Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора. Российский патент 2024 года по МПК A61K39/00 C12Q1/68 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к иммунологии и онкологии. Разработанное иммунобиологическое средство может применяться в терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии. Предложенное изобретение расширяет арсенал средств и способов для индукции иммунного ответа у пациентов с онкологическими заболеваниями.

Уровень техники

Онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности во всем мире. По данным ВОЗ в 2022 г. в мире было зарегистрировано 20 млн новых случаев рака и 9,7 млн случаев смерти от онкологических заболеваний. Число людей, которые оставались в живых через 5 лет с момента постановки диагноза, в 2022 г составляло 53,5 млн человек. Согласно этим данным, приблизительно у каждого пятого человека в течение жизни может развиться какое-либо онкологическое заболевание; примерно 1 из 9 мужчин и 1 из 12 женщин погибнут от данного заболевания ["Глобальное Бремя Онкологических Заболеваний Растет Параллельно с Ростом Потребности в Услугах." World Health Organization, World Health Organization, www.who.int/ru/news/item/01-02-2024-global-cancer-burden-growing~amidst-mounting-need-for-services. Дата обращения: 18 июня 2024 года].

Согласно прогнозу Международного агентства по изучению рака (МАИР) к 2050 году число случаев онкологических заболеваний в мире может увеличиться примерно на 77%. [Cancer rates set to rise 77 per cent by 2050 https://news.un.org/en/story/2024/02/1146127. Дата обращения: 18 июня 2024 года]. Быстрый рост глобального бремени онкологических заболеваний является следствием как старения населения и демографического роста, так и изменения в подверженности людей воздействию факторов риска.

Развитие рака включает прогрессирующую трансформацию нормальных клеток в злокачественные, которая является результатом происходящих в клетках генетических и эпигенетических изменений. Первоначально возникающие опухолевые клетки могут быть устранены клетками-эффекторами иммунной системы. Однако этот процесс приводит к иммунной селекции (иммуноредактированию опухоли), которая способствует отбору клонов опухолевых клеток с меньшей иммуногенностью, обладающих способностью блокировать активность иммунокомпетентных клеток. В итоге во время опухолевой прогрессии, когда опухоль достигает размеров, обнаруживаемых клиническими методами, растворимые факторы, секретируемые клетками опухоли, могут создавать в опухолевом микроокружении благоприятные условия для ускользания от воздействия иммунной системы.

Известно, что опухолевые клетки способны подавлять направленный иммунный ответ, используя различные механизмы защиты. Некоторые из них связаны с активацией системы ингибиторных механизмов (контрольных точек иммунного ответа), которые передают ингибирующий сигнал цитотоксическому Т-лимфоциту, тем самым подавляя иммунологическую реактивность в начальной фазе иммунного ответа - индуктивной. В результате происходит блокирование активации Т-лимфоцитов, что приводит к преобладанию Т регуляторных клеток в опухолевом микроокружении и развитию иммунной толерантности и анергии [Шубникова Е.В., Букатина Т.М., Вельц Н.Ю., Каперко Д.А., Кутехова Г.В. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа: новые риски нового класса противоопухолевых средств // Безопасность и риск фармакотерапии, 2020, №1, стр. 9-20].

Открытие контрольных точек иммунного ответа произвело революцию в онкоиммунологии. В настоящее время разработан целый класс препаратов, которые представляют собой гуманизированные моноклональные антитела ингибирующие контрольные точки иммунного ответа. Данный класс препаратов значительно улучшил выживаемость пациентов и стал существенным прорывом в противоопухолевой терапии. В настоящее время в России зарегистрировано 4 препарата класса блокаторов иммунных контрольных точек: ипилимумаб, ниволумаб, пембролизумаб и атезолизумаб. Кроме того, это направление активно развивается и проводится поиск новых мишеней. Однако, данный класс препаратов не может решить ряд проблем, связанных с низкой иммуногенностью и недостаточной презентацией опухолевых антигенов. В результате чего часть опухолевых клеток способна ускользать от иммунного ответа.

