СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОКСВИРУСА ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/863 A61K39/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к способу конструирования рекомбинантного поксвируса, содержащего одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии продукта слияния одного или множества пептидов, способу получения такого рекомбинантного поксвируса, а также такому рекомбинантному поксвирусу и его применению для лечения или предупреждения заболевания, в частности для лечения или предупреждения рака.

Предшествующий уровень техники

На протяжении последних десятилетий получено множество терапевтических вакцин, экспрессирующих антигены, с целью стимуляции врожденного и специфичного иммунных ответов на такие антигены. Например, многие первые противораковые вакцины были сконструированы для примирования иммунной системы в отношении наиболее распространенных идентифицированных опухолеассоциированных антигенов (от англ. ТАА - tumor-associated antigen) (например, MUC-1, WT1, PSA, СЕА), которые сверхэкспрессируются в опухоли. Однако, данные ТАА могут иметь остаточную экспрессию в неопухолевых клетках; таким образом, ожидают, что эффективность данного традиционного подхода ограничена аутотолерантностью в отношении таких «ауто»антигенов. Другие группы также сосредоточились на использовании мультиэпитопных полипептидов для улучшения эффективности их кандидатной вакцины и индукции широких специфичных Т-клеточных ответов на разные антигены, ассоциированные с заболеванием (например, Depla et al., 2008, J. Virol. 82(1): 435-450). В настоящее время хорошо подходит технология идентификации эпитопов CTL (от англ. cytotoxic Т lymphocyte - цитотоксический Т-лимфоцит), синтеза генов, кодирующих множество полипептидов, содержащих мультиэпитопы, и их доставки посредством ДНК-плазмиды и вирусных векторов.

Кроме того, традиционная парадигма о доставке того же набора раковых антигенов каждому в популяции не учитывает индивидуальную вариабельность в риске заболевания и иммунологических ответах. Важно, нельзя не учитывать, что человек по-разному отвечает на вакцины, и иммунный ответ хозяина значимо варьирует в популяции (Relman, 2008, J Infect Dis. 198(1):4-5; Plotkin, 2008, Clin Infect Dis.47(3):401-9). С недавним введением блокаторов иммунных контрольных точек в клинике, для медицинского персонала на самом деле стало очевидным, что некоторые виды лечения эффективны для некоторых пациентов, но не эффективны для других.

Прогресс в иммунологии, генетике, молекулярной биологии и биоинформатике создал предпосылки для более персонализированных подходов. Технологические прорывы в области секвенирования генома (например, секвенирование нового поколения (NGS - от англ. Next Generation Sequencing)) в настоящее время сделали возможным секвенировать полный геном или экзом (кодирующие области генома) опухоли с беспрецедентной скоростью и стоимостью. Молекулярная характеристика опухолей продемонстрировала, что во время процесса канцерогенеза и пролиферации раковых клеток, мутации встречаются вследствие высоких скоростей пролифераций, механизмов недостаточной репарации и клональной селекции. Накопление мутаций в геноме опухоли обычно приводит к экспрессии аберрантных белковых молекул, которые специфичны для раковой ткани. Они называются неоантигенами. По сравнению с наиболее распространенными опухолеассоциированными антигенами опухолевые неоантигены присутствуют исключительно в опухолевых клетках, но отсутствуют в нормальных клетках и не вызывают удаления их антигенспецифичных Т-клеток в тимусе. Таким образом, ожидают, что они индуцируют сильные иммунные ответы, не неся риск аутотолерантности и аутоиммунных реакций в отношении своих белков. Таким образом, опухолевые неоантигены могут представлять собой идеальные мишени для конструирования терапевтических вакцин, специфично адаптированных к опухоли, хотя их внедрение в повседневное лечение требует решения целого ряда научных и технических проблем. В частности, большая часть раковых мутаций являются результатом стохастического явления и специфичны в отношении каждого пациента.

Среди других тем, успешное претворение в жизнь подчинена достижению эффективного способа изготовления для обеспечения своевременной доставки клинически достаточных количеств к постели пациента, поскольку идентификация опухолевых мутаций, конструирование неопептидов, включающих такие мутации, изготовление и тестирование персонализированной вакцины сопутствует прогрессированию заболевания.

Таким образом, в заявке WO2018/234506 предложена персонализированная противораковая вакцина, содержащая рекомбинантный поксвирус, кодирующий неопептиды (каждый содержит по меньшей мере одну опухолеспецифичную мутацию), и способ получения указанной персонализированной противораковой вакцины. Поксвирусы представляют собой вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК, жизненный цикл которых протекает в цитоплазме, и у которых используется клеточный механизм и свои собственные вирусные белки для репликации.

Более подробно, данный способ включает стадию идентификации неопептидов, подходящих для кодирования так называемой персонализированной противораковой вакциной, и стадию получения указанного рекомбинантного поксвируса. С этой целью, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные пептиды, подлежащие вставке в геном рекомбинантного поксвируса, расположены случайным образом, но с соблюдением баланса с точки зрения длины продукта слияния в одной или более «экспрессионных кассетах» (предпочтительно 3 кассеты, причем каждая кодирует продукт слияния, неся вплоть до 10 пептидов) под контролем подходящих регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию у субъекта. Получение собственно рекомбинантного поксвируса обычно проводят посредством гомологичной рекомбинации между исходным поксвирусом и плазмидой «переноса», содержащей пептид-экспрессирующие экспрессионные кассеты, а также дополнительные признаки, такие как фланкирующие плечи рекомбинации и сайты рестрикции, требуемые для клонирования экспрессионных кассет. Отбор рекомбинантных поксвирусов, включающих пептид-экспрессирующие экспрессионные кассеты, можно облегчать посредством использования репортерного гена, кодирующего селективный или окрашенный маркер, нацеленный на свидетельствование о вставке экспрессионных кассет в поксвирусный геном, несмотря на то, что для подтверждения рекомбинантного статуса требуется более точный анализ (такой как ПЦР (полимеразная цепная реакция)).

Однако есть предположения, что экспрессия гидрофобных пептидов и пептидов, которые несут трансмембранные (ТМ - от англ. transmembrane) домены, может нарушать получение или продукцию рекомбинантного вируса, таким образом, делая невозможной разработку некоторых кандидатных вакцин. Когда ТМ-домен находится в пределах данного пептида (ТМ внутри пептида), указанный пептид может просто исключаться, но также наблюдали, что ТМ домен может быть получен в результате соединения двух конкретных пептидов (межпептидный ТМ) в пределах продукта слияния, кодируемого экспрессионной кассетой, который требует модификации порядка пептидов. Еще одной характеристикой поксвирусов является их чувствительность к событиям гомологичной рекомбинации. Под контролем она является преимущественной для генной инженерии, но остается проблемой, когда включаются неожиданные гомологичные области.

Простой путь для решения данной проблемы заключается просто в удалении ТМ и пептидов с высоким индексом гидрофобности, но это не очень эффективно, как проиллюстрировано в Примере 5 WO2018/234506. Данный пример показывает то, каким непростым является получение рекомбинантного MVA, сконструированного для экспрессии набора 30 пептидов, распределенных в трех экспрессионных кассетах. Подавление сегментов межпептидных (посредством пептидной инверсии) и внутрипептидных (посредством исключения ТМ-содержащих пептидов) возможных ТМ не позволило получать экспрессирующий рекомбинантный MVA. Также не позволило получить уменьшение балльной оценки гидрофобности продукта слияния пептидов (балльные оценки от 133 до 28,5). Это иллюстрирует то, что даже при выборе пептидов, не содержащих ТМ, и пептидов с низким индексом гидрофобности, получение или продукция рекомбинантного поксвируса остается очень низкой.

Следовательно, существует необходимость в решении проблемы конструирования оптимизированных экспрессионных кассет, для экспрессии множества пептидов или одного или более продуктов слияния пептидов. Согласно настоящему изобретению предложен способ на основе следующих свойств: гидрофобность и признаки белков, связанные с гидрофобностью, склонность к образованию трансмембранных доменов и гомология последовательностей; и на основе положения пептидов одного над другим внутри продукта слияния. Как продемонстрировано в разделе Примеры, способ по изобретению позволяет увеличить выход получения рекомбинантного поксвируса.

Данная техническая проблема решается благодаря предоставлению воплощений, как определено в формуле изобретения.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего описания предпочтительных в настоящее время воплощений изобретения. Данные воплощения приведены с целью раскрытия.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно первоме аспекту настоящее изобретение относится к способу конструирования рекомбинантного поксвируса, причем указанный рекомбинантный поксвирус содержит одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии продукта слияния одного или множества пептидов, отличающийся тем, что он включает выполнение, посредством средств обработки сервера, следующих стадий:

(a) отбор первого под набора пептидов-кандидатов, где указанные пептиды демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога TMS;

(b) определение оптимального распределения пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди множества возможных распределений, где указанное оптимальное распределение представляет, если имеется по меньшей мере две экспрессионные кассеты, наименьший диапазон между балльными оценками гидрофобности по меньшей мере двух экспрессионных кассет;

(c) для каждой экспрессионной кассеты определение оптимального присвоения слотов пептидов-кандидатов как функции правила занятости слота кассеты и отбор продукта слияния пептидов с самой низкой ТМ балльной оценкой;

(d) определение последовательности переноса ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность одной или более экспрессионных кассет для получения указанного рекомбинантного поксвируса.

Согласно преимущественным и неограничивающим признакам:

Указанные пептиды стадии (а) представляют непрерывные области ниже порога гомологии.

Стадия (а) включает исключение пептидов, если они демонстрируют трансмембранные балльные оценки выше порога TMS и/или гомологичную область с кандидатом более высокого ранга согласно предсказанному потенциалу иммуногенности выше порога гомологии, и отбор второго поднабора идентифицированного набора пептидов-кандидатов в виде пептидов-кандидатов, которые не были ни раскрыты, ни отобраны в первом поднаборе.

Стадия (b) включает, если число возможных распределений превышает заданную функцию максимального числа ресурсов средств обработки сервера, попытку определить указанное оптимальное распределение пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди по меньшей мере одной итерации указанного максимального числа возможных распределений среди множества возможных распределений.

Стадия (b) включает, если для каждого возможного распределения итерации указанного максимального числа возможных распределений по меньшей мере одна экспрессионная кассета демонстрирует балльную оценку гидрофобности выше заданного порога, или рассмотрение еще одной итерации указанного максимального числа возможных распределений; или замену пептида-кандидата из первого поднабора пептидов-кандидатов, представляющего самую высокую балльную оценку гидрофобности, пептидом-кандидатом из второго поднабора и снова продолжение отбора пептидов.

Стадия (с) дополнительно включает исключение любого продукта слияния, который демонстрирует по меньшей мере один ТМ участок с балльной оценкой выше порога TMSK7.

Стадия (с) включает, если по меньшей мере один трансмембранный домен выявляется в любом возможном присвоении слотов пептидов-кандидатов в экспрессионной кассете, замену пептида-кандидата из первого поднабора пептидов-кандидатов, представляющего самую высокую трансмембранную балльную оценку, пептидом-кандидатом из второго поднабора и повторение стадий (b) затем (с).

Правило занятости слота указанной кассеты определяет возможные положения слотов пептидов-кандидатов в пределах кассеты в соответствии с трансмембранными балльными оценками пептидов, и в случае равных трансмембранных балльных оценок - в соответствии с их балльными оценками гидрофобности.

Пептиды-кандидаты, распределенные по экспрессионной кассете, классифицированы в соответствии с по меньшей мере тремя классами риска неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса, где правило занятости слота указанной кассеты определяет, для каждых положений слотов кассеты, то, какого класса пептид-кандидат должен будет быть отнесен к данному положению слота.

Указанное оптимальное присвоение слотов пептидов-кандидатов, распределенных по экспрессионной кассете, демонстрирует трансмембранную балльную оценку ниже заданного порога.

Имеется одна единственная экспрессионная кассета, если число отобранных пептидов-кандидатов меньше 10, две экспрессионные кассеты, если число отобранных пептидов-кандидатов составляет от 10 до 14, и три экспрессионные кассеты, если число отобранных пептидов-кандидатов составляет от 15 до 30.

Согласно второму аспекту изобретение относится к способу получения терапевтической вакцины, содержащей рекомбинантный поксвирус, включающему:

- осуществление способа по первому аспекту для конструирования указанного рекомбинантного поксвируса;

- получение указанного рекомбинантного поксвируса.

Согласно преимущественным и неограничивающим признакам:

указанный способ дополнительно включает стадию изготовления указанного рекомбинантного поксвируса, где указанная стадия изготовления включает стадию амплификации в подходящей клетке-продуценте до подходящего масштаба, стадию выделения продуцированного рекомбинантного поксвируса из клеточной культуры и возможную стадию очистки выделенного рекомбинантного поксвируса.

Указанный рекомбинантный поксвирус кодирует неопептиды и предназначен для применения в качестве персонализированной противораковой вакцины.

Согласно третьему аспекту изобретение относится к персонализированной противораковой вакцине, полученной согласно способу по третьему аспекту, где указанная персонализированная противораковая вакцина представляет собой композицию, содержащую терапевтически эффективное количество указанного рекомбинантного поксвируса и фармацевтически приемлемый носитель, предпочтительно для применений у субъекта, нуждающегося в этом, для лечения рака или предупреждения его рецидива у субъекта.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 представлена общая схема способа согласно изобретению для конструирования рекомбинантного поксвируса для экспрессии продукта(ов) слияния пептида(ов). Основные стадии (а) - (d) показаны в серых рамках (HSK7: балльная оценка гидрофобности продукта слияния; HSK7Thresh: порог HSK7; ТМ участок: участок трансмембранного домена; TMSK7: порог TMS продукта слияния).

На Фиг. 2 представлена схема для осуществления способа по изобретению, включающая сервер 1, средства обработки данных 11, средства хранения 12 и интерфейс 13.

Фиг. 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую воплощение стадии

(a) отбора пептидов-кандидатов, подходящих для экспрессии рекомбинантный поксвирусом в способе по изобретению (TMS: трансмембранная балльная оценка; TMSThresh: порог TMS пептида; N: общее число пептидов-кандидатов; Nmax: максимальное число пептидов).

Фиг. 4 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую воплощение стадии

(b) определения оптимального межкассетного распределения пептидов-кандидатов в способе по изобретению (L: низкий; М: средний; Н: высокий). Классы L, М и Н относятся к риску неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса (TMS: трансмембранная балльная оценка; HS: балльная оценка гидрофобности; HSK7: бальная оценка гидрофобности продукта слияния; HSK7Thresh: порог HSK7; Nmin: минимальное число пептидов; R: диапазон; RThresh: порог диапазона; iter: итерация).

Фиг. 5 представляет собой пример таблицы по распределению пептидов по кассетам в соответствии с общим числом пептидов и классами пептидов в межкассетном распределении (L: низкий; М: средний; Н: высокий).

Фиг. 6 представляет собой пример ранжирования пептидов в соответствии с их трансмембранными балльными оценками и балльными оценками гидрофобности (TMS: трансмембранная балльная оценка; HS: балльная оценка гидрофобности; L: низкий; М: средний; Н: высокий).

Фиг. 7 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую воплощение стадии (c) определения для каждой экспрессионной кассеты оптимального присвоения слотов пептидов-кандидатов (TMS: трансмембранная балльная оценка; ТМ участок: участок трансмембранного домена; TMSK7Thresh: порог TMS слитого белка; iter: итерация).

Фиг. 8 представляет пример правила занятости слотов в зависимости от числа пептидов;

A) диаграмма, представляющая воплощение правила занятости 10 слотов в зависимости от числа n пептидов кассеты и от классов пептида (светло-серый: класс «низкий»; средне-серый: класс «средний»; темно-серый: класс «высокий»);

B) таблица занятости слотов в соответствии с числом n пептидов кассеты и классами пептида, показывающая число возможных комбинаций.

Фиг. 9 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую воплощение стадии (d) обратной трансляции согласно изобретению, делающей возможным определение последовательности переноса ДНК, подлежащей вставке в рекомбинантный поксвирус

На Фиг. 10 показаны примеры рекомбинантных поксвирусов, несущих три экспрессионные кассеты (А, В и С) (pTG19247 и pTG19266, экспрессирующие соответственно 10 и 6 неопептидов в каждой кассете), полученных с использованием ручного подхода к конструированию персонализированной противораковой вакцины (ТМ домены: трансмембранные домены; HSK7: балльная оценка гидрофобности продукта слияния; ПЦР: полимеразная цепная реакция).

Подробное описание изобретения

Общие определения

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, как и обычно подразумевается средним специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение.

Термин в единственном числе относится к «одному» или к «более чем одному» объекту (а именно, по меньшей мере одному, включая 2, 3, 4, 5 и т.д.), если контекстом явным образом не продиктовано иное.

Термин «и/или», где бы он ни использовался в данном документе, включает значение «и», «или» и «все или любая другая комбинация элементов, соединенных указанным термином».

Термины «такой как», «например», в том виде, в котором они используются в данном документе, представлены в иллюстративных целях и, таким образом, являются неограничивающими.

Термин «примерно» или «приблизительно» используется в данном документе для того, чтобы показать, что значение или диапазон, приведенные в данном документе, не являются крайне важными и могут варьировать в пределах 10%, предпочтительно в пределах 8% и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или диапазона, таким образом, включая присущее варьирование ошибки в отношении устройства или способа, используемого для определения такого значения или диапазона, или варьирование, которое существует среди анализируемых субъектов.

В том виде, в котором он используется в данном документе, при использовании для определения продуктов, композиций и способов, термин «содержащий» (и любая форма слова содержащий, как например, «содержат» и «содержит»), «имеющий» (и любая форма слова имеющий, как например, «имеют» и «имеет»), «включающий» (и любая форма слова включающий, как например, «включает» и «включают») или «содержащий» (и любая форма слова содержащий, такая как «содержит» и «содержат»), являются открытыми и не исключают дополнительных, непроцитированных элементов или стадий способа. Фраза «состоящий по существу из» означает исключение других компонентов или стадий какой-либо существенной значимости. Фраза «состоящий из» означает исключение более чем микроэлементов других компонентов или стадий.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо, относясь к полимерам аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Полимер может быть линейным, разветвленным или циклическим и может включать встречающиеся в природе и/или аналоги аминокислот, и он может прерываться неаминокислотами. Никакого ограничения не накладывается на максимальное число аминокислот.Как общий показатель, термин «пептид» предпочтительно относится к коротким полимерам (обычно содержащим по меньшей мере 9 аминокислотных остатков), тогда как полипептид или белок обозначает более длинные полимеры (обычно содержащие более чем 50 аминокислот). Данные термины охватывают нативные полимеры, модифицированные полимеры (также обозначаемые производными, аналогами, вариантами или мутантами), а также их фрагменты. В контексте настоящего изобретения полипептид может также находиться в виде продукта слияния разных пептидов, а также мультимера (например, димеры), помимо прочего. В контексте настоящего изобретения термин «пептид», в том виде, в котором он используется в данном документе, также охватывает неопептид.

Термин «неопептид» относится к пептиду, содержащему по меньшей мере опухолеспецифичную мутацию, как описано в данном документе.

Термин «продукт слияния», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к комбинации одного или более пептидов в виде одной полипептидной цепи, подобно, например, комбинации двух или более неопептидов, продукту слияния одного сигнального пептида с одним неопептидом, и т.д.

