ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунотерапии на основе опухолеспецифичных Т-клеток, включающие терапии с использованием генетически модифицированных Т-клеток, были исследованы в отношении противоопухолевого лечения. В некоторых случаях Т-клетки, используемые в таких терапиях, не остаются активными in vivo в течение достаточно длительных периодов. В некоторых случаях опухолеспецифичность Т-клеток является относительно низкой, отчасти из-за гетерогенной природы солидных опухолей и потенциальных эффектов на нераковые клетки вне мишени при нацеливании на собственные антигены. Следовательно, в данной области существует потребность в опухолеспецифичных противораковых терапиях с улучшенной противоопухолевой специфичностью и функцией.

Химерные рецепторы антигена (CAR) состоят из внеклеточного домена распознавания/нацеливания на опухоль, внеклеточного линкера/спейсера, трансмембранного домена и внутриклеточных домена активации Т-клеток и костимулирующего домена сигнализации. Конструкция домена распознавания/нацеливания является критически важной для избегания вредных эффектов вне мишени. Большинство доменов CAR нацеливания на опухоль представляют собой одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), происходящие из последовательностей антител, в которых используется специфичность связывания антитела с конкретными антигенами. Также существуют примеры доменов CAR нацеливания на опухоль, происходящих из нормальных лигандов рецептора, как, например, CAR на основе цитокина IL-13 (интерлейкин-13), который нацеливается на клетки, экспрессирующие рецептор IL-13 - IL13Rα2.

Адоптивная Т-клеточная терапия (ACT) с использованием генетически модифицированных Т-клеток, экспрессирующих CAR, продемонстрировала надежную и долговременную клиническую эффективность у пациентов с CD19+ В-клеточными злокачественными заболеваниями (Priceman et al. 2015 Curr Opin Oncol; Maus et al. 2014 Blood 123: 2625-2635). С достижением ранних успехов при гематологических заболеваниях, более широкое применение данного подхода к солидным опухолям сейчас интенсивно исследуется.

Согласно данным Программы по наблюдению, эпидемиологии и конечным результатам (SEER) Национального института рака в 2014 г. было оценочно 40000 случаев смерти от рака молочной железы, главным образом, от метастатического заболевания. Приблизительно 25-30% пациентов с раком молочной железы несут амплификацию гена HER2 (рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2), которая дает особенно плохой прогноз. Даже с появлением более новых агентов, включающих таргетные терапии, имели место только умеренные улучшения общего коэффициента смертности при заболевании IV стадии. Например, в рандомизированном испытании с пациентами с HER2-позитивным раком молочной железы наиболее многообещающая комбинация лечения двумя антителами, нацеленными на HER2 - трастузумабом и пертузумабом - плюс доцетакселом давала медианное общее выживание 56,5 месяцев и продление выживания без прогрессирования лишь на 6,3 месяца по сравнению с одними трастузумабом и доцетакселом.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны химерные трансмембранные иммунорецепторы (химерные рецепторы антигена или «CAR»), которые содержат внеклеточный домен, трансмембранную область и внутриклеточный домен сигнализации. Внеклеточный домен включает scFv, нацеленный на HER2, и, возможно, спейсер, содержащий, например, часть человеческого домена Fc. Трансмембранная часть включает, например, трансмембранный домен CD4, трансмембранный домен CD8, трансмембранный домен CD28 или трансмембранный домен CD3. Внутриклеточный домен сигнализации включает домен сигнализации из зета-цепи человеческого комплекса CD3 (CD3ζ) и один или более чем один костимулирующий домен, например, костимулирующий домен 4-1ВВ или CD28. Внеклеточный домен дает возможность CAR, при экспрессии на поверхности Т-клетки, направлять активность Т-клетки против тех клеток, которые экспрессируют HER2. Такие клетки включают определенные клетки рака молочной железы и определенные клетки рака мозга. Включение костимулирующего домена, такого как костимулирующий домен 4-1ВВ (CD137), последовательно с CD3ζ во внутриклеточной области дает возможность Т-клеткам получать костимулирующие сигналы. Т-клетки, например, специфичные для пациента аутологические Т-клетки, могут быть генетически модифицированы для экспрессии CAR, описанных в данном документе, и данные генетически модифицированные клетки можно размножать и использовать в ACT. Можно использовать разные поднаборы Т-клеток, включающие и альфа бета Т-клетки, и гамма дельта Т-клетки. Кроме того, CAR могут экспрессироваться в других иммунных клетках, таких как NK-клетки (природные клетки-киллеры). Когда пациента лечат иммунной клеткой, экспрессирующей CAR, описанный в данном документе, данная клетка может представлять собой аутологическую Т-клетку или аллогенную Т-клетку. В некоторых случаях использованные клетки представляют собой популяцию клеток, которая включает центральные Т-клетки памяти (Т_СМ) и CD4+, и CD8+, которые являются CD62L+, CCR7+, CD45RO+ и CD45RA-, или использованные клетки представляют собой популяцию клеток, которая включает клетки Т_СМ CD4+и CD8+, стволовые центральные Т-клетки памяти и наивные Т-клетки (т.е. популяцию клеток T_CM/SCM/N). Популяция клеток T_CM/SCM/N представляет собой клетки CD62L+, CCR7+и включает и клетки CD45RA+, и CD45RO+, а также и клетки CD4+, и CD8+. Применение таких клеток может улучшать долговременное сохранение данных клеток после адоптивного переноса по сравнению с применением других типов Т-клеток, специфичных для пациента.

В данном документе описана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержащий: scFv, нацеленный на HER2 (например,

) или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); трансмембранный домен, выбранный из: трансмембранного домена CD4 или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), трансмембранного домена CD8 или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), трансмембранного домена CD28 или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), и трансмембранного домена CD3ζ или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); костимулирующий домен (например, костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); или костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); или и костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), и костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); и домен сигнализации CD3ζ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот.

В разных воплощениях костимулирующий домен выбран из группы, состоящей из следующих: костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, и костимулирующий домен ОХ40 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот.В некоторых воплощениях присутствует костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот. В некоторых воплощениях имеются два костимулирующих домена, например, костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), и костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен). В разных воплощениях 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот представляют собой замены.

В некоторых случаях имеется короткая последовательность из 1-6 аминокислот (например, GGG) между костимулирующими доменами и доменом сигнализации CD3ζ, и/или между двумя костимулирующими доменами.

Дополнительное воплощение CAR содержит: scFv, нацеленный на HER2; два разных костимулирующих домена, выбранных из группы, состоящей из следующих: костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот, и костимулирующий домен ОХ40 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот; два разных костимулирующих домена, выбранных из группы, состоящей из следующих: костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот, костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот, и костимулирующий домен ОХ40 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот; scFv против HER2 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот; трансмембранный домен, выбранный из следующих: трансмембранный домен CD4 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот, трансмембранный домен CD8 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот, трансмембранный домен CD28 или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот, и трансмембранный домен CD3ζ или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот; костимулирующий домен (например, костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), или костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); или и костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), и костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); и домен сигнализации CD3ζ или его вариант, имеющий 1-2 модификации аминокислот; спейсерную область, расположенную между scFv против HER2 или ее вариантом и трансмембранным доменом (например, спейсерная область содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-12 и 42 (Таблица 3), или ее вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот); спейсер содержит шарнирную область IgG; спейсерная область содержит 1-150 аминокислот; отсутствует спейсер; домен сигнализации 4-1ВВ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, домен сигнализации CD3ζ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и линкер из 3-15 аминокислот расположен между костимулирующий доменом и доменом сигнализации CD3ζ или его вариантом. В некоторых воплощениях, где имеется два костимулирующих домена, один представляет собой костимулирующий домен 4-1ВВ, а другой - костимулирующий домен, выбранный из CD28 и CD28gg. В разных воплощениях 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот представляют собой замены, например, консервативные замены.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26-41; химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26-41.

