ИНТРАНАЗАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ ВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ Российский патент 2024 года по МПК A61K33/38 A61K47/36 A61K47/42 A61K47/58 A61K38/12 A61K38/46 A61P31/00 A61P11/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно фармакологии, и может быть использовано для профилактики и/или лечения инфекций вирусной и бактериальной этиологии носоглотки, носовой полости, в том числе коронавирусной инфекции, гриппа, других ОРВИ.

Уровень техники

Возрастающая роль инфекционных вирусных заболеваний в структуре общей заболеваемости населения, появление новых опасных вирусов (в том числе ранее неидентифицированных) способствуют разработке и внедрению перспективных антимикробных композиций широкого спектра активности с пролонгированным действием.

Носовая полость является противомикробным фильтром, в котором широко представлена микрофлора воздуха, в том числе споры грибов, бациллы, микрококки, непатогенные нейссерии, эпидермальный стафилококк, бета-гемолитический стрептококк. К факультативным обитателям носа относятся пневмококки, клебсиелла пнеумония, золотистый стафилококк, бактерии инфлюэнции, кандиды. Эти виды могут послужить причиной аутоинфекции: ринитов, бронхитов, назофарингитов, пневмонии, а также источником инфицирования других людей. У детей микрофлора носа еще более многочисленна и многообразна.

Прототипом заявленного решения является изобретение по патенту RU 2616523 С1 (17.04.2017, МПК A61K 9/06, A61K 31/22, A61K 36/61, A61K 36/53, А61Р 31/04, А61Р 31/16), представляющее собой интраназальную мазь для лечения и профилактики респираторных инфекций. Согласно данным, приведенным в описании, изобретение характеризуется пролонгированным эффектом, который обеспечивается синергизмом отдельных компонентов препарата. Результаты применения лекарственного препарата были показаны у больных с гриппом и ОРВИ.

При этом авторами данного изобретения не указана необходимая кратность и длительность применения интраназальной мази, при которой достигаются заявленные лечение и профилактика.

Кроме того, авторы своими результатами исследований in vitro не подтверждают заявленный противовирусный эффект за счет синергетического действия отдельных компонентов мази. Авторами также не указаны данные по эффективности интраназальной мази в отношении коронавирусов человека, вируса гриппа, других РНК- и ДНК-содержащих вирусов, а также не заявлен антибактериальный эффект мази и ее действие в отношении микробных биопленок.

Раскрытие сущности изобретения

Задача настоящего изобретения направлена на решение проблемы отсутствия эффективной композиции широкого спектра действия для профилактики и/или комплексного лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости при интраназальном применении.

Техническим результатом изобретения является создание более эффективной по сравнению с прототипом композиции широкого спектра действия для профилактики и/или комплексного лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости при интраназальном применении, обладающей пролонгированной широкой антимикробной активностью, в частности, в отношении коронавируса человека, вируса гриппа, других РНК- и ДНК-содержащих вирусов и бактерий, обладающей способностью препятствовать формированию и разрушать уже сформированные микробные биопленки.

Проблема решается и указанный технический результат достигается созданием композиции для аппликации полости носа, характеризующейся тем, что она содержит высокомолекулярную гиалуроновую кислоту, высокомолекулярный поливинилпирролидон (ПВП), гелофузин, гипохлорит натрия, повиаргол, антибактериальный полипептид, представляющий собой грамицидин С или лизоцим при следующем соотношении компонентов, мас. %:

• Гиалуроновая кислота высокомолекулярная - 0,1-2,0;

• Высокомолекулярный ПВП - 4,0-6.0;

• Повиаргол - 0,8-1,2;

• Антибактериальный полипептид (грамицидин С - 0,03-0,15, или лизоцим - 0,1-18,0);

• Раствор гипохлорита натрия с содержанием активного хлора 1566 мг/л - 49,0-51,0;

• Гелофузин до 100,0.

Количественно-качественное сочетание компонентов в составе предлагаемой к патентованию композиции, приводит к проявлению синергетического действия.

Предметом изобретения является также применение заявленной композиции для профилактики и/или лечения (особенно в периоды обострения сезонных инфекционных заболеваний, эпидемий и пандемий) инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости, вызванных коронавирусами, вирусом гриппа, другими РНК- и ДНК-содержащими вирусами и бактериями, сопровождающихся формированием микробных биопленок, характеризующееся тем, что проводят аппликацию композиции на слизистую полости носа в профилактических или лечебных целях один раз в сутки.

Термин «гиалуроновая кислота высокомолекулярная» в контексте настоящего изобретения характеризует несульфированный гликозаминогликан, входящий в состав соединительной, эпителиальной и нервной тканей. Высокомолекулярная гиалуроновая кислота является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса, содержится во многих биологических жидкостях (слюне, синовиальной жидкости и др.), принимает значительное участие в пролиферации и миграции клеток, продуцируется некоторыми бактериями (напр. Streptococcus). В теле человека весом 70 кг в среднем содержится около 15 граммов гиалуроновой кислоты, треть из которой преобразуется (расщепляется или синтезируется) каждый день.