В контексте настоящего изобретения термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид», «последовательность нуклеиновой кислоты» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо и определяют полимер из по меньшей мере 9 нуклеотидных остатков или в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК) или смешанные полирибо-полидезоксирибонуклеотиды. Данные термины охватывают одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, природные или синтетические, немодифицированные или их модифицированные варианты (например, генетически модифицированные полинуклеотиды, оптимизированные полинуклеотиды), смысловые или антисмысловые полинуклеотиды, химерную смесь (например, гибриды РНК-ДНК). Типичные нуклеиновые кислоты ДНК без ограничения включают комплементарную ДНК (кДНК), геномную ДНК, плазмидную ДНК, векторы, вирусную ДНК (например, вирусные геномы, вирусные векторы), олигонуклеотиды, зонды, праймеры, кодирующую ДНК, некодирующую ДНК или любой ее фрагмент и т.д. Типичные нуклеиновые кислоты РНК без ограничения включают матричную РНК (мРНК), предшественник матричной РНК (пре-мРНК), кодирующую РНК, некодирующую РНК и т.д. Последовательности нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, могут синтезироваться стандартными способами, известными в данной области, например, посредством применения автоматизированного синтезатора ДНК (как например, синтезаторы, имеющиеся в продаже у Biosearch, Applied Biosystems, и т.д.), или получены из встречающегося в природе источника (например, генома, кДНК и т.д.) или искусственного источника (такого как, встречающая в природе библиотека, плазмида и т.д.) с использованием методик молекулярной биологии, хорошо известных в данной области (например, клонирование, ПЦР и т.д.).

В общем, термин «идентичность» относится к соответствию аминокислоты аминокислоте или нуклеотида нуклеотиду между двумя полипептидными или нуклеотидными последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, являющихся общими у данных последовательностей, принимая во внимание число гэпов, которые должны быть введены для оптимального выравнивания, и длину каждого гэпа. Разные компьютерные программы и математические алгоритмы доступны в данной области для определения процента идентичности между аминокислотными последовательностями, такие как, например, программа Blast, доступная на NCBI, или ALIGN в Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9). Программы для определения идентичности между нуклеотидными последовательностями также доступны в специализированной базе данных (например, программы Genbank, Wisconsin Sequence Analysis Package, BESTFIT, FASTA и GAP).

Термины «вирус», «вирусная частица», «вирусный вектор» и «вирион» используются взаимозаменяемо и должны быть поняты в широком смысле как означающие носитель, содержащий по меньшей мере один элемент генома вируса дикого типа, который может быть упакован в вирусную частицу. Термин охватывает вирусный геном и вирусные частицы.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «поксвирус» относится к вирусу, принадлежащему к семейству Poxviridae.

Термин «рекомбинантный» относится к генетическому конструированию. При использовании по отношению к вирусу и в частности к поксвирусу, описанному в данном документе, он показывает, что вирус сконструирован содержащим вставленную в свой геном по меньшей мере одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты (также называемую рекомбинантный геном или нуклеиновой кислотой), которая не обнаружена в или не экспрессируется геномом вируса, встречающегося в природе. Тем не менее, экзогенная нуклеиновая кислота может быть гомологичной или гетерологичной в отношении субъекта, в который вводят рекомбинантный вирус. Преимущественно в контексте изобретения указанная экзогенная нуклеиновая кислота представляет собой оду или более экспрессионных кассет, причем каждая кодирует множество пептидов, предпочтительно расположенных в продукте слияния.

Термин «полученный из», «происходящий» или «происходят» используют для идентификации исходного источника компонента (например, (нео)эпитопа, (нео)пептида, (нео)антигена, молекулы нуклеиновой кислоты, вируса и т.д.) или исходного источника образца (например, субъекта или группы субъектов), но он не предназначен для ограничения способа, посредством которого получают компонент/образец, который может быть получен, например, посредством химического синтеза или рекомбинантными средствами.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «выделенный» относится к компоненту (например, полипептиду, молекуле нуклеиновой кислоты, вектору и т.д.), который удаляют из его природной среды (а именно, отделяют от по меньшей мере одного другого компонента(ов), с которым(и) он ассоциирован в природе или обнаружен в природе). Более конкретно, он относится к компоненту, который очищен (частично или по существу). Например, молекулу нуклеотидной кислоты выделяют, когда ее отделяют от последовательностей, обычно ассоциированных с ней в природе (например, отделяют от хромосомы или генома), но она может быть ассоциирована с гетерологичными последовательностями (например, в пределах рекомбинантного вектора). Синтетический компонент выделен по сути.

Термин «субъект» обычно относится к позвоночному организму, для которого необходим или может быть полезен любой из продукта или способов, раскрытых в данном документе. Обычно, организм представляет собой млекопитающее, в частности млекопитающее, выбранное из группы, состоящей из домашних животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и приматов (человек и примат, не являющийся человеком). Термины «субъект» и «пациент» могут использоваться взаимозаменяемо при ссылке не человеческий организм, и охватывает мужчину и женщину, а также утробный плод, новорожденного, ребенка грудного возраста, молодого человека, взрослого и пожилого человека.

Термин «введение» (или любая форма слова введение, такая как «вводимый», и т.д.), в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к доставке субъекту компонента (например, рекомбинантного поксвируса) согласно условиям, описанным в данном документе.

Конструирование рекомбинантного поксвируса

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу конструирования рекомбинантного поксвируса, содержащего одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии одного или множества пептидов и предпочтительно продукта слияния одного или множества пептидов. Общая схема данного процесса проиллюстрирована Фиг. 1.

Под «конструированием» рекомбинантного поксвируса в данном документе, в частности, подразумевается определение идентифицированного набора пептидов-«кандидатов», их распределение в одной или более экспрессионных кассетах и их присвоение слотов в продукте слияния пептидов, и для определения последовательности переноса ДНК, таким образом, что рекомбинантный поксвирус, имеющий такую последовательность переноса ДНК, подходит для применения в качестве терапевтической вакцины, в частности, для лечения инфекционных заболеваний или пролиферативных заболеваний, таких как раковые заболевания. Предпочтительно, способ по настоящему изобретению включает по меньшей мере 4 стадии: (а) стадия отбора первого поднабора пептидов, подходящих для экспрессии рекомбинантный поксвирусом (а именно, пептидов-кандидатов), которые выбраны из перечня пептидов на основе разных критериев, как описано в данном документе, (b) стадия межкассетного распределения (например, распределение пептидов-кандидатов по одной или более экспрессионным кассетам); с) стадия присвоения слотов внутри кассеты (например, определение для каждой экспрессионной кассеты оптимального присвоения пептидов-кандидатов, распределенных по экспрессионной кассете, иными словами, определение порядка пептидов-кандидатов в пределах экспрессионной кассеты) и d) стадия определения последовательности переноса ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность одной или более экспрессионных кассет, для получения рекомбинантного поксвируса. Иными словами, способ по изобретению позволяет выбрать пептиды-кандидаты из списка пептидов, разработать продукт слияния пептидов и перераспределение пептидов в пределах одной или более экспрессионных кассет и получить нуклеотидную последовательность экспрессионной кассеты в соответствии с описаниями поксвируса.

Ссылаясь на Фиг. 2, подразумевают, что настоящее конструирование указанного рекомбинантного поксвируса проводят с помощью средств обработки данных 11 (например, процессора) сервера 1. Указанный сервер 1 может дополнительно содержать средства хранения данных 12 (а именно, память), в частности для хранения баз данных пептидов, и интерфейс 13 (а именно, экран, мышку, клавиатуру, средства соединения с другими устройствами и т.д.).

Поксвирус

В одном воплощении рекомбинантный поксвирус, подлежащий получению способом конструирования по изобретению, получен из подсемейства Chordopoxvirinae, направленного на хозяина-позвоночного, которое включает несколько родов, таких как Orthopoxvirus, Capripoxvirus, Avipoxvirus, Ра га poxvirus, Leporipoxvirus и Suipoxvirus. В предпочтительном воплощении рекомбинантный поксвирус для применения в данном документе получен из поксвируса, принадлежащего к роду Orthopoxvirus и даже более предпочтительно к виду вируса осповакцины (VV - от англ. vaccinia virus). Любой штамм вируса осповакцины может быть использован в контексте настоящего изобретения, включая, без ограничения, следующие штаммы: Western Reserve (WR), Copenhagen (Cop), Lister, LIVP, Wyeth, Tashkent, Tian Tan, Brighton, Ankara, MVA (модифицированный вирус осповакцины Ankara), LC16M8, LC16M0 и т.д., с особым предпочтением в отношении WR, Copenhagen, Wyeth и вируса осповакцины MVA. Последовательности генома разных Poxviridae, доступны в данной области в специализированных банках данных, таких как Genbank (например, номера доступа NC_006998, М35027 и U94848 предоставляют последовательности геномов WR, Copenhagen и MVA). В еще одном воплощении рекомбинантный поксвирус для применения в данной документе может быть получен из парапоксвируса, с особым предпочтением в отношении одного из видов вируса псевдооспы коров (PCPV - от англ. pseudocowpox virus). PCPV имеет геном, который является линейным и двухцепочечным сегментом ДНК, обычно 130-150 т.п.н.

Соответствующие поксвирусы для использования в данном документе описаны в W02018/234506. В контексте настоящего изобретения можно использовать или штамм дикого типа, а также любое его производное (а именно, поксвирус, который модифицирован, по сравнению со штаммом дикого типа, например, посредством усечения, делеции, замены и/или вставки одного или более нуклеотидов, смежных или нет в пределах генома вируса). Иллюстративные модификации предпочтительны в генах вируса, участвующих в метаболизме ДНК, вирулентности хозяина или пути IFN (от англ. interferon - интерферон) (см., например, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5):595-608). Особенно подходящий ген, подлежащий нарушению, представляет собой ген, кодирующий тимидинкиназу (ТК - от англ. thymidine kinase) (локус J2R; номер доступа Genbank ААА48082). В качестве альтернативы или совместно, поксвирус для использования в данном документе может быть модифицирован посредством изменения по меньшей мере одного гена или обоих генов, кодирующих рибонуклеотидредуктазу вируса (RR). Вирусный фермент состоит из двух гетерологичных субъединиц, обозначенных R1 и R2, кодируемых, соответственно, локусом I4L и F4L. Последовательности генов I4L и F4L и их положения в геноме разных поксвирусов доступны в общедоступных базах данных. Номенклатура генов, используемая в данном документе, соответствует штамму осповакцины Copenhagen. Ее также используют в данном документе для гомологичных генов других poxviridae, если особым образом не указано иное, и соответствие между Copenhagen и другими штаммами осповакцины доступно специалисту. В иллюстративных целях вирусы осповакцины (VV - от англ. vaccinia virus), дефектные по TK или TK и RR, описаны в литературе (см., например, WO2009/065546).

Предпочтительно, рекомбинантный поксвирус, подлежащий конструированию, посредством способа конструирования по изобретению, представляет собой поксвирус, дефектный по репликации, и предпочтительно вирус осповакцины, дефектный по репликации, что означает, что он не может реплицироваться до какой-либо значимой степени в клетках человека.

Особенно подходящим поксвирусом для применения в контексте настоящего изобретения является MVA за счет его сильно ослабленного фенотипа (Mayr et al., 1975, Infection 3: 6-14; Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-51). Нуклеотидная последовательность генома MVA и аминокислотная последовательность кодируемых вирусных белков доступны в данной области, например, из Antoine et al. (1998, Virol. 244: 365-96) и Genbank (номер доступа U94848).

Множество пептидов

Термин «множество», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к состоянию многочисленности (например, по меньшей мере 5 или больше). Число пептидов (а именно, множество пептидов), которое может кодироваться рекомбинантный поксвирусом, не является ограничивающим в зависимости от выбранного типа поксвируса (например, MVA), и экспрессии, опосредованной поксвирусом (например, экспрессии в коротких или больших продуктах слияния и регуляторных элементов, как описано ниже в данном документе). В иллюстративных целях 5-150 пептидов могут экспрессироваться рекомбинантный поксвирусом, предпочтительно от 7 до 100, более предпочтительно от 9 до 40 и даже более предпочтительно от 10 до 35 пептидов с предпочтением в отношении примерно 30 пептидов (например, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33).

Длина пептидов, подлежащих выбору способом согласно данному изобретению для того, чтобы кодироваться рекомбинантным поксвирусом, обычно составляет от 12 аминокислотных остатков до примерно 150 аминокислотных остатков, но, конечно, длина может варьировать от одного пептида к другому. В иллюстративных целях каждый из пептидов может иметь длину 13 - 101 аминокислотных остатков, желательно 16 - 90 аминокислотных остатков, предпочтительно 17-85 аминокислотных остатков, более предпочтительно 18-80 аминокислотных остатков и даже более предпочтительно 20 - 40 аминокислотных остатков.

Неопептиды

Способ по изобретению в частности адаптирован к разработке персонализированной противораковой вакцины и позволяет идентифицировать и обеспечивать набор пептидов-кандидатов, содержащих по меньшей мере одну опухолеспецифичную мутацию, на индивидуальной основе, а именно, неопептидов-кандидатов. Неопептид таким образом имеет чужеродную природу (не обнаружен в собственном белке), как объясняется в данном документе. Из-за данной чужеродной природы ожидают, что такой(ие) пептид(ы) будет(ут) распознаваться опухолеспецифичными Т-лимфоцитами.

В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют для отбора множества неопептидов. Обычно «неопептид» представляет собой пептид, соответствующий фрагменту неоантигена и, таким образом, содержащий минимальную иммунную детерминанту (а именно, «неоэпитоп»), который содействует МНС (от англ. major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости) - зависимому распознаванию Т-клетками (или который презентирован молекулами МНС на поверхности клеток субъекта), и по меньшей мере опухолеспецифичную мутацию, которая не является молчащей. Обычно, опухолеспецифичная мутация расположена в пределах неоэпитопа и окружена (на одной из или обеих сторонах) фланкирующей (и ми) последовательностью(ями), представленной(ыми) в природе в своей нормальной среде (которая(ые) представляет(ют) собой последовательность(и) неоантигена, из которого взят неоэпитоп).

Термин «неоантиген», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антигену, который появился в процессе канцерогенеза в раковой клетке. Таким образом, неоантиген обнаружен в раковых клетках или тканях, полученных от пациента, но не обнаружен в образце нормальных клеток или тканей, полученных от пациента или здорового индивида. Обычно, опухолеспецифичная мутация предпочтительно представлена в ДНК, содержащейся в раковой клетке (например, образец опухоли), но отсутствует в ДНК, содержащейся в нераковой клетке (например, образец не опухоли).

Термин «мутация» относится к по меньшей мере одному отличию последовательностей между тестируемой последовательностью (например, неоантиген) и референсной последовательностью (аутоантиген). Несколько типов опухолеспецифичных мутаций охвачены настоящим изобретением, включая миссенс-мутации, делеции, вставки, мутации сдвига рамки считывания и мутации в сайте сплайсинга (см. WO2018/234506). В контексте настоящего изобретения опухолеспецифичная мутация предпочтительно является немолчащей и транслируется в изменение на аминокислотном уровне в отношении соответствующего аутоантигена. Более предпочтительно, она представляет собой миссенс-мутацию или мутацию сдвига рамки считывания. «Миссенс»-мутация происходит в результате замены одного нуклеотида другим нуклеотидом в пределах конкретного кодона, которая влияет на кодируемую аминокислотную последовательность, таким образом, приводя к изменению одной аминокислоты. Другим путем влияния на белковую последовательность является вставка или делеция одного или более нуклеотидов (например, кусок ДНК), которая меняет число нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Мутации - вставка и делеция могут приводить к изменению рамки считывания (так называемая мутация сдвига рамки считывания), но не необязательно в случае инсерционно-делеционных мутаций внутри рамки (например, вставка или делеция кратная 3 нуклеотидам приведет к добавлению или подавлению по меньшей мере одного кодона). Почти вся аминокислотная последовательность может меняться, если мутация рано встречается в нуклеотидной последовательности. Мутация сдвига рамки считывания может также приводить к образованию стоп-кодона, который транслируется в стоп-сигнал, и полученный белок будет затем усечен (удален его участок ниже de novo образованного стоп-кодона). Миссенс-мутация может быть расположена в сайтах сплайсинга мРНК, приводя к аберрантному сплайсингу и, таким образом, к аберрантной белковой последовательности.

Со ссылкой на воплощение неопептида, предпочтительно, чтобы по меньшей мере 70% (например, 80%, 85%, 90%, 95% и даже 100%) неопептидов, подлежащих селекции, имели одну миссенс-мутацию, сосредоточенную в середине неопептида (например, мутантная аминокислота расположена точно в середине неопептида (в случае, когда неопептид имеет нечетное число аминокислот) или в одном из двух центральных положений (в случае, когда неопептид имеет четное число аминокислот), или в любой из 2 - 5 аминокислот на каждой стороне точного центрального положения, с таким же числом фланкирующих аминокислот с каждой стороны от мутантной аминокислоты).

Мутация может, однако, по меньшей мере в некоторых неопептидах, быть расположена близко к N-концу или С-концу, особенно в случае мутации сдвига рамки считывания или когда миссенс-мутация встречается на или близко к N- или С-концу неоантигена.

Конечно, длина неопептидов имеет общие признаки, описанные выше, применительно к воплощению пептида. Предпочтительно, в иллюстративных целях, но не в целях ограничения, неопептиды, содержащие миссенс-мутацию, имеют индивидуально длину от 20 до 40, и предпочтительно от 25 до 35 аминокислотных остатков. Особое предпочтение отдается отдельным неопептидам из 25, 27 или 29 остатков (предпочтительно миссенс-мутация расположена в положении 13 (25mer), 14 (27mer) или 15 (29mer), начиная с N-конца неопептида, фланкирована 12 (25mer), 13 (27mer) или 14 (29mer) аминокислотами с каждой стороны от мутации).

Слияние пептидов

Как объяснено, настоящий способ предполагает экспрессию рекомбинантный поксвирусом множества пептидов (например, неопептидов), локализованных в соответствии со способом по настоящему изобретению в виде одного или более продуктов слияния. В контексте настоящего изобретения «продукт слияния одного или более пептидов» (также называемый «продуктом слияния пептидов» или «пептидным продуктом слияния») может содержать один или более пептидов. Под «продуктом слияния» подразумевается комбинация указанного(ых) пептида (ов) в виде одной полипептидной цепи, независимо от числа включенных пептидов. В случае одного пептида следует понимать, что «продукт слияния» указанного одного пептида относится к собственно пептиду, поскольку он уже представляет собой одну полипептидную цепь. Число пептидов может варьировать от одного продукта слияния к другому продукту слияния с предпочтением в отношении продукта слияния, содержащего от 1 до 20 пептидов, предпочтительно от 2 до 15 пептидов, предпочтительно от 3 до 12, более предпочтительно от 4 до 11 и даже более предпочтительно от 5 до 10 пептидов (например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10).

Положение пептида в продукте слияния пептидов называется «слотом».

Определенные воплощения предполагают наличие одного пептида на N-конце продукта слияния пептидов (например, состоящего из одного или более пептидов) для усиления процессинга посредством ER (от англ. endoplasmic reticulum - эндоплазматический ретикулум) и/или секреции. Указанный сигнальный пептид собственно сливают с продуктом слияния пептидов. Кратко, сигнальные пептиды обычно содержат от 15 до 35 по существу гидрофобных аминокислот, вставлены на N-конце полипептида ниже кодона инициации трансляции и затем удаляются посредством специфичных эндопептидаз, расположенных в ER, с получением зрелого полипептида. Соответствующие сигнальные пептиды известны в данной области. Они могут быть получены из клеточных или вирусных полипептидов, таких как следующие полипептиды: иммуноглобулины, тканевой активатор плазминогена, инсулин, гликопротеин бешенства, гликопротеин оболочки вируса ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) или гликопротеин F вируса кори (gp), или могут быть синтетическими. Если более чем одна последовательность сигнального пептида подлежит использованию в рекомбинантном поксвирусе, можно выбирать последовательности сигнальных пептидов разного происхождения (например, из gp F бешенства или кори) и/или дегенерировать гомологичные последовательности, которые демонстрируют высокую степень идентичности последовательностей (например, выше 75%) таким образом, чтобы ограничить события гомологичной рекомбинации, которые могли бы нарушать технологический процесс (см. WO2008/138649).

