ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ТКАНИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C12N5/775 A61K35/28 A61P1/16 A61P3/10 A61P7/06 A61P17/02 A61Q19/00 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что мезенхимальные стволовые клетки (MSC) являются полезными в регенеративной медицине и инженерии тканей. У взрослых костный мозг, жировая ткань, зубная пульпа и менструальная кровь являются главными источниками MSC. Они также могут быть получены культивированием плацентарных клеток или клеток пуповины в течение 3-4 недель в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), дополненной FCS (фетальная телячья сыворотка) ([12], [13], [14]).

MSC имеют потенциал мезодермальной, эктодермальной и эндодермальной дифференциации. MSC также обладают иммунодепрессивными свойствами. MSC ингибируют или останавливают созревание дендритных клеток и пролиферацию Т-клеток, В-клеток и NK клеток (природные киллеры). Их иммуномодулирующее действие опосредуется цитокинами и хемокинами, которые они секретируют. Несколько групп продемонстрировали то, что MSC в пределах плацентарной ткани демонстрируют пластичность развития в направлении многих линий in vitro и in vivo. MSC, происходящие из плацентарной ткани (включающей пуповину, кровь пуповины, плаценту, хорион, амнион и амниотическую жидкость), демонстрируют позитивную экспрессию CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105, негативную экспрессию в отношении гематопоэтических поверхностных маркеров CD11b, CD19, CD34 и CD45, и негативную экспрессию в отношении эндотелиального поверхностного маркера CD31. Кроме того, MSC, происходящие из плацентарной ткани, в подходящих условиях (например, полная среда) способны к трансдифференциации в клетки всех трех зародышевых листков.

Также было показано то, что MSC, происходящие из перинатальной ткани, обладают широкими иммунорегулирующими способностями и способны влиять как на адаптивные, так и на врожденные иммунные ответы. Данные MSC ингибируют пролиферацию и созревание иммунных клеток и подавляют иммунные реакции как in vitro, так и in vivo, способом, не ограниченным МНС (главный комплекс гистосовместимости). Следовательно, считается, что данные MSC являются гипоиммуногеными, демонстрирующими низкие уровни экспрессии HLA (человеческий лейкоцитарный антиген) класса I, отсутствие экспрессии HLA класса II и отсутствие экспрессии костимулирующих молекул, включающих CD40, CD80 и CD86. В основном, данные MSC могли оказывать широкораспространенные иммуномодулирующие эффекты на клетки как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. Также было показано то, что MSC плаценты, размноженные ех vivo, подавляют активность широкого спектра иммунных клеток, включающих Т-клетки, Т-клетки природные киллеры (NKT), дендритные клетки (DC), В-клетки, нейтрофилы, моноциты, макрофаги и так далее.

Происходящие из человеческой перинатальной ткани MSC также являются безопасными согласно многочисленным отчетам о клинических испытаниях. Оценивали безопасность и исходную эффективность трансфузий MSC, происходящих из пуповины (UC-MSC), в отношении пациентов с обострением хронической печеночной недостаточности (ACLF), ассоциированной с инфекцией вирусом гепатита В (HBV). Данные результаты свидетельствовали о том, что трансфузии MSC являются безопасными в клинических условиях и могут служить в качестве нового терапевтического подхода для пациентов с ACLF, ассоциированной с HBV [1]. Также оценивали безопасность и эффективность человеческих UC-MSC в лечении ревматоидного артрита (RA). Данные результаты показали то, что не наблюдалось серьезных вредных эффектов во время или после инфузии. Кроме того, лечение MSC индуцировало значительную ремиссию заболевания согласно индексу активности заболевания суставов 28 [2]. Ученые оценивали безопасность и возможность внутримиокардиальной инъекции MSC у девяти пациентов вскоре после острого инфаркта миокарда (AMI) на протяжении кратковременного и 5-летнего последующего наблюдения [3]. Данные результаты свидетельствовали о том, что внутримиокардиальная инъекция MSC у пациентов вскоре после AMI является возможной и безопасной вплоть до 5-летнего последующего наблюдения. Проспективное двойное слепое рандомизированное многоцентровое исследование с контролем в виде плацебо для определения безопасности MSC у пациентов с критической ишемией конечностей показало то, что MSC также являются безопасными при внутримышечной инъекции в дозе 2 миллиона клеток/кг массы тела [4]. В каком-либо из мест имплантации MSC не выявляли осложнений в виде новообразований. Hongye Fan et al ([15]) показали то, что пересадка примированных IL1β (интерлейкин-1бета) MSC имеет повышенную терапевтическую эффективность при мышином колите, индуцированном DSS, которая зависит от их повышенных иммунодепрессивных способностей и повышенной способности к миграции. В WO 2014/093948 также раскрыто терапевтическое значение очищенных MSC.

Однако определение MSC всегда было противоречивым, так как нет специфичного или уникального маркера клеточной поверхности, однозначно их идентифицирующего. До настоящего времени MSC определяли с использованием комбинации фенотипических белковых маркеров клеточной поверхности, пластичного, прикрепленного, фибробластоподобного роста и функциональных свойств. Тем не менее, согласно данным маркерам клеточной поверхности, есть несколько разных субпопуляций, и эти разные субпопуляции демонстрируют разные биологические характеристики, биологические функции, и не все являются эффективными в протоколах лечения. Например, некоторые популяции MSC стимулируются IL1β ([12]), тогда как другие популяции не стимулируются (CD106-позитивные MSC в [15]). Кроме того, пролиферация некоторых популяций MSC ингибируется IL4 ([12]), тогда как другие индуцируются к пролиферации в присутствии данного цитокина ([13]). Следовательно, существует срочная необходимость в идентификации популяции функциональных MSC, которые имеют клиническую эффективность, и стандартизации их способа получения. Также важно установить протокол, который можно взаимозаменяемо использовать на каждой плацентарной и внеэмбриональной ткани. Более конкретно, важно идентифицировать способ получения, который дает терапевтически эффективные популяции MSC либо из плацентарной ткани, либо из фрагментов пуповины.

Тем временем, сейчас имеется большая потребность в человеческих MSC для разных терапевтических приложений, но недостаточная доступность на рынке. Следовательно, существует необходимость в способе промышленного масштаба, дающем высокий выход функциональных MSC. Также существует необходимость в эффективной системе культивирования, которая дает оптимальный выход по приемлемой цене, уменьшая, посредством этого, разрыв между спросом и предложением в отношении MSC, полученных из всех плацентарных и внеэмбриональных тканей.

Настоящая заявка удовлетворяет все эти и другие потребности, предлагая оптимальный способ получения и очистки субпопуляций MSC разных происхождений (либо из плацентарной ткани, либо из пуповины), и, в конечном счете, размножения указанной подпопуляции с использованием наименьшего возможного числа пассажей и минимального числа удвоений популяций. Данный способ приводит к выделению из плацентарной ткани и из ткани пуповины высокоэффективных MSC, имеющих способность к дифференциации в направлении разных линий. Этот способ воспроизводимо дает значительное число клеток MSC, которые подходят для клинического применения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В Примере 1 (см. ниже) раскрыт способ получения для генерации происходящих из ткани человеческой плаценты CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в промышленном масштабе, обеспечивающий получение выхода MSC по меньшей мере 1×10⁵ клеток/см², которые получают в помещении, соответствующем GMP (надлежащая производственная практика), и которые подходят для аллогенного применения. Указанные происходящие из плацентарной ткани CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки (MSC) содержат свыше 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Данный способ является полезным для получения клеток, которые можно использовать в испытаниях по пересадке в человеческого субъекта или в животное.

Он включает две следующие общие стадии:

(i) культивирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из биологической ткани или жидкости, в первой культуральной среде, лишенной факторов роста, таким образом, чтобы получить популяцию культивируемых недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,

и

(ii) приведение указанной популяции культивируемых недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток в контакт со второй культуральной средой, содержащей провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы, генерируя, посредством этого, CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки, полезные для трансплантации субъекту, нуждающемуся в этом.

В первом аспекте данное изобретение относится к способу in vitro получения CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в промышленном масштабе, причем указанный способ включает культивирование популяции недифференцированных MSC в культуральной среде, содержащей провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы.

Указанная «популяция недифференцированных MSC» может быть получена отбором одноядерных клеток, присутствующих в биологической ткани или жидкости, и выращивания их в первой культуральной среде. Данные одноядерные клетки можно получать любыми традиционными способами, например, ферментативным расщеплением или культивированием экспланта кусков перинатальной ткани [10], или выделением из биологических жидкостей [11].

Культивирование экспланта является особенно предпочтительным способом получения MSC из пуповин в том виде, как раскрыто в Примере 3 ниже.

Типично для данного способа требуется удаление образца из транспортного раствора для разрезания его на отрезки (грубо 2-3 см в длину) для их дезинфекции антибиотиками и противогрибковыми средствами, которые позднее отмываются для выделения эпителиальной мембраны и распределения кусочков указанной мембраны во флаконы для их прикрепления (предпочтительно без среды, при комнатной температуре), перед аккуратным добавлением полной среды на прикрепленные экспланты и выдерживанием их с инкубацией при 37°С в течение нескольких суток. Мигрирующие клетки, в конечном счете, собирают с использованием подходящих инструментов и поддерживают в культуре в подходящей первой среде (см. ниже), пока они не достигают целевой конфлюентности.

Указанная «первая культуральная среда» может представлять собой любую классическую среду, обычно используемую для благоприятствования росту живых первичных клеток. Предпочтительно она не содержит ни каких-либо факторов роста, ни каких-либо факторов дифференциации.

Специалисту хорошо известно, какие виды культуральных сред можно использовать в качестве «первой культуральной среды». Они представляют собой, например, DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), DMEM/F12, MEM (минимальная питательная среда), альфа-MEM (α-МЕМ), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков) или RPMI. Предпочтительно указанная первая культуральная среда представляет собой DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) или DMEM/F12 (среда Игла, модифицированная по Дульбекко: питательная смесь F-12).

Более предпочтительно, указанная первая культуральная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячей сыворотки. В качестве альтернативы, указанная первая культуральная среда может содержать 1-5% лизата тромбоцитов. Наиболее предпочтительная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячей сыворотки и 1-5% лизата тромбоцитов.

Также возможно использовать в качестве первой культуральной среды среду, которая лишена сыворотки или лизата тромбоцитов, при условии, что она содержит другие подходящие агенты, благоприятствующие росту живых первичных клеток.

В предпочтительном воплощении указанная «биологическая ткань» представляет собой любую часть плацентарной ткани или пуповины. В частности, она может включать или состоять из ворсинок плаценты, амниотической мембраны или хорионической мембраны плаценты. Она также может представлять собой вартонов студень, находящийся в пуповине. Она может включать вены и/или артерии, или быть лишена их.

В другом воплощении указанная «биологическая жидкость» представляет собой образец крови пуповины, плацентарной крови или амниотической жидкости, которую безвредным способом отобрали у женщины или, в общем, у млекопитающего. Например, данные ткани и жидкости можно получать после родов ребенка или потомства, без каких-либо инвазивных процедур.

Указанная популяция недифференцированных MSC предпочтительно представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, посеянных на пластмассовую поверхность, которые культивировали в указанной первой культуральной среде, лишенной какого-либо фактора роста, пока клетки не достигали конфлюентности 85-90%.

Данные клетки регулярно фенотипически характеризовали FACS (флуоресцентная сортировка клеток) или любыми традиционными способами для того, чтобы выявлять уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR.

Когда 95% клеток экспрессируют позитивные маркеры поверхности CD73, CD90, CD105 и CD166 и меньше, чем 2% экспрессируют негативные маркеры поверхности CD45, CD34 и HLA-DR, данные клетки трипсинизируют и вновь высевают при низкой плотности, например, при плотности от 1000 до 5000 MSC на см² во вторую культуральную среду.

Предпочтительно указанная «вторая культуральная среда» представляет собой любую классическую среду, обычно используемую для благоприятствования росту живых первичных клеток. Она может быть такой же, как и «первая культуральная среда», или она может быть другой средой, выбранной, например, среди DMEM, DMEM/F12, MEM, альфа-MEM (α-МЕМ), IMDM или RPMI. Более предпочтительно, указанная вторая культуральная среда представляет собой DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) или DMEM/F12 (среда Игла, модифицированная по Дульбекко: питательная смесь F-12).

