выделения после очистки M701 47,2 мг/л 45,91% 14% M701A 90,8 мг/л 81,12% 57% M701B 84,1 мг/л 78,53% 53% M701C 54,4 мг/л 64,54% 32% M701D 65,8 мг/л 58,63% 23% M701E 49 мг/л 55,76% 22% M701F 52,4 мг/л 66,32% 30% M701G 41 мг/л 70,76% 25% M701H 73,3 мг/л 72,03% 43% M701I 80,6 мг/л 73,21% 45% M701J 87,7 мг/л 78,21% 47% M701K 81,3 мг/л 74,50% 41%

Пример 3: Анализ биспецифических антител на термостабильность

Небольшой образец каждого биспецифического антитела разводили до концентрации 0,5 мг/мл буфером (25 мМ лимонной кислоты+50 мМ NaCl, pH 6,0) и распределяли аликвотами в 1,5-мл EP пробирки по 100 мкл/пробирка. Аликвоты помещали в водяную баню с температурой 40°C для 14-дневного эксперимента по ускоренной оценке термостабильности и анализировали изменения чистоты и аффинности. День, когда аликвоты помещали в водяную баню с температурой 40°C, обозначали как D0, а 14-й день обозначали как D14.

Человеческий антиген EpCAM (SB, Cat: 10694-H08H) и человеческий антиген CD3 (SB, Cat: CT038-H2508H) были отдельно иммобилизованы на чипе CM5 с использованием метода аминосвязывания с уровнем связывания антигена 1500 RU. Для определения активности связывания с антигенами образцы разбавляли до исходной концентрации, используя 1× HBS-EP+буфер, с последующим 2-кратным градиентным разведением до достижения 4 концентраций. Затем осуществляли автоматическую детекцию образцов от низкой концентрации до высокой концентрации со скоростью потока для связывания 30 мкл/мин, временем связывания 120 сек и временем диссоциации 300 сек. Чип регенерировали с использованием раствора глицина с pH 1,5, со скоростью потока для регенерации 10 мкл/мин и временем регенерации 30 сек. После завершения детекции осуществляли подгонку данных по результату с использованием оценочного программного обеспечения Biacore T200 в режиме подгонки связывания 1:1 для получения равновесной константы диссоциации (KD).

Результаты, как показано в Таблице 3, показывают, что M701A, M701B, M701H, M701I, M701J и M701K продемонстрировали снижение чистоты менее чем на 5% на 14-й день ускоренного термического испытания, при этом M701A, M701B, M701J и M701K продемонстрировали изменение чистоты менее чем на 2%, а сродство к обоим антигенам по существу не изменилось, что позволяет предположить, что M701A, M701B, M701J и M701K обладают хорошей термической стабильностью.

Таблица 3
Анализы чистоты и аффинности образцов биспецифических антител с использованием ускоренных термических испытаний Антитело № ВЭЖХ-SEC% EpCAM-Biacore
(K_D, нМ) CD3-Biacore
(K_D, нМ) D0 D14 D0 D14 D0 D14 M701 95,21% 25,11% 19,17 n.d. 25,44 n.d. M701A 95,80% 95,78% 17,11 17,28 21,15 21,07 M701B 95,63% 94,26% 20,01 22,61 28,27 31,52 M701C 95,34% 85,10% 18,57 n.d. 37,20 n.d. M701D 95,87% 86,78% 14,39 n.d. 51,73 n.d. M701E 96,03% 89,33% 23,14 n.d. 31,46 n.d. M701F 95,48% 84,48% 17,94 n.d. 61,34 n.d. M701G 95,22% 80,22% 19,71 n.d. 18,80 n.d. M701H 95,07% 90,72% 51,56 60,91 95,26 100,4 M701I 95,57% 91,27% 49,78 57,05 40,03 45,56 M701J 95,60% 95,23% 18,23 18,67 23,45 23,56 M701K 95,05% 94,56% 21,05 22,58 28,78 30,63 Примечание: n.d.=не обнаружено

Пример 4: Анализ аффинности биспецифического антитела в отношении клеток EpCAM

Аффинность антител к EpCAM человека на поверхности клеток анализировали методом FACS с использованием клеток рака толстой кишки человека HCT116 (Shanghai Institutes for Biological Sciences) в качестве положительных клеток, экспрессирующих EpCAM человека на поверхности клеточной мембраны.