В контексте настоящего изобретения продукт слияния может включать трансформацию (например, химическое действие), если он включает две или более пептидов: слияние пептидов может быть прямым (то есть без каких-либо дополнительных аминокислотных остатков между ними) или посредством линкера для улучшения доступности пептидов. Обычно, линкеры состоят из короткого участка аминокислотных остатков, таких как (Gly или G), серии (Ser или S), треонин (Thr или Т), аспарагин (Asn или N), аланин (Ala или А) и/или пролин (Pro или Р). Предпочтительные линкеры в контексте данного изобретения содержат от 2 до 10 аминокислот, с предпочтением в отношении 3, 5 или 10 аминокислот, главным образом глицина и серина (например, состоят их одного или более мотивов аминокислот, таких как GSG, GST, GAS или GTS). Специалисту доступно оценивать то, есть ли необходимость включения линкера или нет между двумя слитыми пептидами. В предпочтительном воплощении пептиды расположены в продуктах слияния с линкерами между каждым пептидом (например, между пептидом 1 и пептидом 2, между пептидом 2 и пептидом 3, и т.д.) и, возможно, на N-конце первого пептида. Нуклеотидные последовательности линкеров, содержащиеся в одном рекомбинантном поксвирусе, можно дегенерировать, пользуясь преимуществом вырожденности кодонов (4 кодона, доступных для кодирования G-остатка, 6 - для кодирования S-остатка, 4 - для кодирования Т-остатка и т.д.), таким образом, способствуя уменьшению идентичности последовательностей в пределах рекомбинантного поксвируса и огранивая нежелательные события рекомбинации, которые могут встречаться во время технологического процесса.

В определенных воплощениях настоящего изобретения также рассматривается наличие метки (обычно короткой пептидной последовательности, способной распознаваться доступными антисыворотками или соединениями) для облегчения выявления экспрессии пептидов (или продукта(ов) их слияния) или инфицированных клеток-хозяев, экспрессирующих такие пептиды (или продукт их слияния). Огромное разнообразие пептидов-меток может быть использовано в контексте изобретения, включая, без ограничения, метку РК, октапептид FLAG, MYC-метку, HIS-метку (обычно участок 4-10 остатков гистидина) и е-метку (US 6686152). Пептид(ы) метки могут быть независимо расположены на N-конце белка или в качестве альтернативы на его С-конце или в качестве альтернативы с внутренней стороны или в любом изданных положений, когда используется несколько меток. Пептиды-метки можно выявлять посредством иммунологических анализов с использованием антител против метки.

В контексте настоящего изобретения каждый продукт слияния можно конструировать отличным образом от другого(их) и можно различать друг от друга по наличию и/или последовательности и/или числу и/или положению элементов, таких как пептидные сигналы, линкеры, метки и т.д. Согласно предпочтительному воплощению каждый продукт слияния, однако, содержит а) сигнальный пептид на своем N-конце, b) линкеры на N-конце первого пептида между каждым пептидом и С-концом последнего пептида и с) метку на своем С-конце.

Экспрессия продукта(ов) слияния пептидов

Согласно настоящему изобретению каждый продукт слияния пептидов помещен под контроль соответствующих регуляторных элементов (главным образом, промоторной последовательности и последовательности терминации), и называется «экспрессионной кассетой». Обычно, «экспрессионная кассета» содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более пептидов (например, неопептид(ов)) или продукт слияния пептидов под контролем подходящих регуляторных элементов, делающих возможной экспрессию в субъекте. Иными словами, каждая из одной или более экспрессионных кассет, кодирующих продукт слияния пептидов, как описано в данном документе, оснащена подходящими регуляторными элементами для экспрессии в клетке-хозяине или субъекте. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «регуляторный элемент» или «регуляторная последовательность» относится к любому элементу, который обеспечивает, способствует или модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты (например, кодирующей продукт слияния пептидов, описанный в данном документе) в данной клетке-хозяине или субъекте, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию, стабильность и/или транспорт нуклеиновой(ых) кислоты(от) или ее(их) производного (а именно, мРНК).

Специалистам в данной области следует понимать, что выбор регуляторных элементов может зависеть от таких факторов, как сама экспрессионная кассета, вирус, в который ее вставляют, клетка-хозяин или субъект, желательный уровень экспрессии и т.д. Промотор имеет особое значение. Промоторы поксвируса в частности адаптируют для направления экспрессии данной нуклеиновой кислоты из поксвируса, такого как рекомбинантный поксвирус, описанный в данном документе. Типичные примеры включают, без ограничения, промоторы вируса осповакцины 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, p11, pB2R, pA35R и K1L, а также синтетически промоторы, такие как промоторы, описанные в Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; и Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8), а также ранние/поздние химерные промоторы.

Специалистам в данной области будет понятно, что помимо промотора регуляторные элементы могут дополнительно содержать дополнительные элементы для соответствующей инициации, регуляции и/или терминации транскрипции (например, последовательности терминации транскрипции полиА), транспорта мРНК (например, сигнальные последовательности, как описано в данном документе), стабильности (например, интроны и некодирующие 5'- и 3'-последовательности), трансляции (например, инициатор Met, трехкомпонентные лидерные последовательности, участки связывания рибосомы IRES (от англ. Internal Ribosome Entry Site - участок внутренней посадки рибосомы), сигнальные пептиды т.д.) и идентификации и очистки (например, пептиды-метки, как описано в данном документе).

В предпочтительном воплощении все пептиды, выбранные способом по изобретению, собраны в кластеры в 1-5 экспрессионных кассетах с предпочтением в отношении 1-3 кассет, предпочтительно 2 или 3 кассеты и более предпочтительно 3 кассеты из 1-20 пептидов. В особенно предпочтительном воплощении рекомбинантный поксвирус содержит три кассеты, причем каждая кодирует продукт слияния 5-10 пептидов с предпочтением в отношении приблизительно 10 пептидов для каждой. В иллюстративных целях, если рекомбинантный поксвирус содержит 3 экспрессионные кассеты, каждая из них будет использовать разные промоторы для контроля над последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей каждый продукт слияния пептидов, например, промотор pH5R для первой кассеты, промотор pC11R для второй кассеты и промотор р7.5K для третьей кассеты.

Стадия (а) способа конструирования: идентификация и отбор пептидов-кандидатов, подходящих для экспрессии рекомбинантным поксвирусом

Способ конструирования согласно настоящему изобретению, во-первых, требует идентификации и ранжирования пептидов (стадия (а0)) и отбора пептидов-кандидатов, подлежащих экспрессии рекомбинантным поксвирусом (стадия (а)), как проиллюстрировано на Фиг. 3.

Как объясняется, настоящий способ конструирования рекомбинантного поксвируса предполагает, что доступен набор интересующих пептидов. Стадия (а0) обеспечивает отбор набора интересующих пептидов, посредством идентификации и ранжирования указанных пептидов. Указанный набор интересующих пептидов может также быть сконструирован «пептидами из файла ввода». В предпочтительном воплощении указанные интересующие пептиды идентифицированы и/или ранжированы в соответствии с одним или более критериями, например, предсказанным потенциалом иммуногенности пептидов. В целях ясности, «потенциал иммуногенности» относится к способности пептида повышать иммунный ответ сразу при доставке субъекту (например, посредством рекомбинантного поксвируса, кодирующего такой пептид или продукт слияния пептидов). В контексте настоящего изобретения иммунный ответ может быть гуморальным или Т-клеточным ответом (или и тем и другим), включая CD4+ (например, Th1, Th2 и/или Th17) и/или CD8+ Т-клеточный ответ (например. CTL-ответ). Большое число алгоритмов прогнозирования существует в данной области для прогнозирования in silico потенциала иммуногенности пептида или продукта слияния пептидов, главным образом, для прогнозирования способности увеличивать Т-клеточный ответ (см., например, Nielsen et al., 2010, Immunology 130(3): 319-28). Алгоритмы, полагающиеся на прогнозирования аффинности связывания пептида в отношении молекул МНС, являются соответствующими в контексте настоящего изобретения. В иллюстративных целях можно привести SVMHC, NetMHCII, Tepitope/propped, syfpeithi, Epitollkit и т.д. Примечательно, что число пептидов-кандидатов может быть выше, чем финальное число пептидов, фактически экспрессируемых кассетами (например, для того, чтобы иметь 10-35 финальных пептидов, как предполагали, могли иметь место сотни пептидов-кандидатов).

Стадия (а) отдельно оценивает указанные идентифицированные и ранжированные пептиды и обеспечивает отбор пептидов-кандидатов. Под словом «кандидат» подразумевается подходящий для получения рекомбинантного поксвируса.

В одном из воплощений отбор пептидов-кандидатов проводят посредством средств фильтрования на основе одного или более критериев. На данной стадии средства обработки (11) (Фиг. 2) создают один или более под наборов набора интересующих пептидов. Данные пептиды можно исключать и помещать в список исключенных пептидов или можно рассматривать как подходящие для получения рекомбинантного поксвируса. В случае, когда пептиды считаются подходящими для получения рекомбинантного поксвируса, указанные идентифицированные пептиды-кандидаты помещают в первый поднабор (список наилучших пептидов) или во второй поднабор (список дополнительных пептидов), где указанный список наилучших пептидов содержит максимальное число пептидов-кандидатов для получения рекомбинантного поксвируса с наиболее высоким прогнозированием, и где указанный список дополнительных пептидов содержит оставшиеся пептиды-кандидаты.

В предпочтительном воплощении изобретения набор интересующих пептидов или пептидов из файла ввода независимо или дополнительно фильтруют на основе критерия, соответствующего их склонности нести трансмембранный (ТМ) сегмент. Термин «ТМ сегмент» или «ТМ домен», в том виде, в котором он используется в данном документе, может быть определен как короткая гидрофобная альфа-спираль из приблизительно 20 аминокислотных остатков. Трансмембранная балльная оценка («балльная оценка ТМ» или «TMS») представляет собой балльную оценку, рассчитанную для перевода локальных топологических прогнозирований в поддающиеся оценке значения для всей аминокислотной последовательности с использованием способов на основе кумулятивной суммы. Она свидетельствует о вероятности того, что пептид представляет или образует по меньшей мере один ТМ сегмент в пределах своей последовательности (а именно, ТМ внутри). Она преимущественно варьирует от 0 (нет предсказанного ТМ домена) до n*(n+1)/2, где n представляет собой число локальных фрагментов, оцениваемое инструментом прогнозирования, и n*(n+1)/2 представляет собой максимальную балльную оценку из кумулятивной суммы n элементов. Чем выше TMS, тем значимее вероятность того, что пептидная последовательность будет представлять или образовывать ТМ домен. Балльная оценка ТМ может быть определена с использованием нескольких инструментов прогнозирования, хорошо известных специалисту, таких как ТМНММ (в случае скрытой марковской модели трансмембранных доменов; Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol. 305: 567-80), DAS (от англ. Dense Alignment Surface - плотная поверхность выравнивания), где алгоритм фильтрации DAS-TM обеспечивает профиль гидрофобности высокой точности для запроса, из которого можно получить положение потенциальных ТМ сегментов, или способ на основе взаимосвязи между гидрофобностью и гидрофобным моментом в склонности к образованию трансмембранных доменов (Eisenberg et al., 1982, Nature, Sep 23;299(5881):371-4), где корреляция между гидрофобностью и гидрофобным моментом определяет сечение белка, как глобулярное, трансмембранное или поверхностное.

Обычно, балльные оценки ТМ рассчитывают на основе состава аминокислот каждого отдельного пептида. Предпочтительно, расчет балльной оценки ТМ основан на взаимосвязи между гидрофобностью и гидрофобным моментом в склонности образовывать трансмембранные сегменты, как определено Eisenberg. Расчет TMS предпочтительно проводят, используя функцию membpos, на основе стандартизированной шкалы Eisenberg (Eisenberg et al., 1984, Annual review of biochemistry 53.1: 595-623), с использованием окон из 11 аминокислот для расчета теоретического типа фрагмента. Предпочтительно, указанная функция membpos основана по меньшей мере на двух критериях, выбранных для группы, включающей аминокислотную последовательность и угол вращения белка. В указанном аспекте изобретения дискретное значение «1» приписывается трансмембранным, и дискретное значение «0» приписывается глобулярным или поверхностным. Затем, балльная оценка ТМ рассчитывается посредством расчета кумулятивной суммы локальных дискретных значений, включая «порог непрерывности», используемый для рассмотрения пространственного расположения участков ТМ в линейной последовательности. Увеличение порога непрерывности делает возможной встречаемость дискретных значений «0» при кумулятивном расчете. Указанный расчет приращений осуществляют в обоих направлениях для того, чтобы избежать какого-либо смещения. Таким образом, балльная оценка ТМ представляет собой сумму участков ТМ. Используется наиболее высокая балльная оценка, и она соответствует балльной оценке ТМ.

Например, TMS для пептида TVHHRIVGCSLAVICGVLYGSTFQVPIIYI рассчитывали с порогом непрерывности 0 и 1 (Таблица 1). С порогом непрерывности 0 рассчитанные участки ТМ представляли собой 36_3_1 в обоих направлениях, и с ТМ балльной оценкой 40. С порогом непрерывности 1, рассчитанный ТМ участок представлял собой 36_8 (балльная оценка ТМ составляет 44) в одном направлении, и 36_7 (балльная оценка ТМ составляет 43) в другом направлении. При разных двух балльных оценках ТМ, используют самую высокую: в случае порога непрерывности 1, балльная оценка ТМ представляет собой 44. В данном примере, посредством увеличения порога непрерывности до 3 или больше, не учитывается никакой локальный участок, и TMS выше.

В предпочтительном воплощении способ конструирования рекомбинантного поксвируса включает отбор первого поднабора (список наилучших пептидов) пептидов-кандидатов, где указанные пептиды-кандидаты демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога TMS. Указанный способ дополнительно включает исключение пептидов (список исключенных пептидов), если они демонстрируют трансмембранные балльные оценки, превышающие пороги TMS, и отбор второго поднабора (список дополнительных пептидов) идентифицированного набора пептидов-кандидатов в качестве пептидов-кандидатов, которые не были ни раскрыты, ни отобраны в первом поднаборе.

В более предпочтительном воплощении указанные пептиды-кандидаты первого и второго поднабора демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога 40, более предпочтительно порога 30 с конкретным предпочтением в отношении порога 25 (например, предпочтительные балльные оценки ТМ: 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 и т.д.).

В иллюстративных целях интересующие пептиды, имеющие балльную оценку ТМ ниже порога 25, как определено согласно способу, описанному Eisenberg et al., хранят и помещают в набор пептидов-кандидатов, включая первый и второй поднабор.

В еще одном и предпочтительном воплощении изобретения набор интересующих пептидов или пептидов из файла ввода независимо или дополнительно фильтруют на основе критерия, соответствующего гомологии последовательностей пептидов, для ограничения событий рекомбинации между пептидами. Гомология иллюстрирует идентичность аминокислотных последовательностей между пептидами или белками.

Пептиды, имеющие последовательности, несущие непрерывные области с более чем X идентичных аминокислот, считаются гомологичными, где X представляет собой 12, более предпочтительно 11, более предпочтительно 10, более предпочтительно 9, более предпочтительно 8, более предпочтительно 7, более предпочтительно 6 и даже более предпочтительно 5. Хранят только один пептид среди пептидов, имеющих такие гомологичные непрерывные области, причем указанный пептид выбран с наиболее высокой ранговой балльной оценкой (например, предсказанный потенциал иммуногенности). Пептиды, которые не оставляют, исключают и помещают в список исключенных пептидов. Например, в списке пептидов, содержащем 3 пептида, имеющих гомологичные непрерывные последовательности из 5 или более аминокислот, сохраняют пептид, имеющий наивысшую ранговую балльную оценку потенциала иммуногенности, где данные два других пептида исключаются.

Дупликация является конкретным случаем гомологии. Она может встречаться, когда мутация, представленная в данном пептиде (например, опухолеспецифичная мутация данного неопептида), является частью нескольких эпитопов, или когда им присваивается балльная оценка для нескольких типов HLA (от англ. Human Leukocyte Antigen - лейкоцитарный антиген человека). Предпочтительно, сохраняют только один пептид среди таких дуплицированных пептидов, причем указанный пептид отобран с наиболее высокой балльной ранговой оценкой потенциала иммуногенности; другой(ие) дуплицированный(ые) пептид(ы) исключают.

В предпочтительном воплощении способ конструирования рекомбинантного поксвируса включает отбор первого поднабора пептидов-кандидатов, где указанные пептиды-кандидаты представляют непрерывные области ниже порога гомологии. Предпочтительно, интересующие пептиды, представляющие непрерывные области ниже порога гомологии 5, сохраняют и помещают в набор пептидов-кандидатов, содержащий первый и второй поднабор.

В предпочтительном воплощении изобретения стадия отбора (а) включает отбор первого поднабора пептидов-кандидатов, где указанные пептиды демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога TMS (например, ниже 25). В более предпочтительном воплощении указанные пептиды стадии (а) представляют непрерывные области ниже порога гомологии (например, ниже 5). Предпочтительно, стадии фильтрации последовательно проводят в следующем порядке: 1) порог TMS; 2) порог гомологии (Фиг. 3).

Вследствие этого, выходные данные представляют собой вплоть до 3 списков (каждый из списков еще предпочтительно ранжирован в соответствии с их иммуногенностью):

1. Список исключенных пептидов: включает исключенные пептиды;

2. Список наилучших пептидов: включает максимальное число пептидов-кандидатов для получения рекомбинантного поксвируса, причем указанные пептиды имеют наивысшие ранговые балльные оценки прогнозирования иммуногенности (первый поднабор);

3. Список дополнительных пептидов: включает оставшиеся подходящие кандидаты (второй поднабор).

В частности, стадия (а) обычно включает, во-первых, исключение кандидатов, которые демонстрируют балльные оценки ТМ, превышающие порог TMS (например, кандидаты, имеющие балльную оценку ТМ, равную или выше порога 25), и/или пептидов, имеющих гомологичные области (например, кандидаты, имеющие более чем 5 смежных аминокислот, общих с подходящим пептидом), и затем, из N оставшихся пептидов-кандидатов, отбор вплоть до Nmax наилучших пептидов- кандидатов (где Nmax представляет собой максимальное число пептидов, подлежащих экспрессии рекомбинантным поксвирусом, такое как примерно 30) в виде первого поднабора и хранение N-Nmax других в виде второго поднабора (Фиг. 1 и 3). Однако:

- второй поднабор может быть пустым (если N меньше Nmax, таким образом, первый поднабор только содержит N пептидов);

- если число пептидов, выбранных в первом поднаборе, меньше Nmin пептидов (где Nmin представляет собой минимальное число пептидов для получения рекомбинантного поксвируса, такое как примерно 5), поскольку бальные оценки трансмембранных доменов и/или гомология пептидных последовательностей пептидов-кандидатов являются слишком высокими, считается невозможным получать рекомбинантный поксвирус, и способ не дает результатов.

Стадия (b) способа конструирования: межкассетное распределение В предпочтительном воплощении способ по изобретению дополнительно включает стадию (b) определения оптимального распределения пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по одной или более экспрессионным кассетам среди множества возможных распределений.

Стадия (b) позволяет обеспечивать оптимальное соотношение между качеством и количеством пептидов в каждой экспрессионной кассете для того, чтобы избежать какого-либо смещения из-за преобладания пептидов, которые могли бы подвергаться риску в отношении получения и продукции поксвируса (Фиг. 4).

В воплощении стадии (b) отобранные пептиды первого поднабора (список наилучших пептидов), полученного на стадии (а), распределяются по разным классам, в зависимости от балльных оценок ТМ пептидов и балльных оценок гидрофобности пептидов (HS). В частности, пептиды поднабора списка наилучших пептидов предпочтительно распределяются по трем классам, «Низкий» (L), «Средний» (М) и «Высокий» (Н). Данные классы относятся к риску (для каждого пептида в отдельности) неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса.

