Фторсодержащие полимерные мембраны с пьезоэлектрическими свойствами и антимикробной активностью Российский патент 2024 года по МПК C08L27/16 C08L27/18 C08L39/06 A61K9/70 A61L15/22 

Изобретение относится к области медицины, а именно стоматологии, и может быть использовано как материал для регенерации слизистой оболочки полости рта при возникновении открытых раневых дефектов.

Известны материалы, способствующие процессу заживления слизистой оболочки полости рта благодаря поддержанию раневого дефекта в чистоте, такие как повидон-йод [Al-Amiri, A. Evaluation of the haemostatic action of povidone-iodine in dental extraction (Clinical and follow up prospective study). J. Baghdad Coll. Dent. 2012, 24, 85-87]. Применяются различные синтетические материалы, например, на основе шелка [Qian, Ch.; Xin, T.; Xiao, W.; Zhu, H.; Zhang, Q.; Liu, L.; Cheng, R.; Wang, Zh.; Cui, W.; Ge, Z. Vascularized silk electrospun fiber for promoting oral mucosa regeneration. NPG Asia Mat. 2020, 12, 39] или сополимера полимолочной и полигликолевой кислот [Gupta, S.; PK, P.; Gupta, R. Mucosal substitutes for periodontal soft tissue regeneration. Dentistry. 2015, 5, 327. DOI:10.4172/2161-1122.1000327]. Однако использование этих материалов не способствует ангиогенезу, необходимому для восстановления тканей, что приводит к потере кровоснабжения раны и затрудняет достижение полной реконструкции формы и функций поврежденной слизистой оболочки ротовой полости.

Известен материал [пат. RU 2621297], содержащий в качестве действующего вещества сангвиритрин и масляный экстракт цветков календулы и травы тысячелистника, взятых в соотношении 1:1, имеющий форму геля для лечения воспалительных заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта, обладающий пролонгированным антимикробным действием. Однако раневый дефект остается открытым, и используемый материал не препятствует образованию рубцовой ткани, затрудняя ангиогенез.

Известны материалы на основе биена [пат. EA 200500459 A1], который наряду с регенерирующими свойствами обладает некролитическим и противовоспалительным действием, легким анестезирующим эффектом. Лечение проводят аппликационным способом после антисептической обработки полости рта. Данный метод лечения способствует ангиогенезу, однако не обладает антимикробным действием.

Известен многослойный противомикробный материал [пат. EA 000002284 B1], применяющийся для перевязки ран, верхний слой которого содержит, по меньшей мере, один противомикробный металл (Аg, Au, Pt, Pd, Сu, Та, Аl и сплавов или соединений одного или более из этих металлов) в концентрации, достаточной, чтобы обеспечить локальное противомикробное действие на долговременной основе. Данный материал обладает антимикробными свойствами, однако не обладает пьезоэлектрическим свойством.

Известны материалы - биосинтетические заменители слизистых лоскутов и кожи. Они включают в себя эпидермальные (например, Apligraf^®), дермальные (например, Alloderm^® [Kinikoglu, B.; Damour, O.; Hasirci, V. Tissue engineering of oral mucosa: a shared concept with skin. J. Artif. Organs. 2015, 18, 8-19.], Matriderm^®) и композитные мембраны (например, Integra^®, Silastic^®, Biobrane^®). Однако все заменители слизистых лоскутов и кожи имеют как преимущества, так и существенные недостатки. Например, мембрана Silastic^® препятствует дренированию, увеличивая риск инфицирования, образования гематом, образования складок с накоплением серозного экссудата и преждевременного отделения.

Известен материал, принятый за прототип – мембраны, изготовленные из вспененного политетрафторэтилена, производимые компанией Gore-Tex^®, США [Srivastava, A., Maniakas, A., Myers, J., Chambers, M. S., Cardoso, R. Reconstruction of intraoral oncologic surgical defects with Integra^® bilayer wound matrix. Clinical Case Reports. 2020, 9, 1, 213-219. DOI:10.1002/ccr3.3501]. Мембраны из политетрафторэтилена пористы, физиологически инертны, износостойки, стойки к гидролизу, химическому и ультрафиолетовому излучению. Также они прочны, обладают высокими значениями относительного удлинения. Однако они не проявляют пьезоэлектрические свойства, поэтому при применении физиотерапевтического лечения с целью интенсификации клеточной регенерации необходимо использовать внешний источник питания для продвижения электрических стимулов к клеткам.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании материала для закрытия раневых дефектов слизистой оболочки полости рта, обладающего одновременно антимикробным и пьезоэлектрическим свойствами, способствующего ангиогенезу раневого дефекта.