Клетки HCT116 собирали центрифугированием, ресуспендировали в буфере (PBS+1% FBS) и добавляли в 96-луночный планшет при 2×10⁵ клеток/лунка (50 мкл/лунка). Затем клетки центрифугировали при 350× g в течение 5 мин и удаляли супернатант. Каждое биспецифическое антитело разводили буфером до 1000 нМ, подвергали серийному градиентному разведению, а затем добавляли в 96-луночный планшет при 50 мкл/лунка. Смесь ресуспендировали, затем инкубировали 1 ч в темноте и центрифугировали. Затем супернатант удаляли и лунки дважды промывали буфером с последующим ресуспендированием в разбавленном PE-меченном античеловеческом IgG Fc-антителе (Biolegend, 409304). Затем суспензию инкубировали в течение 30 мин в темноте, дважды промывали буфером, затем ресуспендировали в 100 мкл буфера и осуществляли детекцию на проточном цитометре (BD Accuri™ C6).

Все биспецифические антитела продемонстрировали значительное связывание с клетками HCT116, среди которых M700 служил в качестве контрольного анти-EpCAM моноклонального антитела (с легкой цепью SEQ ID NO: 25 и тяжелой цепью SEQ ID NO: 26) со специфическими значениями EC50, как показано в Таблице 4.

Таблица 4
Способность биспецифических антител к связыванию с клетками HCT116 Антитело № M700 M701 M701A M701B M701H M701I M701J M701K EC50 (нМ) 1,782 10,501 3,565 3,719 7,151 7,086 3,779 5,652

Пример 5: Анализ аффинности биспецифического антитела в отношении CD3 (Biacore)

Человеческий антиген CD3 (SB, Cat: CT038-H2508H) иммобилизовали на чипе CM5 с использованием метода аминосвязывания с уровнем связывания антигена 1500 RU. Для определения активности связывания с антигеном CD3 образцы разбавляли до исходной концентрации, используя 1× HBS-EP+буфер, с последующим 2-кратным градиентным разведением до достижения 4 концентраций. Затем осуществляли автоматическую детекцию образцов от низкой концентрации до высокой концентрации со скоростью потока для связывания 30 мкл/мин, временем связывания 120 сек и временем диссоциации 300 сек. Чип регенерировали с использованием раствора глицина с pH 1,5, со скоростью потока для регенерации 10 мкл/мин и временем регенерации 30 сек. После завершения детекции осуществляли подгонку данных по результату с использованием оценочного программного обеспечения Biacore T200 в режиме подгонки связывания 1:1 для получения равновесной константы диссоциации (KD). Как показано в Таблице 5, все из ряда биспецифических антител продемонстрировали связывание с человеческим антигеном CD3. Среди них M701A и M701B имеют идентичные последовательности вариабельных областей анти-EpCAM антитела (SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14), и их последовательности вариабельных областей анти-CD3 антитела представляют собой SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно, с соответствующими аффинностями 21,15 нМ и 28,27 нМ соответственно. Однако последовательности вариабельных областей анти-EpCAM антитела были изменены на SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, в то время как последовательности вариабельных областей анти-CD3 антитела по-прежнему представляли собой SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, и аффинность соответствующих биспецифических антител M701H и M701I составляла 95,26 нМ и 40,03 нМ, соответственно. Это указывает на то, что комбинации различных анти-EpCAM антител с различными анти-CD3 антителами для образования биспецифических антител продемонстрировали неравномерную аффинность.

Таблица 5
Определение способности биспецифических антител к связыванию с человеческим антигеном CD3 методом Biacore Антитело № M701 M701A M701B M701H M701I M701J M701K Kd (нМ) 25,44 21,15 28,27 95,26 40,03 23,45 28,78

Пример 6: Опосредованное биспецифическим антителом связывание клеток мостиком

EpCAM-положительную клеточную линию HCT116 окрашивали PKH26, а CD3-положительную клеточную линию Jurkat (Shanghai Institutes for Biological Sciences) окрашивали CFSE. Окрашенные клетки смешивали и совместно инкубировали в соотношении 1:1 (1×10⁵ клеток HCT116 : 1×10⁵ клеток Jurkat) с тестируемыми антителами, которые были подвергнуты градиентному разведению, среди которых M700 служил в качестве контрольного анти-EpCAM моноклонального антитела (с легкой цепью SEQ ID NO: 25 и тяжелой цепью SEQ ID NO: 26), M100 служил в качестве контрольного анти-CD3 моноклонального антитела (с легкой цепью SEQ ID NO: 27 и тяжелой цепью SEQ ID NO: 28), а Mco101 представляло собой биспецифическое антитело против люциферазы и против CD3 и служило в качестве изотипического контрольного анти-CD3 биспецифического антитела (с легкой цепью SEQ ID NO: 29, тяжелой цепью SEQ ID NO: 30 и одноцепочечной единицей SEQ ID NO: 31, структурно идентичными Фиг. 1). После 1 часа совместной инкубации смеси промывали, ресуспендировали и осуществляли детекцию на проточном цитометре (BD Accuri™ C6). Клетки, дважды положительные на CFSE и PKH26, представляют собой клетки HCT116 и Jurkat, связанные мостиком посредством антитела.