Следует понимать, что слова «низкий», «средний» и «высокий» являются относительными и только выражают, что данные классы позволяют сравнить пептиды поднабора списка наилучших пептидов. Иными словами, пептиды L (пептиды класса L) являются наиболее склонны к получению или продуцированию какого-либо рекомбинантного поксвируса, пептиды Н (пептиды класса Н) являются наименее склонными к получению или продуцированию какого-либо рекомбинантного поксвируса, и пептиды М (пептиды класса М) менее склонны к получению или продуцированию какого-либо рекомбинантного поксвируса, чем пептиды L, но более склонны к получению или продуцированию какого-либо рекомбинантного поксвируса, чем пептиды Н.

Более предпочтительно, пептиды списка наилучших пептидов ранжированы в соответствии с их балльными оценками ТМ (предпочтительно ниже 25). В случае равных балльных оценок ТМ пептиды ранжированы в соответствии с их балльной оценкой гидрофобности. Балльную оценку гидрофобности данного пептида или продукта слияния пептидов рассчитывают посредством деления балльной оценки гидрофобности, определенной для указанного пептида или продукта слияния пептидов, на число остатков, находящихся в указанном пептиде или указанном продукте слияния. Обычным способом, балльную оценку гидрофобности данного пептида определяют по сумме значения гидрофобности/гидрофильности каждого аминокислотного остатка указанного пептида, как описано, например, в WO2018/234506; балльная оценка гидрофобности продукта слияния пептидов соответствует сумме балльных оценок гидрофобности, определенных для каждого пептида, содержащегося в указанном продукте слияния. Технически, аминокислотная последовательность одного или более пептидов или их слитого пептида, кодируемая рекомбинантным поксвирусом, является гидрофильной в природе. Гидрофильная или гидрофобная природа данной последовательности может быть легко определена целым рядом способов и алгоритмов, доступных в данной области. Расчет балльной оценки гидрофобности и/или балльной оценки гидрофобности конкретной последовательности доступен специалисту в данной области. Например, данные балльные оценки можно определять, используя способ Кайта-Дулитла (Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-32) или любой другой подходящий способ (например, Rose et al., 1993, Ann. Rev. Biomol. Struc. 22: 381-415; Kallol et al., 2003, J. Chromat. 1000: 637-55; Sweet et al., 1983, J. Mol. Biol. 171: 479-88; среди многих прочих) или алгоритм (например, ExPAsy Prot Scale Protein; Protein Hydrophobicity Plots, разработанный штатом Колорадо, или World of Bioinformatics, и т.д.).

Как объясняется выше, уровни для определения классов являются относительными, отсутствуют конкретные задействованные пороговые значения, и преимущественно число пептидов каждого класса (L, М или Н) является лишь функцией числа пептидов N.

В предпочтительном воплощении число пептидов-кандидатов каждого класса, распределенных по каждому классу, соответствует первой таблице распределения, включая, без ограничения, таблицу, приведенную на Фиг. 5. На данной фигуре, более конкретно, колонка «Nb пептидов» показывает число пептидов, которое каждый рекомбинантный поксвирус будет содержать (в данном документе, число пептидов находится между 1 и 30). Столбец «общее число на класс» показывает то, сколько пептидов каждого класса будет экспрессировать весь рекомбинантный поксвирус, в виде функции числа отобранных пептидов. На Фиг. 6 дан пример ранжирования пептидов и определения их классов. В данном документе число пептидов равно 30. На Фиг. 5 показано то, что для 30 пептидов имеют место пептиды 6 Н, 6 М и 18 L. 30 пептидов ранжированы в соответствии с их балльными оценками ТМ, и, в случае равных балльных оценок ТМ, в соответствии с их балльными оценками гидрофобности. В данном документе 3 пептида имеют балльную оценку ТМ выше 0; они помещены в класс Н. Поскольку 27 других пептидов имеют балльную оценку ТМ, равную 0, для их ранжирования рассматриваются их балльные оценки гидрофобности. Для данных 27 пептидов 3 пептида с HS, составляющей от 0,32 до 0,64, помещают в класс Н, 6 пептидов с HS, составляющей от -0,21 до 0,07, помещают в класс М, и 18 пептидов с HS, составляющей от -1,31 до -0,25, помещают в класс L.

В предпочтительном воплощении стадия (b) дополнительно включает определение оптимального распределения пептидов-кандидатов из первого поднабора распределенных по классам пептидов по разным экспрессионным кассетам («межкассетное распределение») среди множества возможных распределений. Под «распределением» просто подразумевается определение для каждого отобранного пептида того, какая кассета будет кодировать данный пептид, независимо от их порядка в пределах данной кассеты («присвоение слотов внутри кассеты»). Предварительная установка распределения основана на общем числе пептидов-кандидатов (N) первого поднабора наилучших пептидов и присвоенном числе пептидов из каждого класса в каждой кассете.

Под «оптимальном» распределением подразумевается распределение, имеющее самый низкий глобальный риск неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса, критерии достижения такого оптимального распределения будут объясняться ниже.

Как представлено Фиг. 4, число кассет определено как функция числа отобранных пептидов первого поднабора: обычно 3 кассеты, если первый поднабор содержит по меньшей мере 15 пептидов (по меньшей мере 5 на кассету), 2 кассеты, если первый поднабор содержит от 10 до 14 пептидов (5-7 на кассету), 1 кассету, если первый поднабор содержит меньше чем 10 пептидов (при условии, что достигается минимальное число отобранных пептидов, как объяснено, обычно 5 пептидов). В случае 1 кассеты распределение является тривиальным, и в случае 2 кассет существует только бинарный выбор для каждого пептида, таким образом, что число комбинаций остается низким, и они могут быть все испробованы. В случае 3 кассет число комбинаций может стать слишком высоким, таким образом, что способ предпочтительно работает через итерации («iter») только данного максимального числа групп, а именно возможных комбинаций, причем указанное максимальное число определяет самое высокое число возможных распределений пептидов-кандидатов (например, случайным образом выбранных среди всех возможных распределений пептидов-кандидатов), сразу удобных в управлении, а именно, в пределах приемлемого времени обработки, такого как 30 с. Иными словами, пытаются определить указанное оптимальное распределение пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди итераций указанного максимального числа возможных распределений среди множества возможных распределений.

Данное максимальное число представляет собой функцию ресурсов (а именно, вычислительные характеристики) средств обработки 11 сервера 1. Действительно, чем мощнее средства обработки 11, тем быстрее могут быть обработаны комбинации. В случае типичного настольного персонального компьютера (2-х ядерный 4-поточный ЦП (центральный процессор) с вплоть до 4 Гб RAM (от англ. Random Access Memory - оперативная память с произвольным доступом), причем указанное данное число обычно представляет собой 15000 групп (время обработки: 28,9 с). В случае профессионального сервера, который является предпочтительным оборудованием в данном документе (8-ядерный 16-поточный ЦП с 24 Гб RAM), причем указанное максимальное число обычно составляет 30000 групп (время обработки: 20,7 с). В случае суперкомпьютера (ЦП 56-потоков с 136 Гб RAM), указанное максимальное число может составлять вплоть до 60000 групп (время обработки: 42,4 с). В следующем описании авторы изобретения будут брать предпочтительный пример 30000 групп в качестве максимального числа.

Если ни одна из данных групп не является удовлетворительной (см. ниже), пробуют по меньшей мере вторую итерацию (а именно, данное максимальное число, например, 30000, дополнительных групп). Примечательно, что обработка через итерации обычно происходит в случае 3 кассет, но фактически способ мог обрабатывать все возможные группы в одной итерации, если число возможных комбинаций уступает данному числу n. Иными словами, стадия (b) предпочтительно включает сравнение числа возможных распределений (размер указанного множества возможных распределений) с указанным максимальным числом, и если число возможных распределений превышает указанное максимальное число, итерационно попытку определить указанное оптимальное распределение пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди отборов (в частности, отборов случайным образом) указанного максимального числа возможных распределений среди множества возможных распределений.

Предпочтительно, число пептидов-кандидатов, распределенных по каждой кассете, соответствует таблице распределения, см., например, Фиг. 5. Указанная таблица также преимущественно хранится с помощью средств хранения 12 сервера 1. Как проиллюстрировано и в соответствии с таблицей Фиг. 5, если число отобранных пептидов делится на 3, каждая кассета получит одно и то же число пептидов, также будет максимум один пептид, отличный у двух кассет. Например, в случае 26 пептидов, 26≥15 таким образом, что используют 3 кассеты, с 9 пептидами в первой и второй кассетах, и 8 пептидами в третьей кассете.

Кроме того, в таблице Фиг. 5 определено число пептидов (n) каждого класса (L, М или Н), которое будет содержать каждая кассета (А, В и С), в виде функции числа пептидов, распределенных по кассете. Например, когда число пептидов равно 13, первая кассета будет экспрессировать 7 пептидов, включая 3 пептида L, 2 пептида М и 2 пептида Н; и вторая кассета будет экспрессировать 6 пептидов, включая 2 пептида L, 2 пептида М и 2 пептида Н. Глобально, как представлено в правом столбце, поксвирус будет экспрессировать 5 пептидов L, 4 пептида М и 4 пептида Н.

В более предпочтительном воплощении стадия (b) дополнительно включает расчет балльной оценки гидрофобности содержания каждой экспрессионной кассеты (также называемой «балльной оценкой гидрофобности экспрессионной кассеты» или просто «балльной оценкой гидрофобности продукта слияния») для каждой группы, и сравнение с порогом гидрофобности продукта слияния (HSK7Thresh). Предпочтительно, указанный порог гидрофобности равен или ниже 0,2, предпочтительно ниже 0,19, предпочтительно ниже 0,18, предпочтительно ниже 0,17, предпочтительно ниже 0,16 и даже более предпочтительно ниже 0,15. Примечательно, что под содержанием каждой экспрессионной кассеты, речь идет о пептиде(ах)-кандидате(ах), распределенном(ых) по кассете в данной группе. Следует понимать, что балльная оценка гидрофобности кассеты лишь определяется пептидом(ами)-кандидатом(ами), который(ые) содержит данная кассета, несмотря на их порядок (который еще не определен на данной стадии).

Если по меньшей мере одна экспрессионная кассета демонстрирует балльную оценку гидрофобности выше указанного порога, соответствующая группа не является удовлетворительной и исключается.

Если все группы исключаются:

- Если авторы изобретения работают через итерации (то есть, число возможных распределений превышает данное максимальное число), как объясняется, можно пробовать по меньшей мере одну дополнительную итерацию, иными словами, новый отбор указанного максимального числа возможных распределений среди множества возможных распределений;

- Еще, или если уже попробовано достаточно итераций (например, на третьей итерации), отдельный пептид с самой высокой балльной оценкой гидрофобности удаляют (помещают в список исключенных пептидов) и предпочтительно заменяют первым пептидом, если вообще заменяют, из второго поднабора (список дополнительных пептидов). Если список дополнительных пептидов пуст, генерацию групп проводят еще раз из списка наилучших пептидов с N-1 пептидами. Стадия (b) затем повторяется (возможно, снова через итерации).

Если по меньшей мере одна группа является удовлетворительной, выбирают распределение с самым низким диапазоном балльных оценок гидрофобности среди разных экспрессионных кассет. Под термином «диапазон» (R) подразумевается наибольшая разница между балльными оценками гидрофобности по меньшей мере двух экспрессионных кассет группы, а именно, (HSK7)_max - (HSK7)_min. Примечательно, если диапазоны действительно низкие (например, ниже порога диапазона (RThresh), как изображено Фиг. 4, обычно установленного на уровне 0,005), можно рассматривать несколько разных групп с таким «низким диапазоном», то есть существует более чем одно оптимальное распределение пептидов-кандидатов на кассету. В одном предпочтительном воплощении способ по изобретению включает определение оптимального распределения пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди множества возможных распределений, представляет наименьший диапазон между балльными оценками гидрофобности по меньшей мере двух экспрессионных кассет.

Стадия (с) способа конструирования: присвоение слотов внутри кассеты

На стадии (с), которая подробно изложена на Фиг. 7, средства обработки 11 определяют для каждой экспрессионной кассеты оптимальное присвоение слотов пептидов-кандидатов как функцию правила занятости слотов кассеты, где указанные пептиды-кандидаты распределены по экспрессионной кассете, как описано на стадии (b). Под фразой «присвоение слотов» пептидов-кандидатов в пределах кассеты подразумевается порядок пептидов в экспрессионной кассете. Иными словами, для каждого «слота» кассеты выбирается пептид среди пептидов, распределенных по данной кассете.

Под «оптимальным» присвоением слотов подразумевается, опять же, что присвоение имеет самый низкий глобальный риск неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса, критерии для достижения такого оптимального присвоения слотов будут объясняться ниже.

Риск образования трансмембранных доменов оценивается по генерации, для каждой кассеты, всех возможных комбинаций пептидов с правилом занятости слотов. Действительно наблюдали, что ТМ сегменты могут быть образованы посредством соединения 2 конкретных пептидов (межпептидные ТМ). В данном случае модификация порядка пептидов в продукте слияния является вариантом исключения наличия ТМ. Например, если сегмент ТМ происходит в результате слияния пептида 1 на N-конце пептида 2, инвертирование пептидов (слияние пептида 2 на N-конце пептида 1) может исключать риск наличия сегмента ТМ. Таким образом, данная стадия осуществляет все комбинации отдельных пептидов с образованием слитого белка.

В предпочтительном воплощении на стадии (с) определяют оптимальное присвоение слотов пептидов-кандидатов для каждой экспрессионной кассеты на основе правила занятости слотов кассеты, определяющего возможные положения слотов пептидов в пределах кассеты в соответствии с трансмембранными балльными оценками пептидов и в случае равных трансмембранных балльных оценок - в соответствии с их балльными оценками гидрофобности. Более предпочтительно, пептиды-кандидаты, распределенные по экспрессионной кассете, классифицированы в соответствии с по меньшей мере тремя классами риска неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса, где указанное правило занятости слотов кассеты определяет, для каждого из положений слотов кассеты, то, какого класса пептид-кандидат должен будет быть приписан данному положению слота.

Под «правилом занятости слота» подразумевается правило, определяющее положения слотов пептидов в пределах кассеты в соответствии с классами пептидов «Низкий» (L), «Средний» (М) или «Высокий» (Н) на основе трансмембранных балльных оценок и гидрофобности, как определено на стадии (b).

«Правило занятости слотов кассеты» является разумным путем уменьшения числа возможных комбинаций. Действительно, для кассеты с 10 пептидами имеет место 10!, то есть больше чем 3,6 миллиона, возможных присвоений слотов внутри кассеты.

Идея заключается в выборе слотов в соответствии с данными низким, средним или высоким классами, таким образом, чтобы ограничить число возможных комбинаций при минимизации общей балльной оценки ТМ. Действительно, каждый пептид имеет лишь уменьшенное число возможных слотов, со значимым снижением числа возможных комбинаций.

Фиг. 8А и 8В представляют собой две репрезентации возможности правила занятости слотов. Например, на Фиг. 8А показано, что пептиды Н предпочтительно расположены на конце продукта слияния (где отсутствует риск создания ТМ внутри кассеты) и в третьем слоте (вдали от другого пептида Н).

В соответствии с примером N=13, разработанным на стадии (b), на Фиг. 8В показано, что в первой кассете (7 пептидов), 3 пептида класса «низкий» будут расположены в слотах II, IV и VI, 2 пептида класса «средний» будут расположены в слотах I и V, и 2 пептида класса «высокий» будут расположены в слотах III и VII; и во второй кассете (6 пептидов) 2 пептида класса «низкий» будут расположены в слотах II и IV, 2 пептида класса «средний» будут расположены в слотах I и V, и 2 пептида класса «высокий» будут расположены в слотах III и VI. Примечательно, что существует только 3!х2!х2!=24 возможных комбинаций для первой кассеты (вместо 7!=5040) и 2!х2!х2!=8 возможных комбинаций для второй кассеты (вместо 6!=720). Даже в самом худшем случае 10 пептидов в кассете (первая линия) существует только 6!х2!х2!=2880 возможных комбинаций, вместо 3,6 миллионов.

В предпочтительном воплощении каждую комбинацию, полученную на стадии (с), оценивают в отношении их риска образования ТМ доменов, которые будут нарушать получение и продукцию рекомбинантного вируса. Более конкретно, данная стадия включает расчет участков ТМ для каждого продукта слияния пептидов, сравнение указанных участков ТМ с пороговым значением и исключение любого продукта слияния, который демонстрирует по меньшей мере один ТМ участок с балльной оценкой выше указанного порогового значения. Даже более конкретно, данная стадия включает расчет участков ТМ для каждого продукта слияния пептидов, сравнение указанных участков ТМ с порогом TMS продукта слияния пептидов (TMSK7) и исключение любого продукта слияния пептидов, который демонстрирует по меньшей мере один участок с балльной оценкой выше TMSK7. Предпочтительно, указанный ТМ участок равен или ниже порога TMS продукта слияния, равного 60, более предпочтительно, порога 50, с конкретным предпочтением в отношении порога 40 (например, предпочтительные участки ТМ: 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30 и т.д.).

Если все продукты слияния пептидов исключены, тогда присвоение слотов внутри кассеты нужно проводить со следующей группой пептидов, которые прошли стадию распределения между кассетами. В случае, когда не доступна другая группа, аналогично тому, что предложено для стадии (b), пептид с самой высокой индивидуальной балльной оценкой трансмембранных доменов преимущественно удаляют из списка наилучших пептидов и заменяют первым пептидом из списка дополнительных пептидов. Новый список наилучших пептидов затем повторно обрабатывают на предыдущей стадии (b). В случае, когда список дополнительных пептидов пуст, список наилучших пептидов используют с оставшимися элементами (N-1).

Если все продукты слияния пептидов удовлетворяют порогу TMSK7, рассчитывается глобальная TMS, и наилучшую комбинацию для каждого продукта слияния пептидов затем ранжируют на основе указанной глобальной TMS. В одном предпочтительном воплощении стадия (с) включает отбор продукта слияния пептидов с наиболее низкой ТМ балльной оценкой.

Стадия (d) способа конструирования: обратная трансляция В одном воплощении способ по настоящему изобретению дополнительно включает стадию так называемой «обратной трансляции» (d) определения последовательности переноса ДНК (молекула нуклеиновой кислоты), содержащей по меньшей мере одну из экспрессионных кассет, подлежащих вставке в рекомбинантный поксвирус (Фиг. 9). Предпочтительно, последовательность переноса ДНК может также включать элементы для облегчения получения рекомбинантного поксвируса (например: сайты рестрикции и/или плечо рекомбинации).

Данная функция осуществляет обратную трансляцию (от аминокислоты до нуклеотидной последовательности) каждой экспрессионной кассеты, которая кодирует слитый белок с оптимизированными кодонами и вставляет их в заранее определенный ДНК-каркас, требуемый для получения плазмиды (а именно, плазмиды переноса), которая будет использоваться для образования рекомбинантного поксвируса. Данную конечную последовательность ДНК называют «последовательностью переноса».

Результат (в частности в интерфейсе (13)) преимущественно представляет собой уникальную последовательность переноса, вписанную в файл, например, в формате FASTA, подлежащий отсылке во внешний провайдер синтеза плазмиды. Такая стадия (d) получения последовательности переноса хорошо известна специалисту и не будет обсуждаться подробно.

Стадия обратной трансляции (d) может быть индивидуально адаптирована и оптимизирована таким образом, чтобы обеспечить оптимальные ДНК-последовательности в отношении разных признаков, полезных для экспрессии одного или более продуктов слияния пептидов, и, принимая во внимание промежуточные стадии клонирования, сайт(ы) вставки в пределах генома рекомбинантного поксвируса и получение рекомбинантного поксвируса (дизайн, установленный посредством конфигурационного файла plasmidFeatures.yml).