Одной из важных функций гиалуроновой кислоты в соединительной ткани является связывание воды. В результате этого межклеточное вещество приобретает характер желеобразного матрикса, поддерживающего клетки. Связывание воды и обусловленное им набухание, определяет биологическую роль гиалуроновой кислоты в регуляции проницаемости тканей. Гиалуроновая кислота является основным структурообразующим гликозаминогликаном, так как имеет способность концентрировать вокруг себя другие гликоаминогликаны и образовывать агрегаты протеогликанов, которые обладают большой гидрофильностью и эластичностью по сравнению со свободными протеогликанами. Связывая коллагеновые волокна, другие белки и компоненты межклеточного вещества и даже клетки в единую систему, гиалуроновая кислота создает «буферный объем», который определяет прочность и упругость механических тканей, помогает им преодолевать временное воздействие (Н.Н. Сигаева, С.В. Колесов, П.В. Назаров, P.P. Вильданова. Химическая модификация гиалуроновой кислоты и ее применение в медицине // Вестник Башкирского университета. 2012. Т. 17. №3. С. 1220-1241).

Термин «поливинилпирролидон высокомолекулярный медицинский» (Высокомолекулярный ПВП) в контексте настоящего изобретения характеризует связующее средство. Высокомолекулярный ПВП выпускается в виде порошка марки «фармацевтически чистый», сыпучий белый или желтовато-белый порошок с частицами различного размера, запах специфический. Среднемассовая молекулярная масса ПВП составляет 1000000-1500000 Да [Фолькер Бюлер. Коллидон®. Поливинилпирролидон для фармацевтической промышленности / Перевод с англ. под ред. д.ф.н. К.В. Алексеева. BASF: 2001. - 310 с.]. Водный раствор ПВП представляет собой стерильную вязкую прозрачную слабоокрашенную жидкость со специфическим слабым запахом.

Несмотря на достаточно широкий набор материалов для иммобилизации лекарственных веществ наибольший интерес представляют биодеградируемые носители на основе высокомолекулярного ПВП, позволяющие обеспечивать длительное присутствие антибактериальных веществ в ране, их местное использование как в целях профилактики при металлоосетесинтезе, так и для лечения хирургических инфекций. Важное значение при этом имеет молекулярная масса ПВП. Модификация биологически-активных веществ высокомолекулярными полимерами осуществляется для направленного изменения их свойств: снижения токсичности, улучшения растворимости, фармакокинетики и биодоступности за счет комплексообразования [Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры, 1993. Изд-во «Гиппократ», СПб. - 260 с.]. Основная функция растворимого высокомолекулярного ПВП заключается в пролонгировании действия лекарственных препаратов с улучшенной биодоступностью.

Авторами было обнаружено, что высокомолекулярный ПВП, обладающий сорбирующими и антитоксическими свойствами, в качестве полимерного носителя способствует обеспечению пролонгированного эффекта активных веществ в составе настоящей композиции.

Термин «повиаргол» в контексте настоящего изобретения характеризует высокодисперсное металлическое серебро, стабилизированное поливинилпирролидоном низкомолекулярным медицинским; представляет собой легкий порошок от зеленовато-серого до зеленовато-коричневого цвета. В медицинской практике повиаргол используют в качестве водного раствора для наружного применения, который готовят непосредственно перед употреблением.

Повиаргол - антимикробное средство с широким спектром действия, активное в отношении аэробной и анаэробной микрофлоры, в том числе антибиотикорезистентной. В концентрациях до 100 мкг/мл он подавляет рост большинства бактерий (стафилококков, стрептококков, синегнойной и кишечной палочки, протея, шигелл, сальмонелл и др.).

Препарат в концентрациях 1-3% обладает противовоспалительным действием и стимулирует репаративные процессы в ране на стадии эпителизации; малотоксичен, не обладает раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки, не вызывает аллергических реакций и дерматитов, Повиаргол применяют как антимикробное средство для профилактики и лечения гнойно-септических осложнений ран, язв, ожогов и пролежней, в том числе длительно не заживающих при лечении антибиотиками; при инфекционных заболеваниях верхних дыхательных путей, уха, горла, носа, глаз и полости рта; при заболеваниях мочеполовой системы и опорно-двигательного аппарата [http://sktb-technolog.ru/poviargolum2; «Повиаргол: новое бактерицидное средство для лечения инфицированных ран. (Опыт клинического использования в травматологии, гнойной хирургии, ожоговой терапии, гинекологии, урологии и офтальмологии). Справочное пособие для врачей / Под ред. чл.-корр. РАН Панарина Е.Ф., д.м.н., проф. Благитко Е.М. Новосибирск: Изд-во. 1998. - 66 с.»].

Термин «гипохлорит натрия» в контексте настоящего изобретения характеризует эффективный антисептик. Спектр областей его применения включает в себя дезинфекцию лабораторного оборудования, обеззараживание воды, местную обработку ран и т.д. Гипохлорит натрия проявляет свою биологическую активность через реакции с нуклеиновыми и аминокислотами. В реакциях с нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК, он хлорирует основания, препятствуя формированию водородных связей, что инициирует денатурацию молекулы и, как следствие, потерю биологической активности.

Термин «лизоцим» в контексте настоящего изобретения характеризует фермент врожденной иммунной системы большого количества различных организмов начиная от прокариотов заканчивая высшими эукариотами. Являясь 1,4-b-D-N-ацетилмурамидазой, он ко всему прочему способен проявлять хитиназную активность, гидролизовать гликозидные связи бактериального пептидогликана, активировать аутолизины и проявлять противовирусную активность, в том числе и против ВИЧ. При этом белок обладает довольно низкой токсичностью, и даже при превышении достаточных для достижения бактерицидного эффекта дозировок существенного влияния на организм больного не было обнаружено.

