Настоящая заявка испрашивает приоритет по Китайской Патентной Заявке № 201911250088.1, поданной 9 декабря 2019 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биологической фармацевтики и в частности к соединению, оказывающему агонистическое действие на кальций-чувствительный рецептор (КЧР) человека, или его фармацевтически приемлемой соли, содержащей их композиции и их применению для лечения метаболических заболеваний, таких как первичный гиперпаратиреоз, вторичный гиперпаратиреоз, гиперкальциемия и другие сопутствующие метаболические заболевания.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вторичный гиперпаратиреоз относится к хроническим компенсированным проявлениям, при которых, в случае хронической почечной недостаточности, синдрома кишечной мальабсорбции, синдрома Фанкони, почечного канальцевого ацидоза, дефицита витамина D или резистентности к нему, беременности, лактации и т.п., паращитовидные железы находятся в состоянии длительной стимуляции низким кальцием или магнием в сыворотке или высоким фосфором в сыворотке и выделяют избыточное количество паратиреоидного гормона для увеличения кальция и магния в сыворотке и снижения фосфора в сыворотке, и что обычно сопровождается гиперплазией паращитовидных желез. Длительная паращитовидная гиперплазия в конечном итоге приводит к генезу функционально автономных аденом.

Кальций-чувствительный рецептор (КЧР) относится к члену семейства А рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), распределенному на поверхности клеток в паращитовидных железах человека. Секреция паратиреоидного гормона строго регулируется кальций-чувствительным рецептором на поверхности клеток паращитовидной железы для поддержания постоянного уровня минералов в организме человека. Кальций-чувствительный рецептор непрерывно контролирует мельчайшие изменения концентрации ионов кальция в организме человека и реагирует соответствующим способом, изменения уровень секреции паратиреоидного гормона.

У пациентов с хроническим заболеванием почек потребность в постоянных уровнях ионов кальция и фосфора в организме приводит к непрерывной секреции паратиреоидного гормона в паращитовидных железах. Эта непрерывная секреция паратиреоидного гормона изначально является адаптивной, но в конечном итоге приводит к гиперплазии паращитовидных желез и избытку паратиреоидного гормона в организме и вызывает вторичный гиперпаратиреоз по мере прогрессирования хронического заболевания почек. Исследования показали, что непроходящий вторичный гиперпаратиреоз приводит к потере кальций-чувствительного рецептора и рецептора витамина D на поверхности клеток паращитовидной железы. Эти последующие патологические эффекты, вызванные заболеванием, в дальнейшем приводят к нарушению регуляции паращитовидными железами постоянных уровней минералов.

Агонисты кальция, как правило, относятся к соединениям, которые имеют сходные физиологические функции и механизмы действия с ионом кальция и могут непосредственно активировать кальций-чувствительный рецептор на поверхности клеток паращитовидной железы. Гидрохлорид цинакальцета, органический низкомолекулярный кальцимиметик, разработанный Amgen, может активировать кальций-чувствительный рецептор на поверхности клеток паращитовидной железы и ингибировать секрецию паратиреоидного гормона, тем самым достигая целей лечения сопутствующих метаболических заболеваний, таких как вторичный гиперпаратиреоз. Гидрохлорид цинакальцета был одобрен для лечения вторичного гиперпаратиреоза у пациентов с хроническим заболеванием почек, находящихся на диализе, и вводится перорально один-два раза в сутки в дозе до 90 мг. Гидрохлорид цинакальцета показывает клинически превосходную эффективность в снижении уровней паратиреоидных гормонов в плазме у пациентов с вторичным гиперпаратиреозом. Однако во время лечения наблюдаются значительные побочные эффекты, вызванные лекарственным средством, такие как тошнота, рвота и диарея, связанные с побочными эффектами со стороны желудочно-кишечного тракта. Кроме того, пероральное введение гидрохлорида цинакальцета создает большую нагрузку на пациентов с хроническим заболеванием почек, находящихся на диализе, и было показано, что гидрохлорид цинакальцета ингибирует цитохром 450 и индуцирует сопутствующее лекарственное взаимодействие. Такие побочные эффекты, связанные с применением гидрохлорида цинакальцета, в некоторой степени снижают приверженность и соблюдение пациентами лечения.

Таким образом, соединение, представляющее собой агонист кальций-чувствительного рецептора, которое может быть введено внутривенно и которое может снижать секрецию паратиреоидного гормона, активируя кальций-чувствительный рецептор на поверхности клеток паращитовидной железы, для достижения терапевтической цели лечения сопутствующих метаболических заболеваний, таких как вторичный гиперпаратиреоз, является желательным. Такие соединения, представляющие собой агонист кальций-чувствительного рецептора, могут значительно улучшить приверженность и соблюдение лечения у пациентов с хроническим заболеванием почек.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение предназначено для получения соединения, состоящего из пептида и группы с сопряженными двойными связями, или его фармацевтически приемлемой соли, где пептид состоит из аминокислотной последовательности формулы (I):

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (I) (SEQ ID NO: 39),

где:

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ выбран из группы, состоящей из D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-Phe(2-Cl), D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Arg, D-Trp и D-His;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ выбран из группы, состоящей из D-Arg, D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Phe(4-NO₂), D-2-NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Cha, D-Ser, D-Gln, D-Tyr, D-Ile, D-Ser, D-His, D-Val и D-Chg;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем пептид и группа с сопряженными двойными связями ковалентно соединены дисульфидной связью; при этом группа с сопряженными двойными связями представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида ковалентно соединен дисульфидной связью с группой с сопряженными двойными связями;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

В одном варианте осуществления для соединения или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, в пептиде формулы (I):

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ выбран из группы, состоящей из D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-Phe(2-Cl), D-Tyr, D-Trp, D-Ser и D-His;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ представляет собой D-Arg;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем пептид и группа с сопряженными двойными связями ковалентно соединены дисульфидной связью;

при этом группа с сопряженными двойными связями представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида ковалентно соединен дисульфидной связью с группой с сопряженными двойными связями;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

В другом варианте осуществления для соединения или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, в пептиде формулы (I):

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ представляет собой D-Arg;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ выбран из группы, состоящей из D-Arg, D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Phe(4-NO₂), D-2-NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Chg, D-Ser, D-Cha, D-Gln, D-Tyr, D-His и D-Val;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем пептид и группа с сопряженными двойными связями ковалентно соединены дисульфидной связью;

при этом группа с сопряженными двойными связями представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида соединен дисульфидной связью с группой с сопряженными двойными связями;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

В другом варианте осуществления для соединения или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, в пептиде формулы (I):

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ представляет собой D-Arg;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ выбран из группы, состоящей из D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Phe(4-NO₂), D-2-NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Chg, D-Ser, D-Cha, D-Gln, D-Tyr, D-Ile, D-His и D-Val;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем пептид и группа с сопряженными двойными связями ковалентно соединены дисульфидной связью;

при этом группа с сопряженными двойными связями представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида соединен дисульфидной связью с группой с сопряженными двойными связями;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

В другом варианте осуществления для соединения или его фармацевтически приемлемой соли, как описано выше, в пептиде формулы (I):

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ представляет собой D-Arg;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ выбран из группы, состоящей из D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Abu, D-hLeu и D-Val;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala и D-Ser;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем группа с сопряженными двойными связями представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида ковалентно соединен дисульфидной связью с группой с сопряженными двойными связями;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

В некоторых вариантах осуществления X₄ выбран из группы, состоящей из D-Abu и D-Val; в некоторых других вариантах осуществления X₄ представляет собой D-Abu.