В одном воплощении каждый продукт слияния пептидов подвергается обратной трансляции в ДНК в соответствии с «наибольшей частотой» использования кодонов и прививке в «черновую» последовательность переноса ДНК в своем ожидаемом сайте вставки. Затем файл в формате JSON записывают после обратной трансляции. Он содержит неоптимизированную последовательность переноса, координаты областей, которые нужно оптимизировать, и данная информация образует раздел «custMots» конфигурационного файла plasmiFeatures.yml. Стадию оптимизации кодонов затем осуществляют для каждой экспрессионной кассеты (например, используя инструмент GeneOptimizer™; ThermoFisher). Оптимизированные последовательности затем импортируют обратно в работающие директории и повторно прививают в каркас последовательности переноса. Данную стадию проводят с помощью сценария TSAssembler.sh, который запустит функцию TransferSeqAssembler для данного PMY ID.

Помимо оптимизированных признаков кодонов данный файл также содержит информацию по способу оптимизации последовательности в разделе «custMots» (custom Motives). Оптимизацию также можно проводить посредством подавления кластеров редких, неоптимальных кодонов, находящихся в концентрированных областях, и/или «негативных» элементов последовательности, которые, как ожидают, отрицательно влияют на уровни экспрессии. Такие негативные элементы последовательности включают, без ограничения, области, имеющие очень высокое (больше 80%) или очень низкое (меньше 30%) содержание GC; АТ-богатые или GC-богатые участки последовательности; последовательности нестабильных прямых или инвертированных повторов; внутренние криптические регуляторные элементы (такие как внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты, участки посадки рибосомы и/или донорные/акцепторные сайты сплайсинга) и/или последовательности 5TNT (TTTTT{N}T).

В еще одном воплощении файл также включает регуляторные элементы, подходящие для оптимальной экспрессии продукта(ов) слияния пептидов, в частности, промотор и полиА для создания функциональной(ых) экспрессионной(ых) кассеты(ет), как описано в данном документе.

В еще одном воплощении файл может также включать в последовательность переноса ДНК дополнительные элементы, полезные для последующего клонирования такого переноса ДНК и образования рекомбинантного поксвируса, описанного в данном документе. Желательно, такие дополнительные элементы включают соответствующие сайты рестрикции для обеспечения последующих стадий клонирования. Желательно, такие сайты рестрикции расположены на 5' и 3' каждой экспрессионной кассеты и/или последовательности переноса ДНК. Предпочтительно, такие сайты рестрикции предпочтительно не представлены в пределах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт слияния пептидов.

В еще одном воплощении файл может также включать в последовательность переноса ДНК плечи рекомбинации, адаптированные под выбранный сайт вставки в геноме поксвируса. Предпочтительно, два плеча рекомбинации, соответствующие участкам последовательностей поксвируса, гомологичным (например, идентичны на 90-100%) последовательностям, находящимся в исходном геноме на обеих сторонах сайта вставки, вставлены в 5' и 3' последовательности переноса ДНК одной или более экспрессионных кассет. Длина плечей рекомбинации может варьировать. Желательно, каждое из плечей рекомбинации содержит по меньшей мере 150 п.н., предпочтительно по меньшей мере 200 п.н., более предпочтительно по меньшей мере 300 п.н., даже более предпочтительно от 300 до 600 п.н. с конкретным предпочтением в отношении 350-500 п.н. (например, приблизительно 350 п.н. или 500 п.н.) или в отношении 300-400 п.н. гомологичных последовательностей поксвируса.

В предпочтительном воплощении изобретения способ конструирования рекомбинантного поксвируса, причем указанный рекомбинантный поксвирус содержит одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии продукта слияния одного или множества пептидов, включает осуществление, посредством средств обработки (11) сервера (1), следующих стадий:

(a) отбор первого поднабора пептидов-кандидатов, где указанные пептиды демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога TMS;

(b) определение оптимального распределения пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди множества возможных распределений, где указанное оптимальное распределение представляет, если существуют по меньшей мере две экспрессионные кассеты, наименьший диапазон между балльными оценками гидрофобности по меньшей мере двух экспрессионных кассет;

(c) для каждой экспрессионной кассеты определение оптимального присвоения слотов пептидов-кандидатов как функции правила занятости слотов кассеты и отбор продукта слияния пептидов с самой низкой ТМ балльной оценкой;

(d) определение последовательности переноса ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность одной или более экспрессионных кассет для получения указанного рекомбинантного поксвируса.

Получение рекомбинантного поксвируса

Во втором аспекте изобретение также описывает способ получения рекомбинантного поксвируса, описанного в данном документе. Данный второй способ включает осуществление способа согласно первому аспекту для конструирования указанного рекомбинантного поксвируса и затем получения указанного рекомбинантного поксвируса (как сконструировано).

Обычно такая стадия получения рекомбинантного поксвируса включает получение плазмиды переноса ДНК, содержащей последовательность переноса ДНК, полученную на стадии (d) первого процесса, и получение рекомбинантного поксвируса, экспрессирующего пептид, возможно с изготовлением указанного рекомбинантного поксвируса.

Общие условия для конструирования рекомбинантных поксвирусов хорошо известны в данной области (см., например, WO2018/234506, WO2007/147528; WO2010/130753; WO03/008533; США 6998252; США 5972597 и США 6440422). Обычно, последовательность переноса ДНК клонируют в плазмиду переноса, и получают рекомбинантный поксвирус посредством гомологичной рекомбинации между указанной плазмидой переноса, содержащей экспрессионную(ые) кассету(ы), экспрессирующую пептид, фланкированную(ые) в 5' и 3', с плечами рекомбинации, адаптированными под сайт вставки в пределах генома вируса. В одном воплощении указанный способ включает стадию получения указанной плазмиды переноса (например, общепринятыми способами молекулярной биологии) и стадию введения указанной плазмиды переноса в подходящую клетку-хозяина, главным образом вместе с геномом поксвируса (а именно, исходного вируса). Гомологичную рекомбинацию, позволяющую получать модифицированный поксвирус, предпочтительно осуществляют в соответствующих клетках-хозяевах (например, клетки HeLa или CEF). Предпочтительно, плазмида переноса линеаризована перед трансфекцией в клетку-хозяина, и исходный вирус предпочтительно вводят посредством инфицирования.

Исходный поксвирус может представлять собой поксвирус дикого типа или модифицированный поксвирус (например, ослабленный), как описано выше в связи с термином «поксвирус». Затем проводят вставку посредством гомологичной рекомбинации между участком гомологичных последовательностей, обе из которых представлены в исходном геноме, и линеаризованной плазмидой переноса, требующей трансфекции пермиссивных клеток линеаризованной плазмидой переноса, и инфицирования исходным поксвирусом.

Последовательность переноса ДНК, получаемая на стадии (d), может быть независимо вставлена в любом положении генома поксвируса. Можно рассматривать разные сайты вставки, например, в заменимом вирусном гене, в межгенной области или в некодирующем фрагменте генома поксвируса. В случае онколитического вируса осповакцины, J2R локус (кодирующий TK) является особенно подходящим в контексте изобретения, и плечи рекомбинации конструируют с удалением, по меньшей мере частично, локуса J2R при вставке последовательности переноса ДНК в геном поксвируса, приводя к получению рекомбинантного поксвируса, дефектного в отношении TK. Дополнительно или независимо от вставки TK можно также рассматривать вставку в пределах локуса I4L (кодирующего RR), приводящую к получению рекомбинантного поксвируса, дефектного в отношении RR, с использованием соответствующих плечей рекомбинации. В случае MVA (от англ. Modified Vaccinia Ankara модифицированный вирус осповакцины Анкара), делеция III и/или делеция II в частности адаптированы к вставке оной или более экспрессионных кассет. В контексте изобретения можно рассматривать вставку одной или более экспрессионных кассет в один и тот же сайт вставки в пределах поксвирусного генома или в пределах разных сайтов (например, TK и RR в случае вируса осповакцины WR или Copenhagen, или делеции II и III в случае MVA).

В некоторых воплощениях идентификация рекомбинантного поксвируса может быть облегчена использованием селективного гена и/или выявляемого гена. В предпочтительных воплощениях плазмида переноса дополнительно включает селективный маркер с конкретным предпочтением в отношении гена GPT (кодирующего гуанинфосфорибозилтрансферазу), делающего возможным рост в селективной среде (например, в присутствии микофеноловой кислоты, ксантина и гипоксантина).

В некоторых воплощениях стадия получения рекомбинантного поксвируса охватывает применение исходного поксвируса, содержащего репортерный ген, кодирующий продукт гена, поддающегося выявлению, и, главным образом, флуоресцентный репортерный ген, клонированный в сайте вставки, который выбран для кассеты(ет), экспрессирующей(их) пептид. Предпочтительно, репортерный ген помещен под транскрипционным контролем промотора, что обеспечивает его экспрессию в пермиссивных клетках, например, промотора осповакцины. Данное воплощение облегчает селекцию рекомбинантного поксвируса относительно исходного поксвируса. Репрезентативные примеры флуоресцентных репортеров, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают, без ограничения, GFP (от англ. Green Fluorescent Protein - зеленый флуоресцентный белок), eGFP (от англ. Enhanced Green Fluorescent Protein - усиленный зеленый флуоресцентный белок), флуоресцентный белок AmCyan 1 и mCherry. Например, исходя из mCherry (мономерный флуоресцентный белок, который происходит из гриба Discosoma с пиком поглощения/эмиссии при 587 нм и 610 нм), рекомбинантные вирусы, имеющие вставленную(ые) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, или экспрессионную(ые) кассету(ы) вместо mCherry-кодирующих последовательностей, будут вызывать появление белых бляшек, тогда как исходные вирусы, несущие экспрессионную кассету mCherry, будут вызывать появление красных бляшек. Выбор рекомбинантного поксвируса может быть осуществлен посредством прямой визуализации (белые бляшки в случае рекомбинантных поксвирусов, тогда как исходные вирусы проявляются красными) или может быть также облегчен посредством средств сортировки, таких как FACS (от англ. fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией) после мечения антителом против вируса осповакцины, меченным АРС (от англ. allophycocyanin - аллофи ко цианин). Огромное число антител против осповакцины доступно из коммерческих источников.

Стадия получения рекомбинантного поксвируса может включать дополнительную стадию расщепления эндонуклеазой, способной образовывать по меньшей мере один разрыв двойной цепи в нуклеотидной последовательности репортера (например, mCherry), но на которой указанная эндонуклеаза не расщепляет геном поксвируса. Указанная эндонуклеаза может быть в виде белка или экспрессироваться экспрессионным вектором. Подходящая эндонуклеаза предпочтительно выбрана из группы, состоящей из нуклеаз цинкового пальца (ZFN - от англ. zinc finger nuclease), нуклеаз на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN - от англ. transcription activator-like effector nuclease), кластеризованных регулярных промежуточных коротких палиндромных повторов (CRISPR - от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas9 нуклеаз и рестриктаз с одним сайтом расщепления в пределах флуоресцентного репортерного гена. Применение системы CRISPR/CAS9 для редактирования вируса описано в данной области (Yuan et al., 2015, J. Virol 89, 5176-9; Yuan et al., 2016, Viruses 8, 72, doi:10.3390), требующее применения плазмиды, кодирующей Cas9, без сигнала ядерной локализации, а также подходящую направляющую РНК. В данном рассмотрении, в дополнение к инфицированию исходным вирусом, пермиссивные клетки могут быть трансфицированы плазмидой переноса, плазмидой, экспрессирующей Cas9, и одной или более плазмидами, кодирующими направляющую РНК (например, направляющую РНК, нацеленную на mCherry).

Отбор рекомбинантных поксвирусов затем проводят визуально (прямое выделение белых бляшек, соответствующих в теории рекомбинантным поксвирусам, тогда как окрашенные бляшки соответствуют исходному вирусу; цвет зависит от репортерного гена) или используя традиционные средства сортировки (FACS возможна после стадии мечения соответствующими антителами, как описано выше).

Обычно, с общепринятыми методиками без какого-либо способа конструирования, получают низкий процент белых бляшек (примерно 1%), и примерно один рекомбинантный поксвирус получают на 50 - 100 исходных вирусов (примерно 1% - 2%), тогда как способ по настоящему изобретению позволяет увеличить получение рекомбинантного поксвируса, как видно из увеличения наличия белых бляшек и увеличения числа рекомбинантных поксвирусов. Желательно, указанный способ получения рекомбинантных поксвирусов позволяет достигать выхода по меньшей мере 2%, предпочтительно по меньшей мере 3%, более предпочтительно по меньшей мере 4% белых бляшек и по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно 70% и даже более предпочтительно по меньшей мере 80% рекомбинантных поксвирусов.

Рекомбинантный поксвирус может быть затем идентифицирован посредством стадии анализа белых бляшек, образованных таким образом (предпочтительно, анализ посредством ПЦР), для подтверждения вставки экспрессионной(ых) кассеты(ет) в геном поксвируса.

Изготовление рекомбинантного поксвируса

Сразу после получения способом по настоящему изобретению рекомбинантный поксвирус может быть продуцирован/амплифицирован с использованием общепринятых методик. Таким образом, способ по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию изготовления указанного рекомбинантного поксвируса. В одном предпочтительном воплощении указанная стадия изготовления включает стадию амплификации в подходящей клетке-продуценте до подходящего масштаба, стадию выделения образованного рекомбинантного поксвируса из клеточной культуры и возможную стадию очистки выделенного рекомбинантного поксвируса. Такие стадии являются общепринятыми в данной области (см., например, WO2007/147528 или WO2018/234506).

Кратко, стадия амплификации включает культивирование клетки-хозяина-продуцента (например, пермиссивной), инфицирование культивируемых клеток-хозяев-продуцентов и культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях, таким образом, чтобы обеспечить продукцию рекомбинантного поксвируса (например, инфекционные вирусные частицы). Выбор клетки-продуцента зависит от типа рекомбинантного поксвируса, подлежащего амплификации. MVA строго ограничен хозяином и обычно амплифицируется на клетках птиц, или первичных клетках птиц (таких как фибробласты куриного эмбриона (CEF - от англ. chicken embryo fibroblast), полученных из эмбрионов курицы, полученных из оплодотворенных яиц), или иммортализованной линии клеток птицы, например, с геном TERT утки (см., например, WO2007/077256, WO2009/004016, WO2010/130756 и WO2012/001075); или получены из эмбриональных клеток посредством прогрессивного отделения от факторов роста и питающего слоя (например, Eb66, описанный в Olivier et al., 2010, mAbs 2(4): 405-15). Для другого вируса осповакцины или других штаммов поксвируса, помимо первичных клеток птиц (как например, CEF) и клеточных линий птиц, многие другие клеточные линии, не являющиеся птичьими, доступны для продукции, включая клеточные линии человека, такие как клетки HeLa (ATCC-CRM-CCL-2™ или АТСС-CCL-2.2™) (см., например, WO2010/130753).

Клетки-продуценты предпочтительно культивируют в среде, не содержащей продукты, происходящие из животного или человека, с использованием химически определенной среды без продукта животного или человеческого происхождения. Такие среды имеются в продаже (например, среда VP-SFM (Invitrogen) является подходящей для культивирования CEF). Клетки-продуценты предпочтительно культивируют при температуре, составляющей от 30°С до 38°С (более предпочтительно при примерно 37°С) в течение 1 - 8 суток (предпочтительно, в течение 1-5 суток в случае CEF и 2-7 суток в случае иммортализованных клеток) перед инфицированием.

Инфицирование клеток-продуцентов рекомбинантным поксвирусом осуществляют в соответствующих условиях (например, соответствующая множественность заражения (MOI - от англ. multiplicity of infection)) для обеспечения продуктивного инфицирования клеток-продуцентов. Подходящая MOI, подлежащая использованию для амплификации поксвирусов, типично составляет от 0,001 до 1 (более предпочтительно примерно 0,05). Стадию инфицирования можно проводить в среде, которая может быть такой же, как или отличаться от среды, используемой для культивирования клеток-продуцентов.

Инфицированные клетки-продуценты затем культивируют в соответствующих условиях, хорошо известных специалистам в данной области, до получения вирусного вектора потомства (например, инфекционные вирусные частицы). Культивирование инфицированных клеток-продуцентов также предпочтительно проводят в среде, которая может быть так такой же, как или отличаться от среды, используемой для культивирования клеток-продуцентов и/или для стадии инфицирования, предпочтительно при температуре от 30°С до 37°С, в течение 1 - 5 суток.

Поксвирусные частицы можно собирать из супернатанта культуры и/или клеток-продуцентов. Супернатант клеточной культуры и клетки-продуценты можно объединять или собирать по отдельности. Выделение из клеток-продуцентов может требовать стадию, делающую возможным разрушение мембраны клетки-продуцента для обеспечения высвобождения вируса. Разные методики доступны специалистам в данной области, включая замораживание/оттаивание, гипотонический лизис, обработку ультразвуком, микрофлюидизацию или высокоскоростную гомогенизацию, с предпочтением в отношении последней (например, с использованием SILVERSON L4R), но, не ограничиваясь ими.

Затем поксвирусные частицы можно дополнительно очищать, используя стадии очистки, хорошо известные в данной области. Могут быть предусмотрены разные стадии очистки, включая осветление, ферментативную обработку (например, эндонуклеазой, протеазой и т.д.), хроматографические стадии и стадии фильтрации. Соответствующие способы описаны в данной области (например, WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).

В одном предпочтительном воплощении указанная стадия изготовления достигает продукции по меньшей мере 10⁹ БОЕ (бляшкообразующая единица), желательно по меньшей мере 5×10⁹ БОЕ и предпочтительно приблизительно 10¹⁰ БОЕ или более в случае рекомбинантного поксвируса, подлежащего распределению в подходящих дозах для тестирования и лечения пациента.

«Вооруженный» рекомбинантный поксвирус

Определенные воплощения данного изобретения также охватывают рекомбинантные поксвирусы, которые помимо экспрессионной(ых) кассеты(ет), кодирующей(их) пептиды, включают дополнительный(ые) терапевтический(ие) ген(ы), вставленный(ые) в геном вируса. Может быть предусмотрено огромное число терапевтических генов, особенно генов, кодирующих полипептиды, способные усиливать противоопухолевую эффективность вируса или повторно усиливать иммунитет хозяина. Предпочтительные терапевтические гены выбраны из группы, состоящей из генов самоубийства (генов, кодирующих белок, способный превращать предшественник лекарственного средства в цитотоксическое лекарственное средство), и иммуностимулирующих генов (терапевтических генов, которые кодируют полипептиды, способные стимулировать иммунную систему или эффекторные клетки специфичным или неспецифичным образом).

Композиция рекомбинантного поксвируса

Согласно третьему аспекту изобретения предложена композиция, содержащая рекомбинантный поксвирус, полученный с использованием способа согласно второму аспекту изобретения, содержащий одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии продукта слияния множества пептидов (например, неопептидов), описанных в данном документе.

В одном воплощении композиция по третьему аспекту настоящего изобретения находится в виде фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный поксвирус, описанный в данном документе (или полученный согласно способу, описанному в данном документе), и фармацевтически приемлемый носитель. В предпочтительном воплощении композиция содержит терапевтически эффективное количество указанного рекомбинантного поксвируса.

Предполагают, что термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает всевозможные носители, растворители, разбавители, вспомогательные вещества, адъюванты, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, поглотители и тому подобное, совместимые с введением субъектам, являющимся млекопитающими и, в частности, человеком.

«Терапевтически эффективное количество» соответствует количеству рекомбинантного поксвируса, требуемому для того, чтобы вызвать у субъекта, подвергающегося лечению в соответствии с настоящим изобретением, наблюдаемое улучшение его клинического статуса, включая, по меньшей мере одно из количеств, упомянутых в данном документе.

Такое терапевтически эффективное количество может варьировать, в зависимости от множества факторов, включая характеристики поксвируса (включая тип вируса, биодоступность и дозы), тяжесть и течение болезни (стадия рака, например), сам субъект (включая возраст, пол, историю болезни, общее физическое состояние и т.д.), природу фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества в композиции вируса и методы лечения (путь введения, частота введения, тип сопутствующего лекарственного средства и т.п.), но, не ограничиваясь ими. Соответствующая дозировка поксвируса может быть рутинно определена и адаптирована практиком в контексте релевантных обстоятельств, например, посредством осуществления контроля над ответом субъекта на введение вируса и осуществления регуляции дозировки соответствующим образом (для дополнительных указаний, см. Remington, The Science and Practice of Pharmacy; Gennaro ed., Pharmaceutical Press, London, UK; например, 22oe издание или последующие издания).