Термин «грамицидин С» в контексте настоящего изобретения характеризует молекулу органического происхождения и служит природным механизмом защиты палочки Bacillus brevis, которая начинает продукцию вещества в ответ на угрозу своей жизнедеятельности. Антибиотик полипептидной структуры, обладает бактериостатическим (препятствующим размножению бактерий) и бактерицидным (уничтожающим бактерии) действием. Механизм действия грамицидина С связан с повышением проницаемости цитоплазматической мембраны микробной клетки, что нарушает ее устойчивость и вызывает гибель клетки. Грамицидин С представляет циклическую последовательность аминокислот, и такая структура позволяет предупреждать развитие резистентности микроорганизмов к данному антибиотику, при этом на данный момент в доступной литературе не описано возникновение привыкания к препарату у различных бактериальных возбудителей, что важно для эффективности лечения.

Термин «гелофузин» в контексте настоящего изобретения характеризует 4% раствор сукцинилированного желатина (также известный, как модифицированный жидкий желатин) для внутривенного введения со средней молекулярной массой 23 200 дальтон. Он имеет коллоидно-осмотическое давление 34 мм Hg. Изоэлектрическая точка достигается при рН 4,5. Отрицательные заряды, возникающие в молекуле в результате сукцинилирования, приводят к увеличению молекулы в размерах и, таким образом, формируются более объемные белковые цепи, чем несукцинилированные, при сохранении молекулярной массы. В результате Гелофузин оказывает достаточный волемический эффект в течение 3-4 часов. Гелофузин применяют в качестве коллоидного плазмозамещающего средства.

Краткое описание чертежей

ФИГ. 1 - Кинетика взаимодействия вирусной РНК с гипохлоритом натрия.

ФИГ. 2 - Изменения во времени спектров поглощения поли АУ (С=0,98*10^-5 М а.о.) в присутствии гипохлорита натрия (С_гип.=5*10^-5 М, или 3,75 мг/л).

ФИГ. 3 - Изменения во времени спектров поглощения комплексов «pAU-гипохлорит» в присутствии повиаргола при λ=260 нм.

ФИГ. 4 - Спектры поглощения смеси «гипохлорит натрия - повиаргол» при λ=260 нм.

ФИГ. 5 - Контроль культуры клеток аденокарциномы легкого человека (АТСС® CRL-5800), х600.

ФИГ. 6 - Контроль цитотоксического действия коронавируса ОС43 в отношении культуры клеток аденокарциномы легкого человека (АТСС® CRL-5800), х900.

ФИГ. 7 - Морфологическая картина состояния культуры клеток аденокарциномы легкого человека (АТСС® CRL-5800) в присутствии коронавируса ОС43 и полимерной композиции из трех полимеров, х600.

ФИГ. 8 - Спектры поглощения комплекса «ДНК-гипохлорит», С_ДНК=2,2×10^-5 М_а.о. (1 - 1 мин. п/п, 2 - 5 мин. п/п, 3 - 15 мин. п/п, 4 - 1 сутки п/п). а) C_NaClO=1.46×10^-4 М; б) C_NaClO=3,5×10^-4 М; в) C_NaClO=8,0×10^-4 М.

ФИГ. 9 - А: Кинетика реакции тройной системы Hyp-DNA-Pov; В: производная по времени зависимости поглощения от времени реакции тройной системы DNA-Hyp-Pov (черные квадратики) и DNA-Hyp (красные кружочки).

ФИГ. 10 - Зависимость между бактерицидным действием интраназальной композиции и временем ее воздействия на разные микроорганизмы.

ФИГ. 11 - Бактерицидное действие интраназальной композиции и антимикробных ингредиентов, входящих в ее состав.

ФИГ. 12 - Визуализация интраназальной композиции на слизистой оболочке носовой полости через 8 часов нанесения.

ФИГ. 13 - Отсутствие визуализации интраназальной композиции на основе прототипа на слизистой оболочке носовой полости через 8 часов нанесения.

ФИГ. 14 (А) - Контроль 0.5 МФ Staphylococcus aureus.

ФИГ. 14 (Б) - Опытный образец 0.5 МФ Staphylococcus aureus.

ФИГ. 14 (В) - Прототип 0.5 МФ Staphylococcus aureus.

ФИГ. 15 (А) - Контроль 0.5 МФ Pseudomonas aeruginosa.

ФИГ. 15 (Б) - Опытный образец 0.5 МФ Pseudomonas aeruginosa.

ФИГ. 15 (В) - Прототип 0.5 МФ Pseudomonas aeruginosa.

ФИГ. 16 (А) - Контроль 0.5 МФ Acinetobacter baumannii.

ФИГ. 16 (Б) - Опытный образец 0.5 МФ Acinetobacter baumannii.

ФИГ. 16 (В) - Прототип 0.5 МФ Acinetobacter baumannii.

ФИГ. 17 (А) - Контроль 0 5 МФ Klebsiella pneumoniae.

ФИГ. 17 (Б) - Опытный образец 0.5 МФ Klebsiella pneumoniae.

ФИГ. 17 (В) - Прототип 0.5 МФ Klebsiella pneumoniae.

Осуществление изобретения

Заявляемая композиция для профилактики и/или лечения самостоятельно или в составе комплексной терапии инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости при интраназальном применении, обладающая пролонгированной антимикробной активностью в отношении коронавируса человека, вируса гриппа, других РНК- и ДНК-содержащих вирусов и бактерий, способностью препятствовать формированию и разрушать уже сформированные микробные биопленки, включает компоненты в следующем соотношении, мас. %:

• Гиалуроновая кислота высокомолекулярная - 0,1-2,0;

• Высокомолекулярный ПВП - 4,0-6,0;

• Повиаргол - 0,8-1,2;

• Антибактериальный полипептид (грамицидин С - 0,03-0,15, или лизоцим - 0,1-18,0);

• Раствор гипохлорита натрия с содержанием активного хлора (АХ) 1566 мг/л - 49,0-51,0;

• Гелофузин до 100,0.