Даже более предпочтительно, указанная вторая культуральная среда содержит сыворотку или лизат тромбоцитов, например, 2-20% фетальной телячьей сыворотки и/или 1-5% лизата тромбоцитов. Наиболее предпочтительная вторая среда представляет собой DMEM, содержащую 2-20% фетальной телячьей сыворотки и 1-5% лизата тромбоцитов. Также возможно применять в качестве второй культуральной среды среду, которая лишена сыворотки или лизата тромбоцитов, при условии, что она содержит другие подходящие агенты, благоприятствующие росту живых первичных клеток.

При достижении клетками конфлюентности 40-50%, во вторую культуральную среду добавляют провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы, и клетки культивируют в указанной среде, пока они не достигают конфлюентности 90-95%.

Указанные «провоспалительные факторы роста» типично представляют собой интерлейкины или хемокины, для которых известно, что они имеют провоспалительный эффект. Примеры интерлейкинов, которые можно добавлять во вторую культуральную среду, включают TNFα (фактор некроза опухолей альфа), IL1 (интерлейкин 1), IL4, IL12, IL18 и IFNγ (интерферон гамма). Примеры хемокинов, которые можно добавлять во вторую культуральную среду, включают CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CCL2 и CCL5. Можно использовать другие воспалительные медиаторы (такие как противовоспалительные агенты).

В предпочтительном воплощении во вторую культуральную среду, определенную выше, добавляют по меньшей мере два провоспалительных фактора роста. Данные по меньшей мере два провоспалительных фактора роста выбирают в группе, состоящей из TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18 и IFNγ. В более предпочтительном воплощении указанные провоспалительные факторы роста выбирают среди IL1, IL4, IL12 и IL18. Даже более предпочтительно они представляют собой IL1 и IL4.

Типичная концентрация фактора(ров) роста, которую можно добавлять к MSC, составляет 1-200 нг/мл, предпочтительно 1-100 нг/мл, более предпочтительно 10-80 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования MSC с фактором(рами) роста длиться в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.

Термин «IL1» в данном документе обозначает любую изоформу интерлейкина 1, в частности, IL1α и IL1β. Изоформы IL1 могут быть разного происхождения, в зависимости от намеченного применения. Например, животный IL1 можно использовать для ветеринарных применений. Предпочтительно во вторую культуральную среду по изобретению добавляют только IL1β. В данном конкретном воплощении концентрация добавленного интерлейкина 1β может составлять 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл.

Ссылка на человеческий IL1бета (IL1β) дается с номером доступа NP_000567.1 (SEQ ID NO: 6, 269 аминокислот). Рекомбинантный белок имеется в продаже согласно условиям GMP (R&D Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).

Термин «IL4» в данном документе обозначает любую изоформу интерлейкина 4. IL4 может быть разных происхождений, в зависимости от намеченного применения. Например, животный IL4 можно использовать для ветеринарных применений.

Ссылка на человеческий IL4 дается с номером доступа ААА59149 (SEQ ID NO: 7, 153 аминокислоты). Рекомбинантный белок имеется в продаже согласно условиям GMP (R&D Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).

Во второй среде по изобретению можно использовать любую смесь разных провоспалительных факторов роста. В частности, предпочтительным воплощением является применение смеси IL1 и IL4, более конкретно IL1β и IL4, как раскрыто в экспериментальной части ниже.

В данном конкретном воплощении добавленный интерлейкин 1β имеет во второй культуральной среде концентрацию, составляющую 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл, и добавленный IL4 имеет концентрацию, составляющую 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования с интерлейкином 1β и IL4 длится в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.

На финальной стадии клетки фенотипически характеризуются любыми традиционными способами для того, чтобы выявить уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR. Данные маркеры являются хорошо известными в данной области. Все полезные для выявления уровня экспрессии данных маркеров антитела имеются в продаже.

Экспрессия данных маркеров клеточной поверхности может, в частности, оцениваться с использованием хорошо известных технологий, таких как окрашивание клеточной мембраны с использованием биотинилирования или других эквивалентных методик, с последующей иммунопреципитацией с использованием специфичных антител, проточная цитометрия, вестерн-блоттинг, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или ELISPOT (метод иммуноферментных пятен), микрочипы с антителами или тканевые микрочипы в сочетании с иммуногистохимией. Другие подходящие методики включают FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции) или BRET (резонансный перенос энергии биолюминисценции), микроскопические или гистохимические способы на основе единичных клеток с использованием одной или многих длин волн возбуждения и применение любого из адаптированных оптических способов, таких как электрохимические способы (методики вольтметрии и амперометрии), атомно-силовая микроскопия и способы на основе радиочастоты, например, мультиполярная резонансная спектроскопия, конфокальная и неконфокальная, выявление флуоресценции, люминисценции, хемилюминисценции, поглощения, отражательной способности, коэффициента пропускания и коэффициента двойного преломления или преломления (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрия, способ резонансного зеркала, дифракционное соединение волноводов или интерферометрия), клеточный ELISA, радиоизотопная, магнитно-резонансная визуализация, анализ посредством электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE); ВЭЖХ(высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия); жидкостная хроматография/масс-спектрометрия/масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС).

Предпочтительно уровни маркеров клеточной поверхности оцениваются посредством FACS. Другими словами, способ по изобретению, как правило, требует следующего:

a) сбор одноядерных клеток, содержащихся в перинатальной биологической ткани или жидкости,

b) обеспечение роста указанных одноядерных клеток в первой культуральной среде, пока они не достигнут конфлюентноси 85-90%, предпочтительно на пластмассовой поверхности,

c) как только 95% клеток экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 и меньше, чем 2% экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR, посев клеток при плотности от 1000 до 5000 MSC на см² во вторую культуральную среду,

d) добавление 1-100 нг/мл воспалительных медиаторов или провоспалительных факторов роста, как только клетки достигнут конфлюентности 40-50%,

е) сбор клеток при достижении ими конфлюентности 90-95%.

Собранные клетки могут быть затем фенотипически охарактеризованы посредством FACS или любых традиционных способов для того, чтобы выявлять уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR. Указанные первая и вторая культуральные среды были описаны выше.

На стадии d) указанного способа типичная концентрация добавленного(ных) фактора(ров) роста составляет 1-200 нг/мл, предпочтительно 1-100 нг/мл, более предпочтительно 10-80 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования с фактором(рами) роста длится в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.

В конкретном воплощении изобретения концентрация добавленного интерлейкина 1β или IL4 может составлять 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования с интерлейкином 1β и IL4 длится в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.

Конечные отобранные клетки будут представлять собой «культуру клеток по изобретению» или «СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC по изобретению» или «MSC по изобретению». Данная культура клеток типично содержит свыше 60%, предпочтительно от 60 до 70%, предпочтительно свыше 70%, предпочтительно свыше 80%, более предпочтительно свыше 90% и даже более предпочтительно свыше 95% клеток, экспрессирующих CD106. Более того, она содержит свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих CD151. Кроме того, она содержит свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих нестин. Наконец, она содержит свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток, экспрессирующих позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и содержит меньше, чем 2% клеток, экспрессирующих негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Известно, что CD106 (также известный как VCAM-1 - «белок адгезии сосудистого эндотелия 1 типа») имеет три изоформы. NP_001069.1 (именуемый в данном документе SEQ ID NO: 1, 739 аминокислот), NP_542413.1 (именуемый в данном документе SEQ ID NO: 2, 647 аминокислот) и NP_001186763.1 (именуемый в данном документе SEQ ID NO: 3, 677 аминокислот) представляют собой последовательности изоформ a, b и с соответственно. Антитела для выявления уровня экспрессии данного конкретного биомаркера имеются в продаже (например, у Thermofisher, Abeam, OriGen и т.д.). Экспрессия данного маркера на поверхности клеток по изобретению является очень важной, так как он запускает проангиогенные активности, которые являются существенными для их терапевтического применения.

На биомаркер нестин (на него дается ссылка в данном документе как SEQ ID NO: 4, 1621 аминокислота) у человека дается ссылка под номером NP_006608.1. Антитела для выявления уровня экспрессии данного конкретного биомаркера имеются в продаже (например, у Thermofisher, Abeam и т.д.).

На биомаркер CD151 (на него дается ссылка в данном документе как SEQ ID NO: 5, 253 аминокислоты) у человека дается ссылка под номером NP_620599. Антитела для выявления уровня экспрессии данного конкретного биомаркера имеются в продаже (например, у Invitrogen, Sigma-Aldrich, Abeam и т.д.).

В предпочтительном воплощении стадии культивирования (или стадии выращивания) проводятся на пластмассовой поверхности.

Более конкретно, способ по изобретению может включать следующие стадии:

a) возможно раздельный отбор плацентарных тканей от многих доноров;

b) возможно промывка плацентарной ткани три раза с использованием 1× PBS, рассечение на 1 мм³ кубики и повторная промывка ткани кубиков для удаления из данной ткани большей части крови;

c) возможно расщепление плацентарной ткани каждого донора раздельно коллагеназой, центрифугирование расщепленной ткани и сбор одноядерных клеток;

d) посев отобранных одноядерных клеток в культуральную среду;

e) трипсинизация и пассирование клеток, как только они достигают 85-90%-ной конфлюентности;

f) характеризация данных клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR;

д) посев клеток в культуральную среду, содержащую 90% среды Игла, модифицированной по Дульбекко/нокаут F12 (DMEM/F12-KO), 10% FBS и факторы роста при плотности посева от 1000 до 5000 MSC на см², когда они содержат по меньшей мере 95% позитивных маркеров и самое большее 2% негативных маркеров;

h) добавление 1-100 нг/мл интерлейкина 1β и возможно 1-100 нг/мл IL4, когда они являются конфлюентными на 40-50%;

i) трипсинизация и сбор клеток, как только они достигают конфлюентности 90-95%; и

j) возможно характеризация клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Раскрытые ниже результаты показывают то, что экспрессия CD106 значительно усиливается на поверхности MSC, полученных способом по изобретению либо из пуповины, либо из плаценты. Данная экспрессия является весьма важной для терапевтического применения клеток, полученных таким образом (см. ниже).

Настоящая заявка, следовательно, также относится к способу увеличения уровня экспрессии CD106 недифференцированных MSC, причем указанный способ включает культивирование популяции недифференцированных MSC в конкретных условиях, тщательно раскрытых выше, причем все подробные воплощения применяются с учетом необходимых изменений.

В другом аспекте данное изобретение относится к культуре клеток, полученной вышеописанным способом. Данная культура клеток, как правило, содержит выделенные СD106высокая СD151⁺ Нестин⁺ MSC, экспрессирующие маркер - молекулу адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1) на выявляемо более высоком уровне, чем мезенхимальные своловые клетки, происходящие из костного мозга взрослого, жировой ткани, пуповины или плаценты, которые не находились в контакте с любыми факторами роста во время их получения.

В предпочтительном воплощении культура клеток по изобретению отличается тем, что:

(i) свыше 60%, предпочтительно свыше 70%, более предпочтительно свыше 80% и даже более предпочтительно свыше 90% клеток экспрессируют CD106 на выявляемом уровне, и

(ii) свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток экспрессируют CD151 на выявляемом уровне, и

(iii) свыше 90%, предпочтительно свыше 92%, более предпочтительно свыше 95% клеток экспрессируют нестин на выявляемом уровне, и

(iv) свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне.

В более предпочтительном воплощении указанная культура клеток отличается тем, что она содержит свыше 98% MSC, которые не экспрессируют маркеры CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104 и CD133 на выявляемом уровне. Данные маркеры являются хорошо известными в данной области, и выявляющие их антитела имеются в продаже.

В предпочтительном воплощении культура клеток по изобретению содержит:

- свыше 60%, предпочтительно свыше 70%, более предпочтительно свыше 80% и даже более предпочтительно свыше 90% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне, и

- свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне, и

- свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне, и

- свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне.

Согласно настоящему изобретению клетка «экспрессирует маркер на выявляемом уровне», если указанный маркер присутствует на ее поверхности на значительном уровне, т.е. если сигнал, ассоциированный с окрашиванием указанного поверхностного маркера (типично полученный с антителом, распознающим указанный маркер, причем указанное антитело, например, связано с флуоресцентным красителем), который измеряется для указанной клетки, превышает сигнал, соответствующий окрашиванию одной клетки, известной как не экспрессирующая указанный маркер. Специалисту хорошо известно как идентифицировать указанные клетки/маркеры, таким образом, что данные протоколы не нужно здесь подробно описывать.