Технический результат достигается за счет компонентов, входящих в состав композитной мембраны: сополимер винилиденфторида с тетрафторэтиленом придает мембране пьезоэлектрические свойства, из-за чего регенерация дефекта слизистой оболочки полости рта протекает более эффективно по сравнению с открытым раневым дефектом, ванкомицин проявляет антимикробные свойства. Низкомолекулярный поливинилпирролидон необходим для высвобождения антимикробного агента из объема мембраны.

Предложенный материал, также как прототип, за счет сополимера винилиденфторида с тетрафторэтиленом физиологически инертен, износостоек, стоек к гидролизу, химическому и ультрафиолетовому излучению. Также он обладает с прототипом сопоставимой прочностью, значениями относительного удлинения. Заявленное изобретение обладает достаточными показателями пористости и менее гидрофобен, чем аналог, что позволяет не препятствовать дренированию экссудата (жидкости, выделяющейся при воспалительных процессах).

Однако в предложенном материале, в отличие от прототипа, изготовленного из политетрафторэтилена, в мономерах сополимера ВДФ-ТеФЭ каждый углерод углеродной цепи связан как с фторидной группой, так и с водородной группой, находясь в электрически активной β-фазе фторполимера. Поэтому он может индуцировать электрический заряд на своей поверхности под действием механической деформации или внешнего электрического поля, проявляя пьезоэлектрические свойства. Благодаря этому в мембранах, изготовленных из этого материала и используемых для регенерации слизистых оболочек полости рта, различные поверхностные заряды создаются за счет механического воздействия, и регенерация ткани протекает более эффективно без дополнительных источников энергии или электродов для генерации электрического сигнала. Кроме того, во избежание гнойно-воспалительных процессов полости рта на месте раневого дефекта, в состав композитной полимерной мембраны добавлен антимикробный агент – ванкомицин.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет использовать его в качестве материала для закрытия дефектов слизистой оболочки ротовой полости и ускорения процесса ее регенерации без использования физиотерапевтических процедур и дополнительного использования антисептиков.

Заявленное изобретение получают методом электроспиннинга, который отличается простой и недорогой аппаратной реализацией технологического процесса. Для изготовления фторсодержащих полимерных мембран с пьезоэлектрическими свойствами и антимикробной активностью использовали следующие реактивы при следующем соотношении компонентов, мас.%:

ванкомицин 0,07 сополимер винилиденфторида с тетрафторэтиленом (ВДФ-ТеФЭ) 4,851-6,237 низкомолекулярный поливинилпирролидон (ПВП К-17) 0,693-2,079 ацетон 79,05 N,N-диметилформамид 13,95

Для изготовления фторсодержащих полимерных мембран готовили 7 мас.% прядильный раствор, содержащий 1 мас.% ванкомицина и 99 мас.% полимеров, растворенных в смесевом растворителе ацетон-диметилформамид. Для этого готовили смесевой растворитель, состоящий из смеси ацетона и диметилформамида в соотношении 85:15 мас.% соответственно, в котором растворяли полимеры и ванкомицин при постоянном перемешивании. Соотношение полимеров ВДФ-ТеФЭ/ПВП может варьироваться от 90/10 до 70/30 мас.% соответственно.

При помощи многоканальной установки для электроспиннинга осуществляли формирование фторсодержащих полимерных мембран на вращающийся сборочный коллектор. После этого мембраны снимали с коллектора и хранили при комнатной температуре.

Все типы полимерных мембран были сформированы несмешивающимися волокнами ПВП и ВДФ-ТеФЭ, обладали электрической активностью, уменьшающейся при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в составе мембран, обладали высокими значениями относительного удлинения, проявляли антимикробные свойства относительно грамотрицательных бактерий. Прочность полимерных мембран составила от 8,7 до 10,3 МПа, значения прочности уменьшались при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в составе мембран. Значения пористости полимерных композитных мембран при выбранном технологическом режиме формирования мембран составляли 13-17%, значения пористости увеличивались при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в составе мембран.