Также раскрыта популяция человеческих Т-клеток, трансдуцированных вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный рецептор антигена, где химерный рецептор антигена содержит: scFv, нацеленный на HER2; трансмембранный домен, выбранный из: трансмембранного домена CD4 или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), трансмембранного домена CD8 или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), трансмембранного домена CD28 или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), и трансмембранного домена CD3ζ или его варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); костимулирующий домен (например, костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); или костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); или и костимулирующий домен CD28 или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен), и костимулирующий домен 4-1ВВ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); и домен сигнализации CD3ζ или его вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен). В разных воплощениях популяция человеческих Т-клеток содержит вектор, экспрессирующий химерный рецептор антигена, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 26-41 или ее варианта, имеющего 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен); данная популяция человеческих Т-клеток содержит центральные Т-клетки памяти (клетки Т_СМ), например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки Т_СМ, или популяция Т-клеток содержит комбинацию центральных Т-клеток памяти, наивных Т-клеток и стволовых центральных Т-клеток памяти (клетки T_CM/SCM/N), например, например, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки T_CM/SCM/N. В любом случае популяция Т-клеток включает и клетки CD4+, и клетки CD8+ (например, по меньшей мере 20% Т-клеток CD3+ представляют собой CD4+, и по меньшей мере 3% Т-клеток CD3+ представляют собой CD8+, и по меньшей мере 70, 80 или 90% представляют собой либо CD4+, либо CD8+; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% клеток CD3+ представляют собой CD4+, и по меньшей мере 4%, 5%, 8%, 10%, 20% клеток CD3+ представляют собой клетки CD8+).

Также описан способ лечения рака у пациента, включающий введение популяции аутологических или аллогенных человеческих Т-клеток (например, аутологических или аллогенных Т-клеток, содержащих центральные Т-клетки памяти (клетки Т_СМ) или комбинацию центральных Т-клеток памяти, наивных Т-клеток и стволовых центральных Т-клеток памяти (т.е. Т-клетки представляют собой клетки T_CM/SCM/N), по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% клеток представляют собой клетки T_CM/SCM/N. В любом случае популяция Т-клеток включает и клетки CD4+, и клетки CD8+ (например, по меньшей мере 20% Т-клеток CD3+ представляют собой CD4+, и по меньшей мере 3% Т-клеток CD3+ представляют собой CD8+, и по меньшей мере 70, 80 или 90% представляют собой либо CD4+, либо CD8+; по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% клеток CD3+ представляют собой CD4+, и по меньшей мере 4%, 5%, 8%, 10%, 20% клеток CD3+ представляют собой клетки CD8+), трансдуцированные вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный рецептор антигена, где химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26-41, или ее вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен). В разных воплощениях раковое заболевание представляет собой рак мозга, например, рак мозга, экспрессирующий HER2, который представляет собой метастаз от рака молочной железы; и трансдуцированные человеческие Т-клетки были получены способом, включающим получение Т-клеток от пациента, обработку Т-клеток для выделения центральных Т-клеток памяти и трансдуцирование по меньшей мере части центральных клеток памяти вирусным вектором, содержащим экспрессионную кассету, кодирующую химерный рецептор антигена, где химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26 или 27, или ее вариант, имеющий 1-5 (например, 1 или 2) модификаций аминокислот (например, замен). В некоторых случаях Т-клетки с CAR не вводятся непосредственно в опухоль мозга, но вместо этого вводятся во внутрижелудочковое пространство в мозге пациента.

Также описана молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 26-41; молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 26-41, за исключением присутствия не более чем 5 аминокислотных замен, делеций или вставок; молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 26-41, за исключением присутствия не более чем 5 аминокислотных замен; и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 26-41, за исключением присутствия не более чем 2 аминокислотных замен.

Данное раскрытие также включает молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют любой из CAR, описанных в данном документе (например, векторы, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один из CAR), и выделенные Т-лимфоциты, которые экспрессируют любой из CAR, описанных в данном документе.

Описанный в данном документе CAR может включать спейсерную область, расположенную между доменом связывания HER2 (например, scFv против HER2) и трансмембранным доменом. Можно использовать целый ряд разных спейсеров. Некоторые из них включают по меньшей мере часть человеческой области Fc, например, шарнирную часть человеческой области Fc или домен СН3, или их варианты. В Таблице 1 ниже приведены разные спейсеры, которые можно использовать в CAR, описанных в данном документе.

Некоторые спейсерные области включают всю шарнирную область иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) или ее часть, например, последовательность, которая попадает между доменами СН1 и СН2 иммуноглобулина, например, шарнирную область Fc IgG4 или шарнирную область CD8. Некоторые спейсерные области включают домен СН3 иммуноглобулина или и домен СН3, и домен СН2. Последовательности, происходящие от иммуноглобулина, могут включать одну или более чем одну модификацию аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 замен, например, замены, которые уменьшают связывание вне мишени.

Термин «модификация аминокислот» относится к аминокислотной замене, вставке и/или делеции в последовательности белка или пептида. «Аминокислотная замена» или «замена» относится к замене аминокислоты в конкретном положении в последовательности родительского пептида или белка другой аминокислотой. Замену можно делать для изменения аминокислоты в полученном в результате белке неконсервативным образом (т.е. посредством замены кодона от аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот, имеющих конкретный размер или характеристику, до аминокислоты, принадлежащей к другой группе) или консервативным образом (т.е. посредством замены кодона от аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот, имеющих конкретный размер или характеристику, до аминокислоты, принадлежащей к той же самой группе). Такое консервативное изменение обычно приводит к меньшему изменению в структуре и функции образующегося белка. Следующее представляет собой примеры разных групп аминокислот: 1) аминокислоты с неполярными группами R: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин; 2) аминокислоты с незаряженными полярными группами R: глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин; 3) аминокислоты с заряженными полярными группами R (отрицательно заряженными при рН 6,0): аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; 4) основные аминокислоты (положительно заряженные при рН 6,0): лизин, аргинин, гистидин (при рН 6,0). Другая группа может представлять собой те аминокислоты, которые имеют фенильные группы: фенилаланин, триптофан и тирозин.

В некоторых воплощениях спейсер происходит из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и включает один или более чем один аминокислотный остаток, замененный аминокислотным остатком, отличающимся от остатка, присутствующего в немодифицированном спейсере. Один или более чем один замененный аминокислотный остаток выбран из одного или более чем одного аминокислотного остатка в положениях 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339 или их комбинации, но не ограничивается ими. В данной схеме нумерации, описанной ниже более подробно, первая аминокислота в спейсере IgG4(L235E, N297Q) в Таблице 1 является 219-ой, и первая аминокислота в спейсере IgG4(HL-CH3) в Таблице 1 является 219-ой, также как и первая аминокислота в последовательности шарнира IgG и в последовательности шарнирного линкера (HL) IgG4 в Таблице 1.

В некоторых воплощениях модифицированный спейсер происходит из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, который включает одну или более чем одну из следующих замен аминокислотных остатков: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, Е233Р, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, Т299А, Y300L, V305I, V309L, Е318А, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, Е333А, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L или их комбинацию, но не ограничивается ими.

В некоторых воплощениях модифицированный спейсер происходит из области IgG4, которая включает один или более чем один аминокислотный остаток, замененный аминокислотным остатком, отличным от аминокислотного остатка, присутствующего в немодифицированной области. Один или более чем один замененный аминокислотный остаток выбран из одного или более чем одного аминокислотного остатка в положениях 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339 или их комбинации, но не ограничивается ими.

В некоторых воплощениях модифицированный спейсер происходит из области IgG4, которая включает одну или более чем одну из следующих замен аминокислотных остатков: 220S, 226S, 228Р, 229S, 230S, 233Р, 234А, 234V, 234F, 234А, 235А, 235Е, 236А, 237А, 238S, 239D, 243L, 247I, 267Е, 268Q, 280Н, 290S, 290Е, 290N, 292Р, 297А, 297Q, 298А, 298G, 298D, 298V, 299А, 300L, 305I, 309L, 318А, 326А, 326W, 326Е, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332Е, 333А, 333S, 333S, 334А, 339D, 339Q, 396L или их комбинацию, но не ограничивается ими, где аминокислота в немодифицированном спейсере заменяется определенными выше аминокислотами в указанном положении.

Для положений аминокислот в иммуноглобулине, обсуждаемых в данном документе, нумерация осуществляется согласно индексу EU или схеме нумерации EU (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, тем самым целиком включена посредством ссылки). Индекс EU или индекс EU по Kabat или схема нумерации EU относится к нумерации антитела EU (Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).

В CAR по изобретению можно использовать целый ряд трансмембранных доменов. Таблица 2 включает примеры подходящих трансмембранных доменов. При наличии спейсерного домена трансмембранный домен располагается ближе к карбоксильному концу относительно спейсерного домена.

Многие из CAR, описанных в данном документе, включают один или более чем один (например, два) костимулирующих домена. Костимулирующий(щие) домен(ны) располагается(ются) между трансмембранным доменом и доменом сигнализации CD3ζ. Таблица 3 включает примеры подходящих костимулирующих доменов, наряду с последовательностью домена сигнализации CD3ζ.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показана аминокислотная последовательность Her2scFv-IgG4(S228P,L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t (SEQ ID NO: 26). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 34) не включает сигнальный пептид GMCSFRa (рецептор а гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора), последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19. Также называемый HER2(EQ)28ζ на Фиг. 3А-8Д и в настоящем описании.