В иллюстративных целях подходящее терапевтически эффективное количество для индивидуальных доз может варьировать от приблизительно 10⁵ до приблизительно 10¹³ vp (от англ. viral particle - вирусная частица), iu (от англ. infectious unit - инфекционная единица) или БОЕ (бляшкообразующие единицы) в зависимости от поксвируса и используемой количественной методики. Как правило, индивидуальные дозы от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ являются особенно подходящими в контексте настоящего изобретения, более предпочтительно от приблизительно 5×10⁶ БОЕ до приблизительно 5×10⁹ БОЕ; даже более предпочтительно дозы от приблизительно 10⁷ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ, с предпочтением в отношении индивидуальных доз, содержащих приблизительно 5×10⁷ или 10⁸ БОЕ рекомбинантного поксвируса. Индивидуальные дозы могут быть уменьшены в 2 - 20 раз в случае местного(ых) введения(ий), такого как внутриопухолевая инъекция. Количество вируса, находящееся в образце, можно определять посредством рутинных методик титрования, например, посредством подсчета числа бляшек после инфицирования пермиссивных клеток (например, BHK-21 или CEF), иммуноокрашивания (например, используя антитела против вируса), посредством измерения поглощения при А260 (титры vp), посредством количественной и мму но флуоресценции (титры iu) или посредством кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) с использованием специфичных вирусных праймеров и зондов.

Разные композиции могут быть предусмотрены в контексте изобретения, или жидкие или лиофилизированные, для обеспечения стабильности вируса в условиях изготовления и длительного хранения (то есть по меньшей мере 6 месяцев) при температуре замораживания (например, -70°С, -20°С), охлаждения (например, 4°С) или окружающей среды (например, 20-25°С). Рекомбинантный поксвирус преимущественно помещают в разбавитель, подходящий для применения для человека или животного. Репрезентативные примеры подходящего разбавителя включают стерильную воду, физиологический раствор (например, хлорид натрия), раствор Рингера, растворы глюкозы, трегалозы или сахарозы, раствор Ханка и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы.

Желательно, композиция поксвируса подходящим образом буферизована для применения для человека. Буферы, такие как TRIS (от англ. tris(hydroxymethyl)methylamine - трис(гидроксиметил)метиламин), TRIS-HCl (от англ. tris(hydroxymethyl)methylamine-HCl - трис(гидроксиметил)метиламин-HCl), фосфатный буфер (например, PBS (от англ. Phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор); смесь Na₂HPO₄ и KH₂PO₄; смесь Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄), и бикарбонатные буферы в частности подходят для поддержания физиологического или слабо основного рН (например, от приблизительно рН 7 до приблизительно рН 9). Буфер (например, TRIS-HCl) предпочтительно находится в концентрации 10 - 50 мМ.

Могло бы быть полезным также включать одновалентную соль таким образом, чтобы обеспечить соответствующее осмотическое давление. Указанная одновалентная соль может быть главным образом выбрана из NaCl и KCl, предпочтительно указанная одновалентная соль представляет собой NaCl, в частности, в концентрации 10 - 500 мМ.

При необходимости, композиция может также включать криопротектор таким образом, чтобы облегчить хранение при низкой температуре. Подходящие криопротекторы включают без ограничения сахарозу, трегалозу, мальтозу, лактозу, маннит, сорбит и глицерин, например, в концентрации, варьирующей от 0,5 до 20% (масса в г/объем в л, называемая масс./об.) и предпочтительно от 5 до 15% (масс./об.), с предпочтением в отношении примерно 10%. Наличие высокомолекулярных полимеров, таких как декстран или поливинилпирролидон (ПВП), в частности, подходит для лиофилизированных композиций для защиты рекомбинантного поксвируса во время стадий вакуумной сушки и лиофилизации (см., например, WO2014/053571).

В иллюстративных целях буферизованные композиции, включающие NaCl и/или сахар, в частности адаптированы к сохранению поксвирусов (например, Tris 10 мМ рН 8 с сахарозой 5% (масс./об.), глутамат натрия 10 мМ и NaCl 50 мМ; или фосфатно-солевой буферный раствор с глицерином (10%) и NaCl), а также композиции, описанные в WO2016/087457.

Терапевтические применения и способ лечения

Рекомбинантный поксвирус или его композиция, описанная в данном документе и полученная способом согласно настоящему изобретению, особенно подходят для применения в терапевтических целях (в качестве терапевтической вакцины). Такое применение охватывает профилактические и/или терапевтические цели. Обычно, «профилактика» включает подход к предупреждению, ингибированию, уменьшению вероятности или замедлению начала заболевания или патологического состояния (например, гиперпролиферативного (рак) или инфекционного заболевания), где терапия относится к подходу к получению полезных или желательных результатов, включая клинические результаты.

О полезных эффектах, обеспеченных рекомбинантным поксвирусом или его композицией, описанными в данном документе, может свидетельствовать наблюдаемое улучшение клинического состояния, по сравнению с исходным состоянием или по сравнению с ожидаемым состоянием при отсутствии лечения согласно способам, описанным в данном документе. Улучшение клинического состояния может быть легко оценено любым релевантным клиническим измерением, обычно используемым лечащими врачами или другим квалифицированным медицинским персоналом. В целях изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются одним или более из следующих результатов: облегчение одного или более симптомов, являющихся результатом заболевания, уменьшение степени заболевания, стабилизация заболевания (например, предупреждение или задержка прогрессирования заболевания, уменьшение размера опухоли и т.д.), предупреждение или задержка распространения (например, метастазы) заболевания, предупреждение или задержка рецидива заболевания, снижение риска рецидива, обеспечение ремиссии (частичной или полной) заболевания, уменьшение тяжести заболевания, уменьшение дозы одного или более других лекарственных средств, требуемых для лечения данного заболевания, повышение качества жизни и/или продление выживаемости.

Соответствующие измерения проводят рутинно в медицинских лабораториях и больницах, доступных для оценки клинической пользы, как например, анализы крови, анализ биологических жидкостей и биопсий, а также медицинские методики визуализации, и большое количество наборов имеется в продаже. Они могут быть выполнены перед введением (исходный уровень) и в разные моменты времени во время лечения и после прекращения лечения.

В контексте изобретения полезные или желательные клинические результаты могут быть временными (на протяжении одного или пары месяцев после прекращения введения) или продолжительными (на протяжении нескольких месяцев или лет). Поскольку естественное развитие кинического состояния может значительно варьировать от одного субъекта к другому, не требуется, чтобы полезное терапевтическое действие наблюдалось у каждого субъекта, подвергающегося лечению, но у значимого числа субъектов (например, статистически значимые различия между двумя группами можно определять любым статистическим тестом, известным в данной области, таким как параметрический критерий Тьюки, критерий Крускала-Уоллиса, U-критерий Манна - Уитни, t-критерий Стьюдента, критерий Уилкоксона и т.д.).

В одном предпочтительном воплощении рекомбинантный поксвирус или его композиция предназначены для применения для лечения гиперпролиферативного заболевания. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «гиперпролиферативное заболевание» включает патологическую пролиферацию клеток и распространение, включая раковые заболевания и некоторые сердечнососудистые заболевания (например, рестеноз, который происходит в результате пролиферации гладкомышечных клеток стенки кровеносных сосудов и т.д.). В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «рак» может быть использован взаимозаменяемо с любым из терминов «опухоль», «злокачественность», «неоплазма» и охватывает любое заболевание или патологическое состояние, происходящее в результате неконтролируемого роста и распространения клеток. Подразумевается, что данные термины включают любой тип ткани, органа или клетки, любую стадию злокачественности (например, от предварительного поражения до стадии IV). Обычно, опухоли, особенно злокачественные опухоли, демонстрируют частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации, по сравнению с нормальной тканью, и обычно демонстрируют склонность к проникновению в окружающие ткани (распространение) и/или метастазированию в более дальние участки.

В частности, согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный поксвирус или его композиция для применения для лечения рака или предупреждения его рецидива у субъекта. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному поксвирусу или его композиции для изготовления лекарственного средства для лечения рака или предупреждения его рецидива. Настоящее изобретение также относится к способу лечения, включающему введение рекомбинантного поксвируса, полученного с использованием способа согласно второму аспекту изобретения, или его композиции у субъекта, нуждающегося в этом, в количестве, достаточном для лечения рака или предупреждения его рецидива у указанного субъекта.

В особенно предпочтительном воплощении настоящее изобретение осуществляют для конструирования и получения рекомбинантного поксвируса или композиции для использования в качестве персонализированной противораковой вакцины. Термин «персонализированная», как применяется в данном документе, относится или к индивидуальному уровню (конкретный субъект) или субпопуляционному уровню (маленькая группа людей, имеющих общий признак, например, имеющих конкретное заболевание, конкретный фенотипический признак, или принимающих такое же лекарственное средство или демонстрирующих такой же дефицит, например, в иммунной системе). В частности, соответствующие рекомбинантные поксвирусы в данном контексте будут сконструированы способом, описанным в данном документе, чтобы содержать одну или более экспрессионных кассет, например, для экспрессии продукта слияния множества неопептидов, как описано в разделе Примеры.

Репрезентативные примеры раковых заболеваний, которые можно лечить в контексте настоящего изобретения, включают рак кости, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак толстой кишки, рак пищевода, рак ротоглотки, рак легкого, рак головы или шеи, рак кожи, меланому, рак матки, рак шейки матки, рак яичника, рак молочной железы, рак прямой кишки, рак анальной области, рак предстательной железы, лимфому, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, саркому мягкой ткани, хронический или острый лейкоз, рак мочевого пузыря, рак почки, неоплазму центральной нервной системы (ЦНС), глиому и т.д. Настоящее изобретение в частности подходит для лечения солидных опухолей. В частности, оно также полезно для лечения распространенных раковых заболеваний, включая метастатические раковые заболевания, включая метастатические солидные раковые заболеваний или раковые заболеваний, ассоциированные с высоким риском рецидива. Предпочтительные раковые заболевания для лечения в соответствии со способами, описанными в данном документе, включают рак головного мозга, такой как, например, астроцитома, эмбриональные опухоли, герминогенные опухоли, атипичная тератоидно-рабдоидная опухоль центральной нервной системы, краниофарингиома, эпендимома, глиома и глиобластома, а также рак головы и шеи. Другой тип раковых заболеваний для лечения в соответствии со способами, описанными в данном документе, представляет собой рак яичника, а также раковые заболевания легкого, и, в частности, NSCLC с конкретным предпочтением в отношении аденокарциномы, плоскоклеточной карциномы и крупно клеточной карциномы.

Например, полезные или желательные клинические результаты могут коррелировать с одним или более из нижеследующего: ингибирование или замедление роста опухоли, пролиферации и метастазирования, предупреждение или задержка распространения опухоли (распространение опухолевых клеток в соседние ткани), уменьшение числа опухолевых очаговых поражений; уменьшение размера опухоли, уменьшение числа или степени метастазов, обеспечение пролонгированной общей выживаемости (OS), увеличение выживаемости без прогрессирования (PFS - от англ. progression free survival), увеличение продолжительности ремиссии, стабилизация (то есть отсутствие ухудшения) состояния заболевания, предупреждение рецидива заболевания, обеспечение лучшего ответа на другое лечение, улучшение качества жизни и/или индукция противопухолевого ответа (например, неспецифичный (врожденный) и/или специфичный, как например, цитотоксический Т-клеточный ответ) у субъекта, подвергающегося лечению в соответствии с настоящим изобретением.

В еще одном воплощении рекомбинантный поксвирус или его комбинация предназначен для применения для лечения инфекционных заболеваний. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «инфекционное заболевание» относится к заболеванию, являющемуся результатом инфицирования патогенным организмом (например, бактериями, паразитом, вирусом, грибом и т.д.). Настоящее изобретение также относится к способу лечения, включающему введение рекомбинантного поксвируса, полученного с использованием способа по второму аспекту изобретения, или его композиции субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, достаточном для лечения инфекционного заболевания или предупреждения его рецидива у указанного субъекта.

Репрезентативные примеры инфекционных заболеваний, которые можно лечить в контексте настоящего изобретения, включают хроническую инфекцию HBV (от англ. hepatitis В virus - вирус гепатита В) и инфекцию HPV (от англ. human papillomavirus - вирус папилломы человека). В частности, соответствующие рекомбинантные поксвирусы в данном контексте будут сконструированы и получены способом, описанным в данном документе, для того, чтобы содержать одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии продукта слияния множества иммуногенных пептидов, полученных из патогенного организма. Когда способ нацелен на лечение инфекционного заболевания, о терапевтической пользе может свидетельствовать, например, уменьшение количества инфицирующего патогенного организма, количественно оцениваемого в крови, плазме или сыворотках субъекта, подвергающегося лечению, и/или стабилизированное (отсутствие ухудшения) состояние инфекционного заболевания (например, стабилизация воспалительного статуса), и/или уменьшение уровня специфичных маркеров сыворотки (например, уменьшение аланинаминотрансферазы (АЛТ) и/или аспартатаминотрансферазы (ACT), ассоциированное с плохим состоянием печени, обычно наблюдаемым при хроническом гепатите В или С), уменьшение уровня любого антигена, ассоциированного с возникновением инфекционного заболевания и/или появлением модификации уровня антител к патогенному организму, и/или высвобождение сигналов иммунными клетками (например, цитокинов) и/или улучшенный ответ субъекта, проходящего лечение, на традиционные терапии (например, антибиотики, аналоги нуклеозидов и т.д.) и/или продление периода выживаемости, по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии получения комбинированного лечения.

Введение рекомбинантного поксвируса или его композиции Любые из традиционных путей введения применимы с предпочтением в отношении парентеральных путей. Парентеральные пути предназначены для введения в виде инъекции или инфузии и охватывают системные, а также местные пути. Особенно подходящие пути введения включают, без ограничения, внутривенные (в вену), внутрисосудистые (в кровеносный сосуд), внутриартериальные (в артерию), внутридермальные (в дерму), подкожные (под кожу), внутримышечные (в мышцу), внутрибрюшинные (в брюшную полость), внутримозговые (в головной мозг) и внутриопухолевые (в опухоль или ее близкое окружение) пути, а также скарификацию. Инфузии обычно делают внутривенным путем или внутриопухолевым (в большую опухоль). Введения в слизистые оболочки также рассматриваются настоящим изобретением и включают, без ограничения, пероральный/алиментарный, интраназальный, внутритрахеальный, носоглоточный, внутрилегочный, внутривагинальный или ректальный путь. Местные пути введения, применяемые непосредственно на коже или поверхности тканей (например, глазные капли, ушные кали и т.д.). Ингаляция также может быть предусмотрена, особенно когда опухоль, подлежащая лечению, находится в дыхательных путях и легких. Рекомбинантный поксвирус или его композицию предпочтительно вводят пациенту посредством внутривенной, подкожной, внутримышечной или внутриопухолевой инъекций.

При введениях могут использоваться стандартные иглы и шприцы или любое устройство, доступное в данной области, способное облегчать или улучшать доставку, включая, например, катетеры, электрический шприц, иглы для инъекций Quadrafuse, безыгольные устройства для инъекций (например, устройство Biojector ТМ), инфузионные насосы, спреи и т.д. Электропорацию можно также осуществлять для облегчения внутримышечного введения. Местное введение также можно проводить, используя чрескожные средства (например, пластырь, микроиглы и т.п.).

Рекомбинантный поксвирус можно вводить в однократной дозе или более желательно в многократных дозах на протяжении длительного периода времени. В контексте настоящего изобретения возможно продолжать посредством повторяющихся циклов введений, которые повторяются после периода перерыва. Интервалы между каждым введением поксвируса могут составлять от нескольких часов до 6 месяцев (например, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 1 неделя, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца и т.д.). Интервалы могут также быть регулярными или нет (например, 1 введение в неделю для 6 введений, затем 1 введение каждые 3 недели для 1-14 введений). Дозы могут варьировать для каждого введения в пределах интервала, описанного выше. В иллюстративных целях предпочтительная терапевтическая схема включает от одного до 40 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40) введений от 5×10⁶ до 5×10⁹ БОЕ рекомбинантного MVA с приблизительно 1- или 3-х недельным интервалом до тех пор, пока не будет наблюдаться клиническая польза, и затем каждые 1 - 6 месяцев.

Комбинированные терапии

В еще одних воплощениях способа и терапевтических применениях, описанных в данном документе, рекомбинантный поксвирус или его композиция могут быть введены совместно с одной или более дополнительными противораковыми терапиями, которые обладают полезностью в лечении упомянутых выше раковых заболеваний. В частности, дополнительная(ые) противораковая(ые) терапия/ии выбрана(ы) из группы, состоящей из хирургического вмешательства, лучевой терапии, химиотерапии, криотерапии, гормональной терапии, токсинотерапии, иммунотерапии и цитокинотерапии. Такую(ие) дополнительную(ые) противораковую(ые) терапию(и) вводят субъекту в соответствии со стандартной практикой до, после, по существу одновременно или попеременно с рекомбинантным поксвирусом или его композицией.

В конкретных воплощениях способ или применение согласно изобретению можно осуществлять совместно с хирургическим вмешательством. Например, композиция рекомбинантного поксвируса может быть введена после частичной или полной хирургической резекции опухоли (например, посредство местного нанесения в пределах удаленной зоны, например).

В других воплощениях рекомбинантный поксвирус или его композицию можно использовать совместно с лучевой терапией. Специалисты в данной области могут легко приготовить соответствующие протоколы и параметры лучевой терапии (см., например, Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co; с использованием соответствующих адаптаций и модификаций, как будет сразу очевидно специалистам в данной области). Типы облучения, которые можно использовать в лечении рака, хорошо известны в данной области и включают пучки электронов, высокоэнергетические фотоны из линейного ускорителя или из радиоактивных источников, таких как кобальт или цезий, протоны и нейтроны. Диапазоны дозировок для радиоизотопов варьируют широко и зависят от периода полураспада изотопа, силы и типа испускаемого излучения и поглощения неопластическими клетками. Большие дозы рентгеновских лучей для продолжительных периодов времени (3 - 6 недель), или высокие однократные дозы рассматриваются настоящим изобретением.

В некоторых воплощениях изобретения рекомбинантный поксвирус или его композицию можно использовать совместно с химиотерапией, в настоящее время доступной для лечения рака. Репрезентативные примеры подходящих химиотерапевтических агентов включают, без ограничения, алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы II, ингибиторы (от англ. poly(ADP-ribose) polymerase - полимераза поли-АДФ-рибоза), производные платины, ингибиторы тирозинкиназных рецепторов, циклофосфамиды, антиметаболиты, агенты, повреждающие ДНК, и антимитотические агенты.

В еще одних воплощениях рекомбинантный поксвирус или его композицию можно использовать совместно с иммунотерапевтическими средствами, такими как антитела против неоплазмы (новообразования), а также миРНК (малая интерферирующая РНК) и антисмысловой полинуклеотид. Репрезентативные примеры включают, помимо прочего, моноклональные антитела, блокирующие конкретные иммунные контрольные точки, такие как антитела против PD-1, против PD-L1, против CTLA-4, против LAG3 и т.д. (например, ипилимумаб, тремелимумаб, пембролизумаб, ниволумаб, пидилизумаб, AMP-224MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559 и т.д.), моноклональные антитела, блокирующие рецептор эпидермального фактора роста (в частности, цетуксимаб, панитумумаб, залутумумаб, нимотузумаб, матузумаб, тарстузумаб (Herceptin™) и т.д.), и моноклональные антитела, блокирующие фактор роста эндотелия сосудов (в частности, бевацизумаб и ранибизумаб).