Другим направлением развития онкоиммунологии является разработка терапевтических вакцин. Существует несколько классов данных препаратов, которые используют разные антигены и различные механизмы образования клеточно-опосредованного иммунного ответа:

1) Вакцины на основе дендритных клеток (ДК). Дендритные клетки (ДК) выполняют роль антигенпрезентирующих клеток в иммунной системе человека. В этом типе вакцин ДК усиливают презентацию опухолевых антигенов лимфоцитам. После активации наивных лимфоцитов они становятся способными уничтожать опухолевые клетки, представляющие эти антигены [Боженко В.К. Противоопухолевые вакцины. Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России 2022 год №1 т. 22]. Противораковые вакцины данного типа обычно включают ДК, выделенные у пациентов или полученные ex vivo, путем культивирования гемопоэтических клеток-предшественников или моноцитов пациента. ДК дополнительно загружают опухолевыми антигенами и иногда объединяют с иммуностимулирующими агентами, такими как GM-CSF. Хотя собранные данные свидетельствуют о том, что ДК-вакцины хорошо переносятся и имеют хороший профиль безопасности, четкие терапевтические результаты достигаются менее чем у 15% пациентов Calmeiro J, Carrascal MA, Tavares AR, Ferreira DA, Gomes C, Falcao A, Cruz MT, Neves BM. Dendritic Cell Vaccines for Cancer Immunotherapy: The Role of Human Conventional Type 1 Dendritic Cells. Pharmaceutics. 2020 Feb 15;12(2):158. doi: 10.3390/pharmaceuticsl2020158. PMID: 32075343; PMCID: PMC7076373.

2) Другой класс противораковых вакцин основан на модифицированных (например, облученных сублетальными дозами) опухолевых клетках, используемых в качестве антигенов, также в комбинации с иммуностимулирующими агентами. Вакцины данного типа в настоящее время, находящиеся на клинических испытаниях, основаны как на аутологичных (например, OncoVAX, LipoNova), так и на аллогенных (например, Canvaxin, Onyvax-P, GVAX) опухолевых клеточных линиях. Использование этих методов вакцинации позволяет получить воспроизводимый, безопасный вакцинный продукт, в котором инъецированные опухолевые клетки не могут размножаться. Облученные опухолевые клетки естественным образом экспрессируют многочисленные специфические антигены, таким образом, способствуя инициации противоопухолевого иммунного ответа. Также было показано, что иммунное распознавание опухолевых клеток С08+Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками усиливается после облучения. Кроме того, цельноклеточные вакцины могут быть модифицированы для повышения иммуногенности путем трансфекции иммуностимулирующих молекул. Например, платформа вакцины GVAX включает использование облученных аллогенных линий опухолевых клеток, модифицированных для секреции GM-CSF для усиления иммуногенности вакцины. Несмотря на все преимущества, данный тип вакцин имеет ряд недостатков. Так, например, при облучении клеток фосфатидилсерин, иммуносупрессивный фосфолипид, обычно находящийся на внутреннем листочке плазматической мембраны, транслоцируется с внутренней стороны плазматической мембраны на ее внешнюю сторону, что в свою очередь приводит секреции иммуносупрессивных факторов дендритными клетками и ингибирует их созревание, способствуя иммуносупрессивному окружению опухоли. Более того, облученные клетки могут сохранять способность секретировать иммуносупрессивные факторы подобно исходным опухолевым клеткам. Таким образом, вызванное облучением подавление иммунитета частично сводит на нет иммуногенный эффект облученных целых клеток [Srivatsan S, Patel JM, Bozeman EN, Imasuen IE, He S, Daniels D, Selvaraj P. Allogeneic tumor cell vaccines: the promise and limitations in clinical trials. Hum Vaccin knmunother. 2014;10(l):52-63. doi: 10.4161/hv.26568. Epub 2013 Sep 24. PMID: 24064957; PMCID: РМС4181031].