На Фиг. 2 показана аминокислотная последовательность Her2scFv-IgG4(S228P,L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t (SEQ ID NO: 27). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 35) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19. Также называемый HER2(EQ)BB£ на Фиг. 3А-8Д и в настоящем описании.

На Фиг. 3А-Г показаны конструкции HER2-специфичных CAR и данные по размножению Т-клеток с CAR.

На Фиг. 4А-Г показана характеризация in vitro Т-клеток с CAR против HER2 против линий клеток рака молочной железы.

На Фиг. 5А-5Е показан результат исследований по противоопухолевой активности Т-клеток с CAR против HER2 in vitro.

На Фиг. 6А-6И показан результат исследований по противоопухолевой эффективности in vivo доставляемых местно внутриопухолево Т-клеток с CAR против HER2.

На Фиг. 7А-7Г показаны результаты исследований по местной доставке Т-клеток с CAR против HER2 в человеческих ортотопичских моделях ксенотрансплантатов ВВМ.

На Фиг. 8А-8Д показаны результаты исследований по внутрижелудочковой доставке Т-клеток с CAR против HER2.

На Фиг. 9-14 показаны дополнительные CAR, нацеленные на HER2.

На Фиг. 9 представлена аминокислотная последовательность Her2scFv-CD8 шарнир-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t (SEQ ID NO: 28). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 36) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19.

На Фиг. 10 представлена аминокислотная последовательность Her2scFv-IgG4 шарнир(S228P)-линкер-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t (SEQ ID NO: 29). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 37) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19.

На Фиг. 11 представлена аминокислотная последовательность Her2scFv-IgG4(S228P)-линкер-IgG4 CH3-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t (SEQ ID NO: 30). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 38) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19.

На Фиг. 12 представлена аминокислотная последовательность Her2scFv-IgG4(S228P)-линкер-IgG4 CH3-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t (SEQ ID NO: 31). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 39) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19.

На Фиг. 13 представлена аминокислотная последовательность Her2scFv-линкер-CD28tm-CD28gg-Zeta-Т2А-CD19t (SEQ ID NO: 32). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 40) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19.

На Фиг. 14 представлена аминокислотная последовательность Her2scFv-линкер-CD8tm-41 ВВ-Zeta-Т2А-CD19t (SEQ ID NO: 33). Разные домены перечисляются в порядке приведенной ниже последовательности и указываются чередованием подчеркивания и неподчеркивания. Последовательность зрелого CAR (SEQ ID NO: 41) не включает сигнальный пептид GMCSFRa, последовательность перескакивания рибосомы Т2А или усеченный CD19.

На Фиг. 15А-15В показаны результаты исследований, характеризующих некоторые дополнительные CAR с разными спейсерами. IgG3(EQ) показан на Фиг. 2; ДельтаСh2 показан на Фиг. 11; CD8h показан на Фиг. 9; HL показан на Фиг. 10; и L показан на Фиг. 14.

На Фиг. 16А-16 В показаны результаты исследований, проверяющих CD107a и IFN-гамма (интерферон-гамма), продуцируемые при воздействии на Т_СМ, экспрессирующие разные CAR, клеток, не экспрессирующих HER2 (MDA-MB-468), с низким уровнем HER2 (231BR), с низким уровнем HER2 (231BRHER2LO) или с высоким уровнем HER2 (231BRHER2HI).

На Фиг. 17А-17Г показаны результаты исследований, проверяющих продукцию PD-1 и умерщвление опухолевых клеток в разных линиях клеток с CAR Фиг. 2 (HER2(EQ)BBζ) или Фиг. 14 (HER2(L)BBζ).

На Фиг. 18А-18Б показаны результаты исследований, проверяющих CD107a и IFN-гамма, продуцируемых при воздействии на T_CM, экспрессирующие разные CAR, клеток, не экспрессирующих HER2 (MDA-MB-468), с низким уровнем HER2 (231BR), с низким уровнем HER2 (231BRHER2LO) или высоким уровнем HER2 (231BRHER2HI).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже описаны структура, конструирование и характеризация разных химерных рецепторов антигена, нацеленных на HER2 и полезных в лечении рака молочной железы, экспрессирующего HER2, а также метастазов из молочной железы в мозг. Важно то, что CAR, описанный в данном документе, может использоваться в ACT для лечения опухолей в мозге, экспрессирующих HER2, посредством внутрижелудочковой или внутриопухолевой доставки.

Химерный рецептор антигена (CAR) представляет собой рекомбинантную биомолекулу, которая содержит, как минимум, внеклеточный домен распознавания, трансмембранную область и внутриклеточный домен сигнализации. Термин «антиген», следовательно, не ограничивается молекулами, которые связываются антителами, но относится к любой молекуле, которая может специфично связываться с мишенью. Например, CAR может включать лиганд, который специфично связывается с рецептором поверхности клетки. Внеклеточный домен распознавания (также именуемый внеклеточным доменом или просто элементом распознавания, который он содержит) содержит элемент распознавания, который специфично связывается с молекулой, присутствующей на клеточной поверхности клетки-мишени. Трансмембранная область заякоривает CAR в мембране. Внутриклеточный домен сигнализации содержит домен сигнализации из зета цепи человеческого комплекса CD3 и, возможно, содержит один или более чем один костимулирующий домен сигнализации. CAR могут и связываться с антигеном, и трансдуцировать активацию Т-клеток, независимо от ограничения МНС (главный комплекс гистосовместимости). Таким образом, CAR представляют собой «универсальные» иммунорецепторы, которые могут лечить популяцию пациентов с антигенпозитивными опухолями, независимо от их генотипа HLA (человеческий лейкоцитарный антиген). Адоптивная иммунотерапия с использованием Т-лимфоцитов, которые экспрессируют опухолеспецифичные CAR, может быть мощной терапевтической стратегией для лечения рака.

В некоторых случаях CAR, описанные в данном документе, могут быть продуцированы с использованием вектора, в котором после открытой рамки считывания CAR следует последовательность перескакивания рибосомы Т2А и усеченный CD19 (CD19t), у которого отсутствует цитоплазматический сигнализирующий хвост (усеченная аминокислота 323). При данной организации коэкспрессия CD19t дает инертный неиммуногенный поверхностный маркер, который обеспечивает точное измерение генномодифицированных клеток и делает возможной позитивную селекцию генномодифицированных клеток, а также эффективное отслеживание клеток и/или визуализацию терапевтических Т-клеток in vivo после адоптивного переноса. Коэкспрессия CD19t дает маркер для иммунологического нацеливания на трансдуцированные клетки in vivo с использованием клинически доступных антител и/или реактивов на основе иммунотоксина для избирательного устранения терапевтических клеток и функционирования, посредством этого, в качестве суицидного переключателя.

CAR, описанный в данном документе, может быть получен посредством любых способов, известных в данной области, хотя предпочтительно его получают с использованием методик генной инженерии. Нуклеиновые кислоты, кодирующие несколько областей химерного рецептора, могут быть получены и собраны в полную кодирующую последовательность посредством стандартных методик молекулярного клонирования, известных в данной области (скрининг геномных библиотек, ПЦР, лигирование с помощью праймера, сайтнаправленный мутагенез и т.д.), которые являются удобными. Образующуюся кодирующую область предпочтительно вставляют в экспрессионный вектор и используют для трансформации подходящей экспрессионной линии клеток-хозяев, предпочтительно линии клеток Т-лимфоцитов и, наиболее предпочтительно, аутологической линии клеток Т-лимфоцитов.

Вектором для экспрессии CAR могут быть трансдуцированы разные поднаборы Т-клеток, выделенных из пациента, включая не подвергавшиеся селекции РВМС или Т-клетки, обогащенные CD3, или обогащенные CD3, или поднаборы Т-клеток памяти, или Т_СМ, или T_CM/SCM/N. Центральные Т-клетки памяти являются одним полезным поднабором Т-клеток. Центральные Т-клетки памяти могут быть выделены из одноядерных клеток периферической крови (РВМС) посредством обогащения в отношении клеток CD45RO+/CD62L+ с использованием, например, прибора CliniMACS® для иммуномагнитной селекции клеток, экспрессирующих желательные рецепторы. Клетки, обогащенные центральными Т-клетками памяти, можно активировать антителами против CD3/CD28, трансдуцировать, например, лентивирусным вектором SIN, который управляет экспрессией CAR, а также усеченным человеческим CD19 (CD19t) - неиммуногенным поверхностным маркером как для выявления in vivo, так и для потенциальной селекции ex vivo. Активированные/генетически модифицированные центральные Т-клетки памяти можно размножать in vitro с использованием IL-2/IL-15 и затем криоконсервировать.