Количество гиалуроновой кислоты высокомолекулярной также может составлять 0,5-2 мас. %, 0,5-1 мас. %, или 1-2 мас. %.

Количество высокомолекулярного ПВП также может составлять 4,5-5,5 мас. %.

Количество повиаргола также может составлять 0,8-1 мас. %.

Количество лизоцима также может составлять 1-16,0 мас. %.

Заявленная композиция может использоваться для профилактики самостоятельно, а также в составе комплексной терапии инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости, вызванных коронавирусами, вирусом гриппа, другими РНК- и ДНК-содержащими вирусами и бактериями, путем ее нанесения (аппликации) на слизистую носовой полости.

Для получения композиции все порошкообразные компоненты (гиалуроновая кислота, поливинилпирролидон, повиаргол, грамицидин С (или лизоцим)) растворяют последовательно в растворе гипохлорита натрия с соблюдением вышеуказанных количественных соотношений и добавляют раствор гелофузина до 100,0 мас. %, перемешивают до получения гомогенной массы.

Приготовление заявляемой композиции на основе гелофузина, высокомолекулярных гиалуроновой кислоты и поливинилпирролидона обеспечивает пролонгированное действие за счет образования защитной барьерной пленки на слизистой поверхности носовой полости, которая способствует длительному антимикробному эффекту повиаргола и гипохлорита натрия, увлажнению носовых ходов, что, в свою очередь, снижает риск развития раздражения, сухости носовой слизистой, болевой реакции, кровотечения.

Соотношение компонентов заявляемой композиции является результатом широких экспериментальных исследований и оптимально подходит для достижения указанных выше результатов. При этом существенным преимуществом заявляемой композиции является наличие пролонгированного антимикробного эффекта в отношении широкого спектра РНК- и ДНК-содержащих вирусов и бактерий, микробных биопленок, отсутствие побочных эффектов.

Особенностью заявляемой композиции является образование тонкой полимерной барьерной пленки на слизистой поверхности носовой полости при однократной аппликации, что обеспечивает высокую сорбцию вирусных и бактериальных частиц в течение уже одного часа. Кроме того, присутствие повиаргола в течение первых 50 секунд ускоряет денатурирующее действие гипохлорита натрия в отношении вирусных РНК или вирусных и бактериальных ДНК.

В качестве неограничивающих примеров представляются следующие экспериментальные данные.

Пример 1.

Изучена антивирусная активность в отношении РНК-содержащих вирусов предлагаемой интраназальной композиции следующего состава, мас. %:

Гипохлорит натрия раствор (АХ 1566 мг/л) - 49,0

Гиалуроновая кислота - 1,0

ПВП - 5,0

Повиаргол - 1,0

Грамицидин С - 0,03

Гелофузин - 43,97.

Использованы следующие штаммы вирусов:

- коронавирус человека, штамм ОС43,

- вирус гриппа A/PuertoRico/8/34 (H1N1).

Для анализа противовирусной активности 1 мл образца предлагаемой интраназальной композиции смешивали в пробирке объемом 1,5 мл с 0,1 мл вируссодержащей жидкости (исходный титр коронавируса ОС43 6,5 lg; вируса гриппа 7,5 lg). В контрольную пробирку вместо композиции вносили 0,1 мл среды для клеток. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут, после чего в вируссодержащей жидкости определяли инфекционную активность соответствующего вируса. В каждой исследуемой группе использовали по три аналитические параллели.

Как следует из приведенных данных, предлагаемая интраназальная композиция достоверно снижала титры вируса гриппа и коронавируса ОС43 в культуре клеток.

Эффективность противовирусного действия в отношении РНК-содержащих вирусов составила не менее 99,9% в течение 3-минутной экспозиции.

Пример 2.

Изучена антивирусная активность в отношении РНК-содержащих вирусов предлагаемой интраназальной композиции следующего состава, мас. %:

Гипохлорит натрия раствор (АХ 1566 мг/л) - 49,0

Гиалуроновая кислота - 1,0

ПВП - 5,0

Повиаргол - 1,0

Лизоцим - 16,0

Гелофузин - 28,0.

Использованы следующие штаммы вирусов:

- коронавирус человека, штамм ОС43,

- вирус гриппаА/PuertoRico/8/34 (H1N1).

Для анализа противовирусной активности 1 мл образца предлагаемой интраназальной композиции, смешивали в пробирке объемом 1,5 мл с 0,1 мл вируссодержащей жидкости (исходный титр коронавируса ОС43 4,7 lg; вируса гриппа 5,5 lg). В контрольную пробирку вместо композиции вносили 0,1 мл среды для клеток. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут, после чего в вируссодержащей жидкости определяли инфекционную активность соответствующего вируса. В каждой исследуемой группе использовали по три аналитические параллели.

Как следует из приведенных данных, предлагаемая интраназальная композиция достоверно снижала титры вируса гриппа и коронавируса ОС43 в культуре клеток. Эффективность противовирусного действия в отношении РНК-содержащих вирусов составила не менее 99% в течение 3-минутной экспозиции.

Пример 3.