Для подтверждения технического результата изобретения ниже представлены данные сканирующей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, измерения краевого угла смачивания, механические исследования и антимикробного анализа композитных полимерных мембран, соотношение полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в которых составило от 100/0 до 50/50 мас.% соответственно.

Изображения структуры полимерных мембран методом сканирующей электронной микроскопии были получены на приборе JEOL JCM-6000 (Япония). Перед исследованием образцы покрывались тонким слоем золота с помощью установки магнетронного напыления SC7640 (Quorum Technologies Ltd., Великобритания). Средний диаметр, пористость и ориентацию волокон в мембранах определяли по СЭМ-изображениям, полученным в пяти полях зрения при 5x- и трех полях зрения при 10x-кратном увеличении. Обработка изображений проводилась с помощью программы ImageJ 1.38 (National Institutes of Health, США). Для исследований было измерено не менее чем 500 волокон для каждой исследуемой группы. Данные были обработаны в программе Origin и представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение.

Изображения морфологии поверхности, а также диаграммы значений среднего диаметра, пористости и ориентации волокон композитных мембран представлены на фиг. 1, где соотношение полимерных материалов: а) ВДФ-ТеФЭ/ПВП 100/0 мас.%; б) ВДФ-ТеФЭ/ПВП 90/10 мас.%; в) ВДФ-ТеФЭ/ПВП 50/50 мас.%.

Все типы исследуемых полимерных мембран были сформированы хаотично переплетающимися между собой волокнами, формирующими структуру с открытой взаимосвязанной пористостью. На поверхности мембран всех типов отсутствовали дефекты в виде оплавлений, бусин и т.д., что свидетельствовало об оптимально подобранном режиме формирования мембран. Средний диаметр волокон мембран уменьшался при увеличении концентрации ПВП в соотношении ВДФ-ТеФЭ/ПВП в мембране с 0,96 до 0,50 мкм, а пористость, напротив, увеличилась с 9,6 до 23,2%. Ориентация волокон в полимерных мембранах изменялась нелинейно от -61,89 до 28,03°. Характер распределения полимерных волокон по диаметру у полимерных мембран всех типов нормальный.

Топографию образцов получали в полуконтактном режиме методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) Ntegra Prima (НТ-МДТ, Россия). Использовали кантилевер NSG10 с типичной силовой постоянной 11,8 Н/м и резонансной частотой 240 кГц. Измерения пьезоотклика проводили с помощью пьезоэлектрической силовой микроскопии (ПСМ) на приборе АСМ Ntegra Prima (НТ-МДТ, Россия), оснащенного синхронным усилителем (Zurich Instruments, Германия). Измерение ПСМ проводилось с использованием жесткого наконечника HA_HR/W2C+ с типичной резонансной частотой 380 кГц и силовой постоянной кантилеверов 34 Н/м в контактном режиме для минимизации электростатического эффекта. Измерения ПСМ проводились в квазистатическом режиме с сигналом возбуждения частотой 17 кГц с амплитудой переменного тока 10 В. Данные были обработаны в программе Origin и представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение.

Изображения топографии поверхности полимерных мембран и единичных волокон, а также измерения амплитуды и фазы вертикальной ПСМ представлены на фиг. 2 (АСМ-изображения поверхности волокон в полимерных композитных мембранах в зависимости от содержания полимерных компонентов (ВДФ-ТеФЭ/ПВП 100/0 мас.%; ВДФ-ТеФЭ/ПВП 90/10 мас.%; ВДФ-ТеФЭ/ПВП 50/50 мас.%)), где а) топография поверхности образцов 40×40 μм; б) топография поверхности волокон; в) вертикальная амплитуда сигнала пьезоэлектрического отклика; г) латеральная амплитуда сигнала пьезоэлектрического отклика.

На фиг. 2 представлена топография поверхности, а также вертикальная и латеральная амплитуды пьезоэлектрического отклика в волокнах, формирующих полимерные композитные мембраны. Для волокон полимерной композитной мембраны, содержащей ВДФ-ТеФЭ/ПВП 100/0 мас.% среднее значение вертикальной компоненты пьезоотклика составило 9,6±0,4 пм/В при среднем значении латеральной компоненты, равной 9,7±1,1 пм/В. В волокнах полимерных композитных мембран, содержащих от 10 до 50 мас.% ПВП, средние значения вертикальной компоненты пьезоотклика уменьшаются от 5,5±0,8 пм/В до 1,9±0,6 пм/В соответственно. Средние значения латеральной компоненты пьезоотклика при этом уменьшаются от 4,9±0,5 пм/В до 1,7±0,2 пм/В.