Пример 1: структура двух CAR против HER2

Один CAR, содержащий scFv против HER2, описанный в данном документе, называется Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t. Данный CAR включает целый ряд важных элементов, включающих: scFv, нацеленный на HER2; область Fc IgG4, которая мутирована в двух сайтах в пределах области СН2 (L235E; N292Q) способом, который уменьшает связывание с рецепторами Fc (FcR); трансмембранный домен CD28, костимулирующий домен CD28 и домен антивации CD3ζ. На Фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность данного CAR, включающая последовательность усеченного CD19, используемого для мониторинга экспресии CAR, и последовательность перескакивания рибосомы Т2А, которая обеспечивает продукцию CAR без слияния с последовательностью усеченного CD19. Как показано на Фиг. 2, незрелый CAR включает: сигнальный пептид GMCSFR, scFv против HER2, IgG4, который работает в качестве спейсера, трансмембранный домен CD8, костимулирующий домен 4-1ВВ, который включает изменение последовательности от LL до GG, последовательность из трех Gly, стимулирующий домен CD3 Зета. Данный транскрипт также кодирует последовательность перескакивания рибосомы Т2А и последовательность усеченного CD19, которые не являются частью последовательности белка CAR. Зрелый CAR является идентичным незрелому CAR, но не имеет сигнального пептида GMCSF.

Пример 2: конструирование и структура epHIV7, используемого для экспрессии HER2-специфичного CAR Т-клеток

Вектор epHIV7 представляет собой вектор, который можно использовать для экспрессии HER2-специфичного CAR. Его получали из вектора pHIV7. Важно то, что в данном векторе для управления экспрессией CAR используется человеческий промотор EF1. И 5'-, и 3'-последовательности данного вектора были получены из pv653RSN, который был ранее получен из провируса НХВс2. Вытесняемые последовательности полиуринового тракта ДНК (сРРТ) были получены из штамма pNL4-3 ВИЧ-I (вирус иммунодефицита человека-I) из репозитория реактивов NIH AIDS (Национальный институт здравоохранения по СПИД). Последовательность посттранскрипционного регуляторного элемента лесного сурка (WPRE) была описана ранее.

Конструирование pHIV7 проводили следующим образом. Вкратце, pv653RSN, содержащую 653 п.о. из gag-pol плюс 5'- и 3'-длинные концевые повторы (LTR) с расположенным между ними геном SL3-неомицинфосфотрансферазы (Neo), субклонировали в pBluescript следующим образом: на стадии 1 из последовательностей от 5' LTR до элемента, отвечающего на rev (RRE), делали р5' HIV-I 5l, и затем 5' LTR модифицировали посредством удаления последовательностей выше TATA бокса и лигировали сначала с энхансером CMV (цитомегаловирус) и затем с репликатором SV40 (p5'HIV-2). На стадии 2 после клонирования 3'LTR в pBluescript с получением p3'HIV-1 делали делецию 400 п.о. в 3'LTR энхансере/промоторе для удаления цис-регуляторных элементов в U3 HIV и образования p3'HIV-2. На стадии 3 фрагменты, выделенные из p5'HIV-3 и p3'HIV-2, лигировали с получением pHIV-3. На стадии 4 p3'HIV-2 дополнительно модифицировали посредством удаления дополнительных расположенных выше последовательностей HIV с получением p3'HIV-3, и фрагмент из 600 п.о. BamHI-SaIl, содержащий WPRE, добавляли к p3'HIV-3 с получением p3'HIV-4. На стадии 5 уменьшали размер RRE pHIV-3 посредством ПЦР и лигировали с 5' фрагментом из pHIV-3 (не показан) и с p3'HIV-4 с получением pHIV-6. На Стадии 6 фрагмент BgIII-BamHI из 190 п.о., содержащий вытесняемую последовательность ДНК сРРТ из pNL4-3 HIV-1 (55), амплифицировали из pNL4-3 и помещали между последовательностями RRE и WPRE в pHIV6 с получением pHIV-7. Данную родительскую плазмиду - pHIV7-GFP (GFP - зеленый флуоресцентный белок) использовали для упаковки родительского вектора с использованием четырехплазмидной системы.

Упаковочный сигнал - пси (ψ) - требуется для эффективной упаковки вирусного генома в вектор. RRE и WPRE усиливают транспорт РНК-транскрипта и экспрессию трансгена. Было продемонстрировано то, что вытесняемая последовательность в комбинации с WPRE усиливает эффективность трансдукции лентивирусного вектора в клетках млекопитающих.

Хелперные функции, требующиеся для продукции вирусного вектора, разделяются на три отдельные плазмиды для уменьшения вероятности образования компетентного к репликации лентивируса посредством рекомбинации: 1) pCgp кодирует белок gag/pol, требующийся для сборки вирусного вектора; 2) pCMV-Rev2 кодирует белок Rev, который действует на последовательность RRE для помощи в транспортировке вирусного генома для эффективной упаковки; и 3) pCMV-G кодирует гликопротеин вируса везикулостоматита (VSV), который требуется для инфективности вирусного вектора.

Имеется минимальная гомология последовательности ДНК между геномом вектора, кодируемого pHIV7, и хелперными плазмидами. Области гомологии включают область упаковочного сигнала из приблизительно 600 нуклеотидов, расположенную в последовательности gag/pol хелперной плазмиды pCgp; последовательность промотора CMV во всех трех хелперных плазмидах и последовательность RRE в хелперной плазмиде pCgp. Весьма маловероятно то, что из-за гомологии в данных областях мог бы быть генерирован компетентный к репликации рекомбинантный вирус, так как это потребовало бы многочисленных событий рекомбинации. Кроме того, у любых образующихся рекомбинантов отсутствовали бы функциональные последовательности LTR и tat, требующиеся для лентивирусной репликации.

Промотор CMV был заменен промотором EF1α-HTLV (EF1p), и новая плазмида была названа epHIV7. EF1р имел 563 п.о. и был введен в epHIV7 с использованием NruI и NheI, затем промотор CMV был вырезан.

Из данной системы был удален лентивирусный геном, исключая gag/pol и rev, которые необходимы для патогенности вируса дикого типа и требуются для продуктивной инфекции клеток-мишеней. Кроме того, конструкция вектора не содержит интактного промотора 3'LTR, таким образом, полученная в результате экспрессируемая и обратно транскрибированная ДНК провирусного генома в клетках-мишенях будет иметь неактивные LTR. В результате данной конструкции последовательности, происходящие из ВИЧ-1, не будут транскрибироваться из провируса, и только терапевтические последовательности будут экспрессироваться от соответствующих им промоторов. Ожидается то, что удаление промоторной активности LTR в векторе SIN значительно уменьшает возможность непреднамеренной активации генов хозяина.

Пример 3: получение векторов для трансдукции Т-клеток пациента

Векторы для трансдукции Т-клеток пациента могут быль получены следующим образом. Для каждой плазмиды, экспрессирующей CAR и, возможно, маркер, такой как усеченный CD19; 2) pCgp; 3) pCMV-G и 4) pCMV-Rev2), получают семенной банк, который используется для инокуляции ферментера с получением достаточных количеств плазмидной ДНК. Данную плазмидную ДНК тестировали на идентичность, стерильность и присутствие эндотоксина перед ее применением в производстве лентивирусного вектора.

Вкратце, клетки размножают от рабочей клетки 293Т (WCB), которая была протестирована для подтверждения стерильности и отсутствия вирусного загрязнения. Сосуд с клетками 293Т от WCB 293Т оттаивают. Клетки выращивают и размножают до наличия достаточного числа клеток для посева в подходящее число 10-слойных клеточных фабрик (CF) для продукции вектора и поддержания линии клеток. Для продукции можно использовать одну линию клеток.