Для доказательства усиления противовирусного эффекта компонентов заявленной композиции изучена антивирусная активность в отношении РНК-содержащего вируса (коронавируса) ингредиентов предлагаемой интраназальной композиции в следующих концентрациях, мас. %:

Образец №1

Грамицидин (полипептидный антибиотик) - 0,03

Образец №2

Повиаргол (наночастицы серебра) - 1,0

Образец №3

Грамицидин (полипептидный антибиотик) - 0,03

Повиаргол (наночастицы серебра) - 1,0

Образец №4

Лизоцим (антибактериальный полипептид) - 16,0

Повиаргол (наночастицы серебра) - 1,0

Образец №5

Лизоцим (антибактериальный полипептид) - 16,0

Грамицидин (полипептидный антибиотик) - 0,03

Образец №6

Лизоцим (антибактериальный полипептид) - 16,0,

Использованы следующие штаммы вирусов:

- коронавирус человека, штамм ОС43.

Для анализа противовирусной активности 1 мл каждого образца смешивали в пробирке объемом 1,5 мл с 0,1 мл вируссодержащей жидкости (исходный титр коронавируса ОС43 5,5 lg). В контрольную пробирку вместо соответствующего образца вносили 0,1 мл среды для клеток (полная среда RPMI-1640, содержащая 2 mM L-глугамина, 250 мг/л гентамицина, 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота). Пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут, после чего в вируссодержащей жидкости определяли инфекционную активность соответствующего вируса. В каждой исследуемой группе использовали по три аналитические параллели.

Впервые показано наличие собственной антивирусной активности грамицидина С, так как в доступной литературе отсутствуют данные о его антивирусном действии.

При этом наблюдали аддитивный эффект (отличительный признак) взаимодействия грамицидина C с повиарголом и лизоцима с повиарголом в отношении штамма коронавируса ОС43. Такое взаимодействие дает преимущество в интраназальной композиции пролонгированного действия, когда постепенно снижаются исходные концентрации антимикробных составляющих.

Пример 4.

Изучена способность повиаргола (наночастиц серебра) ускорять процесс разрушения гипохлоритом натрия вирусной и синтетической РНК.

В исследовании использовали коронавирус человека ОС43 из коллекции вирусных штаммов ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Санкт-Петербург). Исходный образец вирусной РНК (С=3*10^-4 М а.о.) разбавляли 0.001 М NaCl до достижения объема, минимально необходимого для измерения в специальной кювете спектрофотометра (600 мкл). Используемая в эксперименте концентрация вирусной РНК составила С=1*10^-5 М а.о.

Концентрация гипохлорита натрия (молярная) во всех экспериментах была в 5 раз больше концентрации нуклеотидов в растворе, т.е. С_гип.=5*10^-5 М, или 3,75 мг/л.

Результаты взаимодействия вирусной РНК и разных концентраций гипохлорита натрия представлены на фигуре 1.

Различный ход временных зависимостей в разных областях спектра свидетельствует о взаимодействии гипохлорита натрия с различными компонентами РНК, присутствующими в растворе. При этом именно область длины волны 260 нм может отражать взаимодействие гипохлорита натрия с азотистыми основаниями полинуклеотида.

Аналогичный эксперимент проводили с синтетической РНК (поли АУ). Результаты представлены на фигуре. 2.

Характер временных зависимостей относительного изменения поглощения и его скорости в области λ=260 нм, которая характеризует состояние азотистых оснований в полинуклеотидах, аналогичен для вирусной и синтетической РНК. Он свидетельствует, что процесс взаимодействия полинуклеотидов с гипохлоритом имеет, по крайней мере, 2 стадии. Первая - быстрая, выражается в возрастании интенсивности поглощения, которое обычно связывают с денатурацией или разрушением вторичной структуры полинуклеотида. На этой же стадии происходит хлорирование азотистых оснований. На второй стадии происходит постепенное разрушение азотистых оснований, вызванное продуктами, образовавшимися на первой стадии взаимодействия.

Изменения во времени спектров поглощения комплексов «поли АУ + гипохлорит натрия» в присутствии повиаргола показаны при следующих концентрациях компонентов: C_pAU=7,6*10^-5 М, C_NaOCl=3,8*10^-4 М, C_{повиаргол}=0,002%. Результаты представлены на фигуре 3.

В присутствии повиаргола значительно усиливается разрушение нуклеотидов, происходящее в первые 2 минуты взаимодействия гипохлорита натрия с полинуклеотидом.

Механизм этого действия заключается в том, что гипохлорит натрия взаимодействует с повиарголом. Об этом свидетельствуют спектры поглощения смеси «гипохлорит натрия - повиаргол» (ФИГ. 4).

Продукты этого взаимодействия способствуют разрушению нуклеотидов в составе РНК.

Впервые выявлен и описан эффект ускорения процесса разрушения РНК гипохлоритом натрия, в присутствии повиаргола. Механизм этого действия заключается в том, что гипохлорит натрия взаимодействует с повиарголом. Продукты этого взаимодействия способствуют более быстрому разрушению нуклеотидов в составе РНК.

Пример 5.

Изучена сорбционная активность в отношении РНК-содержащих вирусов полимерных комбинаций следующего состава, мас. %:

Образец №1

Высокомолекулярный ПВП - 5,0

Среда для культуры клеток - до 100,0.

Образец №2

Высокомолекулярная гиалуроновая кислота - 1,0

Гелофузин (4% жидкий желатин) - до 100,0.

Образец №3

Высокомолекулярная гиалуроновая кислота - 1,0

Высокомолекулярный ПВП - 5,0

Гелофузин (4% жидкий желатин) - до 100,0.

Использованы следующие штаммы вирусов:

- коронавирус человека, штамм ОС43,

- вирус гриппа A/PuertoRico/8/34 (H1N1).