Результаты, раскрытые в экспериментальной части настоящей заявки, показывают то, что культура клеток, полученная способом по изобретению, способна индуцировать ангиогенез in vitro и in vivo. Данные результаты, кроме того, показывают то, что введение указанных клеток индивидам (человеческим или животным субъектам), страдающим от ишемического заболевания или от расстройства системы кровообращения, приводит к выявляемому улучшению одного или более симптомов указанного заболевания или расстройства.

Результаты, раскрытые ниже, также показывают то, что способы по изобретению способны давать клетки, экспрессирующие высокий уровень мембранного белка CD106 / VCAM1. Важно то, что данный белок недавно был ассоциирован с экспрессией проангиогенных цитокинов. Следовательно, CD106+ MSC были выбраны из-за их проангиогенной эффективности и предложены в качестве лечения ишемии задних конечностей ([16], [17]).

Следовательно, в третьем аспекте изобретение относится к применению указанных клеток в качестве лекарственного средства для лечения индивида, страдающего от ишемического заболевания или от расстройства системы кровообращения. Другими словами, данное изобретение относится к применению указанных клеток для изготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в лечении субъектов, страдающих от ишемического заболевания или от расстройства системы кровообращения. Лекарственное средство по изобретению также может наноситься на сосудистую капиллярную сеть кожи и может включать дерматологические и косметические применения.

Клетками по изобретению можно лечить любое млекопитающее. Указанное млекопитающее может представлять собой домашнее животное (собака, кошка, лошадь и т.д.) или животное - крупный рогатый скот (овца, коза, корова и т.д.). Для специалиста очевидно то, что, когда животное подлежит лечению согласно способу по изобретению, исходные недифференцированные MSC будут получены из биологического образца из того же самого вида животного (аллогенный трансплантат) или из аналогичного вида (гетерологичный трансплантат), и факторы роста, которые используются во второй культуральной среде, будут соответствовать факторам роста того же самого вида животных. Например, если лечению подлежит кошка, тогда исходные MSC будут получены из перинатальной ткани или биологической жидкости кошки, и IL1β кошки (рекомбинантный или нерекомбинантный) будет добавлен во вторую культуральную среду, возможно наряду с IL4 кошки.

В предпочтительном воплощении указанное млекопитающее представляет собой человека. В данном случае исходные MSC будут получены из перинатальной ткани или из биологической жидкости, полученной от женщины, и человеческий IL1β (рекомбинантный или нерекомбинантный, например, SEQ ID NO: 6) будет добавлен во вторую культуральную среду, возможно наряду с человеческим IL4 (например, SEQ ID NO: 7).

С данной целью культуру клеток по изобретению можно пересаживать или наносить местно указанному субъекту любыми традиционными способами. В данном случае настоящее изобретение направлено на способ лечения субъекта, страдающего от ишемического заболевния, расстройства системы кровообращения, иммунопатологии, повреждения органа или нарушения функции органа, причем указанный способ включает стадию пересадки описанной выше культуры клеток указанному субъекту. Данная пересадка может осуществляться с использованием имплантированного резервуара или посредством инъецирования клеток в мышцу in situ, или посредством внутривенных инъекций, или посредством любой подходящей системы доставки. Данное применение также может осуществляться местно, посредством прямого приведения в контакт клеток с кожей или слизистой оболочкой, или посредством нанесения клеток на кожу или на любую слизистую оболочку устройством, или посредством доставки клеток на кожу или слизистую оболочку любой подходящей системой доставки.

Предпочтительно указанное заболевание или расстройство выбрано в группе, состоящей из следующих: сахарный диабет типа I, диабет типа II, GVHD (болезнь «трансплантат против хозяина»), апластическая анемия, рассеянный склероз, мышечная дистрофия Дюшенна, ревматоидный артрит, мозговой инсульт, идиопатический легочный фиброз, дилатационная кардиомиопатия, остеоартрит, цирроз, печеночная недостаточность, почечная недостаточность, окклюзионное заболевание периферических артерий, критическая ишемия конечностей, заболевание периферических сосудов, сердечная недостаточность, диабетическая язва или любое дегенеративное заболевание, синехия, эндометриальное расстройство или фиброзное расстройство желудочно-кишечного тракта, такое как анальный свищ. Более предпочтительно указаное заболевание или расстройство представляет собой окклюзионное заболевание периферических артерий, критическую ишемию конечностей, заболевание периферических сосудов или диабетическую язву. В конкретном воплощении указаное заболевание или расстройство представляет собой заболевание кожи или слизистой оболочки, включающее диабетическую язву, язву, травму, ожог, ожог горячей жидкостью, рану или проблему с заживлением раны, пролежень, бородавку и т.д. (но не ограничивающееся ими).

Культура клеток по изобретению может, в частности, использоваться в дерматологическом препарате, целью которого является лечение патологий кожи, таких как ожоги, раны, язвы, шрамы, бородавки, или других заболеваний, таких как синехия или фиброзные расстройства желудочно-кишечного тракта (например, анальный свищ).

В другом конкретном воплощении указанное заболевание или расстройство представляет собой анальный свищ или повреждение эндометрия.

Настоящей заявкой охватываются другие применения. В частности, возможно применение MSC по изобретнию для дерматологических или косметических целей, например, для регенерации клеток кожи или слизистой оболочки, улучшения внешнего вида кожи или слизистой оболочки, исправления дефекта кожи или слизистой оболочки или для лечения ожоговой области кожи или слизистой оболочки.

Для того чтобы увеличить эффективность и облегчить введение лекарственного средства по изобретению, культуру клеток по изобретению можно смешивать с любым агентом, композицией агентов или другим биологически совместимым веществом или устройством. Культура клеток по изобретению также может быть инкапсулирована или включена в любую подходящую систему доставки или биосовместимое вещество. Данные клетки или препарат, содержащий данные клетки, может быть нанесен с использованием медицинского устройства, такого как, например, эндоскоп, стент или шприц. Он также может быть нанесен местно посредством приведения клеток в контакт с кожей или слизистой.

Настоящее изобретение также нацелено на медицинское устройство, содержащее культуру клеток по изобретению. Под термином «медицинское устройство» в данном документе охватывается любой прибор, аппарат, инструмент, машина, приспособление, имплант, реактив для введения терапевтической композиции. В контексте данного изобретения указанное медицинское устройство представляет собой, например, пластырь, стент, эндоскоп или шприц.

Настоящее изобретение также нацелено на систему доставки, содержащую культуру клеток по изобретению. Под термином «система доставки» в данном документе охватывается любая система (среда или носитель) для введения пациенту фармацевтического продукта. Она может представлять собой систему пероральной доставки или систему с контролируемым высвобождением. В контексте данного изобретения указанная система доставки представляет собой, например, липосомы, пролипосомы, микросферы, микро- или нановезикулы из биополимеров, липидов или наночастиц.

В предпочтительном воплощении изобретения клетки по изобретению включаются в гидрогель или другое биосовместимое вещество или эксципиент. Указанный гидрогель может включать, в частности, гидрогель альгината натрия, гидрогель гиалуроновой кислоты, гидрогель хитозана, гидрогель коллагена, гидрогель НРМС (гидроксипропилметилцеллюлоза), гидрогель поли-L-лизина, гидрогель поли-L-глутаминовой кислоты, гидрогель поливинилового спирта (PVA), гидрогель полиакриловой кислоты, гидрогель полиметакриловой кислоты, гидрогель полиакриламида (РАМ) и гидрогель поли-N-акриламида (PNAM).

Настоящее изобретение также относится к гидрогелю, содержащему MSC по изобретению и возможно другое биосовместимое вещество или эксципиент. Альгинатный гидрогель является предпочтительным в данном документе, такой как альгинатный гидрогель, описанный в CN 106538515.

В контексте настоящего изобретения «биосовместимые вещества» представляют собой вещества, классически используемые в биомедицинских приложениях. Они представляют собой, например, металлы (такие как нержавеющая сталь, сплавы кобальта, сплавы титана), керамику (оксид алюминия, двуокись циркония, фосфаты кальция), полимеры (силиконы, поли(этилен), поли(винилхлорид), полиуретаны, полилактиды) или природные полимеры (альгинат, коллаген, желатин, эластин и т.д.). Данные вещества могут быть синтетическими или природными. Биосовместимые эксципиенты являются хорошо известными в данной области и, следовательно, не нуждаются в подробном описании.

Данный гидрогель может использоваться для косметических или терапевтических целей.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или ветеринарной композиции, содержащей культуру клеток по изобретению, а также ее применению для лечения заболеваний и расстройств, упомянутых выше. Оно также касается дерматологической или косметической композиции, содержащей культуру клеток по изобретению.

Данная фармацевтическая, ветеринарная или косметическая копозиция может дополнительно содержать другие биосовместимые агенты (например, гидрогель), как описано выше.

Указанная композиция предпочтительно содержит по меньшей мере примерно от 1 до 5×10⁶ клеток.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Для того чтобы данное раскрытие можно было легко понять и воплотить на практике, теперь будет сделана ссылка на типичные воплощения и иллюстрированные графические материалы. Данные графические материалы вместе с подробным описанием ниже служат для дополнительной иллюстрации воплощений и объяснения разных принципов и преимуществ согласно настоящему раскрытию.

На Фиг. 1 описана диаграмма, показывающая как может быть получена субпопуляция CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC по изобретению.

На Фиг. 2 показана морфология MSC, прикрепленных к культуральным флаконам, в плаценте согласно Примеру 1.

На Фиг. 3 показана адипогенная и остеогенная дифференциация клеток CD106^{высокая} CD151⁺ нестин⁺ MSC. Данные результаты показывают то, что субпопуляция CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC способна к адипогенной и остеогенной дифференциации в подходящей среде. Белые стрелки подчеркивают липидные капельки и сильно минерализованную область.

На Фиг. 4 показано патологическое исследование посредством ангиографии: репрезентативные ангиограммы, полученные в послеоперационные сутки 21.

На Фиг. 5 показано патологическое исследование посредством LDPI: репрезентативные изображения LDPI, полученные в послеоперационные сутки 0 и сутки 21. На приведенной сверху панели область все еще поражена через 3 недели после трансплантации, как показано белой стрелкой. На нижних панелях черные стрелки подчеркивают область, подвергающуюся перфузии, через 3 недели после трансплантации.

На Фиг. 6 показаны результаты инфузии MSC, происходящих из плаценты, для пациентов с диабетом. В данное клиническое испытание включили всего 15 пациентов с диабетом (11 мужчин и 4 женщины). На (А) показано снижение средней потребности в инсулине после 3-кратного лечения CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC, происходящими из перинатальной ткани, в данной группе из 15 пациентов, которое было статистически значимым (Р меньше 0,001). На (В) показано то, что лечение CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC перинатального происхождения также значимо улучшало уровень гликозилированного гемоглобина у пациентов с диабетом (Р меньше 0,001). Данные результаты показывают то, что CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC перинатального происхождения могут быть хорошим выбором для пациентов с диабетом.

Фиг. 7. На (А) показан уровень асцитов, определенный с использованием ультразвукового исследования, перед инфузией CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC у пациента, страдающего от декомпенсированного цирроза. И на (В) показан уровень асцитов, определенный с использованием ультразвукового исследования, через один месяц после введения CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC. На (С) показано то, что функции печени указанного пациента значимо улучшались. Экспрессия СА125 снижалась до нормального уровня. Кроме того, общий белок, альбумин, глобулин в сыворотке также значимо увеличивались.

На Фиг. 8 показана оценка скорости перфузии в мышиной NOD/SCID модели ишемии задних конечностей после наложения лигатуры на артерию и инъекции разных доз MSC пуповины по изобретению или солевого раствора, или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов).

ПРИМЕРЫ

Для простоты и иллюстративных целей настоящее изобретение описывается посредством ссылки на его типичные воплощения. Однако обычному специалисту в данной области будет очевидно то, что настоящее изобретение может воплощаться на практике без ограничения данными конкретными подробностями. В других случаях хорошо известные способы не были подробно описаны таким образом, чтобы без необходимости не затруднять понимание настоящего изобретения.