Лентивирусный вектор продуцируется в подпартиях из вплоть до 10 CF. Две подпартии можно продуцировать в ту же самую неделю, приводя к продукции приблизительно 20 л лентивирусного супернатанта/неделю. Материал, продуцированный из всех подпартий, объединяют на протяжении последующей фазы переработки для того, чтобы произвести одну партию продукта. Клетки 293Т высевают в CF в среду 293Т (DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) с 10% FBS (фетальная телячья сыворотка)). Фабрики помещают в инкубатор при 37°С и горизонтально выравнивают для получения равномерного распределения клеток на всех слоях CF. Через двое суток клетки трансфицируют четырьмя лентивирусными плазмидами, описанными выше, с использованием способа с CaPO₄, который включает смесь Tris:EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 2 М CaCl₂, 2× HBS (человеческий сывороточный альбумин) и четырех ДНК плазмид. В сутки 3 после трансфекции супернатант, содержащий секретированные лентивирусные векторы, отбирают, очищают и концентрируют. После удаления супернатанта из CF из каждой CF отбирают клетки конца продуцирования. Клетки из каждой фабрики трипсинизируют и отбирают центрифугированием. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания и криоконсервируют. Данные клетки позднее используют для тестирования на лентивирус, компетентный в отношении репликации (RCL).

Для очистки и приготовления векторов в виде препарата неочищенный супернатант осветляют мембранной фильтрацией для удаления клеточных обломков. ДНК клетки-хозяина и остаточную плазмидную ДНК деградируют посредством расщепления эндонуклеазой (Бензоназа®). Вирусный супернатант осветляют от клеточных обломков с использованием 0,45 мкм фильтра. Осветленный супернатант отбирают в предварительно взвешенный контейнер, в который добавляют Бензоназу® (конечная концентрация 50 U/мл). Эндонуклеазное расщепление остаточной плазмидной ДНК и геномной ДНК хозяина проводится при 37°С в течение 6 ч. Для удаления остаточных низкомолекулярных компонентов из неочищенного супернатанта используется исходное концентрирование супернатанта, обработанного эндонуклеазой, посредством ультрафильтрации с тангенциальным потоком (TFF), концентрируя вирус в ~20 раз. Осветленный, обработанный эндонуклеазой вирусный супернатант циркулирует через картридж с полыми волокнами с NMWCO (номинальный порог отсечения молекулярной массы) 500 кДа при скорости тока, подобранной для поддержания скорости сдвига ~4000 с^-1 или меньше при максимизации скорости потока. Во время процесса концентрирования запускают диафильтрацию супернатанта, обработанного нуклеазой, для поддержания эффективности картриджа. С использованием 4%-ной лактозы в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в качестве диафильтрационного буфера устанавливается скорость замены пермеата 80%. Вирусный супернатант доводится до целевого объема, представляющего 20-кратное концентрирование неочищенного супернатанта, и диафильтрацию продолжают в течение 4 дополнительных смен объема со скоростью замены пермеата 100%.

Дальнейшее концентрирование вирусного продукта осуществляется с применением методики высокоскоростного центрифугирования. Каждую подпартию лентивируса осаждают с использованием центрифуги Sorvall RC-26 plus при 6000 об./мин (6088 RCF (относительная сила центрифугирования) при 6°С в течение 16-20 ч. Вирусный осадок из каждой подпартии затем растворяют в 50 мл объеме 4%-ной лактозы в PBS. Растворенный осадок в данном буфере представляет собой конечную композицию вирусного препарата. Весь процесс концентрирования вектора приводит приблизительно к 200-кратному уменьшению объема. После завершения получения всех подпартий материал затем помещают при -80°С, при тестировании образцов из каждой подпартии на стерильность. После подтверждения стерильности образца подпартии быстро оттаивают при 37°С с частым встряхиванием. Материал затем объединяют и вручную аликвотируют в боксе биологической безопасности Класса II Типа А/В3. Используется конфигурация заполнения 1 мл концентрированного лентивируса в стерильных криососудах класса 6 USP (Фармакопея США) с наружной резьбой и О-кольцом.

Для обеспечения чистоты препарата лентивирусного вектора его тестируют на остаточные загрязнения ДНК хозяина и перенос остаточной ДНК хозяина и плазмид. Наряду с другими тестами идентичность вектора оценивается посредством ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) для обеспечения того, что присутствует правильный вектор.

Пример 4: получение Т-клеток, подходящих для применения в ACT

Если Т_СМ подлежат применению для экспрессии CAR, подходящие клетки пациента могут быть получены следующим образом. Во-первых, Т-лимфоциты получают от пациента посредством лейкафереза, и подходящий под набор аллогенных или аутологических Т-клеток, например, центральных Т-клеток памяти (Т_СМ) генетически изменяется для экспрессии CAR, затем вводится обратно пациенту посредством любых клинически приемлемых способов для достижения противораковой терапии.

Подходящие Т_СМ могут быть получены следующим образом. Продукты афереза, полученные от участников исследования, подписавших информированное согласие, разделяют на фиколе, промывают и инкубируют в течение ночи. Клетки затем обедняют в отношении популяций моноцитов, регуляторных Т-клеток и наивных Т-клеток с использованием реактивов против CD14, против CD25 и против CD45RA уровня качества GMP (надлежащая медицинская практика) (Miltenyi Biotec) и прибора для разделения CliniMACS™. После обеднения негативная фракция клеток обогащается в отношении клеток Т_СМCD62L+ с использованием DREG56-биотина (клинический уровень качества СОН (City of Норе)) и микрошариков против биотина (Miltenyi Biotec) на приборе для разделения CliniMACS™.

После обогащения клетки Т_СМ готовят в полной X-Vivo15 плюс 50 IU (международные единицы)/мл IL-2 и 0,5 нг/мл IL-15 и переносят в тефлоновый мешок для культуры клеток, где они стимулируются шариками Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28. Вплоть до пяти суток после стимуляции клетки трансдуцируются лентивирусным вектором, экспрессирующим желательный CAR, при множественности заражения (MOI) от 1,0 до 0,3. Культуры поддерживаются в течение вплоть до 42 суток с добавлением полной X-Vivo15 и цитокинов IL-2 и IL-15, как требуется для размножения клеток (поддерживая плотность клеток от 3×10⁵до 2×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и осуществляя дополнение цитокинами каждый понедельник, среду и пятницу культивирования). При данных условиях клетки типично размножаются до приблизительно 10⁹ клеток в пределах 21 суток. В конце периода культивирования клетки отбирают, дважды промывают и готовят в виде препарата в криоконсервирующей среде клинического уровня качества (Cryostore CS5, BioLife Solutions).

В сутки инфузии Т-клеток криоконсервированный и выпущенный продукт оттаивают, промывают и готовят в виде препарата для повторной инфузии. Криоконсервированные сосуды, содержащие выпущенный клеточный продукт, удаляют из хранилища с жидким азотом, оттаивают, охлаждают и промывают промывочным буфером на основе PBS/2% человеческого сывороточного альбумина (HSA). После центрифугирования супернатант удаляют, и клетки ресуспендируют в инфузионном разбавителе на основе нормального физиологического раствора, не содержащего консервантов (PFNS)/2% HSA. Образцы удаляют для контроля качества.

Пример 5: экспрессия CAR, нацеленного на HER2

Фиг. 3А представляет собой схематическую диаграмму двух HER2-специфичных конструкций CAR, показанных на Фиг. 1 и Фиг. 2. В HER2(EQ)28ζ scFv связывается с мембраной модифицированным линкером на основе Fc IgG4 (двойной мутант, L235E; N297Q), содержит трансмембранный домен CD28, внутриклеточный костимулирующий домен CD28 и цитолитический домен CD3ζ. Последовательность перескакивания рибосомы Т2А отделяет CAR от усеченного белка CD19 (CD19t), используемого для отслеживания клеток. HER2(EQ)BBζ является аналогичным, за исключением того, что костимулирующим доменом является 4-1 ВВ, а не CD28, и трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD8, а не трансмембранный домен CD28. Человеческие центральные Т-клетки памяти (Т_СМ) трансфицировали лентивирусным вектором, экспрессирующим либо HER2(EQ)28ζ, либо HER2(EQ)BBζ. На Фиг. 3Б показаны репрезентативные данные FACS (флуоресцентная сортировка клеток) фенотипа поверхности человеческих Т_СМ. На Фиг. 3В показаны результаты анализов на экспрессию CD19 и белка L в Т_СМ, трансфицированных лентивирусным вектором, экспрессирующим либо HER2(EQ)28ζ, либо HER2(EQ)BBζ. Как можно видеть из данных результатов, эффективность трансфекции, оцениваемая по экспрессии CD19, была аналогичной для обоих CAR. Однако экспрессия белка L была ниже для HER2(EQ)BBζ, чем для HER2(EQ)28ζ, свидетельствуя о том, что CAR HER2(EQ)BBζ является менее стабильным, чем HER2(EQ)BBζ. Анализ размножения клеток (Фиг. 3Г) показывает то, что ни один из CAR не препятствует размножению Т-клеток.