Уменьшение пьезоэлектрического отклика волокон в полимерных композитных мембранах при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов свидетельствует об уменьшении пьезоэлектрических свойств полимерных композитных мембран.

Краевой угол смачивания поверхности образцов дистиллированной водой изучали с помощью системы измерения краевого угла смачивания EasyDrop DSA25 (Krüss, Германия). Измерения проводили методом сидячей капли. Для этого в различные места исследуемой поверхности полимерной мембраны помещали каплю воды объемом 3 мкл. Измерения краевого угла проводили спустя одну минуту после контакта капли с поверхностью. Обработку полученных изображений проводили с помощью программного комплекса Drop Shape Analysis (Krüss, Германия). Все данные представлены в виде средних значений и стандартных отклонений измерений, проведенных в пяти различных точках на поверхности соответствующего образца. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 8.0, используя критерии Ordinary one-way ANOVA и Tukey’s multiple comparisons test, уровень значимости 0,05%.

Результаты определения влияния полимерного материала для изготовления мембран на смачивание полимерных мембран дистиллированной водой представлены в табл. 1.

Таблица 1 – Измерение краевого угла смачивания полимерных мембран дистиллированной водой

Соотношение полимерных материалов,
ВДФ-ТеФЭ/ПВП, % мас. Краевой угол смачивания, ° 100/0 133,2±5,4 90/10 131,9±2,7 80/20 131,6±6,6 70/30 112,8±6,4 60/40 123,7±7,4 50/50 129,7±5,9

Поверхность полимерных мембран всех типов плохо смачивается водой и проявляет гидрофобные свойства. Краевой угол смачивания водой полимерных мембран составляет (112,8-133,2)°, при этом меньшее значение краевого угла смачивания водой имеет мембрана, содержание ВДФ-ТеФЭ/ПВП в которой составляет 70/30 мас.%, а большее – мембрана, в составе которой нет ПВП. Статистически отличное значение краевого угла смачивания водой от других значений имеет мембрана, содержание ВДФ-ТеФЭ/ПВП в которой составляет 70/30 мас.%.

Таким образом, увеличения смачивания полимерных мембран водой не происходит при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в составе мембран. Это объясняется химическим составом и пористой структурой полимерных мембран.

Механические испытания полимерных мембран проводили с помощью испытательной машины Instron 3369 (Instron, США) с датчиком нагрузки 50 Н (модель 2519-102, Instron, США), при скорости растяжения образца 10 мм/мин. Образцы для исследований были получены при помощи вырубного пресса ZCP-020 (ZwickRoell, Германия), соответствовали требованиям ISO 37: 2017 “Rubber, vulcanized or thermoplastic - Determination of tensile stress-strain properties” и имели форму лопатки (тип 4). Все данные представлены в виде средних значений и стандартных отклонений измерений, проведенных при механических испытаниях пяти лопаток, вырубленных из полимерных мембран каждого типа. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 8.0, используя критерии Ordinary one-way ANOVA и Tukey’s multiple comparisons test, уровень значимости 0,05%.

Результаты определения влияния полимерного материала для изготовления мембран на прочность и относительное удлинение полимерных мембран представлены в табл. 2.

Таблица 2 – Значения прочности и относительного удлинения полимерных мембран

Соотношение полимерных материалов,
ВДФ-ТеФЭ/ПВП, % мас. Прочность, МПа Относительное удлинение, % 100/0 11,5±1,2 179,8±9,2 90/10 10,3±2,0 173,3±26,1 80/20 13,4±1,3 171,7±21,2 70/30 8,7±0,8 125,1±10,2 60/40 6,3±0,4 100,6±12,5 50/50 1,9±0,3 93,1±19,6

Все значения прочности полимерных мембран статистически значимы и составляют (1,9-11,5) МПа, при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в составе мембран прочность полимерных мембран уменьшается. Статистически неразличимыми являются значения прочности мембран первого, второго и третьего типов между собой (соотношение ВДФ-ТеФЭ/ПВП составляет 100/0, 90/10 и 80/20 мас.%, соответственно), а также значения второго и четвертого типов мембран (соотношение ВДФ-ТеФЭ/ПВП составляет 90/10 и 70/30 мас.%).