Результаты, как показано на Фиг. 2, показывают, что после смешивания клеток Jurkat и HCT116 в соотношении 1:1 и совместной инкубации с hIgG, M700, M100 и Mco101 в течение 1 часа клетки HCT116 и Jurkat не были связаны мостиком; однако после добавления M701A и M701B связанные мостиком клетки составляли около 40% от общего числа PKH26-положительных клеток, M701A и M701B имели сопоставимую активность, а взаимодействие клеток, опосредованное биспецифическим антителом, продемонстрировало положительную взаимосвязь «доза-эффект» с концентрацией антитела.

Пример 7: Анализ биологической активности биспецифических антител (метод с использованием репортерных генов)

Биологическую активность биспецифических антител определяли с использованием клеток Jurkat-CD3-NFAT-RE-Luc (Promega). Вектор pLV-puro (Inovogen Tech. Co., кат. № VL3001), содержащий ДНК, кодирующую ген EpCAM человека (последовательность NCBI № NM_002354.3), трансфицировали в клетки CHO-K1 с получением клеточной линии CHO-K1-huEpCAM, стабильно экспрессирующей человеческий EpCAM. Клетки CHO-K1-huEpCAM собирали в качестве клеток-мишеней и ресуспендировали в буфере (PBS+1% FBS), добавляли в белый 96-луночный культуральный планшет при 4×10⁴ клеток/лунка и инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ в течение 18-24 часов. Затем среду из планшета удаляли и в каждую лунку добавляли по 40 мкл разведения антител. Клетки Jurkat-CD3-NFAT-RE-Luc, которые служили в качестве эффекторных клеток, извлекали и пипетировали для приготовления одноклеточной суспензии. Суспензию добавляли в белый 96-луночный культуральный планшет при соотношении эффектор-мишень (Е:Т) 1,5:1, по 40 мкл на лунку, что соответствует 6×10⁴ клеток на лунку. Белый 96-луночный культуральный планшет инкубировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ в течение 6 часов, а затем в каждую лунку добавляли 80 мкл реагента для анализа люциферазы Bio-Glo. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем помещали в многофункциональный планшет-ридер, где значения люминесценции считывали с использованием хемилюминесценции.

Результаты, как показано на Фиг. 3, показывают, что в системе оценки на основе репортерных генов все биспецифические антитела M701, M701A, M701B, M701H, M701I, M701J и M701K проявляли биологическую активность, при этом M701A, M701J и M701K проявляли более сильную активность, чем M701.

Пример 8: Определение опосредованного биспецифическими антителами киллинг-эффекта in-vitro

Киллинг-эффект in vitro, опосредованный биспецифическими антителами, определяли с использованием выделенных РВМС в качестве эффекторных клеток и EpCAM-экспрессирующих клеток в качестве клеток-мишеней. Вектор pLV-puro (Inovogen Tech. Co., кат. № VL3001), содержащий ДНК, кодирующую ген EpCAM человека (последовательность NCBI № NM_002354.3), трансфицировали в клетки меланомы мыши B16 (Shanghai Institutes for Biological Sciences) с получением клеточной линии B16-EpCAM, стабильно экспрессирующей EpCAM человека, где клетки B16 служили в качестве отрицательных клеток, не экспрессирующих EpCAM. Другие EpCAM-экспрессирующие клетки-мишени также включают клетки рака толстой кишки человека HCT116 (Shanghai Institutes for Biological Sciences), клетки рака яичников человека OVCAR-3 (China Center for Type Culture Collection (CCTCC)) и CHO-K1-huEpCAM. Клетки расщепляли панкреатином для получения суспензии отдельных клеток и суспензию центрифугировали при 300 g в течение 5 минут для сбора клеток. Клетки окрашивали 5 мкМ сукцинимидилового эфира 5,6-карбоксифлуоресцеиндиацетата и (CFSE) при 37°C в течение 15 минут, дважды промывали полной средой, затем подсчитывали на счетчике клеток Vi-cell и добавляли в 96-луночный планшет при 2×10⁴ клеток/100 мкл на лунку, предназначенный для эксперимента. Каждое антитело в соответствующей концентрации добавляли при 50 мкл/лунка, и hPBMC подсчитывали на счетчике клеток Cellometer, а затем добавляли в 96-луночный планшет (при 2×10⁵ клеток/50 мкл на лунку и с соотношением эффектор-мишень 10:1). Планшет с культурой клеток помещали в клеточный инкубатор для культивирования на 72 часа и после расщепления клеток для получения суспензии отдельных клеток добавляли раствор пропидий йодида (PI) с конечной концентрацией 1 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 10 минут, а затем осуществляли детекцию на проточном цитометре (BD Accuri™ C6) и анализировали процентное содержание CFSE+PI+двойных положительных клеток в CFSE+положительных клетках.