3) Следующий класс терапевтических противоопухолевых вакцин основан на пептидных фрагментах антигенов, селективно экспрессированных опухолевыми клетками. Пептиды вводят самостоятельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами, которые могут включать адъюванты и цитокины, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колонне стимулирующий фактор (GM-CSF). Пептиды, загруженные в МНС класса I, распознаются специфическим TCR CD8+ Т-клеток, которые активируются для проявления своей цитотоксической активности против опухолевых клеток, представляющих тот же комплекс пептид-MHC-I. Этот процесс определяется как активная иммунотерапия, поскольку иммунная система хозяина либо активируется de novo, либо рестимулируется для запуска эффективной специфичной к опухоли иммунной реакции, которая в конечном итоге может привести к регрессии опухоли. Однако, хотя доклинические данные часто показывали обнадеживающие результаты, клинические испытания терапевтических противораковых вакцин, в том числе вакцин на основе пептидов, на сегодняшний день не дали удовлетворительных данных. Ограниченная эффективность противораковых вакцин на основе пептидов является следствием нескольких факторов, включая идентификацию специфических опухолевых антигенов-мишеней, ограниченную иммуногенность пептидов и высокоиммуносупрессивное микроокружение опухоли.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых средств для терапии онкологических заболеваний.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств для терапии онкологических заболеваний.

Технический результат заключается в разработке средства, позволяющего обеспечить эффективную индукцию иммунного ответа против опухолевых клеток.

Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК, в котором мРНК содержит последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 8 на 5' конце; открытую рамку считывания, кодирующую от 1 до 80 опухолевых генных сигнатур; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

Кроме того, технический результат заключается в том, что разработан способ получения иммунобиологического средства, содержащий стадии: а) выявление отличий в генных сигнатурах опухолевых и нормальных клеток, включающее приоритизацию по уровню экспрессии мутантного гена, уникальности, агретопности; б) синтез набора ДНК-матриц, каждая из которых содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1 до 80 обнаруженных генных сигнатур, последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 8 на 5' конце и последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3' конце; в) синтез набора мРНК на основе полученного набора ДНК-матриц; г) инкапсуляцию мРНК в липидные наночастицы.

Также технический результат заключается в том, что разработано применение созданного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в состав мРНК вектора.

Существует вариант применения, в котором иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в мРНК, осуществляют путем ввода одного иммунобиологического средства, кодирующее опухолевые генные сигнатуры.

Также существует вариант применения, в котором иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в мРНК, осуществляют путем одновременного ввода двух и более иммунобиологических средств, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры.

Осуществление изобретения

Краткое описание чертежей.

На Фиг. 1 представлены результаты измерения биолюминесценции in vivo на приборе IVIS Imaging System (Perkin elmer, США).

На фотографии номерами обозначены животные, которым вводили следующие варианты мРНК:

1. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

2. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

3. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

4. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

5. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

6. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

7. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

8. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

9. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

10. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

11. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

12. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

А обозначено место флуоресценции в диапазоне от 0,5*10⁸ до 1*10⁸ p/sec/cm²/sr.

В обозначено место флуоресценции в диапазоне от 0,5*10⁸ до 1,5*10⁸ p/sec/cm²/sr/.

На Фиг. 2 представлены результаты измерения объема опухоли у животных, которым вводили фосфатный-буферный раствор и исследуемые препараты мРНК. На оси ординат представлен объем опухоли, мм³. На оси абсцисс представлены различные группы животных, где

1. Контрольные мыши, которым вводили фосфатно-солевой буферный раствор

2. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9;

3. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 10;

4. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 11;

5. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 12;

6. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 13;

7. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 14;

8. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 15;

9. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 16;

10. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 17;

11. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 18;

12. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 10 обнаруженных генных сигнатур SEQ ID NO: 19;

13. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 3 обнаруженных генных сигнатуры SEQ ID NO: 20.

На Фиг. 3 представлены результаты измерения объема опухоли у животных, которым вводили фосфатный-буферный раствор и исследуемые препараты мРНК. На оси ординат представлен объем опухоли, мм³. На оси абсцисс представлены различные группы животных, где

1. Фосфатно-солевой буфер

2. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9;

3. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 10;

4. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 10 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 11;

На Фиг. 4 представлены результаты определения клеточного состава микроокружения опухоли, где

А - оценка процентного содержания макрофагов,

Б - Т-лимфоцитов.