В 1 мл соответствующей полимерной комбинации вносили 100 мкл вируссодержащей жидкости (исходный титр коронавируса ОС43 6,5 lg; вируса гриппа 7,5 lg) и полученные смеси инкубировали 1 час при комнатной температуре. После этого образцы центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин и в надосадке определяли инфекционную активность вируса. В контрольных образцах вместо полимерной комбинации использовали среду для клеточных культур.

Как следует из приведенных данных, при совместной прединкубации в течение 1 часа показана способность высокомолекулярного ПВП снижать титр обоих тест-вирусов на 1 lg; смеси высокомолекулярной гиалуроновой кислоты с желатином - на 2,5 lg; смеси трех полимеров - высокомолекулярных ПВП и гиалуроновой кислоты на гелофузине - на 3,5 lg.

Впервые установлено исключительное противовирусное действие полимерной композиции за счет высокой способности полимеров и их комбинаций сорбировать частицы РНК-содержащих вирусов. Это обеспечивает способность изученной комбинации полимеров препятствовать прикреплению вирусных частиц к слизистой носовой полости, удерживать их в составе полимерной матрицы, облегчая действие антимикробных агентов в составе антимикробной интраназальной композиции.

На фигурах 5-7 показана морфологическая картина состояния культуры клеток в присутствии тест-коронавируса ОС43 и полимерной композиции из трех полимеров - высокомолекулярных ПВП и гиалуроновой кислоты на гелофузине.

Как видно из фигуры 6, коронавирус ОС43 оказывает выраженный цитотоксический эффект, полностью разрушая монослой культуры клеток.

Как видно из фигуры 7, полимерная композиция оказывает протективное действие на монослой культуры клеток, предупреждая его разрушение за счет цитотоксического эффекта коронавируса.

Пример 6.

Изучена способность повиаргола (наночастиц серебра) ускорять процесс разрушения плазмидной ДНК микроорганизмов гипохлоритом натрия.

Использована плазмидная ДНК штамма EscherichiacoliDH5-Alpha, размер 5,5-6 тыс. пар нуклеотидов, используемая в эксперименте концентрация С=2,2⋅10^-5 М_а.о.

Для проведения спектрального исследования приготовлены 3 комплекса гипохлорита с плазмидной ДНК. Для каждого комплекса приготовили три разных раствора с постоянной концентрацией ДНК и различной концентрацией гипохлорита натрия;

1) C_NaOCl=1,46⋅10^-4 M;

2) C_NaOCl=3,5⋅10^-4 М;

3) C_NaOCl=8,0⋅10^-4 M.

Комплексы приготовлены прямым смешиванием. В качестве растворителя использовали водный раствор хлорида натрия NaCl ионной силы 0,015М.

На фигуре 8 представлены спектры поглощения комплексов плазмидной ДНК E.coli c гипохлоритом натрия при различных концентрациях NaOCl.

Как видно из полученных спектров, независимо от концентрации гипохлорита натрия, в течение первой минуты после смешения поглощение раствора увеличивается во всей области поглощения ДНК. При этом суммарный спектр близок к сумме спектров ДНК и гипохлорита натрия используемых концентраций.

Заметные изменения формы спектра и интенсивности поглощения при длине волны 260 нм наблюдали через 10-15 минут.

Через сутки полоса поглощения ДНК (λ_max=260 нм) практически исчезает. При концентрации C_NaClO=8,0×10^-4 М полоса поглощения гипохлорита натрия сохранялась в течение суток. Это говорит о том, что при данной концентрации антисептик взят в избытке и после взаимодействия остается в растворе.

Таким образом, установлено, что при взаимодействии с гипохлоритом натрия происходит как разрушение вторичной структуры микробной ДНК (денатурация), так и химическая модификация азотистых оснований, предположительно хлорирование. Наличие вторичной структуры замедляет химическую реакцию гипохлорита натрия с азотистыми основаниями ДНК.

Раствор повиаргола готовили из сухого порошка навеской. В качестве растворителя выступал водный раствор соли NaCl ионной силой I=0.001 М. Концентрацию приготовленного раствора уменьшали еще в два раза для достижения условия смешивания равных объемов реагентов C_Poυ=0.5%.

Вещества, используемые в работе, имеют характерный спектр поглощения в областях длин волн от 220 до 500 нм. Измерения спектров проводились на спектрофотометре Shimadzu 1800, в кварцевых кюветах с длиной оптического пути d₁=1 см и d₂=0,101 см. Вышеуказанный спектрофотометр работает в двулучевом режиме. Во всех измерениях место кюветы для фонового раствора оставалось пустым, то есть измерения проводились относительно атмосферного воздуха, поглощение которого в рассматриваемом диапазоне не превышало D_Air≤0.005. После каждого измерения кювета с раствором промывалась и использовалась для измерения растворителя, использовавшегося в предыдущем измерении. Спектр растворителя вычитался на стадии обработки данных с помощь программного пакета Origin. Растворы готовились с помощью лабораторных электронных весов (точность 0,0002 г) и дозаторов, размешивание проводилось с помощью Vortex.

Анализ производной изменения поглощения на длине волны 260 нм (ФИГ. 9) во времени позволяет определить, что первый этап реакции разрушения ДНК проходит намного быстрее. Этот факт согласуется с тем, что повиаргол (наночастицы серебра) индуцирует денатурацию микробной ДНК в присутствии гипохлорита натрия, делая азотистые основания более доступными для реакции хлорирования.