Пример 6: характеризация in vitro Т-клеток с CAR против HER2 относительно разных линий клеток рака молочной железы

Для характеризации HER2(EQ)28ζ и HER2(EQ)BBζ использовали целый ряд линий клеток рака молочной железы, включающих HER2-негативные линии (лимфома LCL, MDA-MB-468, глиома U87), линии с низкой экспрессией HER2 (MDA-MB-361, 231BR) и линии с высокой экспрессией HER2 (SKBR3, ВТ474, ВВМ1). На Фиг. 4А показан уровень экспрессии HER2 каждой из этих линий. Для характеризации дегранулирования CD107a и продукции IFNγ использовали проточную цитометрию (сортирующую Т-клетки CAR+) на Т-клетках имитации (нетрансдуцированные), с CAR HER2(EQ)28ζ или HER2(EQ)BBζ после 5 ч сокультивирования либо с опухолевыми клетками MDA-MB-361 (с низкой экспрессией HER2), либо с опухолевыми клетками ВВМ1 (с высокой экспрессией HER2). Результаты данного анализа представлены на Фиг. 4Б. Аналогичные исследования проводили с другими линиями клеток рака молочной железы, и результаты обобщаются на Фиг. 4В. Продукцию IFNγ Т-клетками с CAR против HER2 после 24 ч культивирования с рекомбинантным белком HER2 или опухолями-мишенями измеряли ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), и результаты данного анализа показаны на Фиг. 4Г.

Пример 7: противоопухолевая активность in vitro

Проточную цитометрию использовали для оценки умерщвления опухолевых клеток после 72 ч сокультивирования Т-клеток имитации (нетрансдуцированные), с CAR HER2(EQ)28ζ или HER2(EQ)BBζ с опухолями-мишенями. Результаты данного анализа представлены на Фиг. 5А. Измеряли индукцию PD-1 и LAG-3 в общем пуле Т-клеток с CAR после 72 ч сокультивирования с HER2-негативными MDA-MB-468 или HER2-позитивными клетками ВВМ1, и результаты данного анализа представлены на Фиг. 5Б. Измеряли индукцию PD-1 в Т-клетках с CAR CD8+ после 72 ч сокультивирования с опухолями-мишенями, которые являются HER2-негативными (лимфома LCL, MDA-MB-468, глиома U87), с низкой экспрессией HER2 (MDA-MB-361, 231 BR) или с высокой экспрессией HER2 (SKBR3, ВТ474, ВВМ1), и результаты данного анализа представлены на Фиг. 5В. Данные исследования свидетельствуют о том, что HER2(EQ)BBζ вызывает меньшую индукцию PD-1, чем HER2(EQ)28ζ. Измеряли умерщвление опухолевых клеток при отношении эффектор : опухоль (Е:Т), варьирующем от 0,25:1 до 2:1 и для Т-клеток с CAR HER2(EQ)28ζ, и с CAR HER2(EQ)BBζ. Результаты данного анализа представлены на Фиг. 5Г, которая показывает то, что и HER2(EQ)28ζ, и HER2(EQ)BBζ являются эффективными в умерщвлении опухолевых клеток in vitro. Оцениваемую посредством CFSE (сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина) пролиферацию Т-клеток с CAR против HER2 измеряли проточной цитометрией после 72 ч сокультивирования с клетками MDA-MB-468 или ВВМ1. Результаты данного анализа представлены на Фиг. 5Д, которая показывает то, что Т-клетки с CAR HER2(EQ)BBζ пролиферируют более активно, чем Т-клетки с CAR HER2(EQ)2ζ.

Пример 8: противоопухолевая активность in vivo

Активность доставленных внутриопухолево Т-клеток с CAR против HER2 оценивали в полученной от пациента модели метастазов из молочной железы в мозг. Фиг. 6А-6В представляют собой окрашивание опухолей Н&Е (гематоксилин и эозин). Мышей обрабатывали инъекцией непосредственно в опухоль Т-клеток имитации (нетрансдуцированных) или с CAR HER2(EQ)BBζ. На Фиг. 6Г-6Е показаны результаты оптической визуализации опухолей, а на Фиг. 6Ж-6И - кривые выживания Каплана-Мейера для мышей, местно обработанных в сутки 3, либо 8, либо 14 после инъекции опухоли. Данные исследования показывают то, что Т-клетки с CAR HER2(EQ)BBζ имеют мощную противоопухолевую эффективность in vivo при инъецировании непосредственно в опухоль.

Для оценки противоопухолевой эффективности в моделях человеческих ксенотрансплантатов метастазов из молочной железы в мозг клетки ВВМ1 (0,2 М) или ВТ474 (0,15 М) вводили внутричерепной инъекцией мышам NSG. В сутки 8 после инъекции опухоли внутриопухолево инъецировали Т-клетки имитации (нетрансдуцированные) (IM), с HER2(EQ)28ζ или с HER2(EQ)BBζ. Опухоли ВВМ1 (Фиг. 7А) и ВТ474 (Фиг. 7Б) отслеживали посредством оптической визуализации на основе люциферазы. Кривые Каплана-Мейера представлены на Фиг. 7В и Фиг. 7Г.

Для оценки Т-клеток с CAR HER2(EQ)28ζ и HER2(EQ)BBζ также использовали происходящую от человеческого пациента ортотопическую модель ксенотрансплантата метастазов из молочной железы в мозг. На Фиг. 8А проиллюстрирована область имплантации опухоли посредством стереотаксической инъекции клеток ВВМ1 (0,2 М) и внутрижелудочковой доставки Т-клеток. Окрашивание опухолей показано на Фиг. 8Б. В сутки 14 после инъекции опухоли внутриопухолево инъецировали Т-клетки (0,5 М) с HER2(EQ)28ζ, HER2(EQ)BBζ или Т-клетки имитации (нетрансдуцированные). Рост опухоли отслеживали посредством оптической визуализации на основе люциферазы. На Фиг. 8В показаны средние значения потока для каждой группы обработки, и на Фиг. 8Г представлена кривая выживания Каплана-Мейера для каждой группы обработки.

Пример 9: дополнительные CAR, нацеленные на HER2

На Фиг. 9-14 показаны аминокислотные последовательности разных CAR, имеющих разные линкеры. В частности, данные CAR отличаются по последовательности и длине части между scFv, нацеленным на HER2, и трансмембранным доменом. Трансмембранный домен представляет собой CD8, CD28 или CD28gg. Костимулирующий домен представляет собой 4-1 ВВ или CD28. Все имеют стимулирующий домен CD3ζ. В каждом случае последовательность перескакивания рибосомы Т2А отделяет CAR от усеченного белка CD19 (CD19t), используемого для отслеживания клетки.

На Фиг. 15А схематически показаны разные CAR против HER2, которые являются идентичными, за исключением последовательности и длины части между scFv против HER2 и трансмембранным доменом CD8. Все включают костимулирующий домен 4-1ВВ, с последующим стимулирующим доменом CD3ζ. На Фиг. 15Б показаны результаты анализов на экспрессию CD19 и белка L в T_CM, трансфицированных лентивирусным вектором, экспрессирующим указанный CAR. Как можно видеть из данных результатов, эффективность трансфекции при оценке по экспрессии CD19 была аналогичной для обоих CAR. Однако экспрессия белка L была меньше для HER2(EQ)BBζ, чем для HER2(EQ)28ζ, свидетельствуя о том, что CAR HER2(EQ)BBζ является менее стабильным, чем HER2(EQ)BBζ. Анализ размножения клеток (Фиг. 15В) показывает то, что ни один из CAR не препятствует размножению Т-клеток. На Фиг. 16-18 показаны результаты дополнительных исследований, демонстрирующих то, что CAR с очень коротким спейсером (Фиг. 14) является относительно селективным в отношении клеток, экспрессирующих высокие уровни HER2. Такие CAR могут быть полезными в лечении раковых заболеваний, экспрессирующих HER, где желательно сохранять клетки, экспрессирующий более низкий уровень HER2, чем раковые клетки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ПРАЙСМЕН, Сол Дж.

ФОРМЭН, Стивен Дж.

БРАУН, Кристин Е.