1 - интактные мыши (не вводился препарат),

2 - исследуемый препарат.

* - р<0.05, критерий Манна-Уитни.

Реагируя на стресс, опухолевые клетки адаптируются, подхватывая мутации и изменяя уровень редких белков необходимых, например, для выживания клеток. Это может привести к изменениям в молекулярных сигнатурах антигенов, присутствующих в опухолевых клетках, которые способна распознавать иммунная система. Отслеживание этих изменений может выявить новые мишени, на которые могут быть нацелены терапевтические средства. Однако каждый злокачественный процесс имеет свои уникальные характеристики. Поэтому генетические сигнатуры опухолевых клеток у разных пациентов могут сильно отличаться, даже при условии одинаковой локализации опухолевого процесса.

Разработанный способ получения иммунобиологического средства предполагает секвенирование ДНК, выделенной из опухолевых клеток пациента, по результатам которого составляется мутаном - совокупность мутаций соматического рака в отдельной опухоли. При этом с помощью оригинального алгоритма определяются генные сигнатуры присущие опухолевым клеткам конкретного пациента (т.е. специфические изменения в экспрессии генов, характерные для опухолевых клеток данного пациента). Конечной целью определения генных сигнатур является поиск высокоиммунногенных антигенов, строго специфичных для опухолевых клеток. Далее происходит создание набора ДНК-матриц, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженные генные сигнатуры. При этом существует вариант, когда в одной ДНК-матрице содержится открытая рамка считывания, которая кодирует одну обнаруженную генную сигнатуру. В другом варианте одна ДНК-матрица содержит открытую рамку считывания, кодирующую от 2 до 80 обнаруженных генных сигнатур. Максимальное количество генных сигнатур в одной ДНК матрице (80 шт) определяется максимальной емкостью генетической конструкции. Также это количество зависит от того, сколько специфических генных сигнатур было обнаружено в опухоли у конкретного пациента.

Кроме открытой рамки считывания, ДНК-матрица содержит все конструктивные элементы для транскрипции функциональной мРНК, а также элементы, необходимые для наращивания плазмиды в культуре бактериальных клеток.

Было разработано несколько вариантов ДНК-матриц, кодирующих:

1) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

2) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

3) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

4) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

5) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

6) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

7) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

8) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

9) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

10) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

11) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

12) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

Во всех представленных последовательностях мРНК уридин был заменен на псевдоуридин.

В примере 5 продемонстрировано, что все перечисленные конструкции мРНК способны обеспечивать трансляцию мРНК и синтез целевого белка. Для этого был созданы перечисленные выше мРНК, содержащие различные конструктивные элементы на 5' (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 8) и 3' концах (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу. Таким образом, после введения данных мРНК в мышей, можно было оценить синтез люциферазы по реакции с люциферином, которая сопровождается люминесценцией. Кроме того, авторы получали различные варианты данных конструкций с открытой рамкой считывания, кодирующей опухолевые генные сигнатуры, которые обладали высокой противоопухолевой активностью.

мРНК, полученные в результате транскрипции in vitro с использованием разработанных ДНК-матриц, в дальнейшем упаковывали в липидные наночастицы и вводили в организм млекопитающих.

Было показано, что трансляция мРНК, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую генные сигнатуры, специфичные для опухолевых клеток способствует распознаванию иммунной системой опухолевых антигенов. В результате иммунная система эффективно находит и уничтожает опухолевые клетки. Было показано, что данный эффект коррелирует с изменениями в микроокружении опухоли.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Выявление отличий в генных сигнатурах опухолевых и нормальных

клеток.