Таким образом, в присутствии повиаргола на начальной стадии взаимодействия разрушение молекулы микробной ДНК гипохлоритом натрия происходит быстрее. Продукты реакции наночастиц серебра с гипохлоритом натрия облегчают денатурацию двойной спирали микробной ДНК, что ускоряет реакцию хлорирования азотистых оснований гипохлоритом натрия.

Таким образом, предлагаемая интраназальная композиция разрушает РНК- и ДНК-содержащие вирусы и бактерии.

Пример 7.

Изучена зависимость бактерицидного действия от времени воздействия предлагаемой интраназальной композиции следующего состава, масс. %:

Гипохлорит натрия раствор (АХ 1566 мт/л) - 49,0

Гиалуроновая кислота - 2,0

ПВП - 5,0

Повиаргол - 1,0

Грамицидин С - 0,03

Гелофузин - 42,97.

Из локусов от пациентов разных отделений многопрофильного ЛПУ получены бактериальные изоляты, в отношении которых тестировали предлагаемую антимикробную композицию методом «шахматной доски».

Результаты оценки зависимости бактерицидного действия от времени воздействия представлены на фигуре 10.

Уже через 1,5 часа воздействия интраназальной композиции наблюдали полное отсутствие роста тестируемых микроорганизмов. При этом необходимо отметить, что антисептики - гипохлорит натрия, повиаргол, входящие в состав интраназальной композиции, использовали в суббактерицидных дозах, которые в сотни и тысячи раз ниже разрешенных доз отдельно взятых препаратов для клинического местного применения.

Пример 8.

Изучено бактерицидное действие предлагаемой интраназальной композиции следующего состава, мас. %:

Гмпохлорит натрия раствор (АХ 1566 мг/л) - 49,0

Гиалуроновая кислота - 1,0

ПВП - 5,0

Повиаргол - 1,0

Лизоцим - 16,0

Гелофузин - 28,0.

Известно, что лизоцим оказывает очень слабое антибактериальное действие на грамотрицательные микроорганизмы [Renata Cegielska-Radziejewska ⋅ Grzegorz Lesnierowski ⋅ Tomasz Szablewski ⋅ Jacek Kijowski. Physico-chemical properties and antibacterial activity of modiWedeggwhite-lysozyme // Eur Food Res Technol (2010) 231:959-964; DOI 10.1007/s00217-010-1347-у; Гончарова А.И., Окулич B.К., Земко В.Ю., Сенькович С.А. Антимикробная активность лизоцима как фактор неспецифической резистентности // Вестник Витебского государственного медицинского университета. -2019. - том 18, №4. - с. 40-45: DOI: https://doi.org/10.22263/2312-4156.2019.4.40].

В исследовании использовали клинический мультирезистентный (устойчив более чем к 5 группам антибиотиков, в том числе к гентамицину) Staphylococcus epidermidis 8242008, выделенный из гемокультуры пациента.

Использовали клинический штамм Klebsiella pneumoniae 5299639, выделенный из раневого отделяемого пациента челюстно-лицевого профиля. Данный изолят характеризовался устойчивостью к 8 группам антимикробных препаратов, включая карбапенемы.

Тестировали предлагаемую интраназальную композицию методом «шахматной доски» с экспозицией 1,5 часа.

Результаты оценки бактерицидного действия интраназальной композиции и антимикробных ингредиентов, входящих в ее состав, представлены на фигуре 11.

В отношении грамотрицательной K. pneumoniae наблюдали отсутствие антимикробного действия лизоцима; повиаргол снижал уровень микробной контаминации на 1 lg уже через 1,5 часа воздействия; при действии интраназальной композиции наблюдали снижение числа K. pneumoniae на 2 lg.

В отношении грамположительного S. epidermidis наблюдали снижение контаминации в присутствии лизоцима на 1 lg через 1,5 часа воздействия; повиаргол снижал уровень микробной контаминации стафилококка на 2 lg; при действии интраназальной композиции наблюдали снижение числа S. epidermidis на 3 lg.

Таким образом, показано усиление бактерицидного действия лизоцима в присутствии повиаргола в отношении патогенных микроорганизмов.

Пример 9.

Оценка пролонгированного действия интраназальной композиции следующего состава, масс. %:

Гипохлорит натрия раствор (АХ 1566 мг/л) - 49,0

Гиалуроновая кислота - 1,0

ПВП - 5,0

Повиаргол - 1,0

Грамицидин С - 0,03

Гелофузин - 43,97.

Исследования проведены на 10 волонтерах, мужчинах и женщинах в возрасте от 18 до 83 лет. Предварительно в состав композиции вводили измельченный активированный уголь для улучшения визуализации. Всем испытуемым наносили предлагаемую интраназальную композицию однократно в оба носовых хода, затем испытуемые сжимали пальцами крылья носа для равномерного распределения композиции по поверхности слизистой. В условиях передней риноскопии с использованием аппаратного метода (прибор STORZ Karl Storz Endoscope tele pack XLEDTP100) оценивали распределение интраназальной композиции по слизистой полости носа через 8 часов после нанесения.

У всех волонтеров на все сроки наблюдали сплошное равномерное распределение интраназальной композиции по слизистой передних отделов полости носа, что свидетельствовало о нахождении предлагаемой интраназальной композиции в течение 8 часов наблюдения (ФИГ. 12).

При проведении аналогичного испытания при использовании интраназальной композиции на основе прототипа на слизистой оболочке носовой полости через 8 часов нанесения визуализация отсутствовала (ФИГ. 13).

Пример 10.