<120> Химерные рецепторы антигена, нацеленные на HER2

<130> 40056-0021WO1

<140> US 15/773,754

<141> 2018-05-04

<150> PCT/US2016/060724

<151> 2016-11-04

<150> US 62/251,052

<151> 2015-11-04

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 245

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(245)

<223> scEv, нацеленный на HER2

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 2

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 2

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутировавшая шарнирная область IgG4

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(12)

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутировавшие шарнирная область и линкер химерного IgG4

<400> 5

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 6

<211> 39

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 7

<211> 48

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 8

<211> 45

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 8

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 9

<211> 129

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнирная область химерного IgG4 +

<400> 9

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

20 25 30

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

35 40 45

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

50 55 60

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

65 70 75 80

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

85 90 95

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

100 105 110

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

115 120 125

Lys

<210> 10

<211> 228

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутировавший IgG4

<400> 10

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys

225

<210> 11

<211> 229

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутировавший IgG4

<400> 11

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 12

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 12

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

100 105

<210> 13

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 13

Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ala Leu Phe Leu

20

<210> 14

<211> 27

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 15

<211> 28

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 15

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 16

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 17

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 17

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 18

<211> 23

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 18

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

20

<210> 19

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 19

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 20

<211> 28

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 21

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 21

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 22

<211> 41

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 22

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 23

<211> 41

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутировавший человеческий

<400> 23

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 24

<211> 42

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 24

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 25

<211> 42

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 26

<211> 1027

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-IgG4(L235E,

N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t

<400> 26

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser

275 280 285

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

290 295 300

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

305 310 315 320

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

325 330 335

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val

340 345 350

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

355 360 365

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

370 375 380

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

385 390 395 400

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

405 410 415

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

420 425 430

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

435 440 445

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

450 455 460

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

465 470 475 480

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

485 490 495

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

500 505 510

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

515 520 525

Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

530 535 540

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

545 550 555 560

Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

565 570 575

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

580 585 590

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

595 600 605

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

610 615 620

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

625 630 635 640

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

645 650 655

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

660 665 670

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg

675 680 685

Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

690 695 700

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

705 710 715 720

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

725 730 735

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

740 745 750

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

755 760 765

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

770 775 780

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

785 790 795 800

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

805 810 815

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

820 825 830

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

835 840 845

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

850 855 860

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro

865 870 875 880

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

885 890 895

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

900 905 910

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

915 920 925

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

930 935 940

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

945 950 955 960

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

965 970 975

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

980 985 990

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

995 1000 1005

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu

1010 1015 1020

Arg Arg Lys Arg

1025

<210> 27

<211> 1021

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

<400> 27

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser

275 280 285

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

290 295 300

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

305 310 315 320

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

325 330 335

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val

340 345 350

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

355 360 365

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

370 375 380

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

385 390 395 400

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

405 410 415

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

420 425 430

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

435 440 445

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

450 455 460

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

465 470 475 480

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

485 490 495

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

500 505 510

Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

515 520 525

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

530 535 540

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly

545 550 555 560

Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

565 570 575

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

580 585 590

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

595 600 605

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

610 615 620

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

625 630 635 640

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

645 650 655

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

660 665 670

Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys

675 680 685

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu

690 695 700

Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu

705 710 715 720

Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys

725 730 735

Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg

740 745 750

Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly

755 760 765

Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn

770 775 780

Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro

785 790 795 800

Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser

805 810 815

Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys

820 825 830

Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys

835 840 845

Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile

850 855 860

Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln

865 870 875 880

Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu

885 890 895

Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp

900 905 910

Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu

915 920 925

Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu

930 935 940

Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His

945 950 955 960

Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro

965 970 975

Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala

980 985 990

Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile

995 1000 1005

Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

1010 1015 1020

<210> 28

<211> 843

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-CD8шарнир-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

<400> 28

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Pro Thr Thr

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

275 280 285

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

290 295 300

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

305 310 315 320

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

325 330 335

Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

340 345 350

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

355 360 365

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly

370 375 380

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

385 390 395 400

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

405 410 415

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

420 425 430

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

435 440 445

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

450 455 460

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

465 470 475 480

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

500 505 510

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe

515 520 525

Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu

530 535 540

Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys

545 550 555 560

Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser

565 570 575

Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly

580 585 590

Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser

595 600 605

Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu

610 615 620

Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu

625 630 635 640

Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu

645 650 655

Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met

660 665 670

Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu

675 680 685

Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu

690 695 700

Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys

705 710 715 720

Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His

725 730 735

Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp

740 745 750

Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu

755 760 765

Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly

770 775 780

Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu

785 790 795 800

Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr

805 810 815

Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His

820 825 830

Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

835 840

<210> 29

<211> 814

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-Шарнир-Линкер-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

<400> 29

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

290 295 300

Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

305 310 315 320

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

325 330 335

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

340 345 350

Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

355 360 365

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

370 375 380

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

385 390 395 400

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

405 410 415

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

420 425 430

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

435 440 445

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

450 455 460

Pro Pro Arg Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys

465 470 475 480

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Leu Met Pro Pro Pro Arg

485 490 495

Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu

500 505 510

Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln

515 520 525

Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser

530 535 540

Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro

545 550 555 560

Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe

565 570 575

Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro

580 585 590

Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly

595 600 605

Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly

610 615 620

Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly

625 630 635 640

Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu

645 650 655

Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn

660 665 670

Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp

675 680 685

Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser

690 695 700

Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu

705 710 715 720

Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly

725 730 735

Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys

740 745 750

His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg

755 760 765

Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser

770 775 780

Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly

785 790 795 800

Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

805 810

<210> 30

<211> 921

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

<400> 30

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

290 295 300

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

325 330 335

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

340 345 350

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

355 360 365

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

370 375 380

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp

385 390 395 400

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

405 410 415

Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

420 425 430

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

435 440 445

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val

450 455 460

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

465 470 475 480

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

485 490 495

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

500 505 510

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

515 520 525

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

530 535 540

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

545 550 555 560

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

580 585 590

Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu

595 600 605

Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val

610 615 620

Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr

625 630 635 640

Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu

645 650 655

Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His

660 665 670

Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln

675 680 685

Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala

690 695 700

Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe

705 710 715 720

Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn

725 730 735

Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro

740 745 750

Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu

755 760 765

Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln

770 775 780

Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val

785 790 795 800

Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His

805 810 815

Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg

820 825 830

Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg

835 840 845

Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu

850 855 860

Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His

865 870 875 880

Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala

885 890 895

Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln

900 905 910

Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

915 920

<210> 31

<211> 927

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t

<400> 31

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly

260 265 270

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

290 295 300

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

325 330 335

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

340 345 350

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

355 360 365

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

370 375 380

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val

385 390 395 400

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

405 410 415

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly

420 425 430

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

435 440 445

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

465 470 475 480

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

485 490 495

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

500 505 510

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

515 520 525

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

530 535 540

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

545 550 555 560

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

565 570 575

Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu

580 585 590

Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro

595 600 605

Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro

610 615 620

Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu

625 630 635 640

Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp

645 650 655

Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu

660 665 670

Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile

675 680 685

Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly

690 695 700

Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu

705 710 715 720

Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu

725 730 735

Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser

740 745 750

Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro

755 760 765

Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu

770 775 780

Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu

785 790 795 800

Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu

805 810 815

Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu

820 825 830

Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr

835 840 845

Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr

850 855 860

Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala

865 870 875 880

Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val

885 890 895

Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val

900 905 910

Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

915 920 925

<210> 32

<211> 808

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-Линкер-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t

<400> 32

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Gly Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

275 280 285

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

290 295 300

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

305 310 315 320

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

325 330 335

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys

340 345 350

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

370 375 380

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

385 390 395 400

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

405 410 415

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

420 425 430

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

435 440 445

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly

450 455 460

Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

465 470 475 480

Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu

485 490 495

Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys

500 505 510

Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser

515 520 525

Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys

530 535 540

Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met

545 550 555 560

Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met

565 570 575

Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp

580 585 590

Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg

595 600 605

Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg

610 615 620

Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys

625 630 635 640

Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro

645 650 655

Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp

660 665 670

Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro

675 680 685

Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro

690 695 700

Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro

705 710 715 720

Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala

725 730 735

Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr

740 745 750

Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp

755 760 765

Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr

770 775 780

Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg

785 790 795 800

Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

805

<210> 33

<211> 802

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный

Her2scFv-Линкер-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

<400> 33

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

165 170 175

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Gly Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

275 280 285

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys

290 295 300

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

305 310 315 320

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

325 330 335

Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

340 345 350

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

355 360 365

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

370 375 380

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

385 390 395 400

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

405 410 415

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

420 425 430

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

435 440 445

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly

450 455 460

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met

465 470 475 480

Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu

485 490 495

Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn

500 505 510

Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln

515 520 525

Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser

530 535 540

Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp

545 550 555 560

Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys

565 570 575

Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val

580 585 590

Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu

595 600 605

Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser

610 615 620

Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys

625 630 635 640

Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg

645 650 655

Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly

660 665 670

Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg

675 680 685

Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu

690 695 700

Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val

705 710 715 720

Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly

725 730 735

Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu

740 745 750

Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly

755 760 765

Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys

770 775 780

Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg

785 790 795 800

Lys Arg

<210> 34

<211> 658

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-IgG4(L235E,

N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t минус лидер, TSA или CD19t