Поиск генетических сигнатур опухолевых и нормальных клеток осуществляется на основе получения генетических данных, характеризующих полный геном и/или экзом (для нормальных и опухолевых клеток) и транскриптом (для опухолевых клеток). Экстракция нуклеиновых кислот из образцов и проведение секвенирования выполняются с использованием доступных коммерческих наборов в соответствии с инструкциями производителя. Полученные данные анализируются с помощью оригинального программного обеспечения, которое позволяет провести контроль качества геномных данных, фильтрацию и удаление низкокачественных данных секвенирования, картирование на референсную последовательность, определение зародышевых и соматических мутаций, поиска специфических антигенов, включая биоинформатическое предсказание связывания пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые могут быть представлены на поверхности клеток и распознаны Т-клетками, а также оценку иммуногенности и ряда других показателей. В зависимости от генетического ландшафта опухоли количество отобранных генных сигнатур может варьироваться от нескольких единиц до двух сотен, которые могут быть представлены в генетической конструкции в моноварианте (одна конструкция - одна генная сигнатура), так и объединены в конкатемер (несколько выявленных генных сигнатур расположены последовательно друг за другом). Для демонстрации работоспособности подхода была использована модель мышиной меланомы. Однако приведенный пример использования биоинформатического алгоритма для выбора генных сигнатур, характерных для опухолевых клеток, является универсальным и может быть использован для разных видов опухолей и разных видов млекопитающих, в том числе для людей.

В эксперименте использовались мыши C57BL/6 (самки, возраст 6-8 недель, средний вес 20 г). Все исследования на животных проводились в соответствии с этическими нормами. Сингенные клетки мышиной меланомы B16-F10 были получены из коллекции ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США) в инкубаторе с содержанием 5% СО₂ при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Далее к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут.Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×10⁶ кл/мл. Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57b/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×10⁵ клеток на мышь).

Через 12 дней отбирали образцы опухолевой и здоровой ткани. Далее проводили полногеномное, экзомное и транскриптомное секвенирования на приборе MGI G400 (MGI, Китай). Полученные данные анализировали с помощью оригинального программного обеспечения, которое позволило выявить около 500 мутаций, характерных для данной опухоли. На основании полученного мутанома был сформирован список специфических антигенов, который в дальнейшем был отфильтрован и приоритизирован по ряду критериев: уровень экспрессии мутантного гена, уникальность (для минимизации риска аутоиммунных реакций), агретопность.

Таким образом, в результате проведенной работы было выявлено 10 генных сигнатур, характерных для данного типа опухоли: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18. Полученные последовательности далее были использованы для получения ДНК-матриц.

Пример 2. Создание ДНК-матрицы для получения мРНК.

Целью данного этапа работы являлось создание ДНК-матрицы для получения мРНК. ДНК матрица представляет собой кольцевую плазмидную ДНК, содержащую открытую рамку считывания, кодирующую выявленные генные сигнатуры. В ходе работы были разработаны варианты ДНК-матриц содержащие как отдельные генные сигнатуры опухолевых клеток, так содержащие несколько генных сигнатур в одной рамке считывания.

Кроме, открытой рамки считывания, ДНК-матрица содержит все структурные компоненты необходимые для эффективной наработки мРНК in vitro, а также элементы необходимые для репликации ДНК в E.coli и ген устойчивости к ампициллину.

После транскрипции с разработанной ДНК матрицы образуется мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

Последовательности кодирующие выявленные генные сигнатуры (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18) были синтезированы из олигонуклеотидных праймеров и фланкированы зонами гомологии с плазмидным вектором, необходимым для сборки ДНК-матрицы. Далее, линеаризованный по сайту Hindlll плазмидный вектор и ПЦР-продукт (содержащий генные сигнатуры) были объединены методом сборки по Гибсону с использованием коммерческого набора Gibson Assembly® Ultra kit (Codex, USA). Все молекулярно-биологические работы (клонирования), проводились с помощью Е. coli Тор 10 электрокомпетентных клеток. Подбор олигонуклеотидных праймеров проводился с помощью программы SnapGene V6.1.2.