В предпочтительном воплощении введение рекомбинантного поксвируса увеличивает период выживания у субъекта, подвергающегося лечению, по сравнению с отсутствием лечения, например, по меньшей мере на 3 месяца. В качестве альтернативы, оно генерирует Т-клеточный ответ на указанную опухоль (CD4+ и/или CD8+ Т-клеточный ответ).

Введения композиции рекомбинантного поксвируса и одной или более дополнительных противораковых терапий могут быть с интервалами, находящимися в диапазоне от минут до недель. Например, можно предоставлять субъекту рекомбинантный поксвирус и дополнительную противораковую терапию последовательно или вперемежку, но сопутствующие введения обеих терапий за один и тот же период времени также рассматриваются. Курс лечения может быть рутинным образом определен практикующим врачом, и настоящим изобретением охвачены разные протоколы. Например, от 1 до 10 введений композиции рекомбинантного поксвируса можно проводить после хирургического вмешательства и химио-/лучевой терапии. Кроме того, после курса лечения предполагается, что имеет место период времени, на протяжении которого противораковое лечение не вводят до повторения цикла(ов) лечения.

Примеры

Получение рекомбинантного MVA

Плазмиду переноса MVA конструируют, обеспечивая вставку нуклеотидной последовательности, подлежащей переносу, в результате гомологичной рекомбинации в делеции III генома MVA. Она содержит последовательность переноса, вставленную между фланкирующими последовательностями (BRG3 и BRD3), окружающими делецию III MVA.

Гомологичную рекомбинацию проводили, используя исходный MVA, содержащий ген, кодирующий флуоресцентный белок mCherry, в его делецию III (mCherry MVA). Преимущество mCherry MVA заключается в дифференцировке клеток, которые инфицированы рекомбинантным вирусом, которые успешно интегрировали экспрессионную кассету из клеток, которые инфицированы первоначальным исходным вирусом MVA с mCherry (исходный вирус). Действительно, ген mCherry удаляется в случае успешной рекомбинации экспрессионной кассеты в пределах делеции III, и вирусные бляшки появляются в виде белых бляшек.

Несмотря на то, что рекомбинация является относительно частым событием в вирусе осповакцины, только 1 - 5% рекомбинантных бляшек содержат вставленную ДНК. Таким образом, для увеличения интенсивности гомологичной рекомбинации добавляли дополнительную стадию расщепления эндонуклеазой. Например, эндонуклеаза может использоваться для специфичного образования двухцепочечных разрывов в гене mCherry в MVA, и, таким образом, для увеличения эффективности отбора рекомбинантного MVA (например, обычно от 5 до 50% вирусных бляшек содержат экспрессионную кассету).

Получение MVA проводили посредством гомологичной рекомбинации в первичных фибробластах куриных эмбрионов (CEF), как описано в патенте WO2018/234506. Наличие экспрессионной кассеты и отсутствие загрязнения исходным MVA проверяли посредством ПЦР.

1. Ручная обработка перераспределения неопептидов

Цель данного эксперимента заключалась в оценке дизайна вакцины на основе рекомбинантного MVA, экспрессирующего вплоть до 30 неопептидов в виде трех слитых белков.

а. Материалы и методы

Набор данных

Список из 30 человеческих неопептидов (29mer) получали в результате 30 соматических мутаций, отобранных из общедоступной базы данных COSMIC (Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer, Tate et al., 2019, Nucleic Acids Res., 47(D1): D941-D947)

Программное обеспечение

Прогнозирование трансмембранных доменов (ТМ) и расчет балльной оценки гидрофобности продукта каждой экспрессионной кассеты (HSK7) проводили посредством программного обеспечения Geneious (версия 8.1.9, Biomatters Inc).

b. Результаты

Конструкция с 30 неопептидами: pTG 19247

Получали плазмидную конструкцию pTG 19247, содержащую три экспрессионные кассеты, причем каждая кодировала десять неопептидов (Фиг. 10). Пул из 30 неопептидов выбирали на основе их предсказанной иммуногенности из общедоступного набора данных о пациентах (исследование PRJEB3132, секвенирование экзома образцов аденокарциномы легкого человека и их нормальных аналогов). Перераспределение делали в алфавитном порядке без какого-либо линкера между каждым пептидом. Каждая кассета содержит сигнальную последовательность (полученную из F гликопротеинов бешенства и кори) и помещали под контроль промоторов pH5R, pB2R и p11k7.5, соответственно. Для облегчения конструирования продуктов слияния никакие линкеры не были включены между выбранными неопептидами. Получение соответствующего вируса проводили в CEF посредством гомологичной рекомбинации.

Во время получения рекомбинантного MVA с использованием pTG19247, получали низкую долю белых бляшек (примерно 1%). Выбирали и клонировали только 5 бляшек, и посредством ПЦР-анализов обнаруживали, что ни одна из бляшек не соответствовала рекомбинантному вирусу (белые бляшки происходят из присутствующих исходных вирусов, которые искусственно потеряли сигнал репортерного гена mCherry) (Фиг. 10).

Анализ содержания трех слитых белков обнаружил наличие трансмембранных доменов в слитых белках (2 в случае экспрессионных кассет В и 3 в случае С), и относительно высокую балльную оценку гидрофобности (HSK7 больше 0,5) для экспрессионной кассеты С. Для оценки воздействия данных биохимических свойств 12 пептидов, задействованных в доменах ТМ, и/или в высоких HSK7, удаляли из набора данных, что приводило к получению оставшегося набора из 18 неопептидов.

Конструкция с 18 неопептидами: pTG 19266

Конструкция pTG 19266 была сконструирована на основе 18 неопептидов, «не содержащих ТМ», происходящих из pTG 19247. Пептиды делили на три экспрессионные кассеты, каждая кодирует слитый белок из 6 неопептидов для уравновешивания нагрузки каждой экспрессионной кассеты. В каждом продукте слияния пептиды также были разделены линкерами, состоящими из коротких последовательностей (5mer) или остатков G и/или Т и/или S (например, GSTSG, GSGSG и т.д.), для ограничения взаимодействий между неопептидами в пределах слитого белка.

Последовательность пептидов продукта слияния, сконструированного посредством новых комбинаций, демонстрировала, как и ожидалось, отсутствие домена ТМ и уменьшенную HSK7 с максимумом примерно 0,2 в случае экспрессионной кассеты С (Фиг. 10).

Рекомбинантные MVA получали, используя плазмиду pTG19266, и, несмотря на относительно низкий процент белых бляшек (1,8%), 6 клонов (из 6), проанализированных посредством ПЦР, подтверждались как истинные рекомбинанты.

с. Заключение

Данный эксперимент планировали для оценки условий, требуемых для получения вакцины на основе рекомбинантного MVA, который несет несколько неопептидов в виде слитых белков. Отсутствие трансмембранных (ТМ) доменов и умеренная балльная оценка гидрофобности (равная или меньше 0,2), по-видимому, требовались для получения рекомбинантных MVA, несущих вплоть до 18 неопептидов. Следующие стадии должны были автоматизировать процесс отбора неопептидов и перераспределения в соответствии с критериями ТМ и HSK7.

2. Конструирование последовательности переноса с использованием VacDesignR

а. Материалы и методы

Набор данных:

Три списка неопептидов идентифицировали из трех образцов немелкоклеточного рака легкого (Р2918, V1035 и V1055) и их нормальных аналогов (кровь). Мутации идентифицировали с помощью лаборатории по секвенированию посредством сравнения экзомов из опухоли и экзома из нормальной ткани. Ранжирование проводили посредством Oncoimmunity на основе их экспертизы.

Параметры VacDesignR

Параметры по умолчанию использовали для запуска VacDesignR на данном наборе данных, среди них:

- порог балльной оценки ТМ пептида (TMSThresh): 25

- порог балльной оценки ТМ продукта слияния (TMSK7Thresh): 40

- порог балльной оценки гидрофобности продукта слияния (HSKTThresh): 0,2

- максимальное число пептидов (Nmax) на вакцину: 30

- минимальное число пептидов (Nmin) на вакцину: 5

b. Результаты, полученные с использованием VacDesignR

Результат от VacDesignR представляет собой карту положений неопептидов в пределах каркаса последовательности переноса, который включает экспрессионные кассеты, регуляторные элементы, терминаторы и рестрикционные сайты клонирования. Только относительное положение неопептидов в экспрессионных кассетах изображено в Таблице 8 для трех образцов. Также изображены средние значения гидрофобности и прогнозируемого числа ТМ в каждом слитом белке, а также результаты по получению рекомбинантного вируса в виде процента белых клеток (бляшек) и абсолютного числа клонов рекомбинантного вируса, подтвержденного посредством ПЦР.

В следующих разделах будут лишь описаны промежуточные результаты для образца V1055, поскольку более чем 30 неопептидов были доступны в качестве входных данных. Два других образца имели исходный список с менее чем 30 неопептидами, что привело к получению последовательности переноса с меньшим количеством неопептидов, но похожие стадии использовали для каждого из образцов.

Отбор пептидов:

Первая стадия заключается в расчете бальной оценки ТМ (трансмембранный домен) и участков ТМ посредством функции tmCalc VacDesignR. Данную стадию проводят на всем наборе входных данных, как показано в Таблице 3. Балльная оценка ТМ представляет собой сумму локальных областей ТМ, о которых сообщается в участках ТМ (например, участки ТМ «36_1» сообщает о двух областях с локальными балльными оценками ТМ 36 и 1, соответственно. Бальная оценка ТМ для данного пептида составляет 36+1=37).

Неопептиды с ТМ балльной оценкой выше порога (балльная оценка ТМ больше или равна 25) отфильтрованы и направлены в список исключенных пептидов (Таблица 4). О причине также сообщается в данном списке, и как об области Фильтр_Код, и как об области Фильтр_Причина. В качестве примера, Фильтр_Код «1» означает «бальная оценка ТМ больше порога».

Поскольку оставшийся список неопептидов составляет больше 30, создают два списка как результат стадии отбора неопептидов: помимо списка исключенных пептидов, подфункция listsCreatoR разделяет неопептиды на два списка.

Как только список ввода фильтруют, затем неопептиды с самым высоким рангом отбирают как часть последовательности переноса и направляют в список наилучших пептидов (Таблица 5). Кроме того, балльную оценку гидрофобности рассчитывают для каждого неопептида списка наилучших пептидов. Данная балльная оценка соответствует среднему значению балльных оценок гидрофобности остатков пептида.

Оставшиеся кандидаты хранятся в списке дополнительных пептидов (Таблица 6) и могут быть использованы, при необходимости, в качестве пула дополнительных кандидатов в случае признания непригодными неопептидов во время обработки первого списка наилучших пептидов.

Межкассетное распределение:

30 неопептидов, которые являются частью списка наилучших пептидов, разделяли по трем экспрессионным кассетам. Правило перераспределения, предопределенное в VacDesignR, использовали для уравновешивания трех слитых белков с точки зрения гидрофобности и риска создания трансмембранных доменов между неопептидами. Таким образом, к 30 неопептидам применяли относительную классификацию риска: Высокий (Н), Средний (М) и Низкий (L). В отношении правила перераспределения, каждая экспрессионная кассета будет состоять из десяти неопептидов: двух высокого класса, двух среднего класса и шести низкого класса. Выбор пептидов из каждого класса случайным образом осуществляют 30000 раз для получения 30000 групп композиций трех экспрессионных кассет. Затем средние значения гидрофобности рассчитывают для каждого набора неопептидов и для каждой группы, также рассчитывают диапазон. Любая группа с балльной оценкой гидрофобности по меньшей мере одной кассеты (HSK7) выше порога исключается. Группу с самым низким диапазоном HSK7 сохраняли для следующей стадии. В примере образца V1055 наилучшая группа, выбранная для стадии присвоения слотов внутри кассеты, имела диапазон балльных оценок гидрофобности кассеты 0,028 (Таблица 7).

Присвоение слотов внутри кассеты

На данной стадии каждая экспрессионная кассета создается на основе композиции неопептидов и в соответствии с правилом занятости слотов, которое создано в VacDesignR. Для каждой экспрессионной кассеты, кодирующей 10 неопептидов, получают в общей сложности 2880 продуктов слияния. Содержание в неопептидах конечных конструкций для образцов Р2918, V1047 и V1055 показаны в Таблице 8. TMS и участки ТМ рассчитаны для каждого продукта слияния пептидов для выявления любого ТМ домена, который мог бы встретиться между двумя смежными неопептидами. Таким образом, если выявляли локальную ТМ область (ТМ участок больше TMSK7Thresh), тогда продукт слияния исключали.

Плазмиды получали для трех образцов Р2918, V1047 и V1055, кодирующих, соответственно, 14, 21 и 30 неопептидов в виде вплоть до трех слитых белков.

Итоговые последовательности переноса соответствовали ранее определенным нормативным требованиям, а именно, отсутствию ТМ домена и балльной оценке гидрофобности продукта слияния (HSK7) ниже 0,2.

Получение рекомбинантных MVA с данными плазмидами усиливали посредством инструмента. Диапазон % белых бляшек составлял от 12 до 22%, и число рекомбинантных клонов составляло 13, 19 и 24. Только исходные клоны, еще обнаруженные посредством ПЦР, несли плазмиду из V1055, но с ограниченным числом (3). Следует отметить, что только один пептид из 30 с наивысшим рангом в исходном списке неопептидов для образца V1055 удаляли из-за проблемы TMS. Его заменяли 31^ым для получения рекомбинантного вируса MVA.

с. Заключение

Применение автоматизированного инструмента, VacDesignR, в значительной степени улучшило получение рекомбинантных MVA, кодирующих вплоть до 30 неопептидов в трех слитых белках. Улучшение получения MVA не было сделано ценой сверхселекции пептидов-кандидатов с более низким процентом, чем пептиды-кандидаты высшего ранга. Данное улучшение было полезным для конструирования оптимизированных персонализированных вакцин.

Все из приведенных выше раскрытий патентов, публикаций и значений в базах данных конкретно включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и графических материалов и из формулы изобретения. Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных воплощений изобретения. Однако, в свете настоящего раскрытия, специалистам в данной области следует понимать, что изменения могут быть внесены в конкретные воплощения, которые раскрыты, без отступления от сущности и объема изобретения.

ССЫЛКИ

Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365-96

Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23:1094-7

Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9

Depla et al., 2008, J. Virol. 82(1): 435-450

Eisenberg etal., 1982, Nature, Sep 23;299(5881):371-4

Eisenberg et al., 1984, Annual review of biochemistry 53.1: 595-623

Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28)

Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther. 11(5):595-608

Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8

Kallol et al., 2003, J. Chromat. 1000: 637-55

Krogh etal., 2001, J. Mol. Biol. 305: 567-80

Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8

Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-32

Mayr et al., 1975, Infection 3: 6-14

Nielsen et al., 2010, Immunology 130(3): 319-28

Olivier et al., 2010, mAbs 2(4): 405-15

Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co

Plotkin, 2008, Clin Infect Dis.47(3): 401-9 Relman, 2008, J Infect Dis. 198(1): 4-5;

Remington, The Science and Practice of Pharmacy; Gennaro ed., Pharmaceutical Press,

London, UK; e.g. 22nd Edition or subsequent ones

Rose et al., 1993, Ann. Rev. Biomol. Struc. 22: 381-415

Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-51

Sweet et al., 1983, J. Mol. Biol. 171: 479-88

Tate et al., 2019, Nucleic Acids Res., 47(D1): D941-D947

Yuan et al., 2015, J. Virol 89, 5176-9

Yuan et al., 2016, Viruses 8, 72, doi: 10.3390

US 5972597

US 6440422

US 6686152

US 6998252

WO 03/008533

WO 2007/077256

WO 2007/147528

WO 2008/138533

WO 2008/138649

WO 2009/004016

WO 2009/065546

WO 2009/100521

WO 2010/130753

WO 2012/001075

WO 2013/022764

WO 2014/053571

WO 2016/087457

WO 2018/234506

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ТРАНСГЕН

<120> СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОКСВИРУСА ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ

<130> B378898PCT D39402

<150> EP19306751.9

<151> 2019-12-23

<160> 84

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида

<400> 1

Thr Val His His Arg Ile Val Gly Cys Ser Leu Ala Val Ile Cys Gly

1 5 10 15

Val Leu Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Val Pro Ile Ile Tyr Ile

20 25 30

<210> 2

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 2

Thr Val His His Arg Ile Val Gly Cys Ser Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 3

Val His His Arg Ile Val Gly Cys Ser Leu Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 4

His His Arg Ile Val Gly Cys Ser Leu Ala Val

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 5

His Arg Ile Val Gly Cys Ser Leu Ala Val Ile

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 6

Arg Ile Val Gly Cys Ser Leu Ala Val Ile Cys

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 7

Ile Val Gly Cys Ser Leu Ala Val Ile Cys Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 8

Val Gly Cys Ser Leu Ala Val Ile Cys Gly Val

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 9

Gly Cys Ser Leu Ala Val Ile Cys Gly Val Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 10

Cys Ser Leu Ala Val Ile Cys Gly Val Leu Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 11

Ser Leu Ala Val Ile Cys Gly Val Leu Tyr Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 12

Leu Ala Val Ile Cys Gly Val Leu Tyr Gly Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 13

Ala Val Ile Cys Gly Val Leu Tyr Gly Ser Thr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 14

Val Ile Cys Gly Val Leu Tyr Gly Ser Thr Phe

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 15

Ile Cys Gly Val Leu Tyr Gly Ser Thr Phe Gln

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 16

Cys Gly Val Leu Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Val

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 17

Gly Val Leu Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Val Pro

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 18

Val Leu Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Val Pro Ile

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 19

Leu Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Val Pro Ile Ile

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 20

Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Val Pro Ile Ile Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная

<220>

<223> Иллюстративный пример пептида (Таблица 1)

<400> 21

Gly Ser Thr Phe Gln Val Pro Ile Ile Tyr Ile

1 5 10

<210> 22

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 22

Thr Gly Val Ala Arg Pro Gln Val Gly Gly Gly Ala Arg Ala Arg Gln

1 5 10 15

Pro Val Thr Leu His Leu Cys Arg Pro Arg Ala Gln Val

20 25

<210> 23

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 23

Leu His Ile Asn Gly Glu Ser Thr Gln Gly Leu Thr His Ala Lys Ala

1 5 10 15

Val Glu Arg Ile Arg Ala Gly Gly Pro Gln Leu His Leu

20 25

<210> 24

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ala Ile Glu Glu Arg Tyr Ala Ala Leu Leu Lys Arg Trp Glu Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Ser Ala Val His Arg Gln Lys Leu Leu Glu

20 25

<210> 25

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 25

Leu Arg Leu Leu Phe Pro Arg Val Leu Cys Arg Glu Thr Gly Arg Leu

1 5 10 15

Ala Leu His Ser Ala Ala Leu Val Ser Arg Thr Phe Leu

20 25

<210> 26

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 26

Glu Trp Met Lys Arg Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Gln Phe Trp Val

1 5 10 15

Arg Val Lys Ala Asn Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Tyr

20 25

<210> 27

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 27

Ile Trp Gln Lys Asp Gly Ala Ala Leu Ser Pro Ser Pro Asn Arg Arg

1 5 10 15

Ile Ser Asp Ala Glu Asn Lys His Ile Leu Glu Leu Ser

20 25

<210> 28

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ile Ser Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Phe Ala

1 5 10 15

Ala Phe Asn Pro Glu Asn Ile Gly Leu Ala Ala Trp Glu

20 25

<210> 29

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 29

Met Glu Ala Glu Lys Asp Ser Arg Arg Arg Leu Arg Pro Ile Asp Arg

1 5 10 15

Gln Arg Tyr Asp Glu Asn

20

<210> 30

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ile Thr Ser Ala Val Asp Asp Thr Thr Val Phe Thr Ser Asn His Ala