1. Способ получения MSC по изобретению из плацентарной ткани

Способ по изобретению был осуществлен посредством следующего:

a) раздельный отбор человеческой плацентарной ткани от многих матерей-доноров;

b) промывка данной плацентарной ткани три раза с использованием 1× PBS, рассечение на 1 мм³ кубики и повторная промывка ткани кубиков для удаления из данной ткани большей части крови;

c) расщепление плацентарной ткани каждого донора раздельно коллагеназой, центрифугирование расщепленной ткани и сбор одноядерных клеток;

d) посев данных одноядерных клеток в культуральную среду;

e) трипсинизация и пассирование клеток, как только они достигают 85-90%-ной конфлюентности;

f) характеризация данных клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR;

g) посев клеток в культуральную среду, содержащую 90% среды Игла, модифицированной по Дульбекко/нокаут F12 (DMEM/F12-KO), 10% FBS и факторы роста при плотности посева от 1000 до 5000 MSC на см², когда они содержат по меньшей мере 95% позитивных маркеров и самое большее 2% негативных маркеров;

h) получение CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC, содержащих свыше 80% клеток, которые экспрессируют CD106, 98% для CD151, 98% для нестина и 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR (для трансплантационного применения), и добавление 20 нг/мл IL1β (предоставленного Peprotech) и 20 нг/мл IL4 (предоставленного Peprotech), когда они являются конфлюентными на 40-50%;

i) трипсинизация и сбор клеток, как только они достигают конфлюентности 90-95%;

j) характеризация клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Данный способ обеспечивал получение субпопуляции MSC плацентарного происхождения с выходом по меньшей мере 1×10⁵ клеток/см² MSC (5×10⁶ MSC во флаконах Т75, когда они являются конфлюентными на 90%), которые могут использоваться в аллогенных введениях. Данные культуры клеток содержали свыше 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.

Человеческие происходящие из перинатальной ткани CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC были фибробластоподобными, и они очень хорошо растут на пластмассовом флаконе (ср. с Фиг. 2).

Провели три независимых эксперимента (эксперимент 1, эксперимент 2 и эксперимент 3). Добавляли 20 нг/мл и интерлейкина 1 (β), и 4, когда клетки были на 40-50% конфлюентными (см. Фиг. 1). В данный момент MSC составляют свыше 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR. После этого MSC поддерживали в растущем состоянии до тех пор, пока 90% клеток не были конфлюентными (см. Таблицы 1 и 2 ниже), на практике - на протяжении примерно 2 суток.

Примечательно то, что экспрессия белка клеточной поверхности MSC CD106, CD151 и нестина значительно возрастала после добавления интерлейкина 1 и 4.

В ТАБЛИЦЕ 1 показана экспрессия CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151, нестина и HLA-DR на MSC, происходящих из плацентарной ткани, перед добавлением интерлейкина 1 и 4, полученных в Примерах 1, 2 и 3 с плацентой. Данные результаты показывают то, что MSC, происходящие из плаценты, имеют классические маркеры клеточной поверхности, совсем как MSC, происходящие из костного мозга и жировой ткани.

В ТАБЛИЦЕ 2 показана экспрессия CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151, нестина и HLA-DR на MSC, происходящих из ткани плаценты, после добавления интерлейкина 1 и 4 в Экспериментах 1, 2 и 3. Данные результаты показывают то, что белковые маркеры CD106 и нестин значимо возрастали через 48 часов после добавления IL-1 и IL-4 в полной среде. Тем временем, клетки CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ все еще имеют классический фенотипический маркер клеточной поверхности MSC.

Данные субпопуляции могут секретировать дополнительные факторы роста, цитокины, иммуномодулирующие факторы и факторы воспаления (см. Таблицу 3). Данные CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ MSC будут, следовательно, иметь лучший потенциал иммуномодуляции и ангиогенеза.

В Таблице 3 показаны связанные уровни экспрессии факторов роста, секретированных в истощенную питательную среду, определенные посредством кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция). Данные результаты показывают то, что MSC, происходящие из ткани плаценты, имеют большую экспрессию или секрецию белка IL-6, IL-8, IL-10, HGF, ANG, ММР2, VEGF-A и TGF-β через 48 часов после добавления IL-1 и IL-4 в полной среде.

2. Способ получения MSC по изобретению из тканей пуповины

В настоящем примере использовали следующие реактивы:

2.1. Выделение клеток способом эксплантов

Пуповину удаляли из транспортного раствора и нарезали на отрезки длиной 2-3 см. Для того чтобы избежать загрязнения прилипшими клетками крови, отбрасывали каждый отрезок пуповины, содержащий кровяной сгусток, который не мог быть удален. Данные отрезки затем дезинфицировали в сосуде с антибиотиками и противогрибковыми средствами, содержащем αМЕМ плюс 1 г/л ванкомицина плюс 1 г/л амоксициллина плюс 500 мг/л амикацина плюс 50 мг/л амфотерицина В, в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Антибиотики немедленно растворяли в стерильной воде для инъекции.

Отрезки пуповины удаляли из сосуда и быстро промывали в 1× PBS при RT. Эпителиальную мембрану слегка надрезали, не трогая сосуды. Каждый отрезок затем измельчали на кусочки 0,5 см толщины и размещали на дне 150 см² пастмассового флакона с крышкой. От 6 до 10 отрезков на флакон размещали с кругом свободного пространства радиусом по меньшей мере 1 см вокруг каждого кусочка и оставляли прикрепляться в течение 15 мин без среды при RT.

После прикрепления аккуратно добавляли полную среду (αМЕМ плюс 5% CPL плюс 2 U/мл гепарина) с сохранением прикрепления эксплантов ко дну флакона. Данные флаконы затем инкубировали при 37°С, 90%-ной влажности и 5% CO₂.

Культуральную среду заменяли через 5-7 суток.

В сутки 10 после выделения миграцию клеток из эксплантов контролировали посредством инвертированной микроскопии. Если круг прикрепившихся клеток был видимым вокруг большинства эксплантов, их аккуратно удаляли, вытаскивая из флакона через крышку с использованием пары стерильных одноразовых пинцетов.

Начиная с данной стадии, конфлюентность клеток визуально проверяли через сутки, и, при необходимости, осуществляли замену среды на сутки 17.

При достижении клетками 70-90%-ной конфлюентности или в С20 (сутки 20) среду удаляли, и клетки промывали 30 мл 1× PBS на флакон. Клетки затем удаляли с использованием Trypzean®, собирали со старой средой и центрифугировали 10 мин при 2500 об./мин. Супернатант отбрасывали, и затем суспендировали клетки в криоконсервирующем растворе, состоящем из αМЕМ плюс 100 мг/мл HSA (человеческий сывороточный альбумин) плюс 10% DMSO (диметилсульфоксид), и криоконсервировали.

2.2. Выделение клеток ферментативным способом

Пуповину удаляли из транспортного раствора и нарезали на отрезки длиной 2-3 см. Для того чтобы избежать загрязнения прилипшими клетками крови, отбрасывали каждый отрезок, содержащий кровяной сгусток, который не мог быть удален. Данные отрезки затем дезинфицировали в сосуде с антибиотиками и противогрибковыми средствами, содержащем αDMEM плюс 1 г/л ванкомицина плюс 1 г/л амоксициллина плюс 500 мг/л амикацина плюс 50 мг/л амфотерицина, в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Антибиотики немедленно растворяли в стерильной воде для инъекции.

Пуповину затем разрезали на маленькие кусочки, погружали в ферментативную смесь, содержащую 2,7 мг/мл коллагеназы типа I и 0,7 мг/мл гиалуронидазы, инкубировали в течение 3 ч при 37°C с легким встряхиванием, с последующим добавлением 2,5% трипсина и дополнительной инкубацией в течение 30 мин.

Расщепленную суспензию разводили 1:2 средой для уменьшения вязкости суспензии и пропускали через нейлоновую сетку для получения суспензии одиночных клеток. Клетки центрифугировали при 300 g в течение 20 мин и высевали при плотности 10000 клеток/см² с использованием свежей среды.

Культуральную среду заменяли через 5-7 суток и каждые 7 суток после этого.

При достижении клетками 70-90%-ной конфлюентности или в С20 среду удаляли, и клетки промывали 30 мл 1× PBS на флакон. Клетки затем удаляли с использованием Trypzean®, собирали со старой средой и центрифугировали 10 мин при 2500 об./мин. Супернатант отбрасывали, и затем суспендировали клетки в криоконсервирующем растворе, состоящем из αМЕМ плюс 100 мг/мл HSA плюс 10% DMSO, и криоконсервировали.

2.3. Оттаивание и культивирование клеток

Клетки оттаивали, следуя классическому протоколу. Вкратце, криопробирки удаляли из жидкого азота и быстро погружали в водную баню с температурой 37°С.Как только в пробирке не оставалось льда, клетки разводили в предварительно нагретой (37°С) полной среде (αМЕМ плюс 0,5% (об./об.) ципрофлоксацина плюс 2 U/мл гепарина плюс 5% (об./об.) LP) и быстро центрифугировали (300 g, RT, 5 мин).

После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на число и жизнеспособность (трипановый синий / гемоцитометр Mallassez).

Клетки высевали в два 75 см² пластмассовых культуральных флакона в полную среду и инкубировали (90%-ная влажность, 5% CO₂ , 37°С).

2.4. Стимулирование клеток

После нескольких суток размножения клетки проверяли на конфлюентность. Когда конфлюентность достигала 30-50%, старую среду отбрасывали и заменяли либо свежей полной средой для нестимулированного состояния, либо свежей средой, дополненной 10 нг/мл IL-1β и 10 нг/мл IL-4.

Клетки затем инкубировали в течение по меньшей мере 2 суток перед экспериментами с использованием проточной цитометрии.

2.5. Сбор клеток и анализ проточной цитометрией

После 2-3 суток размножения/стимулирования клетки проверяли на конфлюентность. Если конфлюентность составляла вплоть до 80%, клетки собирали. Вкратце, старую среду отбрасывали, и клетки промывали 1× DPBS. Добавляли трипсин EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), и клетки инкубировали 5 мин при 37°С. Трипсин нейтрализовали по меньшей мере 2× объемом среды, и клеточную суспензию отбирали и оценивали на число и жизнеспособность клеток.

Для эксперимента с проточной цитометрией требовалось 1×10⁶ клеток, которые центрифугировали и ресуспендировали в 1× DPBS плюс 0,4% HSA.

Клетки метили на CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 и CD31, CD34, CD45, HLA-DR согласно следующему протоколу:

1. Клетки оценивали на жизнеспособность и количество.

2. Необходимый объем суспензии для получения 20000 клеток/пробирку для мечения помещали в 15 мл пропиленовую пластмассовую пробирку.

3. Данную пробирку центрифугировали 5 мин при 300 g и 4°С.

4. Клетки ресуспендировали с использованием 1× DPBS плюс 0,4% HSA (разведенные в 10 раз 4 мг/мл HSA в 1× DPBS). Необходимый объем составлял 500 мкл на пробирку для мечения.

Проводили внеклеточное окрашивание на маркеры CD106 и CD151, как рекомендовано изготовителем FACS и поставщиками антител. Проводили внутриклеточное окрашивание на нестин. Для внутриклеточного окрашивания использовали раствор для фиксации/пермеабилизации, именуемый «набор BD Cytofix/Cytoperm».

Если клетки не анализировали сразу после окрашивания, стадию фиксации проводили приведением клеток в контакт с раствором 1× DPBS / 0,5% формальдегида.

После мечения клетки промывали 1× DPBS плюс 0,4% HSA и пермеабилизировали для мечения нестина.

Меченые клетки анализировали цитометром Accuri С6+ BD Biosciences, и результаты анализировали с использованием программы BD Accuri С6 Plus.

2.6. Результаты

Несколько партий MSC, происходящих из пуповины (от HB-COR001 до COR005-MSC), было получено культивированием MSC пуповины, выделенных посредством способов эксплантов, описанных выше (2.1.), при условиях, раскрытых в пункте 2.4. выше. Для пуповины 3 и 5 (COR003 и COR005) сопутствующе получали две популяции MSC (MSC1 и MSC2) посредством повторения стадий по изобретению отдельным способом.

Экспрессию CD106 на поверхности указанных клеток измеряли проточной цитометрией.

Все протестированные партии MSC демонстрировали резкое увеличение (больше 60%) уровней экспрессии CD106 (см. Таблицу 4).

3. Влияние протокола выделения на экспрессию CD106 MSC, происходящими из пуповины

Мезенхимальные стволовые клетки выделяли из пуповины с использованием двух разных способов, раскрытых выше (см. 2.1. и 2.2.): посредством выделения эксплантов и посредством ферментативного расщепления.