Амплификация нуклеиновых кислот проводилась на приборах MiniAmp (Thermofisher) и Т100 (Biorad). Высокоспецифичная амплификация фрагментов ДНК проводилась с помощью набора 2Х Platinum SuperFi Green MasterMix. Условия амплификации согласно рекомендации производителя. Очистка ПЦР-продуктов для клонирования из агарозного геля проводилась набором QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя.

Кроме того, были получены: последовательность, кодирующая несколько генных сигнатур в одной рамке считывания (SEQ ID NO: 19), а также последовательность, кодирующая три генных сигнатуры в одной рамке считывания, соединенные через линкер (SEQ ID NO: 20). Данные последовательности были синтезированы ЗАО «Евроген» и помещены в ДНК-матрицу с помощью методов генной инженерии, аналогично описанному выше.

Наращивание клеток Е. Coli, трансформированных ДНК-матрицей, проводилось в жидкой среде 2xYT (1,6% Триптон, 1% Дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl) или на твердой среде 2xYT+2% агар, с антибиотиком. Плазмидная ДНК выделялась из ночной культуры Е. coli объемом 4 мл с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) или QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) по стандартному протоколу, предложенному производителем. После выделения плазмидной ДНК измеряли ее концентрацию на флуориметре Qubit®4.0 (Invitrogene, США) с использованием реагентов из коммерческого набора Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) по стандартному протоколу, предложенному производителем. Правильность сборки финальных плазмид подтверждалась секвенированием по Сэнгеру на аппарате Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), используя коммерческий набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, согласно рекомендациям производителя.

Кроме того, был получен ряд ДНК-матриц, которые содержат открытую рамку считывания с последовательностью люциферазы и кодируют различные варианты конструктивных элементов мРНК, в частности:

13) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

14) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

15) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

16) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

17) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

18) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 6 после открытой рамки считывания.

19) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

20) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

21) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

22) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

23) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

24) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания.

Таким образом, в результате проведенной работы был получен ряд ДНК матриц, кодирующих мРНК с последовательностью SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 16, или SEQ ID NO: 17, или SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20).

Кроме того, были получены ДНК-матрицы, кодирующие мРНК с различными конструктивными элементами на 5' (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 8) и 3' концах (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.

Пример 3. Синтез мРНК на основе полученных ДНК-матриц, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженные генные сигнатуры.

Для синтеза мРНК проводили реакцию транскрипции in vitro с использованием ДНК-матриц, полученных в предыдущем примере.

Для проведения реакции in vitro транскрипции необходимы следующие компоненты:

- смесь нуклеотидов (Аденозин - 5'- трифосфат (АТР), Гуанозин - 5' - трифосфат (GTP), Цитидин - 5' - трифосфат (СТР) и H1-метилпсевдоуридин-5'-трифосфат (N1-Me-PseudoUTP)) (Биолабмикс);

- аналог структуры кэпа1 m7GmAmG (Биолабмикс);

- ингибитор РНКаз (Биолабмикс);

- пирофосфатаза;

- Т7-РНК-полимераза (Биолабмикс);

- Т7-буфер для IVT;

- добавочный буфер.

В таблице 1 представлен состав реакционной смеси, рассчитанный на 100 мкл реакции с количеством ДНК-матрицы от 2 до 5 мкг. При необходимости объем реакции можно уменьшать до 25 мкл кратно снижая количества компонентов. Перед началом IVT все компоненты размораживаются на льду, перемешиваются на вортексе. Далее составляется реакция, компоненты добавляются в представленном порядке.

Реакционную смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 120 минут, после чего к ней добавляют 1 мкл ДНКазы+12 мкл буфера для ДНКазы (10х) («Синтол») и смесь инкубируют еще 30 минут.

Таким образом, в результате проведенной работы был получен набор мРНК с последовательностью SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 16, или SEQ ID NO: 17, или SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20).

Кроме того, были получен набор мРНК с различными конструктивными элементами на 5' (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 8) и 3' концах (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.

Пример 4. Получение липидных наночастиц, содержащих синтезированные мРНК.