Значения относительного удлинения полимерных мембран при растяжении 10 мм/мин статистически значимы и составляют (93,1-179,8)%, при увеличении концентрации ПВП в соотношении полимерных материалов ВДФ-ТеФЭ/ПВП в составе мембран значения относительного удлинения полимерных мембран уменьшается. Статистически неразличимыми являются значения относительного удлинения мембран при растяжении первого, второго и третьего типов между собой (соотношение ВДФ-ТеФЭ/ПВП составляет 100/0, 90/10 и 80/20 мас.%, соответственно), а также значения относительного удлинения мембран при растяжении четвертого, пятого и шестого типов между собой (соотношение ВДФ-ТеФЭ/ПВП составляет 70/30, 60/40 и 50/50 мас.%, соответственно).

Количественная оценка антимикробной активности проводилась методом подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). Для этого в раствор Staphylococcus aureus с начальной концентрацией 1,25×105 КОЕ/мл помещали 3 лоскута мембран размером 1×1 см, термостатировали при 37°C в течение суток, после чего серийно разводили и высевали на агарированную среду, при этом контрольные посевы инкубировали без элюата из мембран. Конечную концентрацию Staphylococcus aureus определяли путем усреднения двух параллельных экспериментов для каждой исследуемой группы.

Конечные концентрации Staphylococcus aureus, определенные при изучении антимикробной активности соответствующих полимерных мембран, представлены в табл. 3.

Таблица 3 – Конечная концентрация Staphylococcus aureus в элюате из мембраны

Соотношение полимерных материалов,
ВДФ-ТеФЭ/ПВП, % мас. Конечная концентрация Staphylococcus aureus в элюате из мембраны, КОЕ/мл 100/0 5,38×10⁷ 90/10 3,80×10⁴ 80/20 5,21×10⁶ 70/30 7,74×10⁶ 60/40 1,50×10⁷ 50/50 2,58×10⁵

Конечная концентрация Staphylococcus aureus в контрольных посевах, теермостатированных без элюата из мембран, составила 5,60×10⁷ КОЕ/мл. Композитные мембраны обладали антимикробной активностью относительно грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus), угнетая их рост в 3,5–1000 раз относительно контроля. При этом наименьшая антимикробная активность была отмечена у мембран, содержащих 100/0 мас.% ВДФ-ТеФЭ/ПВП, что может быть объяснено малой растворимостью ВДФ-ТеФЭ в водных растворах, и, следовательно, плохим высвобождением ванкомицина из структуры мембраны в элюат. Наибольшая антимикробная активность отмечена у мембран, содержащих 90/10 мас.% ВДФ-ТеФЭ/ПВП. Их использование подавляет рост Staphylococcus aureus в 1000 раз и демонстрирует тем самым эффективность использования композитных полимерных мембран в качестве материала для медицинских целей.

Изобретение относится к области медицины, а именно стоматологии. Описаны компоненты для получения фторсодержащей полимерной мембраны для регенерации слизистой оболочки полости рта при возникновении открытых раневых дефектов, мас.%: ванкомицин – 0,07; сополимер винилиденфторида с тетрафторэтиленом (ВДФ-ТеФЭ) – 4,851-6,237; низкомолекулярный поливинилпирролидон (ПВП К-17) – 0,693-2,079; ацетон – 79,05; N,N-диметилформамид – 13,95. Технический результат – создание материала для закрытия раневых дефектов слизистой оболочки полости рта, обладающего одновременно антимикробным и пьезоэлектрическим свойствами, способствующего ангиогенезу раневого дефекта. 2 ил., 3 табл.

Компоненты для получения фторсодержащей полимерной мембраны для регенерации слизистой оболочки полости рта при возникновении открытых раневых дефектов, мас.%:

ванкомицин 0,07 сополимер винилиденфторида с тетрафторэтиленом (ВДФ-ТеФЭ) 4,851-6,237 низкомолекулярный поливинилпирролидон (ПВП К-17) 0,693-2,079 ацетон 79,05 N,N-диметилформамид 13,95