Все клетки культивировали в одинаковой культуральной среде (αМЕМ плюс 5% лизата тромбоцитов (LP)), стимулировали во время пассажа 3 согласно способу по изобретению и отбирали через 2 суток после стимуляции. Измеряется жизнеспособность клеток, и клетки подсчитывали.

Затем измеряли экспрессию нескольких фенотипических маркеров, включая CD106, посредством проточной цитометрии.

Все MSC, каким бы ни был способ выделения или условия стимуляции, экспрессировали фенотипические маркеры классическим образом: свыше 95% являются позитивными в отношении CD73, CD90, CD105, тогда как они были негативными в отношении CD31, CD34, CD45 и HLA-DR.

В отношении и CD151+, и нестина свыше 95% также были позитивными, независимо от способа стимуляции или выделения.

Без стимуляции MSC, выделенные ферментативным расщеплением, экспрессировали более высокие уровни CD106 до стимуляции (53%), чем MSC, выделенные с использованием способов с эксплантами (20%). Однако они были менее чувствительными к стимуляции без воспалительной смеси: наблюдали меньшее увеличение CD106 (увеличение плюс 4% по сравнению с увеличением плюс 60%).

Способ с эксплантами, следовательно, является предпочтительным способом по изобретению для MSC, происходящих из пуповины.

4. Эффекты стимуляции комбинацией IL1-IL4 по сравнению со стимуляцией одним IL1 или IL4 на уровни CD106 мезенхимальных стволовых клеток пуповины

Мезенхимальные стволовые клетки выделяли из двух пуповин посредством выделения эксплантов (см. 2.1.).

Все клетки культивировали в одинаковой культуральной среде (αМЕМ плюс 5% лизата тромбоцитов (LP)), стимулировали во время пассажа 4 согласно способу по изобретению смесью 10 нг/мл IL-1b и 10 нг/мл IL-4 или каждым интерлейкином по отдельности (10 нг/мл каждого) и собирали через 2 суток после стимуляции. Измеряется жизнеспособность клеток, и клетки подсчитывали.

Затем измеряли экспрессию нескольких фенотипических маркеров, включая CD106, посредством проточной цитометрии.

Все MSC, независимо от условий стимуляции, экспрессировали фенотипические маркеры классическим образом: свыше 95% являются позитивными в отношении CD73, CD90, CD105, тогда как они были негативными в отношении CD31, CD34, CD45 и HLA-DR. Свыше 95% также были CD151+ позитивными, независимо от стимуляции.

В том, что касается маркера CD106, увеличение экспрессии, наблюдаемое с использованием стимуляции комбинацией IL1 и IL4, в 3-5 раз выше, чем увеличение экспрессии, наблюдаемое со стимуляцией одним интерлейкином (см. Таблицу 7).

5. Эффект неоваскуляризации MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ плацентарного происхождения у диабетических мышей

Данный пример сосредоточен на эффекте терапевтической неоваскуляризации MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ плацентарного происхождения. Он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии на основе клеток, в сочетании с инъекцией инсулина для лечения критической ишемии задних конечностей при диабете. Результаты авторов изобретения показали, что MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺, происходящие из плаценты, участвуют в ангиогенезе и терапевтической васкуляризации для того, чтобы улучшать ишемическое состояние и восстановить перфузию кровотоком посредством прямой дифференциации в сосудистые клетки. Кроме того, MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺, происходящие из плаценты, улучшали ишемическое повреждение и функциональное восстановление у диабетических крыс.

Иммунодефицитных самцов голых крыс в возрасте шести недель приобретали у Vital River Laboratories (поставщик Charles River Laboratories в Китае). Диабет индуцировали одной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина (70 мг/кг в растворе цитратного буфера, готовится только непосредственно перед инъекцией) после голодания в течение ночи. Каждую неделю измеряли уровни глюкозы в плазме натощак, и крыс с уровнем глюкозы плазмы от 11 мМ до 15 мМ считали диабетическими. Соответствующих по возрасту и массе голых крыс, получающих внутрибрюшинную инъекцию цитратного буфера, использовали в качестве недиабетических контролей (гликемия от 5,5 до 8 мМ).

Через две недели диабетических голых крыс анестезировали (60 мг/кг пентобарбитала внутрибрюшинно), и левую бедренную артерию перекрывали наложением на нее лигатуры из шелка 3-0. Данную лигатуру накладывали в 0,5 см проксимально к раздвоению сафенной и подколенной артерий. Использовали липиодол (1,5 мл/кг) для индукции внутрисосудистой эмболии. Имитацию лигатуры наносили на левую бедренную артерию, оставляя левую заднюю конечность неишемической.

После установления модели ишемии хирургическая недостаточность конечности была очевидной, так как данная конечность больше не могла выдерживать какой-либо вес, и лапа была опухшей и красной. С течением времени данное ишемическое повреждение в разной степени улучшалось во всех группах. Восстановление функции конечности значительно возрастало в подпопуляции MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ (Фиг. 4).

Более конкретно, гистологичекие данные на Фиг. 4 показывают, что плотность капилляров возрастала в группах с пересадкой клеток по сравнению с группой PBS. Кроме того, большее число капилляров наблюдали в группах с пересадкой клеток подпопуляции MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ у диабетических крыс и недиабетических крыс по сравнению с группой PBS.

На Фиг. 5 показано функциональное доказательство индуцированных ишемией изменений с использованием васкуляризации LDPI. На данном изображении показано, что кровоток был полностью заблокирован в левой задней лапе в сутки хирургического вмешательства; на это указывает глубокий темный цвет. Через три недели перфузия кровотоком в некоторой степени восстанавливалась во всех группах, но не возвращалась к нормальной в группе PBS, где отношение ишемической/неишемической перфузии достигало только 52%. Восстановление перфузии в группах с пересадкой клеток было значимо большим. Данное отношение составляло 81% в группе P-MSC предшествующего уровня техники (Р меньше 0,05 по сравнению с группой PBS) и 86% для группы подпопуляции MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ (Р меньше 0,01 по сравнению с группой PBS).

Восстановление перфузии в обоих субпопуляциях MSC было значимо большим. Следовательно, данные результаты выявили то, что MSC улучшают перфузию кровотоком, и что MSC по изобретению являются более эффективными в этом. На самом деле, MSC по изобретению показали значительное улучшение в восстановлении кровотока как у диабетических, так и у недиабетических крыс.

Данные результаты выявили то, что MSC по изобретению более эффективно улучшают перфузию кровотоком, чем MSC предшествующего уровня техники. Данный пример показывает то, что введение MSC по изобретению является многообещающим новым подходом против диабетической критической ишемии конечностей.

6. Терапевтический эффект MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺, происходящих из плаценты, в отношении пациентов с диабетом

Данный пример сосредоточен на терапевтическом эффекте MSC СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ происходящих из плаценты, в отношении пациентов, страдающих от диабета. Он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии диабета на основе клеток.

Всего 15 пациентов с диабетом (11 мужчин и 4 женщины) были включены в данное клиническое исследование. Критериями включения были пациенты с диабетом 2 типа с диагнозом, поставленным с ноября 2013 г. по ноябрь 2014 г. в Tianjin General Hospital. Данные пациенты находились в возрасте от 30 до 85 лет, продолжительность диабета 3 года или более, требовали инсулин для оптимального гликемического контроля в дозе 0,7 U/кг/сутки или более в течение по меньшей мере 1,5 лет, имели инсулиновую дисфункцию, плохо контролируемые флуктуации уровня глюкозы в крови при лечении на основе инсулина и желание участвовать в данном исследовании. Данные 15 пациентов находились в возрасте от 42 до 67 лет с медианным возрастом 59 лет; продолжительность диабета составляла от 3 лет до 17 лет с медианой 8 лет; ежесуточная потребность в инсулине составляла от 38 единиц до 90 единиц со средним значением 58,7 единиц. Каждые три месяца одновременно осуществляли проверку пробой на толерантность к глюкозе, анализом высвобождения инсулина, анализом стимуляции С-пептидом и определением гликозилированного гемоглобина. Проводили анализы функции сердца, печени и почки. На протяжении лечения наблюдали неблагоприятные явления и побочные эффекты. Оно считалось эффективным, если ежесуточная потребность в инсулине уменьшалась на 50% или более после лечения, и данный эффект длился больше, чем 3 месяца.

Пациенты получали три внутривенные инфузии MSC, происходящих из плаценты (P-MSC), по изобретению с одномесячным интервалом инфузии. Общее количество P-MSC, введенных для каждого пациента, составляло (1,0-1,5)×10⁶/кг со средним значением 1,25×10⁶/кг. В то же самое время, пациенты продолжали применять инсулин и корректировали дозу инсулина согласно уровням глюкозы в крови. В том, что касается осложнений, сохраняли исходное общее лечение. Всех пациентов наблюдали после терапии в течение по меньшей мере 6 месяцев.

Данное клиническое испытание показало уменьшение средней потребности в инсулине после 3 введений MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в данной группе из 15 пациентов, которое было статистически значимым (Р меньше 0,001). Инъекционная дозировка инсулина для пациентов с диабетом уменьшалась почти на половину после введения MSC, происходящих из плаценты, по изобретению (по сравнению со средней дозировкой инсулина, принимаемой на протяжении 6 месяцев до введения MSC) (Фиг. 6А).

Данное клиническое испытание показало то, что лечение MSC, происходящими из плаценты, по изобретению значимо снижало уровень гликозилированного гемоглобина пациентов с диабетом (Р меньше 0,001) (Фиг. 6Б).

Эти данные подтверждают то, что MSC по изобретению можно использовать для лечения пациентов с диабетом.

7. Терапевтический эффект MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в отношении пациентов с апластической анемией

Данный пример сосредоточен на терапевтическом эффекте MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в отношении пациентов с апластической анемией, и он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии апластической анемии на основе клеток.

Апластическая анемия, главным образом, рассматривается в качестве иммуноопосредованного синдрома недостаточности костного мозга (ВМ), отличающегося гипоплазией и панцитопенией с жирным ВМ и пониженным ангиогенезом. Предыдущие исследования продемонстрировали то, что приобретенная апластическая анемия проявляется ненормальностями HSC (гематопоэтическая стволовая клетка)/НРС (гематопоэтическая клетка-предшественник) и гематопоэтического микроокружения. Множество доказательств намекали на то, что апластическая анемия может представлять собой синдром отличающийся расстройствами стволовых клеток/клеток-предшественников, включая HSC/HPC и MSC. MSC поддерживают гематопоэз и регулируют почти все функции иммунных клеток для поддержания гематопоэтического и иммунного гомеостаза. MSC могут модулировать функции главных иммунных клеток, включая Т-клетки, В-клетки, моноциты, DC (дендритные клетки), NKT и нейтрофилы [5]. MSC обладают примечательными иммунодепрессивными свойствами в отношении Th1, Th17 и CTL. MSC ингибируют пролиферацию Т-клеток, секрецию IFN-γ и TNF-α клетками Th1, при стимулировании продукции IL-10 клетками Th2 и размножения клеток Treg. Однако недавние исследования показали то, что MSC от пациентов с апластической анемией имеют плохую пролиферацию и неполную иммунодепрессию MLR, РНА-индуцированную активацию Т-клеток и высвобождение IFN-γ [6,7]. Недавнее исследование авторов изобретения показало то, что MSC от пациентов с апластической анемией были ослабленными в подавлении пролиферации и клоногенного потенциала Т-клеток CD4+, при стимулировании размножения клеток Treg. Также обнаружили то, что MSC были дефектными в подавлении продукции TNF-α и IFN-γ клетками CD4+. Однако не было значимого различия в регуляции продукции IL-4, IL-10 и IL-17 [8]. Кроме того, исследование авторов изобретения также показало то, что MSC от пациентов с апластической анемией демонстрировали нарушенную морфологию, пониженную пролиферацию и клоногенный потенциал, и усиленный апоптоз по сравнению с BM-MSC от здоровых контролей. MSC от пациентов с апластической анемией были чувствительными к индукции к дифференциации в адипоциты, но более сложными для дифференциации в остеобласты. В соответствии с ненормальными биологическими характеристиками, большое число генов, вовлеченных в клеточный цикл, деление клетки, пролиферацию, хемотаксис и гематопоэтическую клеточную линию, демонстрировали заметно пониженную экспрессию в MSC от этих пациентов с апластической анемией. Наоборот, больше генов, связанных с апоптозом, адипогенезом и иммунным ответом демонстрировали повышенную экспрессию в MSC от пациентов с апластической анемией. Профиль экспрессии генов MSC дополнительно подтвердил ненормальные биологические свойства и предоставил значимое доказательство возможного механизма разрушения микроокружения ВМ при апластической анемии [9].