Сравнительные испытания интраназальной композиции (гидрогель) и прототипа.

При оценке вирулицидной активности по представленной выше методике выявлено, что при совместной инкубации коронавируса ОС43 с мазью-прототипом в течение 3 минут снижение титра вируса составило 1,3 lg TCID50 (титр вируса в контроле 5,3 lg).

Для сравнения представленный выше пример 1 показал снижение титра коронавируса ОС43 при совместной инкубации с интраназальной композицией в течение 3 минут, которое составило 3 lg (титр вируса в контроле 6,5 lg). В примере 2 снижение титра вируса ОС43 при инкубации с интраназальной композицией с лизоцимом составило 1,5 lg (когда титр вируса в контроле 4,7 lg).

Следовательно, предложенный гидрогель обладает более высокой эффективностью по сравнению с прототипом.

Пример 11.

Сравнительная оценка бактерицидной активности интраназальной композиции (гидрогель) и прототипа в зависимости от времени совместной инкубации (по методике Примера 7, метод Time-kill assay - оценка зависимости «время - летальное действие») и дозы тест-культур микроорганизмов в дозе 10⁵ КОЕ/мл (Staphylococcus aureus (ФИГ. 14 (А-В)), Pseudomonas aeruginosa (ФИГ. 15 (А-В)), Acinetobacter baumannii (ФИГ. 16 (А-В)), Klebsiella pneumoniae (ФИГ. 17 (А-В)) при экспозиции 1 час.

Получены следующие результаты.

Препарат из прототипа не оказывал бактерицидного действия в отношении тест-культур микроорганизмов. На чашках Петри отмечен рост микробов (ФИГ. 14 (В), ФИГ. 15 (В), ФИГ. 16 (В), ФИГ. 17 (В)).

При этом интраназальная композиция по примеру 7 приводит к снижению микробной популяции на 4-5 lg в отношении всех грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Таким образом, заявленная композиция более эффективна, чем препарат из прототипа как по вирулицидной, так и по бактерицидной активности.

Настоящее изобретение относится к интраназальной композиции для профилактики и/или лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости, вызванных вирусом гриппа А или коронавирусом человека OC43 или бактериями S. epidermidis, S. aureus, A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli или P. aeruginosa, содержащей высокомолекулярную гиалуроновую кислоту, высокомолекулярный поливинилпирролидон (высокомолекулярный ПВП), повиаргол, антибактериальный полипептид, который представляет собой грамидин С или лизоцим, раствор гипохлорита натрия, гелофузин, при следующем соотношении компонентов, мас.%: гиалуроновая кислота высокомолекулярная – 0,1-2,0; высокомолекулярный ПВП – 4,0-6,0; повиаргол – 0,8-1,2; антибактериальный полипептид грамицидин С - 0,03-0,15 или лизоцим – 0,1-18,0; раствор гипохлорита натрия – 49,0-51,0; гелофузин до 100,0, также относится к применению интраназальной композиции для профилактики и/или лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости, вызванных вирусом гриппа А или коронавирусом человека OC43 или бактериями S. epideridis, S. aureus, A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli или P. aeruginosa коронавирусами, вирусом гриппа, другими РНК- и ДНК-содержащими вирусами и бактериями, сопровождающихся формированием микробных биопленок, где аппликацию композиции на слизистую полости носа проводят один раз в сутки. Настоящее изобретение обеспечивает создание более эффективной по сравнению с прототипом композиции широкого спектра действия для профилактики и/или комплексного лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости при интраназальном применении, обладающей пролонгированной широкой антимикробной активностью, в частности, в отношении коронавируса человека, вируса гриппа, других РНК- и ДНК-содержащих вирусов и бактерий, обладающей способностью препятствовать формированию и разрушать уже сформированные микробные биопленки. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 25 ил., 4 табл., 11 пр.

1. Интраназальная композиция для профилактики и/или лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости, вызванных вирусом гриппа А или коронавирусом человека OC43 или бактериями S. epidermidis, S. aureus, A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli или P. aeruginosa, содержащая высокомолекулярную гиалуроновую кислоту, высокомолекулярный поливинилпирролидон (высокомолекулярный ПВП), повиаргол, антибактериальный полипептид, который представляет собой грамидин С или лизоцим, раствор гипохлорита натрия, гелофузин, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Гиалуроновая кислота высокомолекулярная – 0,1-2,0;

Высокомолекулярный ПВП – 4,0-6,0;

Повиаргол – 0,8-1,2;

Антибактериальный полипептид грамицидин С 0,03-0,15 или лизоцим – 0,1-18,0;

Раствор гипохлорита натрия – 49,0-51,0;

Гелофузин до 100,0.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что количество гиалуроновой кислоты высокомолекулярной составляет 0,5-2 мас.%.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что количество гиалуроновой кислоты высокомолекулярной составляет 1-2 мас.%.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что количество высокомолекулярного ПВП составляет 4,5-5,5 мас.%.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что количество повиаргола составляет 0,8-1 мас.%.

6. Применение интраназальной композиции по п.1 для профилактики и/или лечения инфекционно-воспалительных заболеваний носовой полости, вызванных вирусом гриппа А или коронавирусом человека OC43 или бактериями S. epideridis, S. aureus, A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli или P. aeruginosa коронавирусами, вирусом гриппа, другими РНК- и ДНК-содержащими вирусами и бактериями, сопровождающихся формированием микробных биопленок, где аппликацию композиции на слизистую полости носа проводят один раз в сутки.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что композицию применяют самостоятельно или в составе комплексной терапии.