В настоящем изобретении дополнительно предложено соединение формулы (II) или его фармацевтически приемлемая соль, где два конца соединены следующим образом:

R₁-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-R₂ (II),

где:

R₁ представляет собой H, алкил, ацетил, формил, бензоил, трифторацетил, D-pGlu или L-pGlu;

R₂ представляет собой -NH₂ или -OH;

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ и X₇ являются такими, как определено для формулы (I) выше.

В одном варианте осуществления для соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли:

R₁ представляет собой ацетил; X₁ представляет собой аминокислотный остаток D-Cys; X₂ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-Phe(2-Cl), D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Arg и D-His; X₃ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₄ выбран из группы, состоящей из D-Arg, D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Phe(4-NO₂), D-2-NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Cha, D-Ser, D-Gln, D-Tyr, D-Ile, D-Ser, D-His, D-Val и D-Chg; X₅ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₆ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly; X₇ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg, и R₂ представляет собой -NH₂.

В одном варианте осуществления для соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли: R₁ представляет собой ацетил; X₁ представляет собой аминокислотный остаток D-Cys; X₂ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-Phe(2-Cl), D-Tyr, D-Trp, D-Ser и D-His; X₃ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₄ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₅ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₆ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly; X₇ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg, и R₂ представляет собой -NH₂.

В одном варианте осуществления для соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли: R₁ представляет собой ацетил; X₁ представляет собой аминокислотный остаток D-Cys; X₂ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₃ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₄ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Arg, D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Phe(4-NO₂), D-2NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Chg, D-Ser, D-Cha, D-Gln, D-Tyr, D-His и D-Val; X₅ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₆ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly; X₇ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg, и R₂ представляет собой -NH₂.

В одном варианте осуществления для соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли: R₁ представляет собой ацетил; X₁ представляет собой аминокислотный остаток D-Cys; X₂ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₃ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₄ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-2-Thi, D-Phe(4-NO₂), D-2NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Chg, D-Ser, D-Cha, D-Gln, D-Tyr, D-Ile, D-His и D-Val; X₅ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg; X₆ выбран из группы, состоящей из аминокислотных остатков D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly; X₇ представляет собой аминокислотный остаток D-Arg, и R₂ представляет собой -NH₂.

В одном варианте осуществления для соединения формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемой соли, когда X₁ представляет собой аминокислотный остаток D-Cys, указанный остаток X₁ соединен со второй тиольной группой через дисульфидную связь боковой цепи.

В одном варианте осуществления соединение или его фармацевтически приемлемая соль выбраны из группы, состоящей из следующих соединений:

Соединение Последовательность SEQ ID NO: 1 Ac-c(C)-(D-Phg)-r-r-r-a-r-NH₂ 1 2 Ac-c(C)-[D-Phe(2-Cl)]-r-r-r-a-r-NH₂ 2 3 Ac-c(C)-[D-Phe(4-CH₃)]-r-r-r-a-r-NH₂ 3 4 Ac-c(C)-(D-Tyr)-r-r-r-a-r-NH₂ 4 5 Ac-c(C)-(D-Trp)-r-r-r-a-r-NH₂ 5 6 Ac-c(C)-s-r-r-r-s-r-NH₂ 6 7 Ac-c(C)-h-r-r-r-G-r-NH₂ 7 8 Ac-c(C)-s-r-r-r-G-r-NH₂ 8 9 Ac-c(C)-w-r-r-r-G-r-NH₂ 9 10 Ac-c(C)-h-r-r-r-s-r-NH₂ 10 11 Ac-c(C)-r-r-(D-Phg)-r-a-r-NH₂ 11 12 Ac-c(C)-r-r-[D-Phe(4-CH₃)]-r-a-r-NH₂ 12 13 Ac-c(C)-r-r-(D-2-Thi)-r-a-r-NH₂ 13 14 Ac-c(C)-r-r-[D-Phe(4-NO₂)]-r-a-r-NH₂ 14 15 Ac-c(C)-r-r-(D-2-NaI)-r-a-r-NH₂ 15 16 Ac-c(C)-r-r-(D-hPhe)-r-a-r-NH₂ 16 17 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-a-r-NH₂ 17 18 Ac-c(C)-r-r-(D-Tle)-r-a-r-NH₂ 18 19 Ac-c(C)-r-r-(D-hLeu)-r-a-r-NH₂ 19 20 Ac-c(C)-r-r-(D-Chg)-r-a-r-NH₂ 20 21 Ac-c(C)-r-r-(D-Cha)-r-a-r-NH₂ 21 22 Ac-c(C)-r-r-s-r-G-r-NH₂ 22 23 Ac-c(C)-r-r-q-r-G-r-NH₂ 23 24 Ac-c(C)-r-r-y-r-a-r-NH₂ 24 25 Ac-c(C)-r-r-s-r-s-r-NH₂ 25 26 Ac-c(C)-r-r-q-r-s-r-NH₂ 26 27 Ac-c(C)-r-r-h-r-s-r-NH₂ 27 28 Ac-c(C)-r-r-h-r-G-r-NH₂ 28 29 Ac-c(C)-r-r-v-r-s-r-NH₂ 29 30 Ac-c(C)-r-r-v-r-G-r-NH₂ 30 31 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-s-r-NH₂ 31 32 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-G-r-NH₂ 32 33 Ac-c(C)-r-r-(D-hLeu)-r-s-r-NH₂ 33 34 Ac-c(C)-r-r-(D-hLeu)-r-G-r-NH₂ 34 35 Ac-c(C)-r-r-(D-Chg)-r-s-r-NH₂ 35 36 Ac-c(C)-r-r-(D-Chg)-r-G-r-NH₂ 36 37 Ac-c(C)-r-r-(D-Tle)-r-s-r-NH₂ 37 38 Ac-c(C)-r-r-(D-Tle)-r-G-r-NH₂ 38

В структурных формулах приведенной выше таблицы «Ac-c(C)» означает, что ацетилированный цистеин в конфигурации D(c) на амино-конце соединен дисульфидной связью с другим цистеином в конфигурации L(C); «r-NH₂» обозначает амидированный аргинин в конфигурации D(r) на карбоксильном конце.

В настоящем изобретении дополнительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая любое из вышеупомянутых соединений или их фармацевтически приемлемых солей и фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем изобретении дополнительно предложено применение любого из вышеупомянутых соединений или их фармацевтически приемлемых солей и их композиций для получения лекарственного препарата для снижения уровней паратиреоидных гормонов у субъекта или для лечения вторичного гиперпаратиреоза или гиперкальциемии, индуцированной опухолью.

Полипептидные соединения, раскрытые в настоящем документе, представляют собой цвиттер-ионные соединения и могут быть приведены в реакцию с кислотными или основными соединениями с образованием солей способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

Фармацевтическая композиция, содержащая полипептидное соединение, раскрытое в настоящем документе, может быть применена для лечения пациентов, нуждающихся в таком лечении, путем парентерального введения. Для парентеральных путей введения может быть выбрана подкожная инъекция, внутримышечная инъекция или внутривенная инъекция. Также полипептидное соединение, раскрытое в настоящем документе, может быть введено трансдермальными путями, например через пластырь на коже головы, необязательно ионофоретический пластырь, или трансмукозальными путями. Такие фармацевтические композиции и способы получения хорошо известны в данной области техники, а предпочтительным способом введения является внутривенная инъекция.