MSC представляют собой многообещающего терапевтического кандидата для лечения апластической анемии из-за следующих двух важных фактов:

i) в общем, поддерживающая гематопоэз и мощная иммунодепрессивная способоность MSC и

ii) различие биологических характеристик и функциональная недостаточность, наблюдаемая в MSC, происходящих от пациентов с апластической анемией.

В клиническом испытании 6-летнюю девочку с перемежающейся лихорадкой, продолжающейся в течение больше, чем месяца, лечили MSC. Апластическая анемия была подтверждена после того, как две биопсии костного мозга выявили гипоклеточность. После лечения циклоспорином и станозололом в течение почти 6 месяцев не было улучшения в фенотипе периферической крови. Пересадка гематопоэтических стволовых клеток не была хорошим выбором, так как было очень сложно найти соответствующего донора. Следовательно, данному пациенту ввели внутривенную инфузию 1×10⁷ MSC, происходящих из плаценты, по изобретению. Фенотип периферической крови значимо улучшался после 1-ой пересадки MSC. Однако данный пациент все еще зависел от переливания продуктов крови, включая переливание эритроцитов и тромбоцитов. Через 6 месяцев данный пациент 2-ой раз получил внутривенную инъекцию 1×10⁷ MSC по изобретению. Фенотип периферической крови значительно улучшался и практически достигал нормального уровня через 12 месяцев после 2-ой инъекции. Кроме того, данный пациент был полностью независимым от переливания продуктов крови через 12 месяцев после 2-ой инъекции (Таблица 8). Эти данные подтверждают, что MSC, происходящие из плаценты, по изобретению можно использовать для клинического лечения пациентов с апластической анемией.

8. Терапевтический эффект MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в отношении пациентов с заболеваниями печени

Данный пример сосредоточен на терапевтическом эффекте происходящих из плаценты MSC, полученных согласно способу по изобретению (т.е. с обработкой IL1 и IL4), введенных пациентам, страдающим от заболеваний печени. Он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии заболеваний печени на основе клеток.

В данном клиническом испытании было подтверждено то, что 40-летний мужчина страдал от алкоголического гепатита в течение больше, чем десяти лет. Было подтверждено, что у данного пациента два года назад был декомпенсированный цирроз, хотя он и принимал традиционное лечение. Поскольку отсутствует хороший выбор для лечения декомпенсированного цирроза, данный пациент добровольно принимал внутривенную инъекцию 4×10⁷ MSC по изобретению.

В данном клиническом испытании результаты ультразвуковой проверки показали уровень асцитов 9,7 см до введения MSC (см. Фиг. 7А). Однако уровень асцитов снижался до 3,6 см через один месяц после введения MSC (см. Фиг. 7Б). Кроме того, данные результаты показали то, что функции печени пациента с декомпенсированным циррозом значительно улучшались после введения MSC. Кроме того, экспрессия СА125 в сыворотке снижалась до нормального уровня согласно клиническим контролям.

Данные результаты демонстрирут превосходную клиническую реакцию у пациентов с декомпенсированным циррозом, которых лечили MSC по изобретению.

Кроме того, общий белок, альбумин, глобулин в сыворотке также значительно возрастали с достижением нормального уровня согласно клиническим референсным значениям (Фиг. 7 В). Данные результаты показали, что синтетическая и метаболическая функция печени пациента улучшались через один месяц после внутривенной инъекции MSC.

Следовательно, MSC, происходящие из плаценты, по изобретению представляют собой очень хороший цитотерапевтический выбор против заболеваний печени.

9. Ангиогенный потенциал клеток по изобретению, полученных из пуповины

Проангиогенный потенциал MSC по изобретению дополнительно анализировали в мышиной модели ишемии задних конечностей.

Материал и методы

Двенадцать 8-недельных мышей NOD/SCID (Laboratoire Janvier) анестезировали смесью кетамина и ксилазина. Затем накладывали лигатуру на левую проксимальную и дистальную части бедренной артерии левой ноги (шелковая хирургическая нить 6.0, Ethicon, Issy-Les-Moulineaux, Франция), и часть между наложенными лигатурами вырезали. Мышам, которые демонстрируют больше, чем 80% ишемии после хирургического вмешательства, внутримышечно инъецировали в икроножную мышцу ишемической конечности 2 дозы MSC по изобретению, полученных согласно протоколам, раскрытым в пункте 2.4 выше (0,5×10⁶ клеток на животное в группе 2, 0,05×10⁶ клеток на животное в группе 3). Инъекцию физиологического раствора использовали в контрольной группе 1. В контрольной группе 4 также инъецировали дозу 20 нг/мл VEGF/мышь.

Схему инъекции, а также дозу получали для намеченного клинического применения клеток, и доза, введенная животным, была больше чем в 10 раз выше предложенной дозы для клинического испытания фазы I/II у человека (которая составляет примерно 25×10⁶ клеток/кг, что означает примерно 0,5×10⁶ клеток/мышь (средняя масса мыши равна 20 г)).

Кровоток задней конечности измеряли с использованием лазерной сканирующей доплеровской установки (лазерная доплеровская перфузионная система, Perimed PeriScan PIM III). Среднюю перфузию ишемических и неишемических конечностей определяли до и после ишемии, и каждые 7 суток до 21 суток после ишемии. Изменения частоты лазера, зависимые от кровотока, визуализировали с использованием разных цветных пикселей. Изображения анализировали для количественного измерения кровотока с использованием программы для анализа перфузии крови (LPDIwin). Процентную долю перфузии выражали как отношение ишемической к неишемической задней конечности.

Окрашивание срезов мышцы задней конечности гематоксилином-эозином

Мышей умерщвляли в конце эксперимента (С21). Икроножные мышцы задней конечности препарировали и окрашивали для визуализации распределения ядер клеток в мышечном волокне. Мышцы, выделенные из ишемической задней конечности, фиксировали в парафине и окрашивали гематоксилином/эозином.

Результаты

На Фиг. 8 показан средний показатель повторной перфузии после ишемии задней конечности у мышей, обработанных разными инъекциями: 0,9% NaCl (негативный контроль - n равно 8), 20 нг/мл VEGF (позитивный контроль - n равно 6), 50×10³ клеток MS (n равно 9) и 500×10³ клеток MS (n равно 7).

Данные результаты продемонстрировали то, что введение высоких доз MSC по изобретению у мышей после наложения лигатуры на бедренную артерию приводило к большим показателям повторной перфузии по сравнению с носителем (NaCl) или одним введенным VEGF. 100%-ный показатель повторной перфузии наблюдали уже через 7 суток после инъекции клеток для мышей, получающих наивысшую дозу клеток (0,5×10⁶ клеток). Имело место статистически значимое различие с другими группами.

Также вероятен эффект доза-ответ, поскольку в данном предварительном эксперименте наивысшая доза клеток (0,5×10⁶ клеток), по-видимому, достигает лучшего показателя перфузии, чем меньшая в 10 раз доза.

Данные результаты подтверждают реальную ангиогенную активность MSC по изобретению в улучшении перфузии крови в данной мышиной модели CLI.

Результаты, наблюдаемые при окрашивании гематоксилином-эозином (данные не показаны):

В нормальных, неишемических мышцах ядра клеток распределяются на периферии мышечного волокна.

В ишемических мышцах мышей из групп 1 (0,9% NaCl) и 4 (20 нг/мл VEGF) через 21 сутки после индукции ишемии клетки демонстрируют очень мало ядер на периферии мышечного волокна, так как они все еще регенерируют.

В ишемических мышцах мышей из группы 3 (0,05×10⁶ клеток MSC или 50000) через 21 сутки после индукции ишемии 50% мышечных волокон являются регенерировавшими и демонстрируют ядра не периферии волокна. Регенерация происходит быстрее, чем в группах 1 и 4.

В ишемических мышцах мышей из группы 2 (0,5×10⁶ клеток MSC или 500000) через 21 сутки после индукции ишемии 100% мышечных волокон являются регенерировавшими и демонстрируют ядра не периферии волокна. Профиль окрашивания мышцы является идентичным нормальной неишемической мышце. В данном эксперименте доза 500000 клеток обеспечивает полную регенерацию мышцы.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. Shi М, Zhang Z, Xu R, Lin H, Fu J, Zou Z, Zhang A, Shi J, Chen L, Lv S et ah Human mesenchymal stem cell transfusion is safe and improves liver function in acute-on-chronic liver failure patients. Stem cells translational medicine 2012, 1(10):725-731.

2. Wang L, Wang L, Cong X, Liu G, Zhou J, Bai B, Li Y, Bai W, Li M, Ji H et al: Human umbilical cord mesenchymal stem cell therapy for patients with active rheumatoid arthritis: safety and efficacy. Stem cells and development 2013, 22(24):3192-3202.

3. Rodrigo SF, van Ramshorst J, Hoogslag GE, Boden H, Velders MA, Cannegieter SC, Roelofs H, Al Younis I, Dibbets-Schneider P, Fibbe WE et al: Intramyocardial injection of autologous bone marrow-derived ex vivo expanded mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction patients is feasible and safe up to 5 years of follow-up. Journal of cardiovascular translational research 2013, 6(5):816-825.

4. Gupta PK, Chullikana A, Parakh R, Desai S, Das A, Gottipamula S, Krishnamurthy S, Anthony N, Pherwani A, Majumdar AS: A double blind randomized placebo controlled phase I/II study assessing the safety and efficacy of allogeneic bone marrow derived mesenchymal stem cell in critical limb ischemia. Journal of translational medicine 2013, 11:143.

5. Chen X, Armstrong MA, Li G: Mesenchymal stem cells in immunoregulation. Immunology and cell biology 2006, 84(5):413-421.

6. Bacigalupo A, Valle M, Podesta M, Pitto A, Zocchi E, De Flora A, Pozzi S, Luchetti S, Frassoni F, Van Lint MT et al: T-cell suppression mediated by mesenchymal stem cells is deficient in patients with severe aplastic anemia. Experimental hematology 2005, 33(7):819-827.

7. Chao YH, Peng CT, Harn HJ, Chan CK, Wu KH: Poor potential of proliferation and differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells derived from children with severe aplastic anemia. Annals of hematology 2010, 89(7):715-723.

8. Li J, Lu S, Yang S, Xing W, Feng J, Li W, Zhao Q, Wu H, Ge M, Ma F et al: Impaired immunomodulatory ability of bone marrow mesenchymal stem cells on CD4(+) T cells in aplastic anemia. Results in immunology 2012, 2:142-147.

9. Li J, Yang S, Lu S, Zhao H, Feng J, Li W, Ma F, Ren Q, Liu B, Zhang L et al: Differential gene expression profile associated with the abnormality of bone marrow mesenchymal stem cells in aplastic anemia. PloS one 2012, 7(11):e47764.

10. Anna Otte, Vesna Bucan, Kerstin Reimers, and Ralf Hass. Mesenchymal Stem Cells Maintain Long-Term In Vitro Sternness During Explant Culture. Tissue Engineering Part C: Methods. November 2013,19(12): 937-948

11. Van Pham, P., Truong, N.C., Le, P.TB. et al. Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Cell Tissue Bank (2016) 17: 289

12. Dong Li et al, Biological characteristics of human placental mesenchymal stem cells and their proliferative response to various cytokines. Cells Tissues Organs 2007; 186:169-179.