1 5 10 15

Phe Ser Glu Thr Arg Arg Ile Pro Thr Glu Pro Thr Phe

20 25

<210> 31

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 31

His Glu Met Glu Ala Met Lys Thr Ile Cys Gln Ser Phe Arg Lys Tyr

1 5 10 15

Leu Glu Glu Ile Glu Gln His Leu Met Gly Gln Gln Ala

20 25

<210> 32

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 32

Leu Arg Leu Phe Gln Pro Phe Leu Lys Val Ile Glu Pro Val Val Asn

1 5 10 15

Arg Glu Glu Lys Ile Leu Asn Arg Glu Ile Gly Phe Ala

20 25

<210> 33

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 33

Leu Tyr Gly Pro Gly Glu Thr Ala Arg Leu Asp Cys Gln Val His Gly

1 5 10 15

Arg Pro Gln Pro Glu Val Thr Trp Arg Ile Asn Gly Ile

20 25

<210> 34

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 34

Thr Gly Glu Val Asp Ile Gly Ala Gln Val Met Gln Thr Ile Thr Pro

1 5 10 15

Gly Leu Phe Trp Arg Phe Gln Ile Thr Ile His His Pro

20 25

<210> 35

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 35

Asp Pro Val Met Pro Gly Gly Glu Glu Lys Ala Ser Pro Phe Val Ile

1 5 10 15

Lys Leu Arg Arg Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Phe Asn Cys

20 25

<210> 36

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 36

Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr Asn Lys Asn Thr Trp Lys

1 5 10 15

Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asp Gly

20 25

<210> 37

<211> 27

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 37

Met Glu Thr Gln Lys Asp Glu Ala Ala Gln Ala Lys Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Ser Thr Arg Glu Gln Thr Ala Glu Lys

20 25

<210> 38

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 38

Gly Arg Thr Met Ser Arg Ser Trp Lys Pro Arg Cys Pro His Trp Arg

1 5 10 15

Met Thr Trp Arg Gly Ser Trp Arg Leu Trp Pro Ala Leu

20 25

<210> 39

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 39

Lys Asn Arg Gly Tyr Ala Phe Val Met Tyr Cys His Lys His Gln Ala

1 5 10 15

Lys Arg Ala Val Arg Glu Leu Asn Asn Tyr Glu Ile Arg

20 25

<210> 40

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 40

Asp Ser Lys Ile Tyr Thr Asp Trp Ala Asn His Tyr Leu Ala Asn Ser

1 5 10 15

Gly His Lys Arg Leu Ile Lys Asp Leu Gln Gln Asp Ile

20 25

<210> 41

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 41

Leu Gly Ser Met Pro Glu Leu Lys Lys Tyr Met Lys Lys Val Ile Pro

1 5 10 15

Phe Val Ala Met Ile Lys Glu Asn Leu Glu Lys Met Gly

20 25

<210> 42

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 42

Leu Gln Ala Thr Ser Pro Glu Ile Lys Leu Lys Trp Thr Ser Phe Ile

1 5 10 15

Ala Gln Leu Leu Trp Arg Gln Ala Ala His Asn Lys Glu

20 25

<210> 43

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 43

Gly Ser Leu Gln His Ser Thr Phe Leu Met Ser Phe Leu Ala Asn Ala

1 5 10 15

Thr Ala Phe Ala Ser Arg Leu Val Arg His Ser Glu Pro

20 25

<210> 44

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 44

Thr Ser Val Val Met Ser Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Lys Tyr Ser

1 5 10 15

Val Phe Lys Pro Pro Leu Asp Phe Gly Val Val Asn Val

20 25

<210> 45

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 45

Cys Met Leu Ser His Leu Ser Gln His Glu Arg Ile Tyr Thr Ile Glu

1 5 10 15

Asn Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Asn Gly Lys Ala Phe Asn

20 25

<210> 46

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 46

Glu Leu Cys Pro Met Ile Glu Ala Arg Lys Asn His Gly Leu Leu Phe

1 5 10 15

Val Lys Asp Lys Ile Phe Ala Val Gly Gly Gln Asn Gly

20 25

<210> 47

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 47

Asp Leu Leu Thr Gly Asn Arg Ser Leu Ala Ser Ser Ala Gln Ala Gly

1 5 10 15

Leu Gly Lys Gly Arg Val Ala Ala Gln Ser Pro Pro Ser

20 25

<210> 48

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 48

Ser Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Gln Val

1 5 10 15

Lys Ile Pro Leu Arg Tyr Lys Met Val Val Thr Pro Arg

20 25

<210> 49

<211> 27

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 49

Ile Pro His Asp Leu Cys His Asn Gly Glu Lys Ser Lys Lys Leu Ser

1 5 10 15

Lys Ile Lys Ser Leu Phe Lys Lys Lys Ser Lys

20 25

<210> 50

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 50

Pro Gln Glu Cys Lys Gly Ser Phe Leu Val Tyr Pro Asp Gly Tyr Val

1 5 10 15

Ser Arg Pro Leu Val Arg Glu Arg Leu Trp Val Asn Ser

20 25

<210> 51

<211> 26

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 51

Phe Val Glu Ala Val Ser Lys Thr Leu Lys Leu Ile Gly Ile Ser Leu

1 5 10 15

Pro Trp Arg Thr Ser Arg Leu Ala His His

20 25

<210> 52

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 52

Ser Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Gln Val

1 5 10 15

Lys Ile Pro Leu Arg Arg Ile Ser Gln Cys Met Ala Ser

20 25

<210> 53

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 53

Glu Asn Pro Gly Ile Ala Ser Lys Ala Arg Glu Ser Leu Ile Phe Ile

1 5 10 15

Trp Lys Pro Ile Glu Arg His Asp Asn Cys Ala Tyr Asp

20 25

<210> 54

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 54

Ile Leu Ala Leu Gly Phe Val Leu Ser Ala Gln Val Ser Pro Leu Ile

1 5 10 15

Thr Phe Lys Pro Ile Ala Pro Ser Gly Gln Asn Ala Thr

20 25

<210> 55

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 55

Leu Trp Lys Arg Gly His Leu Arg Arg Asn Trp Ala Glu Arg Cys Phe

1 5 10 15

Gln Leu Gln Pro Ser Cys Leu Cys Tyr Phe Gly Ser Glu

20 25

<210> 56

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 56

Arg Leu Asp Ile Arg Gly Lys Leu Tyr Leu Ala Pro Leu Thr Met Cys

1 5 10 15

Gly Asn Leu Pro Phe Arg Arg Ile Cys Lys Arg Phe Gly

20 25

<210> 57

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 57

Ile Tyr Gln Leu Cys Asn Asn Arg Lys Ser Phe Arg Leu Arg Leu Arg

1 5 10 15

Asp Leu Leu Leu Gly Phe Asn Lys Arg Ala Ile Asp Lys

20 25

<210> 58

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 58

Arg Trp Val Cys Ser Leu Pro Phe Gly His Val Gln Phe Ser Val Lys

1 5 10 15

Ile Gln Arg Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu Phe

20 25

<210> 59

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 59

Pro Asn Thr Ser Gln Ser Ala Thr Leu Phe Leu Arg Lys Val Val Ser

1 5 10 15

Val His Pro Trp Ser Arg Pro Ser Leu Gln Asp Cys Leu

20 25

<210> 60

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 60

Ala Arg Asn Ile Ser Asn Gln Leu Ser Ile Gly Thr Asp Ile Leu Ala

1 5 10 15

Gln His Pro Glu Leu Arg Thr His Ala Gln Ala Lys Gly

20 25

<210> 61

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 61

Cys Ala Arg Val Asp Ala Leu Arg Ser His Gly Tyr Pro Lys Asp Ala

1 5 10 15

Leu Arg Leu Thr Val Ala Ile Ile Asn Thr Leu Arg Leu

20 25

<210> 62

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 62

His Ser Ser Cys Ala Gly Arg Ser His Ile Met Ser Gly Glu Cys Val

1 5 10 15

Lys Gly Arg Asn Pro Ser Asp Leu Ser Trp Ser Ser Cys

20 25

<210> 63

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 63

Asp Leu Lys Asn Lys Gln Ile Glu Met Leu Glu His Lys Tyr Cys Gly

1 5 10 15

His Leu Val Ser Arg Arg Ala Ala Cys Thr Ile Gln Thr

20 25

<210> 64

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 64

Ala Ser Ser Ser Pro Pro Ser Gly His Ser Thr Pro Lys Leu Ser Pro

1 5 10 15

Arg Ser Pro Ala Arg Glu Met Asp Arg Met Gly Val Met

20 25

<210> 65

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 65

Thr Ser Phe Leu Trp Phe Thr Ser Pro Tyr Lys Thr Met Lys Leu Ile

1 5 10 15

Leu Trp Arg Arg Phe Arg Trp Ala Ile Ile Leu Phe Ile

20 25

<210> 66

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 66

Gly Ala Leu Gln Thr Val Arg Leu Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Cys Ile

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ala Arg Ala Cys Asp Gly Ser Thr Gly Pro

20 25

<210> 67

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 67

Leu Leu Leu Phe Leu Phe Trp Val Cys Leu Pro His Phe Cys Tyr Pro

1 5 10 15

Glu Ile Met Phe Arg Arg Thr Pro Val Pro Gln Gln Arg

20 25

<210> 68

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 68

Asp Pro Ser Leu Asp Pro Asn Val Tyr Ile Thr Arg Glu His Ile Leu

1 5 10 15

Val Val Arg Gln Ala Arg Leu Ala Asp Thr Ala Asn Tyr

20 25

<210> 69

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 69

Pro Phe Gln Tyr His Arg Gln Leu Tyr His Lys Cys Thr His Arg Gly

1 5 10 15

Arg Pro Gly Pro Gln Pro Trp Cys Ala Thr Thr Pro Asn

20 25

<210> 70

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 70

Gln Gln His Ser His Pro Asn Thr Ala Thr Val Ala Pro Phe Val Tyr

1 5 10 15

Arg Ala His Ser Glu Asn Glu Gly Thr Ala Leu Pro Ser

20 25

<210> 71

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 71

Val Ala Phe Glu Arg Leu Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Ala Trp Gly

1 5 10 15

Phe Gly Gln Val Tyr Arg Ala Thr Trp Gln Gly Gln Glu

20 25

<210> 72

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 72

Glu Ile Leu Trp Arg Pro Leu Thr Gly His Leu Leu Glu Lys Phe Cys

1 5 10 15

Gln His Pro Asn Ser Arg Met Arg Glu Trp Gly Ala Glu

20 25

<210> 73

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 73

Ser Ala Pro Arg Cys Leu Gly Lys Ser Lys Gly Arg Thr His Leu Arg

1 5 10 15

Ile Asp Pro Asp Val Ile His Arg Leu Arg Lys Phe Tyr

20 25

<210> 74

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 74

Ser Thr Thr Ser Gly Val Val Ser Gly Ser Leu Gly Ser Arg Asp Ile

1 5 10 15

Asn Tyr Ile Leu Arg Val Leu Gly Pro Ala Ala Cys Arg

20 25

<210> 75

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 75

Leu Arg Thr Leu Leu Leu Ser His Asn Arg Ile Ser His Leu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Phe Leu Ser Glu Val Ser Ser Leu Lys His Leu Asp

20 25

<210> 76

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 76

Asp Thr Leu Asp Val Phe Thr Met Ile Asp Ile Phe Lys Tyr Met Ile

1 5 10 15

Tyr Gly Ile Ala Ala Ala Phe Phe Val Tyr Gly Ile Leu

20 25

<210> 77

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 77

Arg Thr Gln Val Val Thr Asn Cys Trp Glu Asn Lys Ser Lys Ile Asn

1 5 10 15

Tyr Ala Arg Cys Phe His Lys Met Ile Ser Tyr Asn Gly

20 25

<210> 78

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 78

Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Cys Ser

1 5 10 15

Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu

20 25

<210> 79

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 79

Gln Glu Tyr Ala His Ser Ile Arg Val Asp Gly Asp Ile Ile Phe Gly

1 5 10 15

Gly Leu Phe Pro Val His Ala Lys Gly Glu Arg Gly Val

20 25

<210> 80

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 80

Ile Leu Glu Asn Arg Asn Gly Ser Leu Lys Pro Gly Ser Ser Gln Arg

1 5 10 15

Lys Thr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Thr Pro Glu Glu Asp

20 25

<210> 81

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 81

Leu Val Phe Tyr Ile Glu Ala Ala Tyr Lys Val Ala Asp Tyr Arg Met

1 5 10 15

Trp Glu Arg Gly Asp Lys Thr Asn Gln Gly Ile Pro Glu

20 25

<210> 82

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 82

Gly Ser Thr Ala Pro Leu Glu Phe Leu His Ile Thr Phe Gln Trp Phe

1 5 10 15

Phe Ala Ala Phe Tyr Leu Ala Leu Ser Ala Asp Val Pro

20 25

<210> 83

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 83

Lys Lys Met Glu Ser Gln Ala Ala Arg Leu Gln Ser Leu Glu Trp Arg

1 5 10 15

Thr Gly Thr Ala Glu Lys Lys Leu Ala Asp Cys Glu Lys

20 25

<210> 84

<211> 29

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 84

Thr Gln His Val Pro Pro Ala Asp Gly Thr Asp Cys Gly Pro Val Met

1 5 10 15

His Cys Arg His Gly Leu Cys Val Asn Lys Glu Thr Glu

20 25

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ конструирования рекомбинантного поксвируса, содержащего одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии пептида или продукта слияния множества пептидов, отличающийся тем, что он включает проведение, посредством средств обработки (11) сервера (1), следующих стадий: (a) отбор первого поднабора пептидов-кандидатов из набора пептидов-кандидатов, где пептиды-кандидаты первого поднабора пептидов-кандидатов демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога трансмембранной балльной оценки, где трансмембранная балльная оценка пептида-кандидата указывает на вероятность того, что пептид-кандидат представляет или образует по меньшей мере один трансмембранный сегмент в пределах его последовательности; (b) определение оптимального распределения пептидов-кандидатов указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди множества возможных распределений, где указанное оптимальное распределение представляет, если имеются по меньшей мере две экспрессионные кассеты, наименьший диапазон между балльными оценками гидрофобности по меньшей мере двух экспрессионных кассет; (c) для каждой экспрессионной кассеты, определение оптимального присвоения слотов пептидов-кандидатов указанного первого поднабора как функции правила занятости слотов кассеты таким образом, чтобы отобрать продукт слияния пептидов с самой низкой трансмембранной балльной оценкой, где указанное правило занятости слотов кассеты определяет возможные положения слотов пептидов-кандидатов в пределах экспрессионной кассеты в соответствии с трансмембранными балльными оценками пептидов-кандидатов и, в случае равных трансмембранных балльных оценок, в соответствии с балльными оценками гидрофобности пептидов-кандидатов; (d) определение последовательности переноса ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность одной или более экспрессионных кассет, для получения указанного рекомбинантного поксвируса. Описан способ получения терапевтической вакцины для лечения инфекционных заболеваний или пролиферативных заболеваний, включающий: осуществление способа для конструирования рекомбинантного поксвируса; получение указанного рекомбинантного поксвируса; получение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество указанного рекомбинантного поксвируса и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение позволяет увеличить выход получения рекомбинантного поксвируса. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл.

1. Способ конструирования рекомбинантного поксвируса, содержащего одну или более экспрессионных кассет, каждая из которых предназначена для экспрессии пептида или продукта слияния множества пептидов, отличающийся тем, что он включает проведение, посредством средств обработки (11) сервера (1), следующих стадий: (a) отбор первого поднабора пептидов-кандидатов из набора пептидов-кандидатов, где пептиды-кандидаты первого поднабора пептидов-кандидатов демонстрируют трансмембранные балльные оценки ниже порога трансмембранной балльной оценки, где трансмембранная балльная оценка пептида-кандидата указывает на вероятность того, что пептид-кандидат представляет или образует по меньшей мере один трансмембранный сегмент в пределах его последовательности; (b) определение оптимального распределения пептидов-кандидатов указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди множества возможных распределений, где указанное оптимальное распределение представляет, если имеются по меньшей мере две экспрессионные кассеты, наименьший диапазон между балльными оценками гидрофобности по меньшей мере двух экспрессионных кассет; (c) для каждой экспрессионной кассеты, определение оптимального присвоения слотов пептидов-кандидатов указанного первого поднабора как функции правила занятости слотов кассеты таким образом, чтобы отобрать продукт слияния пептидов с самой низкой трансмембранной балльной оценкой, где указанное правило занятости слотов кассеты определяет возможные положения слотов пептидов-кандидатов в пределах экспрессионной кассеты в соответствии с трансмембранными балльными оценками пептидов-кандидатов и, в случае равных трансмембранных балльных оценок, в соответствии с балльными оценками гидрофобности пептидов-кандидатов; (d) определение последовательности переноса ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность одной или более экспрессионных кассет, для получения указанного рекомбинантного поксвируса.

2. Способ по п. 1, в котором пептиды-кандидаты указанного первого поднабора представляют непрерывные области ниже порога гомологии.

3. Способ по п. 1, в котором стадия (b) включает, если число возможных распределений превышает заданную функцию максимального числа ресурсов средств обработки (11) сервера (1), попытку определить указанное оптимальное распределение пептидов-кандидатов из указанного первого поднабора по экспрессионной(ым) кассете(ам) среди по меньшей мере одной итерации указанного максимального числа возможных распределений среди множества возможных распределений.

4. Способ по п. 3, где стадия (а) включает исключение пептидов, если они демонстрируют трансмембранные балльные оценки выше порога трансмембранной балльной оценки и/или идентичность области последовательности выше порога гомологии с пептидом-кандидатом, для которого предсказан более высокий потенциал иммуногенности, и отбор второго поднабора пептидов-кандидатов в виде пептидов-кандидатов, которые не были ни исключены, ни отобраны в первом поднаборе.

5. Способ по п. 4, дополнительно включающий, когда для каждого возможного распределения по меньшей мере одна экспрессионная кассета демонстрирует балльную оценку гидрофобности выше заданного порога, замену пептида-кандидата из первого поднабора пептидов-кандидатов, демонстрирующих самую высокую балльную оценку гидрофобности, пептидом-кандидатом из второго поднабора пептидов-кандидатов, и реитерацию стадии (b).

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором стадия (c) дополнительно включает исключение любого продукта слияния пептидов, который демонстрирует по меньшей мере один трансмембранный участок с балльной оценкой выше порога трансмембранной балльной оценки слияния пептидов.

7. Способ по п. 6, в котором стадия (с) включает, если по меньшей мере один трансмембранный домен выявлен при каком-либо возможном присвоении слотов пептидов-кандидатов в экспрессионной кассете, замену пептида-кандидата из первого поднабора пептидов-кандидатов, демонстрирующих самую высокую балльную оценку трансмембранного домена, пептидом-кандидатом из второго поднабора, и повторение стадий (b) затем (c).

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором пептиды-кандидаты, распределенные по экспрессионной кассете, классифицированы в соответствии с по меньшей мере тремя классами риска неполучения или непродуцирования какого-либо рекомбинантного поксвируса, где указанное правило занятости слотов кассеты определяет, для каждого из положений слотов кассеты, то, какого класса пептид- кандидат должен будет относиться к данному положению слота.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором имеется одна экспрессионная кассета, если число отобранных пептидов-кандидатов составляет меньше 10, две экспрессионные кассеты, если число отобранных пептидов-кандидатов составляет от 10 до 14, и три экспрессионные кассеты, если число отобранных пептидов- кандидатов составляет от 15 до 30.

10. Способ получения терапевтической вакцины для лечения инфекционных заболеваний или пролиферативных заболеваний, включающий: осуществление способа по любому из пп. 1-9 для конструирования рекомбинантного поксвируса; получение указанного рекомбинантного поксвируса; получение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество указанного рекомбинантного поксвируса и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Способ по п. 10, где указанный способ дополнительно включает стадию изготовления указанного рекомбинантного поксвируса, где указанная стадия изготовления включает стадию амплификации в подходящей клетке-продуценте до подходящего масштаба, стадию выделения полученного рекомбинантного поксвируса из клеточной культуры и возможную стадию очистки выделенного рекомбинантного поксвируса.

12. Способ по любому из пп. 10-11, в котором указанный рекомбинантный поксвирус кодирует неопептиды.