Полипептидное соединение, раскрытое в настоящем документе, было получено путем твердофазного синтеза с применением полимерного носителя амидной MBHA (4-метилбензгидриламин) смолы Ринка для синтеза (Sunresin, Xi'an). Аминогруппы α производных аминокислот, применяемых в процессе синтеза, были защищены группой Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил), а для боковых цепей аминокислот в соответствии с функциональными группами были выбраны следующие защитные группы: тиол боковой цепи цистеина, амино боковой цепи глутамина и имидазолил боковой цепи гистидина, защищенные Trt (трифенилметил), гуанидинил боковой цепи аргинина, защищенный Pbf (2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил), индолил боковой цепи триптофана, защищенный Boc (трет-бутилоксикарбонил), и фенолил боковой цепи тирозина и гидроксил боковой цепи серина, защищенные t-Bu (трет-бутил). В процессе синтеза карбоксил С-концевого аминокислотного остатка полипептида сначала конденсировали на нерастворимую полимерную амидную MBHA смолу Ринка в форме амидной связи, затем защитную группу Fmoc на α-аминогруппе удаляли с помощью 25% раствора 4-метилпиперидина в N,N-диметилформамиде (ДМФА), а затем твердофазный носитель и следующее в последовательности производное аминокислоты конденсировали в избытке с образованием амидной связи для удлинения пептидной цепи. Процедуры конденсация → промывка → снятие защиты → промывка → следующий цикл аминокислотной конденсации повторяли для достижения желаемой длины полипептидной цепи. В заключении, смешанный раствор трифторуксусной кислоты, воды и триизопропилсилана в соотношении, составляющем 90 : 5 : 5 (об. : об. : об.), приводили в реакцию со смолой для отщепления полипептида от твердофазного носителя, и смесь осаждали с применением замороженного метил-трет-бутилового эфира для получения твердого неочищенного продукта полипептидного соединения. Твердый неочищенный полипептидный продукт растворяли в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в ацетонитрил/вода, а очищали и отделяли с помощью колонки C-18 для препаративной обращенно-фазовой хроматографии с получением очищенного продукта полипептидного соединения.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, термины, используемые в формуле изобретения и описании, имеют следующие значения.

Аминокислотные последовательности, описанные в настоящем документе, представлены с применением стандартных одно- или трехбуквенных кодов для двадцати аминокислот. Если не указано иное, в настоящем изобретении аминокислоты в конфигурации D обозначены префиксом «D-» перед стандартными трехбуквенными кодами, например, D-Ser, или соответствующими строчными однобуквенными кодами, например, s; аминокислоты в конфигурации L обозначены префиксом «L-» перед стандартными трехбуквенными кодами, например, L-Cys, или соответствующими прописными однобуквенными кодами, например, C; в качестве исключения глицин является ахиральным и обозначается как «Gly» или соответствующим прописным однобуквенным кодом «G».

Термин агонист относится к веществу, которое активирует обсуждаемые рецепторы.

Термин агонист кальций-чувствительного рецептора в контексте настоящего документа относится к веществу или лиганду, которое может активировать кальций-чувствительный рецептор. В контексте настоящего документа термин «лечение» включает ингибирование, облегчение, остановку или обращение вспять прогрессирования или тяжести существующего симптома или состояния.

В контексте настоящего документа паратиреоидный гормон представляет собой пептид из 84 аминокислот, продуцируемый паращитовидными железами, и продукты его распада. В дополнение к полноразмерному паратиреоидному гормону в крови присутствуют различные фрагменты паратиреоидных гормонов, которые продуцируются протеолизом и другими метаболическими путями. В интактной молекуле паратиреоидного гормона область остатков 1-34 на амино-конце несет биологическую активность. В данной области техники были разработаны и известны различные способы измерения уровней паратиреоидных гормонов.

Термин «природные аминокислоты» относится к 20 встречающимся в природе обычным аминокислотам, т.е. аланину (Ala, A), цистеину (Cys, C), аспарагиновой кислоте (Asp, D), глутаминовой кислоте (Glu, E), фенилаланину (Phe, F), глицину (Gly, G), гистидину (His, H), изолейцину (Ile, I), лизину (Lys, K), лейцину (Leu, L), метионину (Met, M), аспарагину (Asn, N), пролину (Pro, P), глутамину (Gln, Q), аргинину (Arg, R), серину (Ser, S), треонину (Thr, T), валину (Val, V), триптофану (Trp, W) и тирозину (Tyr, Y).

Термин «неприродные аминокислоты» относятся к аминокислотам, которые не кодируются естественным образом или не встречаются в генетическом кодоне какого-либо организма. Это могут быть, например, полностью синтетические соединения. Примеры включают, но не ограничиваются ими, D-2-аминомасляную кислоту (D-Abu), 3-циклогексил-D-аланин (D-Cha), 3-(2-тиенил)-D-аланин (D-2-Thi), 2-нафтил-D-аланин (D-2-NaI), D-фенилглицин (D-Phg), D-2-хлорфенилаланин (D-Phe(2-Cl)), D-4-нитрофенилаланин (D-Phe(4-NO₂)), D-4-метилфенилаланин (D-Phe(4-Me)), D-гомофенилаланин (D-hPhe), D-трет-лейцин (D-Tle), D-гомолейцин (D-hLeu) и D-циклогексилглицин (D-Chg).

Кроме того, также включено, что С-концевой карбоксил, N-концевой амино и/или функциональная группа боковой цепи природной аминокислоты или неприродной аминокислоты химически модифицированы.

Описания «X выбран из группы, состоящей из A, B или C», «X выбран из группы, состоящей из A, B и C», «X представляет собой A, B или C», «X представляет собой A, B и C» и т.п. все имеют одинаковое значение, т. е. X может быть любым одним или более из A, B и C.

Все атомы водорода, описанные в настоящем изобретении, могут быть заменены изотопом дейтерием, и любой атом водорода в соединениях примеров, к которым относится настоящее изобретение, также может быть заменен атомом дейтерия.

Термин «необязательный» или «необязательно» означает, что событие или обстоятельство, описанное впоследствии, может, но не обязательно, иметь место, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, «гетероциклильная группа, необязательно замещенная алкилом» означает, что алкил может, но не обязательно, присутствовать, и что описание включает случаи, когда гетероциклильная группа является или не является замещенной алкилом.

Термин «замещенный» означает, что один или более, предпочтительно до 5, более предпочтительно от 1 до 3 атомов водорода в группе независимо замещены соответствующим количеством заместителей. Само собой разумеется, что заместитель находится только в своем возможном химическом положении, и специалисты в данной области техники могут определить (экспериментально или теоретически) возможную или невозможную замену без ненужных усилий. Например, замещение может быть нестабильным, когда амино- или гидроксигруппа, имеющая свободный водород, связана с атомом углерода, имеющим ненасыщенную (например, олефиновую) связь.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к смеси, содержащей одно или более соединений, описанных в настоящем документе, или его физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство и другие химические компоненты, например, физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Фармацевтическая композиция предназначена для облегчения введения в организм, что способствует абсорбции активного ингредиента, необходимой для проявления биологической активности.

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, раскрытых соединений, которые являются безопасными и эффективными для применения в организме млекопитающего и обладают необходимой биологической активностью.

В контексте настоящего документа субъект относится к субъекту-человеку или субъекту-животному.

В контексте настоящего документа любая группа или фрагмент, содержащая тиол, относится к функциональной группе, которая содержит связь сера-водород и способна образовывать дисульфидную связь с другим тиолом в нормальных условиях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показано гемолитическое действие иллюстративных соединений 12, 13, 17, 19, 29 и 31 к эритроцитам человека in vitro, где * обозначает положительный контроль (октилфениловый эфир полиэтиленгликоля), а # обозначает буфер PBS (phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буфер).

На Фиг. 2 показана эффективность иллюстративных соединений 13, 17, 31 и этелкальцетида (AMG-416) в дозе 3 мг/кг в снижении уровня паратиреоидного гормона у нормальных крыс.