Как показано на Фиг. 4A и 4B, M701A продемонстрировал киллинг-эффект только на клетках B16-EpCAM, экспрессирующих EpCAM, без киллинг-эффекта на клетки B16, не экспрессирующие EpCAM, в то время как контрольное антитело Mco101 не показало киллинг-эффекта ни на какие клетки, что указывает на целенаправленный эффект биспецифического антитела. Как показано на Фиг. 4C и 4D, M701A показало значительный киллинг-эффект как на клетки HCT116, так и на клетки OVCAR-3, и этот эффект был сильнее, чем у контрольного Mco101. Как показано на Фиг. 4E, биспецифические антитела M701A, M701B, M701H и M701I все показали значительный киллинг-эффект на клетки CHO-K1-huEpCAM, и эффект M701A и M701B был значительно сильнее, чем эффект M701H и M701I. Как показано на Фиг. 4F, биспецифические антитела M701J и M701K оба продемонстрировали значительный киллинг-эффект на клетки HCT116 со значениями EC₅₀ для киллинга 7,814-25,43 нг/мл, и уровень киллинга M701J существенно не отличался от M701A. Киллинговая активность указанных биспецифических антител была значительно сильнее, чем у M701 (значение EC₅₀ для M701 составляло 69,17 нг/мл).

Пример 9: Эффективность биспецифических антител в гетеротопической модели опухолевого трансплантата рака толстой кишки человека HCT116 in-vivo

Достаточное количество клеток HCT116 и эффекторных клеток (цитокин-индуцированные клетки-киллеры (CIK), гетерогенная популяция клеток, полученная путем совместного культивирования мононуклеарных клеток периферической крови человека in vitro с различными цитокинами в течение определенного периода времени; эти клетки экспрессируют как CD3+, так и CD56+ молекулы мембранных белков (поэтому они также известны как Т-лимфоциты, подобные NK-клеткам) культивировали в соответствии с условиями культивирования, затем собирали и подсчитывали. Каждой мыши инокулировали на правой дорсальной стороне предварительно смешанные клетки HCT116 (2×10⁶ клеток/мышь) и клетки CIK (2×10⁶ клеток/мышь) в объеме 0,1 мл/мышь для создания модели опухолевого ксенотрансплантата рака толстой кишки человека HCT116. Введение для лечения начинали через 1 час после инокуляции. Мышей разделяли на группы следующим образом: группа введения 2 мг/кг тестируемого препарата M701A, группа введения 1 мг/кг тестируемого препарата M701A, группа введения 1 мг/кг M701, группа введения 2 мг/кг контрольного моноклонального антитела M700 и контрольная группа введения носителя (физиологический раствор), по 8 мышей в каждой группе. Введение осуществляли путем инъекции в хвостовую вену в дни 0, 2 и 4 после инокуляции, всего три введения. Терапевтические эффекты оценивали по относительной степени ингибирования опухоли и проценту полной регрессии опухоли, а безопасность оценивали по изменению массы тела и смертности животных.

Формула расчета размера опухоли: объем опухоли (мм³)=0,5 × (длинный диаметр опухоли × короткий диаметр опухоли²).

Относительная степень ингибирования опухоли TGI (%): TGI=1 - T/C (%). T и C представляют собой объемы опухолей (TV) в конкретный момент времени для экспериментальной и контрольной групп, соответственно. Формула расчета следующая: T/C%=T_TV/C_TV × 100% (T_TV: средний объем опухоли для группы лечения; C_TV: средний объем опухоли для контрольной группы введения носителя).

Полная регрессия опухоли: определяется как состояние, при котором объем опухоли уменьшается до ниже чем 63 мм³ во время или после лечения. Процент полной регрессии опухоли (%)=количество животных с полной регрессией в группе/общее количество животных в этой группе × 100%.

Как показано на фиг. 5А, тестируемый препарат М701А (2 мг/кг, 1 мг/кг) показал значительный ингибирующий эффект на опухоль на 30-й день после прерывания введения (т.е. на 33-й день после инокуляции) в группах лечения, с относительной степенью ингибирования опухоли (TGI%) 100% и 93,82%, соответственно. По сравнению с контрольной группой введения носителя все остальные группы демонстрировали статистически значимую разницу (p-значения <0,001), а в двух группах, получавших M701A, все опухоли в группе введения 2 мг/кг соответствовали критериям полной регрессии. Эффективность M701A в обеих дозах значительно превосходила эффективность M700 (значения p < 0,001) при дозе 2 мг/кг, а эффективность M701A значительно превосходила эффективность M701 в той же дозе (оба при дозе 1 мг/кг). Как показано на Фиг. 5B, во время лечения у животных не наблюдалось снижения массы тела и признаков токсичности препарата.