мРНК, синтез которых описан в примере 3 инкапсулировали в липидные наночастицы (ЛНЧ) с использованием процесса микрофлюидного смешивания быстрого раствора мРНК (рН 3,0) с раствором липидов, растворенных в спирте. Для этого липиды растворяли в 96% этаноле при молярных соотношениях 46,3:9:42,7:1,6 (ионизируемый липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин: пегилированный липид (ПЭГ-липид)). Ионизируемый липид Acuitas (ALC-0315) и ПЭГ-липид (1,2-димиристоил-зп-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль 2000) были приобретены в Cayman Chemical Company. Раствор мРНК с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10х цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (рН 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°С до использования.

Таким образом, в результате проведенной работы был получен набор липидных частиц, содержащих мРНК с последовательностью SEQ ID NO: 2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID NO: 7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 16, или SEQ ID NO: 17, или SEQ ID NO: 18, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20).

Кроме того, были получен набор липидных частиц, содержащих мРНК с различными конструктивными элементами на 5' (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 8) и 3' концах (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7), с открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.

Полученные липидные частицы использовались для доставки мРНК в клетки млекопитающих.

Пример 5. Оценка экспрессии целевого антигена после введения различных конструкций мРНК, кодирующих люциферазу.

В данном эксперименте были использованы мыши линии BALB/c весом около 18 г. Животные были разделены на несколько экспериментальных групп, которым вводили:

1) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 6 на 3' конце.

2) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 6 на 3' конце.

3) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 6 на 3' конце.

4) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 6 на 3' конце.

5) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 6 на 3' конце.

6) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 6 на 3' конце.

7) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 1 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

8) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 2 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

9) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 3 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

10) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 4 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

11) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 5 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

12) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO: 8 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO: 7 на 3' конце

Через 3 часа после введения экспериментальных средств мышам внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора D-люциферина в PBS (25 мг/мл). Через 5 минут после инъекции животных анестезировали 1-2% изофлураном и помещали в систему визуализации IVIS Lumina III (Perkin Elmer). Фотографии мышей были обработаны с помощью программного обеспечения Living Image (Perkin Elmer).

Полученные данные показаны на Фиг. 1. Как видно из результатов эксперимента после введения все исследуемых конструкций мРНК наблюдалась экспрессия люциферазы в месте введения и печени животных.

Пример 6. Способ применения разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в состав мРНК вектора.

В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии С57Ы/6. Клетки культивировали в 75 см культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO₂ при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×10⁶ клеток в миллилитре.

Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57b1/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×10⁵ клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.

Животные были разделены на несколько групп, в зависимости от типа препарата, который им вводили:

1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9;

2) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 10;

3) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 11;

4) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 12;

5) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 13;

6) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 14;

7) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 15;

8) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 16;

9) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 17;

10) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 18;

11) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 10 обнаруженных генных сигнатур SEQ ID NO: 19;

12) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 3 обнаруженных генных сигнатуры SEQ ID NO: 20.

13) Фосфатно-солевой буфер

Исследуемый препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.

На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг. 2. Как видно из результатов эксперимента, введение мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры опухолевых клеток, приводит к ограничению роста опухолевых клеток. Таким образом формируется система иммунного надзора за опухолевыми клетками организме млекопитающих, которая позволяет эффективно обнаруживать и элиминировать опухолевые клетки.

Пример 7. Способ применения разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, в котором одновременно вводят более 2 иммунобиологических средств, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры.

В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии C57b1/6. Клетки культивировали в 75 см культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% СО₂ при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×10^б клеток в миллилитре.

Перед введением опухолевых клеток мышей линии С57Ы/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×10⁵ клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.

Животные были разделены на несколько групп, которым вводили:

1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9;

2) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 10;

3) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 10 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 11;

4) Фосфатно-солевой буфер

Исследуемый препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК (общее количество пропорционально делили количество мРНК векторов) на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.

На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг. 3. Как видно из результатов эксперимента, введение нескольких вариантов мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры опухолевых клеток, приводит к ограничению роста опухолевых клеток. Таким образом, формируется система иммунного надзора за опухолевыми клетками организме млекопитающих, которая позволяет эффективно обнаруживать и элиминировать опухолевые клетки.