На Фиг. 3 показана эффективность иллюстративных соединений 13, 17, 31 и этелкальцетида (AMG-416) в дозе 3 мг/кг в снижении уровня кальция в сыворотке у нормальных крыс.

На Фиг. 4 показана эффективность иллюстративного соединения 17 и этелкальцетида (AMG-416) в снижении уровня паратиреоидного гормона у 5/6 нефрэктомированных крыс.

На Фиг. 5 показана эффективность иллюстративного соединения 17 и этелкальцетида (AMG-416) в снижении уровня кальция в сыворотке у 5/6 нефрэктомированных крыс.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Следующие конкретные варианты осуществления представлены в настоящем документе только для более подробной иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения.

1. Реагенты

№ Реагент Источник 1 Амидная MBHA смола Ринка Sunresin, Xi'an 2 O-(1H-6-хлорбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HCTU) Highfine Biotech, Suzhou 3 4-Метилморфолин TCI Chemicals 4 Ацетонитрил (для хроматографии) Sigma-Aldrich 5 N,N-диметилформамид Sinopharm Chemical Reagent 6 Дихлорметан Sinopharm Chemical Reagent 7 Трифторуксусная кислота TCI Chemicals 8 Триизопропилсилан TCI Chemicals 9 Метил-трет-бутиловый эфир TCI Chemicals 10 4-Метилпиперидин TCI Chemicals 11 L-цистеин Sigma-Aldrich 12 Fmoc-D-Cys(Trt)-OH GL Biochem 13 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH GL Biochem 14 Fmoc-D-Ala-OH GL Biochem 15 Fmoc-D-Abu-OH GL Biochem 16 Fmoc-D-Phg-OH GL Biochem 17 Fmoc-D-Phe(4-CH₃)-OH GL Biochem 18 Fmoc-D-2-Thi-OH GL Biochem 19 Fmoc-D-Phe(4-NO₂)-OH GL Biochem 20 Fmoc-D-2NaI-OH GL Biochem 21 Fmoc-D-hPhe-OH GL Biochem 22 Fmoc-D-Tle-OH GL Biochem 23 Fmoc-D-hLeu-OH GL Biochem 24 Fmoc-D-Chg-OH GL Biochem 25 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH GL Biochem 26 Fmoc-D-Cha-OH GL Biochem 27 Fmoc-D-Gln(Trt)-OH GL Biochem 28 Fmoc-Gly-OH GL Biochem 29 Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH GL Biochem 30 Fmoc-D-His(Boc)-OH GL Biochem 31 Fmoc-D-Val-OH GL Biochem 32 Fmoc-D-Phe(2-Cl)-OH GL Biochem 33 Fmoc-D-Trp(Boc)-OH GL Biochem 34 2,2’-Дипиридилдисульфид GL Biochem

2. Приборы

№ Приборы Источник 1 Многоканальный синтезатор полипептидов Prelude-X Protein Technology 2 Аналитическая система H-CLASS для сверхпроизводительной жидкостной хроматографии Waters 3 Хромато-масс-спектрометр жидкостной Xevo Waters 4 Многофункциональная сублимационная сушилка Labconco Thermo Fisher Scientific 5 Система Prep150 для препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии Waters 6 Многоканальная высокоскоростная центрифуга Sigma

3. Примеры

3.1 Химический синтез соединения 1

Твердофазный пептидный синтез проводили на автоматическом синтезаторе полипептидов Prelude-X с применением стратегии синтеза Fmoc/tBu, начиная с амидной MBHA смолы Ринка (0,1 ммоль). Связывание осуществляли, применяя 10 эквивалентов аминокислотных остатков, активированных HCTU и 4-метилморфолином (молярное соотношение между HCTU, 4-метилморфолином и аминокислотными остатками составляло 1 : 2 : 1), в N,N-диметилформамиде при комнатной температуре в течение 25 мин.

После завершения вышеуказанного синтеза пептид-смола, в растворе трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана и воды с соотношением, составляющим 90 : 5 : 5 (об./об./об.), и 2,2'-дипиридилдисульфида (1 ммоль) при комнатной температуре синхронно осуществляли отщепление полипептида от твердофазной смолы, удаление защитной группы боковой цепи и активацию тиольной группы боковой цепи D-Cys в течение 2 ч. После завершения реакции смесь фильтровали и дважды промывали смолу с помощью трифторуксусной кислоты. Фильтраты объединяли перед добавлением большого количества замороженного метил-трет-бутилового эфира для осаждения твердого вещества. Смесь центрифугировали и супернатант отбрасывали с получением неочищенного продукта полипептида, который затем сушили и взвешивали.

Полученный выше неочищенный полипептид и L-Cys (0,1 ммоль) растворяли в буфере PBS (рН равен 7,4) и приводили в реакцию при встряхивании при комнатной температуре. Получение соединения 1 контролировали с помощью сверхпроизводительной жидкостной хроматографии. После завершения реакции к смеси добавляли трифторуксусную кислоту (300 мкл) для гашения реакции и последующей очистки.

Полученную выше смесь фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и разделяли с помощью системы Waters Prep150 для препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с буферами A (0,1% трифторуксусная кислота, водный раствор) и B (0,1% трифторуксусная кислота, 90% ацетонитрил, водный раствор). Препаративная хроматографическая колонка представляла собой обращенно-фазовую хроматографическую колонку X-SELECT OBD C-18 (Waters), в процессе очистки длина волны детектора хроматографа была установлена равной 220 нм, а скорость потока - 15 мл/мин. Очищенный полипептидный продукт соединения 1 получали после того, как соответствующие фракции собирали и лиофилизировали (выход 45%). Чистоту и идентичность соединения чистого полипептидного продукта определяли с помощью аналитической сверхпроизводительной жидкостной хроматографии и сверхпроизводительной жидкостной хромато-масс-спектрометрии, причем чистота соединения составляла 96,78%, а молекулярная масса соединения равна 1109,60.

3.2 Химический синтез соединений 2-38

Соединения 2-38 по настоящему изобретению синтезировали, применяя синтетические протоколы, аналогичные таковым для соединения 1, а чистоту и молекулярную массу синтезированных полипептидов определяли с помощью аналитической сверхпроизводительной жидкостной хроматографии и сверхпроизводительной жидкостной хромато-масс-спектрометрии, как подробно описано ниже в таблице 1:

Таблица 1: Чистота и измеренная молекулярная масса синтезированных соединений

Соединение Чистота Молекулярный вес 2 96,00% 1157,80 3 97,80% 1137,80 4 95,25% 1140,00 5 97,72% 1162,80 6 96,58% 1079,80 7 98,62% 1100,00 8 95,20% 1050,00 9 98,20% 1149,00 10 95,56% 1130,00 11 95,69% 1110,00 12 95,88% 1138,20 13 99,04% 1129,60 14 97,64% 1169,00 15 95,48% 1174,00 16 97,07% 1138,20 17 95,79% 1062,00 18 96,65% 1090,80 19 96,33% 1104,40 20 96,82% 1116,80 21 98,39% 1130,00 22 96,97% 1050,00 23 95,47% 1091,00 24 96,35% 1140,00 25 95,83% 1080,00 26 96,92% 1120,90 27 95,80% 1130,00 28 96,74% 1100,20 29 96,56% 1092,20 30 95,98% 1062,00 31 95,81% 1077,80 32 99,68% 1047,80 33 96,03% 1119,80 34 96,73% 1090,00 35 98,53% 1132,00 36 95,25% 1102,00 37 96,83% 1106,00 38 96,76% 1075,80

Оценка биологического действия

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в сочетании с конкретными примерами, которые, однако, не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

1. Реагент для биологической оценки in vitro и in vivo

№ Реагент Источник 1 FBS (Fetal bovine serum - эмбриональная бычья сыворотка), 500 мл ThermoFisher Scientific 2 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium - среда Игла в модификации Дульбекко), с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAX (дипептидный заменитель L-глутамина), 500 мл ThermoFisher Scientific 3 Пеницилин-Стрептомицин, жидкость, 100 мл (100 ×) ThermoFisher Scientific 4 1 × PBS, pH 7,2-7,4 (500 мл) Solarbio 5 1 × фермент TrypLE Express, без фенолового красного (500 мл) ThermoFisher Scientific 6 Раствор гигромицина B Gold (5 г, 1 × 50 мл, 100 мг/мл) Invivogen 7 HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), 1 М Gibco 8 MgCl₂, 1 M Sigma-Aldrich 9 KCl, 1 М Sigma-Aldrich 10 NaCl, 5 М Sigma-Aldrich 11 Глюкоза Sigma-Aldrich 12 LiCl, 8 M Sigma-Aldrich 13 CaCl₂, 1 M Sigma-Aldrich 14 Комплект IP-One - Gq (1000 тестов) Cisbio

2. Приборы

№ Приборы Источник 1 Детектор EnVision Perkin Elmer

3. Тестовые примеры

3.1 Оценка агонистической активности соединений 1-38 в отношении кальций-чувствительного рецептора (КЧР) человека

3.1.1 Цель: Тестовый пример предназначен для измерения агонистической активности соединений 1-38 в отношении кальций-чувствительного рецептора (КЧР) человека.

3.1.2 Процедуры:

Стабильно трансфицированные клетки HEK293/КЧР (источник: Pharmaron) культивировали в полной среде (состав: DMEM, высокая глюкоза + 10% FBS + 2 мМ GlutaMAX + 1 × пенициллин-стрептомицин + 200 мкг/мл гигромицина B) и инкубировали в 5% CO₂ при 37°C до 70%-90% слияния клеток. Клетки расщепляли TrypLE, инокулировали в 384-луночные планшеты для культивирования клеток и культивировали в 5% CO₂ в течение ночи при 37°C. После замены буфера добавляли буфер для стимуляции (HEPES 10 мМ, MgCl₂ 0,5 мМ, KCl 4,2 мМ, NaCl 146 мМ, глюкоза 5,5 мМ, LiCl 50 мМ, CaCl₂ 1,2 мМ) и различные концентрации тестовых иллюстративных соединений и инкубировали при 37°C в течение 60 мин. Продукцию IP-One в клетках обнаружили в соответствии с процедурами в инструкциях к комплекту Cisbio IP-One Tb. Значения EC₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация) различных тестовых иллюстративных соединений по воздействию на кальций-чувствительный рецептор человека рассчитывали с помощью программного обеспечения после сбора необработанных данных иллюстративных соединений, чтобы оценить агонистическую активность иллюстративных соединений в отношении кальций-чувствительного рецептора человека.

3.1.3 Обработка данных:

Сигнал HTRF (гомогенная флуоресценция с временным разрешением) считывали детектором EnVision с длиной волны возбуждения 320 нм и длинами волн эмиссии 620 нм и 665 нм. Соотношение сигнала (665 нм/620 нм × 10000) рассчитывали и устанавливали нелинейно по отношению к концентрации образца в GraphPad Prism 6 с применением четырехпараметрического уравнения для получения значений EC₅₀ тестовых иллюстративных соединений 1-38. Конкретные значения приведены ниже в таблице 2.

Таблица 2: Агонистическая активность соединений 1-38 in vitro в отношении кальций-чувствительного рецептора

Соединение Последовательность SEQ ID NO: EC₅₀ для кальций-чувствительного рецептора (мкМ) 1 Ac-c(C)-(D-Phg)-r-r-r-a-r-NH₂ 1 15,71 2 Ac-c(C)-[D-Phe(2-Cl)]-r-r-r-a-r-NH₂ 2 6,76 3 Ac-c(C)-[D-Phe(4-CH₃)]-r-r-r-a-r-NH₂ 3 15,28 4 Ac-c(C)-(D-Tyr)-r-r-r-a-r-NH₂ 4 6,92 5 Ac-c(C)-(D-Trp)-r-r-r-a-r-NH₂ 5 1,14 6 Ac-c(C)-s-r-r-r-s-r-NH₂ 6 11,56 7 Ac-c(C)-h-r-r-r-G-r-NH₂ 7 18,60 8 Ac-c(C)-s-r-r-r-G-r-NH₂ 8 14,32 9 Ac-c(C)-w-r-r-r-G-r-NH₂ 9 3,16 10 Ac-c(C)-h-r-r-r-s-r-NH₂ 10 3,52 11 Ac-c(C)-r-r-(D-Phg)-r-a-r-NH₂ 11 15,71 12 Ac-c(C)-r-r-[D-Phe(4-CH₃)]-r-a-r-NH₂ 12 1,28 13 Ac-c(C)-r-r-(D-2-Thi)-r-a-r-NH₂ 13 1,21 14 Ac-c(C)-r-r-[D-Phe(4-NO₂)]-r-a-r-NH₂ 14 4,33 15 Ac-c(C)-r-r-(D-2-NaI)-r-a-r-NH₂ 15 5,59 16 Ac-c(C)-r-r-(D-hPhe)-r-a-r-NH₂ 16 2,37 17 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-a-r-NH₂ 17 6,28 18 Ac-c(C)-r-r-(D-Tle)-r-a-r-NH₂ 18 13,37 19 Ac-c(C)-r-r-(D-hLeu)-r-a-r-NH₂ 19 2,05 20 Ac-c(C)-r-r-(D-Chg)-r-a-r-NH₂ 20 7,53 21 Ac-c(C)-r-r-(D-Cha)-r-a-r-NH₂ 21 5,59 22 Ac-c(C)-r-r-s-r-G-r-NH₂ 22 15,41 23 Ac-c(C)-r-r-q-r-G-r-NH₂ 23 30,40 24 Ac-c(C)-r-r-y-r-a-r-NH₂ 24 2,03 25 Ac-c(C)-r-r-s-r-s-r-NH₂ 25 10,08 26 Ac-c(C)-r-r-q-r-s-r-NH₂ 26 9,24 27 Ac-c(C)-r-r-h-r-s-r-NH₂ 27 10,81 28 Ac-c(C)-r-r-h-r-G-r-NH₂ 28 21,50 29 Ac-c(C)-r-r-v-r-s-r-NH₂ 29 9,80 30 Ac-c(C)-r-r-v-r-G-r-NH₂ 30 19,57 31 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-s-r-NH₂ 31 5,93 32 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-G-r-NH₂ 32 13,09 33 Ac-c(C)-r-r-(D-hLeu)-r-s-r-NH₂ 33 5,03 34 Ac-c(C)-r-r-(D-hLeu)-r-G-r-NH₂ 34 12,19 35 Ac-c(C)-r-r-(D-Chg)-r-s-r-NH₂ 35 12,94 36 Ac-c(C)-r-r-(D-Chg)-r-G-r-NH₂ 36 17,95 37 Ac-c(C)-r-r-(D-Tle)-r-s-r-NH₂ 37 15,45 38 Ac-c(C)-r-r-(D-Tle)-r-G-r-NH₂ 38 18,73 Этелкальцетид Ac-c(C)-a-r-r-r-a-r-NH₂ 40 6,78 Аналог этелкальцетида Ac-c(C)-r-r-a-r-a-r-NH₂ 41 6,74

Положительные контроли этелкальцетида и аналога этелкальцетида в таблице выше были приготовлены в соответствии со способом, раскрытым в патенте № WO2011014707.

Значительная часть раскрытых в настоящем документе иллюстративных соединений продемонстрировала превосходную эффективность in vitro, соответствующую значениям EC₅₀ менее 10 мкМ при оценке агонистической активности in vitro в отношении кальций-чувствительного рецептора человека.

3.2 Оценка активности соединений 1-38 in vitro индуцировать высвобождение гистамина в перитонеальных тучных клетках крыс

3.2.1 Цель: оценить in vitro активность тестовых соединений 1-38 для индуцирования высвобождения гистамина в перитонеальных тучных клетках крыс

3.2.2 Процедуры и обработка данных:

Для оценки уровней высвобождения гистамина in vitro, индуцированных некоторыми тестовыми иллюстративными соединениями, перитонеальные тучные клетки крыс собирали путем промывания брюшной полости крыс буфером для промывания (холодный HBSS (Hank's Balanced Salt Solution - сбалансированный солевой раствор Хенкса) + 25 мМ HEPES, содержащий гепарин 5 Ед./мл, pH 7,4). После сбора клетки центрифугировали, а промывной буфер отбрасывали. Клетки ресуспендировали и дважды промывали буфером для стимуляции (HBSS + 25 мМ HEPES + 1 мМ CaCl₂, pH 7,4). Клетки высевали при плотности 10⁵ клеток/лунку (200 мкл/лунку) и инкубировали при 37°C в течение 15 мин с соединением положительного контроля 48/80 (конечная концентрация: 4 мкг/мл), тестовыми иллюстративными соединениями (конечная концентрация: 10 мкМ) или контрольным носителем. Клетки центрифугировали, а клеточный супернатант собирали и тестировали на концентрацию гистамина в соответствии с инструкциями набора Histamine ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) от LDN (BAE-1000). Конкретные данные приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3: Уровни высвобождения гистамина in vitro, индуцированные некоторыми соединениями, раскрытыми в настоящем документе

Пример Относительная кратность высвобождения гистамина in vitro Буфер PBS 1,00 Соединение 48/80 8,78 1 1,50 2 4,96 4 3,94 5 4,13 6 1,65 7 2,24 8 1,50 10 3,66 11 1,11 12 2,81 13 2,38 16 2,94 17 0,97 18 1,24 19 2,07 20 2,33 21 3,42 22 1,63 24 3,18 25 1,65 26 1,73 27 2,23 29 0,99 30 1,51 31 1,29 32 1,41 33 2,50 34 2,28 35 2,06 37 2,23 Этелкальцетид 1,70

Значительная часть соединений, раскрытых в настоящем документе, существенно не индуцировала высвобождение гистамина в перитонеальных тучных клетках крыс in vitro, в частности относительное кратное высвобождение гистамина составляло менее 1,50 относительно буфера PBS. Неожиданно аминокислотные замены в некоторых соединениях приводили к снижению уровней высвобождения гистамина в перитонеальных тучных клетках крыс in vitro относительно этелкальцетида, например, примеры 17, 29, 31 и 32.

3.3 Оценка гемолитического действия некоторых соединений, раскрытых в настоящем документе, в отношении эритроцитов человека in vitro

3.3.1 Цель: оценить гемолитическое действие некоторых соединений, раскрытых в настоящем документе, в отношении эритроцитов человека in vitro.

3.3.2 Процедуры и обработка данных:

Для оценки гемолитического действия соединений, раскрытых в настоящем документе, в отношении эритроцитов in vitro брали цельную кровь человека (100 мкл) и смешивали с фосфатным буфером. Смесь центрифугировали при 4°C в течение 10 мин и отбрасывали супернатант. Эритроциты ресуспендировали в буфере PBS (900 мкл) и центрифугировали при 4°C в течение 10 мин с отбрасыванием супернатанта, и описанные выше процедуры однократно повторяли. Тестовые иллюстративные соединения растворяли в 1 × буфере PBS до конечной концентрации 100 мкг/мл. Эритроциты ресуспендировали в растворах различных тестовых иллюстративных соединений, растворе октилфеноксиполи(этиленокси)этанол-100 или буфере PBS, и инкубировали при 37°C в течение 1 ч. После инкубации клетки центрифугировали при 4°С в течение 10 мин, а супернатант (100 мкл) отбирали пипеткой и переносили в 96-луночный планшет. Для оценки гемолитического действия тестовых иллюстративных соединений в отношении эритроцитов in vitro определяли оптическую плотность при 540 нм.

3.3.3 Результаты

При концентрации 100 мкг/мл значительного гемолитического действия в отношении эритроцитов для соединений 12, 13, 17, 19, 29 и 31 по настоящему изобретению не наблюдалось, в то время как раствор октилфеноксиполи(этиленокси)этанол-100 продемонстрировал значительное гемолитическое действие в отношении эритроцитов в указанных экспериментальных условиях, как показано на Фиг. 1.

3.4 Оценка эффективности in vivo некоторых соединений, раскрытых в настоящем документе, на нормальной крысиной модели после однократной дозы

3.4.1 Цель: оценить эффективность тестовых соединений в отношении снижения уровней паратиреоидных гормонов в плазме после однократной дозы на нормальной крысиной модели.

3.4.2 Процедуры и обработка данных:

Беспатогенных (СПФ - свободный от специфических патогенов) нормальных взрослых крыс (Sprague Dawley или SD) с массой тела 250-350 г кормили нормальным рационом в помещении для животных в течение 7 дней. Крысы были рандомизированы в группы по 6, половина самки и половина самцы, и пронумерованы. За день до начала лечения у каждой крысы отбирали 540 мкл крови и измеряли уровень паратиреоидного гормона в плазме и концентрацию кальция в сыворотке в качестве исходного уровня. Плазму отделяли с помощью антикоагулянта K2-ЭДТА (этилендиаминтетраацетат). Кровь отбирали через яремную вену и хранили на льду после сбора. Цельную кровь центрифугировали при 6800 об./мин в течение 6 мин при 2-8°C. Супернатант, т.е. плазму, собирали и хранили при 2-8°C. Для отделения сыворотки кровь отбирали через яремную вену, оставляли при комнатной температуре на 1 ч и центрифугировали при комнатной температуре при 3500 об./мин в течение 10 мин. Супернатант, т.е. сыворотку, собирали и хранили при комнатной температуре. За день до лечения животных не кормили в течение ночи, но они имели свободный доступ к воде. На следующий день после забора крови иллюстративные соединения 13, 17, 31 и этелкальцетид (AMG-416) растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS, Gibco). Крысам внутривенно вводили 3 мг/кг иллюстративных соединений 13, 17, 31 или этелкальцетида или равный объем буфера PBS. Затем образцы крови отбирали в соответствии со следующими процедурами измерения параметров. 100 мкл крови отбирали через 1 ч, 2 ч и 4 ч после введения дозы, и плазму отделяли в соответствии с описанными выше процедурами. Уровни паратиреоидных гормонов в плазме измеряли, применяя набор Rat Intact PTH ELISA (крысиный набор для интактного ИФА ПТГ (паратиреоидный гормон)) (Quidel - Immunotopics, Cat. #: 60-2500; ИФА: твердофазный иммуноферментный анализ), в соответствии с инструкциями набора. Подробные процедуры представляют собой следующее: применяя реакционных полоски, предварительно обработанные стрептавидином, представленные в наборе, в лунки добавляли 25 мкл эталонного образца, образцов контроля или плазмы. Биотинилированное крысиное антитело к паратиреоидному гормону и связывающее крысиное антитело к паратиреоидному гормону/HRP (пероксидаза хрена), смешивали в соотношении 1:1 и в каждую лунку добавляли 100 мкл смешанного раствора. Реакционную полоску герметизировали герметизирующей пленкой, оборачивали алюминиевой фольгой для хранения в темноте и встряхивали на горизонтальном шейкере при комнатной температуре в течение 3 ч при скорости вращения 220 об./мин. Растворы в лунках отбрасывали. В лунки для промывки добавляли 350 мкл очищающего рабочего раствора, а затем отбрасывали; проводили 5 промывок теми же процедурами. В заключение лунки высушивали. В каждую лунку добавляли 150 мкл субстрата ИФА пероксидазы хрена. Реакционную полоску герметизировали герметизирующей пленкой, оборачивали алюминиевой фольгой для хранения в темноте и встряхивали на горизонтальном шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин при скорости вращения 180-220 об./мин. В каждую лунку добавляли 100 мкл останавливающего раствора ИФА, и полоску встряхивали при 180-220 об./мин в течение 1 мин на горизонтальном шейкере при комнатной температуре. После добавления останавливающего раствора ИФА в каждой лунке определяли оптическую плотность при 450 нм в течение 10 мин, а оптическую плотность при 620 нм вычитали как фон. При определении оптической плотности в качестве холостого контроля применяли смесь 150 мкл субстрата пероксидазы хрена ИФА и 100 мкл останавливающего раствора ИФА. Строили стандартную кривую в соответствии с оптической плотностью эталонного образца, а фактическую концентрацию паратиреоидного гормона в плазме рассчитывали в соответствии с оптической плотностью других образцов и стандартной кривой. Определение концентрации кальция в сыворотке проводилось в соответствии с процедурами соответствующего набора.

3.4.3 Результаты

Тестовые соединения 13, 17 и 31 полностью снижали уровень паратиреоидного гормона в плазме крови у здоровых крыс в течение 4 ч в дозе 3 мг/кг, и также наблюдалось соответствующее снижение уровня кальция в сыворотке, как показано на Фигурах 2 и 3.

3.5 Оценка эффективности in vivo некоторых соединений, раскрытых в настоящем документе, у 5/6 нефрэктомированных крыс после непрерывного введения

3.5.1 Цель: оценить эффективность некоторых соединений, раскрытых в настоящем документе, в снижении уровня паратиреоидныхх гормонов в плазме и уровня кальция в сыворотке после непрерывного введения у 5/6 нефрэктомированных крыс.

3.5.2 Процедуры и обработка данных:

Крысы были адаптированы. После анестезии 2/3 левой почки было хирургически удалено, и через 1 неделю восстановления правая почка была удалена для создания модели у 5/6 нефрэктомированных крыс. После второго удаления животных нормально кормили в течение 2 недель, тестировали на креатинин (CREA) и уровень паратиреоидных гормонов в плазме и рандомизировали по уровню паратиреоидных гормонов на 4 группы по 10 крыс, включая группу изотонического раствора, соединения 17 - группа низкой дозы, соединения 17 - группа высокой дозы и группу с этелкальцетидом. После рандомизации группе с изотоническим раствором, с соединением 17 - группе низкой дозы, с соединением 17 - группе высокой дозы и группе с этелкальцетидом вводили, соответственно, 1 дозу изотонического раствора, 1 мг/кг соединения 17, 2 мг/кг соединения 17 и 1 мг/кг этелкальцетида через хвостовую вену ежедневно в течение 28 дней. В течение периода лечения определяли такие параметры, как масса животного, уровень паратиреоидных гормонов в плазме и уровень кальция в сыворотке. Первый день лечения был взят за день 1.

3.5.3 Результаты и выводы:

По сравнению с группой с изотоническим раствором, иллюстративное соединение 17 в дозе 1 мг/кг и 2 мг/кг снижало уровень паратиреоидного гормона в плазме крыс дозозависимым образом. Уровень паратиреоидного гормона снижался до чрезвычайно низкого уровня в различных группах лечения через 6 ч после введения дозы в 1, 14 и 28 день, а снижение уровня паратиреоидного гормона превышало 90% с 14-го дня. В течение периода лечения соединение 17 в дозе 1 мг/кг подавляло уровень паратиреоидного гормона в плазме через 6 ч и 16 ч после введения дозы на несколько более высокую или сопоставимую величину по сравнению с этелкальцетидом в той же дозе (Фиг. 4). Снижение кальция в сыворотке является механически связанным эффектом для лекарственных средств данного типа. В этом исследовании после введения в 1, 14 и 28 дни оба соединение 17 и этелкальцетид индуцировали обратимое снижение кальция в сыворотке. Значимых различий в минимальном содержании кальция в сыворотке на 14 и 28 день по сравнению с 1 днем в различных группах лечения не наблюдалось, что позволяет предположить, что степень снижения кальция в сыворотке, индуцированного соединением 17 и этелкальцетидом, не увеличивалась с периодом лечения. Максимальное снижение кальция в сыворотке, индуцированное соединением 17, было сравнимо с этелкальцетидом в той же дозе в 1, 14 и 28 день, что позволяет предположить, что соединение 17 обладает сравнимой с этелкальцетидом активностью, снижающей кальций в сыворотке (Фиг. 5). Примечательно, что стойкость соединения 17 к снижению уровней кальция в сыворотке на 28 день была выше и значительно отличалась по сравнению с этелкальцетидом в той же дозе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Beijing Tuo Jie Biopharmaceutical Co., Ltd.

<120> СОЕДИНЕНИЕ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЕ СОБОЙ АГОНИСТ КАЛЬЦИЙ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО

РЕЦЕПТОРА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 702126CPCT

<150> 201911250088.1

<151> 2019-12-09

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = D-Phg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = D-Phe(2-Cl)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<400> 2

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = D-Phe(4-CH3)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<400> 3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = D-Tyr

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<400> 4

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> D-Trp

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> D-Ala

<400> 5

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> D-Ser

<400> 6

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> D-His

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<400> 7

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<400> 8

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> D-Trp

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<400> 9

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> D-His

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> D-Ser

<400> 10

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Phg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<400> 11

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Phe(4-CH3)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<400> 12

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-2-Thi

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<400> 13

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = Phe(4-NO2)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<400> 14

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-2-NaI

<400> 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-hPhe

<400> 16

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Abu

<400> 17

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Tle

<400> 18

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 19

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-hLeu

<400> 19

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Chg

<400> 20

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Cha

<400> 21

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Ser

<400> 22

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Gln

<400> 23

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Tyr

<400> 24

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 25

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Ser

<400> 25

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Gln

<400> 26

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-His

<400> 27

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-His

<400> 28

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 29

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Val

<400> 29

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 30

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Val

<400> 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 31

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Abu

<400> 31

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Abu

<400> 32

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-hLeu

<400> 33

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 34

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-hLeu

<400> 34

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 35

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Chg

<400> 35

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 36

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Chg

<400> 36

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 37

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ser

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Tle

<400> 37

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 38

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Tle

<400> 38

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210> 39

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = D-Phg, D-Phe(4-CH3), D-Phe(2-Cl), D-Tyr, D-Trp, D-Ser, D-Arg, D-Trp or D-His

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Arg, D-Phg, D-Phe(4-CH3), D-2-Thi, D-Phe(4-NO2), D-2-NaI, D-hPhe, D-Abu, D-Tle, D-hLeu, D-Cha, D-Ser, D-Gln, D-Tyr, D-Ile, D-Ser, D-His, D-Val or D-Chg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala, D-Abu, D-Ser or Gly

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<400> 39

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 40

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<400> 40

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = D-Cys

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (1)..(1)

<223> N-концевой ацетилированный

<220>

<221> ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ

<222> (1)..(1)

<223> Дисульфидная связь Cys-Cys, образованная L-Cys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = D-Ala

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ПОСТ-ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКА

<222> (7)..(7)

<223> C-концевой амидированный

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = D-Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = D-Ala

<400> 41

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Предложен новый агонист кальций-чувствительного рецептора (КЧР), состоящий из короткого пептида, конъюгированного через дисульфидный мостик с L-Cys и содержащего искусственную аминокислоту D-Abu. Соединения согласно настоящему изобретению обладают меньшим побочным эффектом высвобождения гистамина по сравнению с этелкальцетидом или его известными аналогами. Помимо этого предложены фармацевтическая композиция, содержащая указанный агонист КЧР, и ее применение для снижения уровня паратиреоидного гормона в плазме и ионов кальция в сыворотке человека. Также показана возможность применения агониста КЧР согласно настоящему изобретению для лечения метаболических заболеваний, связанных с аномальными уровнями паратиреоидных гормонов (например, гиперпаратиреоз, вторичный гиперпаратиреоз, гиперкальциемия, индуцированная опухолью и др.). 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 1 пр.