13. Abomaray F.M. et al, Phenotypic and functional characterization of mesenchymal stem/multipotent Stromal cells from Decidua Basalis of human term placenta. Stem cells international, volume 2016, Article ID5184601

14. Savilova A.M. et al, Comparaison of the expression of immunomodulatory factors in cultures of mesenchymal stromal cells from human extraembryonic tissues. Cell Technologies in Biology and Medicine, №4, February 2015

15. Hongye Fan et al, Pre-treatment with IL-1β enhances the efficacy of MSC transplantation in DSS-induced colitis. Cellular and Molecular Immunology (2012), 9, 473-481

16. Han Z.C., et al, New insights into the heterogeneity and functional diversity of human mesenchymal stem cells. Bio-medical Materials and Engineering 28 (2017) S29-S45

17. Du W. et al, VCAM-1+ placenta chorionic villi-derived mesenchymal stem cells display potent pro-angiogenic activity. Stem Cell research & therapy (2016) 7:49

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> HEALTH AND BIOTECH FRANCE

<120> ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ТКАНИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ

КЛЕТКИ: СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

<130> B373499 D36728

<150> PCT/IB/2016/001936

<151> 2016-12-12

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 739

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> прочий_признак

<223> изоформа CD106 у человека

<400> 1

Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp

1 5 10 15

Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser

35 40 45

Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp

50 55 60

Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu

65 70 75 80

Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr

85 90 95

Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile

100 105 110

Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu

115 120 125

Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro

130 135 140

Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys

145 150 155 160

Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys

165 170 175

Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val

180 185 190

Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro

195 200 205

Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys

210 215 220

Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly

225 230 235 240

Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile

245 250 255

Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly

260 265 270

Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile

275 280 285

Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val

290 295 300

Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly

305 310 315 320

Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser

325 330 335

Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp

340 345 350

Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu

355 360 365

Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr

370 375 380

Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val

405 410 415

Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu

435 440 445

Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys

450 455 460

Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala

465 470 475 480

Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro

485 490 495

Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg

500 505 510

Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser

515 520 525

Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile

530 535 540

Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu

545 550 555 560

Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val

565 570 575

Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val

580 585 590

Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe

595 600 605

Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr

610 615 620

Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu

625 630 635 640

Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg

645 650 655

Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn

660 665 670

Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg

675 680 685

Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu Tyr Phe

690 695 700

Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr Phe Ala

705 710 715 720

Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala Gln Lys

725 730 735

Ser Lys Val

<210> 2

<211> 647

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> прочий_признак

<223> изоформа b CD106 человека

<400> 2

Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp

1 5 10 15

Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser

35 40 45

Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp

50 55 60

Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu

65 70 75 80

Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr

85 90 95

Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile

100 105 110

Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu

115 120 125

Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro

130 135 140

Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys

145 150 155 160

Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys

165 170 175

Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val

180 185 190

Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro

195 200 205

Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys

210 215 220

Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly

225 230 235 240

Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile

245 250 255

Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly

260 265 270

Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile

275 280 285

Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val

290 295 300

Glu Leu Ile Val Gln Ala Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser

305 310 315 320

Gly Gly Leu Val Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro

325 330 335

Ser Val Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu

340 345 350

Thr Ile Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser

355 360 365

Leu Glu Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp

370 375 380

Thr Gly Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met

385 390 395 400

Glu Phe Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn

405 410 415

Val Ala Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu

420 425 430

Glu Glu Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro

435 440 445

Ala Pro Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln

450 455 460

Pro Leu Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu

465 470 475 480

Asp Ser Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser

485 490 495

Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys

500 505 510

Leu Thr Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile

515 520 525

Ile Ser Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys

530 535 540

Lys Lys Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala

545 550 555 560

Tyr Thr Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys

565 570 575

Glu Ser Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp

580 585 590

Val Gln Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu

595 600 605

Val Leu Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile

610 615 620

Ile Tyr Phe Ala Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val

625 630 635 640

Glu Ala Gln Lys Ser Lys Val

645

<210> 3

<211> 677

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> прочий_признак

<223> изоформа c CD106 человека

<400> 3

Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp

1 5 10 15

Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser

35 40 45

Thr Thr Gly Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Glu Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val

65 70 75 80

Tyr Pro Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu

85 90 95

Met Lys Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu

100 105 110

Thr Lys Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly

115 120 125

Lys Val Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser

130 135 140

Val Pro Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser

145 150 155 160

Pro Lys Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu

165 170 175

Gly Gly Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro

180 185 190

Glu Ile Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu

195 200 205

Ser Gly Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser

210 215 220

Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys

225 230 235 240

Glu Val Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser

245 250 255

Pro Gly Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr

260 265 270

Cys Ser Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln

275 280 285

Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser

290 295 300

Thr Leu Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu

305 310 315 320

Cys Thr Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val

325 330 335

Glu Leu Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly

340 345 350

Leu Val Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val

355 360 365

Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile

370 375 380

Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu

385 390 395 400

Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly

405 410 415

Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe

420 425 430

Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala

435 440 445

Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu

450 455 460

Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro

465 470 475 480

Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu

485 490 495

Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser

500 505 510

Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys

515 520 525

Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr

530 535 540

Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser

545 550 555 560

Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys

565 570 575

Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr

580 585 590

Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser

595 600 605

Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln

610 615 620

Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu

625 630 635 640

Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr

645 650 655

Phe Ala Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala

660 665 670

Gln Lys Ser Lys Val

675

<210> 4

<211> 1621

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> прочий_признак

<223> Нестин у человека

<400> 4

Met Glu Gly Cys Met Gly Glu Glu Ser Phe Gln Met Trp Glu Leu Asn

1 5 10 15

Arg Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Glu Gln

20 25 30

Asn Glu Leu Leu Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu Arg Ala Gln Ser Ala

35 40 45

Asp Thr Ser Trp Arg Ala His Ala Asp Asp Glu Leu Ala Ala Leu Arg

50 55 60

Ala Leu Val Asp Gln Arg Trp Arg Glu Lys His Ala Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Arg Asp Asn Leu Ala Glu Glu Leu Glu Gly Val Ala Gly Arg Cys Gln

85 90 95

Gln Leu Arg Leu Ala Arg Glu Arg Thr Thr Glu Glu Val Ala Arg Asn

100 105 110

Arg Arg Ala Val Glu Ala Glu Lys Cys Ala Arg Ala Trp Leu Ser Ser

115 120 125

Gln Val Ala Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Ala His

130 135 140

Glu Glu Glu Arg Val Gly Leu Asn Ala Gln Ala Ala Cys Ala Pro Arg

145 150 155 160

Cys Pro Ala Pro Pro Arg Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Glu

165 170 175

Glu Leu Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ala Trp Arg Gly Ala Val Arg Gly

180 185 190

Tyr Gln Glu Arg Val Ala His Met Glu Thr Ser Leu Gly Gln Ala Arg

195 200 205

Glu Arg Leu Gly Arg Ala Val Gln Gly Ala Arg Glu Gly Arg Leu Glu

210 215 220

Leu Gln Gln Leu Gln Ala Glu Arg Gly Gly Leu Leu Glu Arg Arg Ala

225 230 235 240

Ala Leu Glu Gln Arg Leu Glu Gly Arg Trp Gln Glu Arg Leu Arg Ala

245 250 255

Thr Glu Lys Phe Gln Leu Ala Val Glu Ala Leu Glu Gln Glu Lys Gln

260 265 270

Gly Leu Gln Ser Gln Ile Ala Gln Val Leu Glu Gly Arg Gln Gln Leu

275 280 285

Ala His Leu Lys Met Ser Leu Ser Leu Glu Val Ala Thr Tyr Arg Thr

290 295 300

Leu Leu Glu Ala Glu Asn Ser Arg Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Ser

305 310 315 320

Lys Thr Ser Leu Ser Phe Gln Asp Pro Lys Leu Glu Leu Gln Phe Pro

325 330 335

Arg Thr Pro Glu Gly Arg Arg Leu Gly Ser Leu Leu Pro Val Leu Ser

340 345 350

Pro Thr Ser Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ala Thr Leu Glu Thr Pro Val

355 360 365

Pro Ala Phe Leu Lys Asn Gln Glu Phe Leu Gln Ala Arg Thr Pro Thr

370 375 380

Leu Ala Ser Thr Pro Ile Pro Pro Thr Pro Gln Ala Pro Ser Pro Ala

385 390 395 400

Val Asp Ala Glu Ile Arg Ala Gln Asp Ala Pro Leu Ser Leu Leu Gln

405 410 415

Thr Gln Gly Gly Arg Lys Gln Ala Pro Glu Pro Leu Arg Ala Glu Ala

420 425 430

Arg Val Ala Ile Pro Ala Ser Val Leu Pro Gly Pro Glu Glu Pro Gly

435 440 445

Gly Gln Arg Gln Glu Ala Ser Thr Gly Gln Ser Pro Glu Asp His Ala

450 455 460

Ser Leu Ala Pro Pro Leu Ser Pro Asp His Ser Ser Leu Glu Ala Lys

465 470 475 480

Asp Gly Glu Ser Gly Gly Ser Arg Val Phe Ser Ile Cys Arg Gly Glu

485 490 495

Gly Glu Gly Gln Ile Trp Gly Leu Val Glu Lys Glu Thr Ala Ile Glu

500 505 510

Gly Lys Val Val Ser Ser Leu Gln Gln Glu Ile Trp Glu Glu Glu Asp

515 520 525

Leu Asn Arg Lys Glu Ile Gln Asp Ser Gln Val Pro Leu Glu Lys Glu

530 535 540

Thr Leu Lys Ser Leu Gly Glu Glu Ile Gln Glu Ser Leu Lys Thr Leu

545 550 555 560

Glu Asn Gln Ser His Glu Thr Leu Glu Arg Glu Asn Gln Glu Cys Pro

565 570 575

Arg Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Thr Leu Lys Ser Leu Glu Lys Glu

580 585 590

Asn Lys Glu Leu Leu Lys Asp Val Glu Val Val Arg Pro Leu Glu Lys

595 600 605

Glu Ala Val Gly Gln Leu Lys Pro Thr Gly Lys Glu Asp Thr Gln Thr

610 615 620

Leu Gln Ser Leu Gln Lys Glu Asn Gln Glu Leu Met Lys Ser Leu Glu

625 630 635 640

Gly Asn Leu Glu Thr Phe Leu Phe Pro Gly Thr Glu Asn Gln Glu Leu

645 650 655

Val Ser Ser Leu Gln Glu Asn Leu Glu Ser Leu Thr Ala Leu Glu Lys

660 665 670

Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Pro Glu Val Gly Asp Glu Glu Ala

675 680 685

Leu Arg Pro Leu Thr Lys Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Leu Glu

690 695 700

Asp Glu Asn Lys Glu Ala Phe Arg Ser Leu Glu Lys Glu Asn Gln Glu

705 710 715 720

Pro Leu Lys Thr Leu Glu Glu Glu Asp Gln Ser Ile Val Arg Pro Leu

725 730 735

Glu Thr Glu Asn His Lys Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Gln Asp Gln

740 745 750

Glu Thr Leu Arg Thr Leu Glu Lys Glu Thr Gln Gln Arg Arg Arg Ser

755 760 765

Leu Gly Glu Gln Asp Gln Met Thr Leu Arg Pro Pro Glu Lys Val Asp

770 775 780

Leu Glu Pro Leu Lys Ser Leu Asp Gln Glu Ile Ala Arg Pro Leu Glu

785 790 795 800

Asn Glu Asn Gln Glu Phe Leu Lys Ser Leu Lys Glu Glu Ser Val Glu

805 810 815

Ala Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ala

820 825 830

Gly Gln Glu Asn Leu Glu Thr Leu Lys Ser Pro Glu Thr Gln Ala Pro

835 840 845

Leu Trp Thr Pro Glu Glu Ile Asn Gln Gly Ala Met Asn Pro Leu Glu

850 855 860

Lys Glu Ile Gln Glu Pro Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Gln Glu Thr

865 870 875 880

Phe Arg Leu Leu Glu Glu Glu Asn Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gly

885 890 895

Ala Trp Asn Leu Glu Asn Leu Arg Ser Pro Glu Glu Val Asp Lys Glu

900 905 910

Ser Gln Arg Asn Leu Glu Glu Glu Glu Asn Leu Gly Lys Gly Glu Tyr

915 920 925

Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Glu Gly Gln Glu Leu Pro Gln

930 935 940

Ser Ala Asp Val Gln Arg Trp Glu Asp Thr Val Glu Lys Asp Gln Glu

945 950 955 960

Leu Ala Gln Glu Ser Pro Pro Gly Met Ala Gly Val Glu Asn Glu Asp

965 970 975

Glu Ala Glu Leu Asn Leu Arg Glu Gln Asp Gly Phe Thr Gly Lys Glu

980 985 990

Glu Val Val Glu Gln Gly Glu Leu Asn Ala Thr Glu Glu Val Trp Ile

995 1000 1005

Pro Gly Glu Gly His Pro Glu Ser Pro Glu Pro Lys Glu Gln Arg

1010 1015 1020

Gly Leu Val Glu Gly Ala Ser Val Lys Gly Gly Ala Glu Gly Leu

1025 1030 1035

Gln Asp Pro Glu Gly Gln Ser Gln Gln Val Gly Ala Pro Gly Leu

1040 1045 1050

Gln Ala Pro Gln Gly Leu Pro Glu Ala Ile Glu Pro Leu Val Glu

1055 1060 1065

Asp Asp Val Ala Pro Gly Gly Asp Gln Ala Ser Pro Glu Val Met

1070 1075 1080

Leu Gly Ser Glu Pro Ala Met Gly Glu Ser Ala Ala Gly Ala Glu

1085 1090 1095

Pro Gly Pro Gly Gln Gly Val Gly Gly Leu Gly Asp Pro Gly His

1100 1105 1110

Leu Thr Arg Glu Glu Val Met Glu Pro Pro Leu Glu Glu Glu Ser

1115 1120 1125

Leu Glu Ala Lys Arg Val Gln Gly Leu Glu Gly Pro Arg Lys Asp

1130 1135 1140

Leu Glu Glu Ala Gly Gly Leu Gly Thr Glu Phe Ser Glu Leu Pro

1145 1150 1155

Gly Lys Ser Arg Asp Pro Trp Glu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Glu