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

260 265 270

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

275 280 285

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

290 295 300

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

305 310 315 320

Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

325 330 335

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

340 345 350

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

355 360 365

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

370 375 380

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

405 410 415

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

420 425 430

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

435 440 445

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

450 455 460

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val

465 470 475 480

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

485 490 495

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser

500 505 510

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His

515 520 525

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly

530 535 540

Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

545 550 555 560

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

565 570 575

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

580 585 590

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

595 600 605

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

610 615 620

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

625 630 635 640

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

645 650 655

Pro Arg

<210> 35

<211> 652

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

260 265 270

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

275 280 285

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

290 295 300

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

305 310 315 320

Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

325 330 335

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

340 345 350

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

355 360 365

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

370 375 380

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

405 410 415

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

420 425 430

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

435 440 445

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

450 455 460

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

465 470 475 480

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys

485 490 495

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

500 505 510

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

515 520 525

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe

530 535 540

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

545 550 555 560

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

565 570 575

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

580 585 590

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

595 600 605

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

610 615 620

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

625 630 635 640

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645 650

<210> 36

<211> 474

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-CD8hinge-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

245 250 255

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

260 265 270

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

275 280 285

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

290 295 300

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Gly Gly Gly Lys Arg Gly

305 310 315 320

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

325 330 335

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

340 345 350

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg

355 360 365

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

370 375 380

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

385 390 395 400

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

405 410 415

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

420 425 430

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

435 440 445

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

450 455 460

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 37

<211> 445

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-Шарнир-Линкер-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ile Tyr Ile Trp Ala

260 265 270

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

275 280 285

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

290 295 300

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

305 310 315 320

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys

325 330 335

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

340 345 350

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

355 360 365

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

370 375 380

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

385 390 395 400

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

405 410 415

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

420 425 430

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435 440 445

<210> 38

<211> 552

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu

260 265 270

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

275 280 285

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

290 295 300

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

325 330 335

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

340 345 350

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

355 360 365

Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

370 375 380

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys

385 390 395 400

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

405 410 415

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

420 425 430

Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

435 440 445

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

450 455 460

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

465 470 475 480

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

485 490 495

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

500 505 510

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

515 520 525

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

530 535 540

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550

<210> 39

<211> 558

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu

260 265 270

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

275 280 285

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

290 295 300

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

325 330 335

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

340 345 350

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

355 360 365

Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

370 375 380

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

385 390 395 400

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn

405 410 415

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

420 425 430

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val

435 440 445

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

450 455 460

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

465 470 475 480

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

485 490 495

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

500 505 510

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

515 520 525

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

530 535 540

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550 555

<210> 40

<211> 439

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-Линкер-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met

245 250 255

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

260 265 270

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

275 280 285

Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

290 295 300

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

305 310 315 320

Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

325 330 335

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

340 345 350

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

355 360 365

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

370 375 380

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

385 390 395 400

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

405 410 415

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

420 425 430

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435

<210> 41

<211> 433

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> человеческий химерный Her2scFv-Линкер-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t

минус лидер, TSA или CD19t

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ile

245 250 255

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

260 265 270

Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

275 280 285

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

290 295 300

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly

305 310 315 320

Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

325 330 335

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

340 345 350

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

355 360 365

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

370 375 380

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

385 390 395 400

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

405 410 415

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

420 425 430

Arg

<210> 42

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> домен шарнирная область-линкер

<400> 42

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и может быть использована для лечения рака мозга. Раскрыта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный рецептор антигена, где данный химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27. Также раскрыты популяция человеческих Т-клеток, композиция для применения в лечении рака мозга, экспрессирующего HER2, у пациента и химерный рецептор антигена. Группа изобретений обеспечивает улучшенную противоопухолевую специфичность. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 18 ил., 3 табл., 9 пр.

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный рецептор антигена, где данный химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.

3. Популяция человеческих Т-клеток, содержащих экспрессионную кассету, кодирующую химерный рецептор антигена, где химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27.

4. Популяция человеческих Т-клеток по п. 3, где указанная популяция содержит центральные Т-клетки памяти.

5. Популяция человеческих Т-клеток по п. 3, где указанная популяция содержит Т-клетки памяти CD62L+.

6. Композиция, содержащая популяцию человеческих Т-клеток, содержащих экспрессионную кассету, кодирующую химерный рецептор антигена, где химерный рецептор антигена содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27, для применения в лечении рака мозга, экспрессирующего HER2, у пациента.

7. Композиция для применения по п. 6, где рак мозга, экспрессирующий HER2, представляет собой метастаз из молочной железы в мозг.

8. Композиция для применения по п. 6, где указанная популяция содержит центральные Т-клетки памяти.

9. Композиция для применения по п. 6, где указанная популяция содержит Т-клетки памяти CD62L+.

10. Композиция для применения по п. 6, где Т-клетки вводятся внутриопухолево или интравентрикулярно.

11. Химерный рецептор антигена, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27.

название	год	авторы	номер документа
ВВЕДЕНИЕ СКОНСТРУИРОВАННЫХ Т-КЛЕТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ	2017	Бади Бенхэм Браун Кристин Е. Формэн Стивен Дж. Прайсмен Сол Дж.	RU2757308C2
ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АНТИГЕНА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА PSCA	2016	Прайсмен, Сол Дж. Браун, Кристин Е. Формэн, Стивен Дж.	RU2759879C2
Т-КЛЕТКИ С КОСТИМУЛИРУЮЩИМ ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА IL13Rα2	2015	Браун Кристин Е. Формэн Стивен Дж.	RU2749922C2
ЦЕНТРАЛЬНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПАМЯТИ ДЛЯ АДОПТИВНОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ	2015	Браун Кристин Е. Формэн Стивен Дж.	RU2763523C2
Т-КЛЕТКИ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ХИМЕРНЫМ РЕЦЕПТОРОМ АНТИГЕНА, НАЦЕЛЕННЫМ НА CS1, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АМИЛОИДОЗА AL	2018	Ван, Сюли Формэн, Стивен Дж.	RU2774895C2
Т-КЛЕТКИ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ХИМЕРНЫМ РЕЦЕПТОРОМ АНТИГЕНА, НАЦЕЛЕННЫМ НА CS1	2015	Формэн Стивен Дж. Ван Сюли	RU2727451C2
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НЕПРИРОДНЫЕ ЛИГАНДЫ NKG2D, КОТОРЫЕ ИЗБИРАТЕЛЬНО ДОСТАВЛЯЮТ ПРИСОЕДИНЕННЫЕ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЕ МОЛЕКУЛЫ К НЕПРИРОДНЫМ РЕЦЕПТОРАМ NKG2D НА CAR-КЛЕТКАХ	2020	Ким, Каман Кайлин, Найджел Херциг, Эйтан Грин, Уорнер	RU2823728C2
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР КЛЕТОК	2015	Бедойа Фелипе Гхассеми Саба Джун Карл Х. Левин Брюс Л. Миленхорст Ян Дж. Майлон Майкл С. Пауэлл Дэниэл Дж. Мл. Чжэн Зоуи	RU2751362C2
ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА ПОДОБНЫЙ FC-РЕЦЕПТОРУ БЕЛОК 5, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2015	Брентдженс Ренье Дж. Смит Эрик Л. Лю Чэн	RU2779747C2
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДОМЕНЫ α1-α2 НЕПРИРОДНЫХ ЛИГАНДОВ NKG2D, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С НЕПРИРОДНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ NKG2D	2019	Ким, Каман К. Лэндграф, Кайл И.	RU2815278C2

WO 2014100385 A1, 26.06.2014
US 2014099309 A1, 10.04.2014
WO 2012050374 A2, 19.04.2012
Jonnalagadda M
et al
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды	1921	Богач Б.И.	SU4A1
Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса	1924	Шапошников Н.П.	SU2015A1
Прибор для испытания материалов на твердость	1924	Иоффе В.М.	SU757A1
КОМПОЗИЦИЯ АНТИТЕЛ К HER2	2005	Као Юн-Сиан Вандерлан Мартин	RU2361880C2
Якубке Х.-Д
и др

ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АНТИГЕНА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА HER2 Российский патент 2021 года по МПК A61K35/12 A61P35/00 C12N15/85

Описание патента на изобретение RU2753695C2

Похожие патенты RU2753695C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 753 695 C2

Реферат патента 2021 года ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АНТИГЕНА, НАЦЕЛЕННЫЕ НА HER2

Формула изобретения RU 2 753 695 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2753695C2

RU 2 753 695 C2