1. Соединение, представляющее собой агонист кальций-чувствительного рецептора (CaSR), состоящее из пептида и конъюгированной группы, или его фармацевтически приемлемая соль,

где пептид состоит из аминокислотной последовательности следующей формулы (I):

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (I),

где:

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ выбран из группы, состоящей из D-Phg, D-Phe(4-CH₃), D-Phe(2-Cl), D-Tyr, D-Trp, D–Ser, D-Arg и D-His;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ представляет собой D-Abu;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем пептид и конъюгированная группа ковалентно соединены дисульфидной связью;

при этом конъюгированная группа представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида ковалентно соединен дисульфидной связью с конъюгированной группой;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

2. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где пептид состоит из аминокислотной последовательности следующей формулы (I):

Х₁-Х₂-Х₃-Х₄-Х₅-Х₆-Х₇ (I),

где:

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ представляет собой D-Arg;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ представляет собой D-Abu;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala, D-Abu, D-Ser и Gly;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем пептид и конъюгированная группа ковалентно соединены дисульфидной связью;

при этом конъюгированная группа представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида соединен дисульфидной связью с конъюгированной группой;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

3. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где пептид состоит из аминокислотной последовательности следующей формулы (I):

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (I),

где:

X₁ представляет собой D-Cys;

X₂ представляет собой D-Arg;

X₃ представляет собой D-Arg;

X₄ представляет собой D-Abu;

X₅ представляет собой D-Arg;

X₆ выбран из группы, состоящей из D-Ala и D-Ser;

X₇ представляет собой D-Arg;

причем конъюгированная группа представляет собой L-Cys, и остаток X₁ пептида ковалентно соединен дисульфидной связью с конъюгированной группой;

и N-концевой X₁ пептида является ацетилированным, и C-концевой X₇ пептида является амидированным.

4. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-3, где конъюгированная группа является ацетилированной.

5. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-4, где соединение выбрано из группы, состоящей из соединений, перечисленных ниже:

Соединение Последовательность SEQ ID NO: 17 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-a-r-NH₂ 17 31 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-s-r-NH₂ 31 32 Ac-c(C)-r-r-(D-Abu)-r-G-r-NH₂ 32

6. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с аномальными уровнями паратиреоидных гормонов, содержащая эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-5.

7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-5 или фармацевтической композиции по п. 6 для получения лекарственного препарата для лечения заболевания, связанного с аномальными уровнями паратиреоидных гормонов.

8. Применение по п. 7, где заболевание, связанное с аномальными уровнями паратиреоидных гормонов, представляет собой гиперпаратиреоз.

9. Применение по п. 8, где гиперпаратиреоз представляет собой вторичный гиперпаратиреоз у субъекта с хроническим заболеванием почек.

10. Способ лечения заболевания, связанного с аномальными уровнями паратиреоидных гормонов, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-5 или фармацевтической композиции по п. 6.

название	год	авторы	номер документа
ПЕПТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-23 ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИЕМА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА	2015	Борн Грегори Бхандари Ашок Чэн Сяоли Фредерик Брайан Трой Чжан Цзе Пател Динеш В. Лю Дэвид	RU2736637C2
БЛОКАТОРЫ Kv1.3	2020	Мунк, Хенрик Фишер Йенсен, Расмус Бугге Мадсен, Йенс Квист	RU2825633C1
МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕМЕНТА	2015	Хорти, Мишелль Дениз Дхамнаскар, Кетки Асхок Элбом, Дэниел Джозефсон, Кристофер Ларсон, Келли Кронин Ма, Чжун Нимс, Натан Изекил Рикардо, Алонсо Сейб, Кэтлин Тан, Го-Цин Треко, Дуглас А. Ван, Чжаолинь Е, Пин Чжэн, Хун Перлмуттер, Сара Жаклин Хаммер, Роберт Пол	RU2778514C2
ПЭГИЛИРОВАННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2017	Пери Кришна Дж.	RU2748576C2
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЛИПИДИРОВАННЫЕ ПЕПТИДЫ B-ЦЕПИ РЕЛАКСИНА И ИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Дюкло, Оливье Иллиано, Стефан Маллар, Сержио Минолетти-Ошепье, Клер Бьянки, Элизабетта Индженито, Раффаэле Маготти, Паола Сантопрете, Алессия	RU2804702C2
МОДУЛЯЦИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ СТРУКТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВ	2012	Тайт Джон Уокер Эдвард Стейс Кэтрин Тьюфел Дэниел	RU2745572C2
Аналоги инсулина	2017	Ментинг, Джон Гербрандт Тасман Смит, Брайан Чоу, Дэнни Хунг-Чие Сафави-Хемами, Хелена Лоуренс, Майкл Колин Балдомеро, Оливера М.	RU2769476C2
СХЕМЫ ДОЗИРОВАНИЯ И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ	2018	Гросси, Федерико Дешателетс, Паскаль Франсуа, Седрик Джонсон, Патрик Вега, Каролина	RU2779495C2
ПЛАТФОРМА НА ОСНОВЕ КАРКАСА ЦИСТИНОВОГО УЗЛА	2016	Хэнноуш Рами Калуараччи Харини Найл Аарон Ноланд Кэмерон Чжан Иннань Чжоу Лицзюань Гао Синьсинь	RU2770384C2
ПЕПТИДНЫЕ АНТАГОНИСТЫ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ ИЗ СЕМЕЙСТВА КАЛЬЦИТОНИНА (CGRP) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2017	Соарес Кристофер Дж.	RU2742826C2

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА	2010	Карим Феликс Барух Амос Маклин Дерек Дас Канад Инь Цюнь	RU2557654C2
Многоступенчатая активно-реактивная турбина	1924	Ф. Лезель	SU2013A1
PEREIRA L
et al.: "Old and new calcimimetics for treatment of secondary hyperparathyroidism: impact on biochemical and relevant clinical outcomes", Clin
Kidney J., 2018, v
Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба	1920	Богач Б.И.	SU11A1
ДАВЫДОВИЧ М.Г
и др.: "Гиперпаратиреоз: диагностика и лечение", Медицинский вестник Башкортостана,

Соединение, представляющее собой агонист кальций-чувствительного рецептора, и его применение Российский патент 2024 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P3/14 A61P5/00

Описание патента на изобретение RU2827834C1

Похожие патенты RU2827834C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 827 834 C1

Реферат патента 2024 года Соединение, представляющее собой агонист кальций-чувствительного рецептора, и его применение

Формула изобретения RU 2 827 834 C1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2827834C1

RU 2 827 834 C1