1160 1165 1170

Glu Ser Glu Ala Glu Ala Pro Arg Gly Ala Glu Glu Ala Phe Pro

1175 1180 1185

Ala Glu Thr Leu Gly His Thr Gly Ser Asp Ala Pro Ser Pro Trp

1190 1195 1200

Pro Leu Gly Ser Glu Glu Ala Glu Glu Asp Val Pro Pro Val Leu

1205 1210 1215

Val Ser Pro Ser Pro Thr Tyr Thr Pro Ile Leu Glu Asp Ala Pro

1220 1225 1230

Gly Pro Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Gln Glu Ala Ser Trp Gly

1235 1240 1245

Val Gln Gly Arg Ala Glu Ala Leu Gly Lys Val Glu Ser Glu Gln

1250 1255 1260

Glu Glu Leu Gly Ser Gly Glu Ile Pro Glu Gly Pro Gln Glu Glu

1265 1270 1275

Gly Glu Glu Ser Arg Glu Glu Ser Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu

1280 1285 1290

Thr Leu Pro Asp Ser Thr Pro Leu Gly Phe Tyr Leu Arg Ser Pro

1295 1300 1305

Thr Ser Pro Arg Trp Asp Pro Thr Gly Glu Gln Arg Pro Pro Pro

1310 1315 1320

Gln Gly Glu Thr Gly Lys Glu Gly Trp Asp Pro Ala Val Leu Ala

1325 1330 1335

Ser Glu Gly Leu Glu Ala Pro Pro Ser Glu Lys Glu Glu Gly Glu

1340 1345 1350

Glu Gly Glu Glu Glu Cys Gly Arg Asp Ser Asp Leu Ser Glu Glu

1355 1360 1365

Phe Glu Asp Leu Gly Thr Glu Ala Pro Phe Leu Pro Gly Val Pro

1370 1375 1380

Gly Glu Val Ala Glu Pro Leu Gly Gln Val Pro Gln Leu Leu Leu

1385 1390 1395

Asp Pro Ala Ala Trp Asp Arg Asp Gly Glu Ser Asp Gly Phe Ala

1400 1405 1410

Asp Glu Glu Glu Ser Gly Glu Glu Gly Glu Glu Asp Gln Glu Glu

1415 1420 1425

Gly Arg Glu Pro Gly Ala Gly Arg Trp Gly Pro Gly Ser Ser Val

1430 1435 1440

Gly Ser Leu Gln Ala Leu Ser Ser Ser Gln Arg Gly Glu Phe Leu

1445 1450 1455

Glu Ser Asp Ser Val Ser Val Ser Val Pro Trp Asp Asp Ser Leu

1460 1465 1470

Arg Gly Ala Val Ala Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Glu Thr Glu

1475 1480 1485

Ser Gln Asp Ser Ala Glu Pro Ser Gly Ser Glu Glu Glu Ser Asp

1490 1495 1500

Pro Val Ser Leu Glu Arg Glu Asp Lys Val Pro Gly Pro Leu Glu

1505 1510 1515

Ile Pro Ser Gly Met Glu Asp Ala Gly Pro Gly Ala Asp Ile Ile

1520 1525 1530

Gly Val Asn Gly Gln Gly Pro Asn Leu Glu Gly Lys Ser Gln His

1535 1540 1545

Val Asn Gly Gly Val Met Asn Gly Leu Glu Gln Ser Glu Glu Val

1550 1555 1560

Gly Gln Gly Met Pro Leu Val Ser Glu Gly Asp Arg Gly Ser Pro

1565 1570 1575

Phe Gln Glu Glu Glu Gly Ser Ala Leu Lys Thr Ser Trp Ala Gly

1580 1585 1590

Ala Pro Val His Leu Gly Gln Gly Gln Phe Leu Lys Phe Thr Gln

1595 1600 1605

Arg Glu Gly Asp Arg Glu Ser Trp Ser Ser Gly Glu Asp

1610 1615 1620

<210> 5

<211> 253

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> прочий_признак

<223> человеческий CD151

<400> 5

Met Gly Glu Phe Asn Glu Lys Lys Thr Thr Cys Gly Thr Val Cys Leu

1 5 10 15

Lys Tyr Leu Leu Phe Thr Tyr Asn Cys Cys Phe Trp Leu Ala Gly Leu

20 25 30

Ala Val Met Ala Val Gly Ile Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr

35 40 45

Ile Ser Leu Leu Ala Ser Gly Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Leu

50 55 60

Val Val Ala Gly Thr Val Val Met Val Thr Gly Val Leu Gly Cys Cys

65 70 75 80

Ala Thr Phe Lys Glu Arg Arg Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Phe Ile Leu

85 90 95

Leu Leu Ile Ile Phe Leu Leu Glu Ile Ile Ala Gly Ile Leu Ala Tyr

100 105 110

Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp

115 120 125

Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser

130 135 140

Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu Phe His Cys Cys Gly Ser Asn Asn

145 150 155 160

Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser Gln Glu Ala Gly

165 170 175

Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys

180 185 190

Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Cys

195 200 205

Ile Thr Lys Leu Glu Thr Phe Ile Gln Glu His Leu Arg Val Ile Gly

210 215 220

Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Cys Val Gln Val Phe Gly Met Ile Phe

225 230 235 240

Thr Cys Cys Leu Tyr Arg Ser Leu Lys Leu Glu His Tyr

245 250

<210> 6

<211> 269

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> прочий_признак

<223> человеческий IL1бета

<400> 6

Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser

1 5 10 15

Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met

20 25 30

Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile

35 40 45

Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala

50 55 60

Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro

65 70 75 80

Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe

85 90 95

Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala

100 105 110

Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp

115 120 125

Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala

130 135 140

Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met

145 150 155 160

Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu

165 170 175

Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp

180 185 190

Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys

195 200 205

Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn

210 215 220

Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr

225 230 235 240

Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly

245 250 255

Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

260 265

<210> 7

<211> 153

<212> ПРТ

<213> homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> человеческий IL4

<400> 7

Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala

1 5 10 15

Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln

20 25 30

Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys

35 40 45

Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr

50 55 60

Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr

65 70 75 80

Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln

85 90 95

Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg

100 105 110

Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala

115 120 125

Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met

130 135 140

Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser

145 150

<---

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к получению происходящих из ткани плаценты и внеэмбриональных тканей СD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и увеличению уровня экспрессии CD106 недифференцированных MSC, а также культурам таких клеток MSC, фармацевтическим и косметическим композициям, их содержащим. Для получения указанных MSC и увеличения экспрессии CD106 культивируют недифференцированные MSC в культуральной среде, содержащей смесь ILβ и IL4. Полученные культуры клеток и композиции используют для лечения диабета, апластичекой анемии, декомпенсионного цирроза печени, для индукции ангиогенеза, а также для регенерации клеток кожи и слизистой, улучшения вида кожи и слизистой и лечения повреждения или расстройства кожи. Культуру клеток согласно изобретению используют в системах введения, представляющих собой микро- и нановезикулы биополимеров, липидов или наночастиц. Настоящее изобретение позволяет повысить выход функциональных MSC, полученных из всех плацентарных и внеэмбриональных тканей, благодаря более эффективной системе культивирования. 13 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 9 пр.

1. Способ получения CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальных стволовых клеток (MSC), включающий культивирование популяции недифференцированных MSC из плацентарных и внеэмбриональных тканей в культуральной среде, содержащей смесь IL1β и IL4.

2. Способ по п. 1, где указанные недифференцированные MSC происходят из биологической ткани, выбранной из плаценты, пуповины или плацентарных мембран, или их компонентов, или из биологической жидкости, такой как кровь пуповины, кровь плаценты или амниотическая жидкость.

3. Способ по любому из пп. 1 и 2, где указанные недифференцированные MSC получают посредством выделения клеток из тканей эксплантов.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанные недифференцированные MSC получают из пуповины, предпочтительно посредством выделения клеток из экспланта фрагмента пуповины.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанные недифференцированные MSC получают из плаценты, предпочтительно посредством выделения клеток из фрагмента ткани плаценты.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанная культуральная среда содержит от 1 до 100 нг/мл интерлейкина 1β.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанная культуральная среда содержит от 1 до 100 нг/мл интерлейкина 4.

8. Способ увеличения уровня экспрессии CD106 недифференцированных MSC, включающий культивирование популяции недифференцированных MSC из плацентарных и внеэмбриональных тканей в культуральной среде, содержащей смесь IL1β и IL4.

9. Способ по п. 8, где указанные недифференцированные MSC происходят из биологической ткани, выбранной из плаценты, пуповины или плацентарных мембран, или их компонентов, или из биологической жидкости, такой как кровь пуповины, кровь плаценты или амниотическая жидкость.

10. Способ по любому из пп. 8, 9, в котором указанные недифференцированные MSC получают выделением клеток из эксплантов ткани.

11. Способ по любому из пп. 8-10, в котором указанные недифференцированные MSC получают из пуповины, предпочтительно посредством выделения клеток из экспланта фрагмента пуповины.

12. Способ по любому из пп. 8-11, в котором указанные недифференцированные MSC получают из плаценты, предпочтительно посредством выделения клеток из фрагмента ткани плаценты.

13. Способ по любому из пп. 8-12, в котором указанная культуральная среда содержит от 1 до 100 нг/мл интерлейкина 1, предпочтительно интерлейкина 1β.

14. Способ по любому из пп. 8-13, в котором указанная культуральная среда содержит от 1 до 100 нг/мл интерлейкина 4.

15. Культура клеток для лечения диабета, содержащая CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки (MSC), полученные способом по пп. 1-14, причем указанная культура клеток содержит

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне.

16. Культура клеток для лечения апластической анемии, содержащая CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки (MSC), полученные способом по пп. 1-14, причем указанная культура клеток содержит

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне.

17. Культура клеток для лечения декомпенсированного цирроза печени, содержащая CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки (MSC), полученные способом по пп. 1-14, причем указанная культура клеток содержит

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне.

18. Культура клеток для индукции ангиогенеза, содержащая CD106^{высокая} CD151⁺ Нестин⁺ мезенхимальные стволовые клетки (MSC), полученные способом по пп. 1-14, причем указанная культура клеток содержит

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне.

19. Культура клеток по любому из пп. 15-18, отличающаяся тем, что она содержит свыше 98% MSC, которые не экспрессируют маркеры CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104 и CD133 на выявляемом уровне.

20. Фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, полученной способом по п. 1, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

21. Фармацевтическая композиция для лечения апластической анемии, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, полученной способом по п. 1, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

22. Фармацевтическая композиция для лечения декомпенсированного цирроза печени, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, полученной способом по п. 1, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

23. Фармацевтическая композиция для индукции ангиогенеза, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, полученной способом по п. 1, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

24. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 20-23, дополнительно содержащая гидрогель или другое биосовместимое вещество.

25. Косметическая композиция для регенерации клеток кожи или слизистой, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

26. Косметическая композиция для улучшения вида кожи или слизистой оболочки, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

27. Косметическая композиция для лечения повреждения или расстройства кожи, содержащая по меньшей мере от 1 до 5 x 10⁶ клеток культуры клеток, включающей в себя

- свыше 60% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне,

- свыше 98% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне,

- свыше 95% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и

- менее 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне,

и биологически совместимое вещество.

28. Система для введения культуры клеток по любому из пп. 15-19 пациенту, представляющая собой микро- или нановезикулы биополимеров, липидов или наночастиц, которые включают в себя культуру клеток по любому из пп. 15-19.