В одной и той же модели опухоли все M701B, M701J и M701K продемонстрировали ингибирующий опухоль эффект, подобный эффекту M701A при той же дозе, при этом не наблюдали никакой потери массы тела.

Пример 10: Эффективность биспецифических антител в гетеротопической модели опухолевого трансплантата рака яичников человека OVCAR-3 in-vivo

Достаточное количество клеток OVCAR-3 и эффекторных клеток (CIK клетки) культивировали в соответствии с условиями культивирования, затем собирали и подсчитывали. Каждой мыши инокулировали на правой дорсальной стороне предварительно смешанные клетки OVCAR-3 (1×10⁷ клеток/мышь) и CIK клетки (1×10⁷ клеток/мышь) в объеме инокуляции 0,2 мл/мышь и при содержании матригеля 50% (0,1 мл/мышь) для создания гетеротопической модели опухолевого ксенотрансплантата рака яичников человека OVCAR-3. Введение для лечения осуществляли через 1 час после инокуляции. Мышей разделяли на группы следующим образом: группа введения тестируемого препарата M701A (5 мг/кг), группа введения анти-CD3 изотипического контроля Mco101 (5 мг/кг), контрольная группа введения моноклонального антитела M700 (5 мг/кг) и контрольная группа введения носителя (физиологический раствор), по 8 мышей в каждой группе. Введение осуществляли путем инъекции в хвостовую вену в дни 0, 2 и 4 после инокуляции, всего три введения. Терапевтические эффекты оценивали по относительной степени ингибирования опухоли и проценту полной регрессии опухоли, а безопасность оценивали по изменению массы тела и смертности животных.

Как показано на Фиг. 6A, группа введения тестируемого препарата M701A (5 мг/кг) показала значительный ингибирующий эффект на опухоль на 44-й день после прерывания введения (т.е. 48-й день после инокуляции) в группе лечения, с относительной степенью ингибирования опухоли (TGI%) 98,97%. По сравнению с контрольной группой введения носителя все остальные группы демонстрировали статистически значимую разницу (p-значения < 0,001); в группе введения M701A (5 мг/кг) полная регрессия опухоли была на уровне 87,5%, и эффективность в этой группе значительно превосходила эффективность в группе введения M700 (5 мг/кг) (TGI=70,42%) (p-значения < 0,001) и в группе введения Mco101 (5 мг/кг) (TGI=68,87%) (p-значения < 0,001). Как показано на Фиг. 6B, во время лечения у животных не наблюдалось снижения массы тела и признаков токсичности препарата.

В одной и той же модели опухоли все M701B, M701J и M701K продемонстрировали ингибирующий опухоль эффект, подобный эффекту M701A при той же дозе, при этом не наблюдали никакой потери массы тела.

Все документы, на которые ссылаются в настоящей заявке, включены посредством ссылки, так же, как если бы каждый документ цитировался отдельно в качестве ссылки. Кроме того, следует понимать, что возможны различные модификации или изменения, которые могут осуществить специалисты в данной области техники после ознакомпления с указаниями, содержащимися в настоящей заявке, и эти эквивалентные формы также охватыаются объемом, определяемым прилагаемой формулой изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Название Аминокислотная последовательность Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 1 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 60 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 61 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 62 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPAKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 63 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 64 GQPKAAPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVKVAWKADSSPAKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Константная область легкой цепи CL
SEQ ID NO: 65 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS CH1 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 2 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV Шарнирная область
SEQ ID NO: 3 EPKSCDKTHTCPPCP Линкерный пептид 1 (L1)
SEQ ID NO: 4 GGGGSGGGGSGGGGS Линкерный пептид 2 (L2)
SEQ ID NO: 5 GAAA CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 6 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 7 APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEAPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 66 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 67 APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 68 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 69 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 70 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH2 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 71 APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 8 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 9 GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 10 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Константная область тяжелой цепи CH3
SEQ ID NO: 11 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 12 GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 72 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 73 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 74 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 75 GQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK CH3 константной области тяжелой цепи
SEQ ID NO: 76 GQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Анти-EpCAM VL(1) ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 13) (подчеркнутые части означают CDR)
CDRL1: KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 32)
CDRL2: WASTRES (SEQ ID NO: 33)
CDRL3: QNDYSYPLT (SEQ ID NO: 34) Анти-EpCAM VH(1) EVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14) (подчеркнутые части означают CDR)
CDRH1: GYAFTNYWLG (SEQ ID NO: 35)
CDRH2: DIFPGSGNIHYNEKFKG (SEQ ID NO: 36)
CDRH3: LRNWDEPMDY (SEQ ID NO: 37) Анти-EpCAM VL(2) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLIIYGASTTASGIPARFSASGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 15) (подчеркнутые части означают CDR)
CDRL1: RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 38)
CDRL2: GASTTAS (SEQ ID NO: 39)
CDRL3: QQYNNWPPAYT (SEQ ID NO: 40) Анти-EpCAM VH(2) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLWNYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16) (подчеркнутые части означают CDR)
CDRH1: SYAIS (SEQ ID NO: 41)
CDRH2: GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 42)
CDRH3: GLLWNY (SEQ ID NO: 43) Анти-CD3 ScFv(1) QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 17) (подчеркнутые части означают CDR) Анти-CD3 ScFv(2) DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 18) (подчеркнутые части означают CDR)
CDRH1: GYTFTRYTMH (SEQ ID NO: 44)
CDRH2: YINPSRGYTNYNQKFKD (SEQ ID NO: 45)
CDRH3: YYDDHYCLDY (SEQ ID NO: 46)
CDRL1: RASSSVSYMN (SEQ ID NO: 47)
CDRL2: DTSKVASG (SEQ ID NO: 48)
CDRL3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 49)
VH: DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 50)
VL: DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 51) Анти-CD3 ScFv(3) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 19) (подчеркнутые части означают CDR)
CDRH1: GFTFSTYAMN (SEQ ID NO: 52)
CDRH2: RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 53)
CDRH3: HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 54)
CDRL1: RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 55)
CDRL2: GTNKRAP (SEQ ID NO: 56)
CDRL3: ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 57)
VH:QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 58)
VL:QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59) Анти-CD3 ScFv(4) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 20) (подчеркнутые части означают CDR) Анти-CD3 ScFv(5) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFPMAWVRQAPGKGLEWVSTISTSGGRTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFRQYSGGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQPNSVSTSLGSTVKLSCTLSSGNIENNYVHWYQLYEGRSPTTMIYDDDKRPDGVPDRFSGSIDRSSNSAFLTIHNVAIEDEAIYFCHSYVSSFNVFGGGTKLTVLRQP (SEQ ID NO: 21) (подчеркнутые части означают CDR) Анти-CD3 ScFv(6) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 22) (подчеркнутые части означают CDR) Анти-CD3 ScFv(7) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGG SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 23) (подчеркнутые части означают CDR) Анти-CD3 ScFv(8) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKP GKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSL QPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 24) (подчеркнутые части означают CDR) Название контрольного антитела Аминокислотная последовательность Моноклональное антитело M700 Легкая цепь (SEQ ID NO: 25)
ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 26)
EVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Моноклональное антитело M100 Легкая цепь (SEQ ID NO: 27)
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 28)
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Mco101 Легкая цепь (SEQ ID NO: 29)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 30)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Одноцепочечная единица (SEQ ID NO: 31)
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Wuhan YZY Biopharma Co., Ltd.

<120> БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> FP240130

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 1

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 2

<211> 98

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH1 константной области тяжелой

цепи

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 3

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность шарнирной области

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкерного пептида 1

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкерного пептида 2

<400> 5

Gly Ala Ala Ala

1

<210> 6

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 6

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 7

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Ala Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

100 105

<210> 8

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 8

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 9

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 9

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 10

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 10

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 11

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Arg Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 12

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 13

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи

анти-EpCAM антитела

<400> 13

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 14

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи

анти-EpCAM антитела

<400> 14

Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn

20 25 30

Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys

50 55 60

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи

анти-EpCAM антитела

<400> 15

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Thr Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Ala

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи

анти-EpCAM антитела

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Leu Trp Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 241

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

225 230 235 240

Arg

<210> 18

<211> 240

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 18

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

225 230 235 240

<210> 19

<211> 249

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val

130 135 140

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

165 170 175

Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245

<210> 20

<211> 241

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

Arg

<210> 21

<211> 247

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Thr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Arg Gln Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Asn Ser Val

130 135 140

Ser Thr Ser Leu Gly Ser Thr Val Lys Leu Ser Cys Thr Leu Ser Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ile Glu Asn Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Leu Tyr Glu Gly

165 170 175

Arg Ser Pro Thr Thr Met Ile Tyr Asp Asp Asp Lys Arg Pro Asp Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala

195 200 205

Phe Leu Thr Ile His Asn Val Ala Ile Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe

210 215 220

Cys His Ser Tyr Val Ser Ser Phe Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu Arg Gln Pro

245

<210> 22

<211> 242

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Met Gly Tyr Trp His Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

130 135 140

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

165 170 175

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro

180 185 190

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg

210 215 220

Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

225 230 235 240

Lys Arg

<210> 23

<211> 242

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

225 230 235 240

Lys Arg

<210> 24

<211> 244

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность анти-CD3 ScFv

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu

180 185 190

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys

<210> 25

<211> 220

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи моноклонального

антитела M700

<400> 25

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 26

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи моноклонального

антитела M700

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn

20 25 30

Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys

50 55 60

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 27

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи моноклонального

антитела M100

<400> 27

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 28

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи моноклонального

антитела M100

<400> 28

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 29

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела Mco101

<400> 29

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 30

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела Mco101

<400> 30

Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Met Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 31

<211> 476

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность одиночной цепи антитела Mco101

<400> 31

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

225 230 235 240

Gly Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

370 375 380

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Arg Val Lys Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 32

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL1 вариабельной области легкой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 32

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 33

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL2 вариабельной области легкой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 33

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL3 вариабельной области легкой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 34

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 35

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH1 вариабельной области тяжелой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 35

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH2 вариабельной области тяжелой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 36

Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH3 вариабельной области тяжелой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 37

Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL1 вариабельной области легкой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 38

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL2 вариабельной области легкой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 39

Gly Ala Ser Thr Thr Ala Ser

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL3 вариабельной области легкой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 40

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Ala Tyr Thr

1 5 10

<210> 41

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH1 вариабельной области тяжелой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 41

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH2 вариабельной области тяжелой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 42

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH3 вариабельной области тяжелой

цепи анти-EpCAM антитела

<400> 43

Gly Leu Leu Trp Asn Tyr

1 5

<210> 44

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH1 ScFv анти-CD3 антитела

<400> 44

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His

1 5 10

<210> 45

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH2 ScFv анти-CD3 антитела

<400> 45

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 46

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH3 ScFv анти-CD3 антитела

<400> 46

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 47

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL1 ScFv анти-CD3 антитела

<400> 47

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 48

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL2 ScFv анти-CD3 антитела

<400> 48

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly

1 5

<210> 49

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL3 ScFv анти-CD3 антитела

<400> 49

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 50

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи

анти-CD3 ScFv

<400> 50

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи

анти-CD3 ScFv

<400> 51

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 52

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH1 анти-CD3 ScFv

<400> 52

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn

1 5 10

<210> 53

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH2 анти-CD3 ScFv

<400> 53

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 54

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRH3 анти-CD3 ScFv

<400> 54

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 55

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL1 анти-CD3 ScFv

<400> 55

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 56

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL2 анти-CD3 ScFv

<400> 56

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CDRL3 анти-CD3 ScFv

<400> 57

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 58

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи

анти-CD3 ScFv

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 59

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи

анти-CD3 ScFv

<400> 59

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 60

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 60

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 61

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 61

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 62

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 62

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Ala Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 63

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 63

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

100 105

<210> 64

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 64

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Ala Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 65

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи CL

<400> 65

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 66

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 66

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 67

Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 68

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 68

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 69

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 70

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 70

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 71

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH2 константной области тяжелой

цепи

<400> 71

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

100 105

<210> 72

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 72

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 73

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 73

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 74

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 74

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 75

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 75

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 76

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность CH3 константной области тяжелой

цепи

<400> 76

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыты биспецифическое антитело, которое специфически связывается с EpCAM и CD3, включающее антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, и антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD, композиция нуклеиновых кислот для его получения, клетка-хозяин для получения биспецифического антитела, фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака, положительного по EpCAM. Кроме того, представлены набор для профилактики или лечения рака и способ профилактики или лечения рака, положительного по EpCAM, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела. Изобретение может быть использовано для лечения злокачественных новообразований у субъекта. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл., 10 пр.

1. Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с EpCAM и CD3, включающее антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, и антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, где антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, выбран из группы, состоящей из:

1) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с EpCAM, который включает следующие CDR:

(i) CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 14, и

(ii) CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13; или

2) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с EpCAM, который включает следующие CDR:

(i) CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 16, и

(ii) CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 15;

антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, выбран из группы, состоящей из:

1) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с CD3, который включает следующие CDR:

CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 50, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 51; или

2) антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с CD3, который включает следующие CDR:

CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 58, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 59; где антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, находится в форме Fab-фрагмента, а антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, находится в форме ScFv.

2. Биспецифическое антитело по п. 1, в котором антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, включает следующие CDR:

(1) в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 32, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 33, последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 34, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 35, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 36 и последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 37; или

(2) в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat и системой определения CDR, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 38, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 39, последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 40, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 41, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 42 и последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 43; или

антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, включает следующие CDR:

(1) в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 44, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 45, последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 46, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 47, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 48 и последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 49; или

(2) в соответствии с системой нумерации последовательностей по Kabat, последовательность CDRH1 представлена в SEQ ID NO: 52, последовательность CDRH2 представлена в SEQ ID NO: 53, последовательность CDRH3 представлена в SEQ ID NO: 54, последовательность CDRL1 представлена в SEQ ID NO: 55, последовательность CDRL2 представлена в SEQ ID NO: 56 и последовательность CDRL3 представлена в SEQ ID NO: 57.

3. Биспецифическое антитело по п. 1 или 2, где антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, включает следующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи или их варианты:

(i) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 13; или

(ii) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 15; и антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, включает следующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи или их варианты:

(1) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 51, или

(2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 59.

4. Биспецифическое антитело по п. 1 или 2, в котором антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с EpCAM, включает следующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи или их варианты:

(i) вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 14, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 13; и антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с CD3, выбран из группы, состоящей из:

(1) ScFv, представленного в SEQ ID NO: 18, или его варианта, (2) ScFv, представленного в SEQ ID NO: 19, или его варианта, при этом варианты, отличающиеся от соответствующих вариабельных областей или соответствующих ScFv, имеют идентичность по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с соответствующими вариабельными областями или соответствующими ScFv.

5. Биспецифическое антитело по п. 1 или 2, где биспецифическое антитело включает:

(1) пару легкая цепь-тяжелая цепь, специфически связывающуюся с EpCAM, при этом пара легкая цепь-тяжелая цепь включает или состоит из легкой цепи и тяжелой цепи, где легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи, в частности, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 60-65, и тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи, CH1, в частности, представленную в SEQ ID NO: 2, и первый Fc-фрагмент, при этом предпочтительно первый Fc-фрагмент включает шарнирную область, в частности, представленную в SEQ ID NO: 3, CH2, в частности, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 7 и 66-71, и CH3a; и

(2) слитый пептид, специфически связывающийся с CD3, при этом слитый пептид включает или состоит из ScFv, специфически связывающегося с CD3, и второго Fc-фрагмента, при этом ScFv включает, в последовательности от N-конца к C-концу, вариабельную область тяжелой цепи, линкерный пептид, в частности, представленный в SEQ ID NO: 4, и вариабельную область легкой цепи, и второй Fc-фрагмент включает, в последовательности от N-конца к C-концу, шарнирную область, в частности, представленную в SEQ ID NO: 3, CH2, в частности, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 7 и 66-71, и CH3b, при этом C-конец вариабельной области легкой цепи связан с шарнирной областью второго Fc-фрагмента через линкерный пептид, в частности, представленный в SEQ ID NO: 5.

6. Биспецифическое антитело по п. 5, в котором CH1 биспецифического антитела включает последовательность SEQ ID NO: 2; и/или CL включает последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1 и 60-65; или первый Fc-фрагмент и/или второй Fc-фрагмент биспецифического антитела включают CH2 последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NOs: 6, 7 и 66-71, и/или CH3 последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 8, 9, 11, 12 и 72-76; или последовательности CH3a и CH3b биспецифического антитела выбраны из группы, состоящей из:

(1) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 8, а другая представлена в SEQ ID NO: 11;

(2) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 9, а другая представлена в SEQ ID NO: 12;

(3) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 72, а другая представлена в SEQ ID NO: 74;

(4) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 9, а другая представлена в SEQ ID NO: 75;

(5) последовательностей, из которых одна представлена в SEQ ID NO: 73, а другая представлена в SEQ ID NO: 76.

7. Биспецифическое антитело по п. 1 или 2, в котором биспецифическое антитело выбрано из группы, состоящей из:

(1) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(2) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(3) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(4) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(5) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(6) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(7) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(8) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1;

(9) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(10) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1;

(11) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1; и

(12) биспецифического антитела, включающего или состоящего из слитого пептида, тяжелой цепи и легкой цепи, при этом слитый пептид включает или состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, тяжелая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 12, и легкая цепь включает или состоит из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 1.

8. Композиция нуклеиновых кислот для получения биспецифического антитела, связывающегося с EpCAM и CD3, включающая нуклеиновые кислоты, кодирующие биспецифическое антитело по любому из пп. 1-7.

9. Клетка-хозяин для получения биспецифического антитела, связывающегося с EpCAM и CD3, включающая композицию нуклеиновых кислот по п. 8 в векторе экспрессии.

10. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака, положительного по EpCAM, включающая биспецифическое антитело по любому из пп. 1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Набор для профилактики или лечения рака, положительного по EpCAM, включающий биспецифическое антитело по любому из пп. 1-7.

12. Набор по п. 11, где набор дополнительно содержит лекарственное средство для лечения рака.

13. Способ профилактики или лечения рака, положительного по EpCAM, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела по любому из пп. 1-7.

14. Способ по п. 13, где рак, положительный по EpCAM, представляет собой колоректальный рак, гастральный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, ретинобластому, рак пищевода, рак почки, светлоклеточную почечно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному кожи, базальноклеточную карциному кожи, саркому, эстезионейробластому, краниофарингеому, рак щитовидной железы, холангиокарциному, рак мочевого пузыря, опухоль головы и шеи, рак шейки матки или рак полости рта.