Пример 8. Изменение микроокружения опухоли.

В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии C57b1/6. Клетки культивировали в 75 см культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO₂ при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×10^б клеток в миллилитре.

Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57b1/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×10⁵ клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.

Животные были разделены на 2 группы, которым каждые 4 дня вводили:

1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующая 21 обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO: 19.

2) Фосфатно-солевой буфер

Препараты начинали вводить препарат с 1 дня исследования.

Контрольные мыши (интактные животные) и мыши, которым был введен исследуемый препарат, подвергались эвтаназии углекислым газом. Опухоль отделяли от окружающей ткани ножницами, а затем размельчали и протирали через нейлоновое ситечко с размером пор 100 мкм в 10 мл фосфатно-солевого буфера с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Суспензию клеток осаждали при 450g 10 минут, осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Далее из суспензии отбирали 1 млн клеток, осаждали при 450g 10 минут. К осадку добавляли Fc-блок, инкубировали 30 минут на +4°С. Далее к суспензии клеток добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера, осаждали при 450g 10 минут. К осадку добавляли смесь антител, разведенных в буфере для окрашивания (Stain buffer, BD). В исследование использовались антител к следующим маркерам клеток: CD45 - маркер всех лейкоцитов, CD3 маркер Т-лимфоцитов, F4/80 маркер макрофагов. Далее к суспензии клеток добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера, осаждали при 450g 10 минут. Осадок ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера с DAPI анализировали методом проточной цитометрии. DAPI использовали для оценки выживаемости клеток, так как данный краситель попадает только в клетки с поврежденной мембранной.

Полученные данные представлены на Фиг. 4 Как видно из результатов эксперимента, после введения мРНК, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженную генную сигнатуру, меняется микроокружение опухоли. В частности, уменьшается количество макрофагов F4/80+, которые играют важную роль в васкуляризации опухоли, а также увеличивается количество CD3+ Т лимфоцитов, что, согласно литературным данным, является прогностическим маркером успешной терапии.

Таким образом, полученные данные показывают, что разработанное иммунобиологическое средство индуцирует иммунные реакции, изменяющие микроокружение опухоли, и инициирует обнаружение иммунной системой опухолевых клеток, а также их элиминацию.

Промышленная применимость. Разработанное иммунобиологическое средство может использоваться для терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии.

Группа изобретений относится к иммунологии и онкологии. Разработано иммунобиологическое средство на основе мРНК, в котором мРНК содержит последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую от 1 до 80 опухолевых генных сигнатур; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3’ конце. Также предложены способ получения средства и его применение. Предложенная группа изобретений расширяет арсенал средств и способов для индукции иммунного ответа у пациентов с онкологическими заболеваниями и может применяться в терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 8 пр.

1. Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК, в котором мРНК содержит последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 8, на 5' конце; открытую рамку считывания, кодирующую от 1 до 80 опухолевых генных сигнатур; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3' конце.

2. Способ получения иммунобиологического средства по п. 1, содержащий стадии:

а) выявление отличий в генных сигнатурах опухолевых и нормальных клеток, включающее приоритизацию по уровню экспрессии мутантного гена, уникальности, агретопности;

б) синтез набора ДНК-матриц, каждая из которых содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1 до 80 обнаруженных генных сигнатур, последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 8, на 5' конце и последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3' конце;

в) синтез набора мРНК на основе полученного набора ДНК-матриц;

г) инкапсуляцию мРНК в липидные наночастицы.

3. Применение иммунобиологического средства по п. 1 для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в мРНК.

4. Применение по п. 3, в котором индукцию иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в мРНК, осуществляют путем ввода одного иммунобиологического средства по п. 1, кодирующего опухолевые генные сигнатуры.

5. Применение по п. 3, в котором индукцию иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в мРНК, осуществляют путем одновременного ввода двух и более иммунобиологических средств по п. 1, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры.