Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться в качестве двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной вакцины для профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа А H1N1, вирусом гриппа А H3N2, вирусом гриппа B/ Victori, вирусом гриппа B/Yamagata (в зависимости от валентности вакцины).
Уровень техники
Грипп - острое инфекционное заболевание, вызываемое различными серотипами вируса гриппа, которые поражают преимущественно верхние дыхательные пути, вызывая воспаление и раздражение в трахее, гортани, бронхах, поэтому характерным клиническим симптомом является сухой надсадный кашель. Другими симптомами заболевания являются высокая температура, ломота в теле, головная боль, сильная интоксикация, боль в горле и насморк. Хотя большинство людей выздоравливает в течение недели, у некоторых пациентов (беременные женщины, маленькие дети, пожилые люди и лица с хроническими заболеваниями) могут развиваться осложнения. По данным Всемирной организации здравоохранения до 10% населения планеты ежегодно болеют гриппом, у 3-5 млн человек развивается тяжелое заболевание и 290-650 тыс. человек погибают (https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)).
Все вирусы гриппа представляют собой одноцепочечные РНК-вирусы с негативным смыслом и сегментированным геномом. Для человека эпидемиологическую значимость имеют вирусы гриппа А и В. Данные вирусы содержат восемь сегментов РНК, которые кодируют субъединицы РНК-полимеразы, вирусные гликопротеины: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), вирусный нуклеопротеин (NP), матриксный белок (M1), мембранный белок (M2), неструктурный белок NS1 и белок ядерного экспорта (NEP). Вирусные белки HA и NA являются наиболее антигенно изменчивыми, и в случае вируса гриппа А они классифицируются на антигенно разнообразные подтипы. Эти два вирусных гликопротеина расположены на поверхности вирусной частицы и являются основными мишенями для защитных антител, индуцируемых вирусом гриппа и вакцинацией.
Вирус гриппа А отличается чрезвычайной изменчивостью генома. Каждый сезон появляются его новые генетические варианты, отличающиеся по своим антигенным характеристикам от предшественников. В основе такой изменчивости лежит два механизма: антигенный дрейф и антигенный шифт. Антигенный дрейф - это постепенное накопление мутаций за счет ошибок, которые делает вирусная полимераза во время копирования генома. Из-за постепенных точечных изменений в гемагглютинине и нейраминидазе возникают варианты вируса гриппа, которые настолько отличаются от предыдущих, что иммунная система распознает их как совершенно новые. Второй механизм, антигенный шифт предполагает замену одного гена или сразу нескольких сегментов РНК вируса гриппа в результате реассортации при одновременном инфицировании клетки разными штаммами вируса гриппа.
Вирусы гриппа А поражают не только человека, но и ряд млекопитающих и птиц, которые являются их естественными резервуарами. Считается, что именно природные резервуары вируса гриппа А обеспечивают источник антигенно разнообразных генов гемагглютинина и нейраминидазы, увеличивая разнообразие вирусов и в некоторых случаях приводя к образованию пандемических штаммов вируса гриппа А человека.
В отличие от этого, вирусы гриппа В не вызывают серьезных эпидемий, хотя для них возможны те же механизмы изменчивости, что и для вируса гриппа А. Это связано с тем, что он распространяется в основном среди людей. В настоящий момент нет известных природных резервуаров данного вируса (хотя было обнаружено его ограниченное распространение среди тюленей и свиней), поэтому не происходят межвидовые реассортации, которые могли бы привести к появлению принципиально новых вариантов вируса. Однако вирусы гриппа В недавно разделились на две антигенно разные линии (B / Victoria/2/1987-подобные и B / Yamagata/16/1988-подобные), которые в настоящее время совместно циркулируют в популяции человека что побудило производителей включить эти две линии, в дополнение к вирусам гриппа A, во многие сезонные вакцины против гриппа.
Ежегодная вакцинация является основным и наиболее эффективным способом профилактики гриппа и связанных с ним осложнений, особенно для групп высокого риска.
Вакцины против гриппа бывают живыми (встречаются редко) и инактивированными. Современные инактивированные можно разделить на нескольких категорий:
• Цельновирионные вакцины (например, Микрофлю»), которые представляют собой инактивированный цельный вирион вируса гриппа. Данные вакцины обладают высокой эффективностью, но также имеют высокую реактогенность.
• Расщепленные, или сплит-вакцины, включающие в себя наружные и внутренние типоспецифические белки, наиболее важные для выработки иммунного ответа.
• Субъединичные вакцины (например, Инфлювак) состоят только из поверхностных антигенов гемагглютинина и нейраминидазы. Также к ним относятся субъединичные адъювантные вакцины (например, Совигрипп), в состав которых добавлен адъювант.
• Виросомальные вакцины (например, Инфлексал® V) - отличаются они тем, что формируют инактивированный виросомальный комплекс с презентацией поверхностных и внутренних антигенов вируса гриппа.
В настоящее время процесс производства вакцины от гриппа занимает достаточно длительное время. В отличие от других вакцин, антигены вакцины против гриппа нуждаются в регулярном обновлении из-за высокой изменчивости вируса. Поэтому в течение года около ста национальных центров по борьбе с гриппом по всему миру, проводят мониторинг вирусов гриппа, которые циркулируют до начала сезона. В феврале Всемирная организация здравоохранения выпускает рекомендацию по составу вакцин против гриппа для предстоящего осенне-зимнего сезона гриппа в Северном полушарии. После этого требуется еще не менее шести месяцев для разработки и производства большого количества необходимых вакцин против гриппа. Это связано с длительной технологией получения и производства одобренных в настоящее время вакцин от гриппа.
Технология на основе мРНК является привлекательной платформой для разработки вакцин против гриппа. Средства на основе мРНК могут быть разработаны и протестированы в короткие сроки. Технология позволяет синтезировать белки непосредственно в организме, устраняя необходимость очистки и долговременной стабилизации белка. Природные свойства РНК позволяют избежать противовекторного иммунитета, таким образом обеспечивая возможность многократного введения препарата. Препараты, полученные на основе мРНК, способны индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. Возможность получения мРНК в бесклеточных системах позволяет организовать масштабируемое и экономически эффективное производство. Использование технологии мРНК позволит разрабатывать и производить вакцину против гриппа ближе к сезону гриппа, а следовательно лучше сопоставлять ее с циркулирующими вирусами, тем самым повышая ее эффективность.
Вместе с тем, в России нет одобренных к применению вакцин против гриппа на основе мРНК технологии.
Таким образом, в уровне технике существует потребность в разработке безопасного и эффективного средства на основе мРНК, которое индуцирует иммунный ответ против вируса гриппа.
Раскрытие изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса гриппа.
Технический результат заключается в создании безопасного иммунобиологического средства на основе мРНК вектора, которое обеспечивает индукцию иммунного ответа против вируса гриппа.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса гриппа, которое содержит мРНК вектор, где мРНК содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H1N1; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце, а также вектор на основе мРНК, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H3N2; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
В другом варианте изобретения, иммунобиологическое средство, кроме двух вышеперечисленных мРНК векторов, дополнительно содержит мРНК вектор, где мРНК содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Victoria; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
Также существует вариант изобретения, в котором иммунобиологическое средство, кроме трех вышеперечисленных мРНК векторов, дополнительно содержит мРНК вектор, где мРНК содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Yamagata; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
Также технический результат достигается тем, что разработано применение иммунобиологического средства путем его введения в организм млекопитающих для индукции иммунного ответа против вируса гриппа.
Осуществление изобретения
Краткое описание чертежей.
На Фиг. 1 представлено схематичное изображение вектора на основе мРНК, где
1 – последовательность на 5’-конце, которая может быть выбрана из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9;
2 – открытая рамка считывания, кодирующая вакцинный антиген.
3 - последовательность на 3’-конце, которая может быть выбрана из SEQIDNO:6, SEQIDNO:7.
На Фиг. 2 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа в отношении гемагглютинина различных вариантов вирусов гриппа А или В у животных, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством или контрольным препаратом.
Титры антител определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), при этом использовали гемагглютинин различных вариантов вирусов гриппа:
A – H1N1 A/Victoria/2570/2019,
Б – H1N1 A/Wisconsin/588/2019;
В – H3N2 A/Darwin/9/2021;
Г - B/Austria/1359417/2021;
Д - B/Massachusetts/02/2012,
Е – B/Phuket/3073/2013.
Группы животных:
Контроль 14 д – титр антител к гемагглютинину вируса гриппа в сыворотке крови контрольных животных на 14 день после начала эксперимента.
Контроль 39 д – титр антител к гемагглютинину вируса гриппа в сыворотке крови контрольных животных на 39 день после начала эксперимента.
Средство 14 д – титр антител к гемагглютинину вируса гриппа в сыворотке крови животных, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством, на 14 день после начала эксперимента.
Средство 39 д – титр антител к гемагглютинину вируса гриппа в сыворотке крови животных, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством, на 39 день после начала эксперимента.
На Фиг. 3 представлены результаты оценки протективности разработанного иммунобиологического средства.
А – выживаемость животных, вакцинированных иммунобиологическим средством по сравнению с контрольной группой, вакцинированной фосфатно-солевым буфером.
На оси ординат – выживаемость, %.
На оси абсцисс – время, дни.
Б – динамика веса животных, вакцинированных иммунобиологическим средством по сравнению с контрольной группой, вакцинированной фосфатно-солевым буфером.
На оси ординат – потеря веса, %.
На оси абсцисс – время, дни.
● Животные, вакцинированные разработанным иммунобиологическим средством;
■ Контрольные животные.
Перечень последовательностей, поясняющих сущность изобретения
SEQIDNO:1 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:2 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:3 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:4 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:5 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:6 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 3’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:7 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 3’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:8 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:9 последовательность рибонулеиновой кислоты, на 5’ конце вектора на основе мРНК;
SEQIDNO:10 аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа AH1N1.
SEQIDNO:11 аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа AH3N2.
SEQIDNO:12 аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria.
SEQIDNO:13 аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа H1N1 B/Yamagata.
Для создания безопасного и эффективного иммунобиологического средства для индукции комплексного иммунного ответа к антигенам вируса гриппа была выбрана векторная система на основе мРНК. Данная технология имеет ряд преимуществ, которые выделяют ее среди других технологических платформ. Средства на основе рибонуклеиновой кислоты могут быть разработаны и протестированы в короткие сроки. Технология позволяет синтезировать белки непосредственно в организме, устраняя необходимость очистки и долговременной стабилизации белка. Природные свойства РНК позволяют избежать противовекторного иммунитета, таким образом, обеспечивая возможность многократного введения препарата. Вакцины, полученные на основе мРНК, способны индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. Возможность получения мРНК в бесклеточных системах позволяет организовать масштабируемое и экономически эффективное производство.
В настоящее время технология на основе мРНК активно используется для разработки вакцин. Так, например, компании Moderna, Pfizer/BioNThech, CureVac, Walvax предложили свои варианты вакцин против covid-19 на основе мРНК. Результаты клинических испытаний показали, что все вакцины отличались как по эффективности, так и по количеству побочных реакций. Различия в конечных эффектах данных вакцин были обусловлены отличиями в конструкциях мРНК и используемыхлипидных наночастицах [Uddin, Mohammad&Roni, Monzurul. (2021). Challenges of Storage and Stability of mRNA-Based COVID-19 Vaccines. Vaccines. 9. 1033. 10.3390/vaccines9091033].
Синтетическая мРНК должна сохранять свою структурную целостность и оставаться функциональной в процессе производства, хранения и использования лекарственных средств. Кроме того, она должна обеспечивать высокую эффективность продукции целевого белка invivo. При конструировании синтетических мРНК используют природные механизмы регуляции генов. Было обнаружено, что встречающиеся в природе молекулы мРНК эукариот содержат характерные регуляторные элементы.Например, только при секвенировании мРНК дрожжей было обнаружено около 560 стабилизирующих и 851 дестабилизирующих элементов [Geisberg JV, Moqtaderi Z, Fan X, Ozsolak F, Struhl K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 2014 Feb 13;156(4):812-24. doi: 10.1016/j.cell.2013.12.026. PMID: 24529382; PMCID: PMC3939777.].
Авторами изобретения была разработана последовательность мРНК, которая отличается от известных вакцин против гриппа, она отличается стабильностью и обеспечивает высокую экспрессию целевого гена. Конструкция мРНК схематично представлена на Фиг.1. При этом участок 1 имеет последовательность, выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9, участок 2 представляет собой область, кодирующую целевой антиген, участок 3 имеет последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7. В качестве антигена может быть выбран гемагглютинин вируса гриппа А H1N1, гемагглютинин вируса гриппа А H3N2, гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata, гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria.
В приведенных ниже примерах проиллюстрировано получение нескольких вариантов иммунобиологического средства, на основе мРНК вектора, содержащего две и более мРНК, кодирующих различные варианты гемагглютинина вируса гриппа. Результаты проведенных экспериментов подтверждают, что при введении данных вариантов иммунобиологического средства в организм млекопитающих формируется иммунный ответ против соответствующих антигенов. Разработанные варианты иммунобиологического средства могут быть использованы для создания вакцины для профилактики гриппа.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Создание ДНК-матрицы для получения мРНК.
На первом этапе работы необходимо было разработать дизайн мРНК вектора. Каждая встречающаяся в природе мРНК имеет свой индивидуальный период полураспада. Различные скорости деградации природных мРНК являются одним из инструментов регуляции экспрессии генов. Нестабильные мРНК обеспечивают временную экспрессию гена в различные моменты времени, тогда как долгоживущие мРНК могут быть связаны с непрерывной экспрессией генов или накоплением отдельных белков.
При конструировании мРНК вектора стабильность и эффективность трансляции имеют первостепенное значение, поскольку данные характеристики существенно влияют на фармакокинетические и фармакодинамические свойства лекарственных средств. Вектор на основе мРНК должен сохранять свою структурную целостность и оставаться функциональным в процессе производства, хранения и использования лекарственных средств. Кроме того, он должен обеспечивать высокую эффективность продукции целевого белка in vivo. Выбор конструктивных элементов мРНК является сложной научной задачей.
В данном изобретении было разработано несколько вариантов дизайна мРНК вектора:
1) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
2) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
3) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
4) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
5) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
6) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
7) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
8) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
9) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
10) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
11) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
12) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
13) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
14) мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
В качестве антигенов для иммунобиологического средства были выбраны: гемагглютинин вируса гриппа АH1N1, гемагглютинин вируса гриппа АH3N2, гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata, гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria.Специалисту среднего уровня известно, что антигенный состав всех вакцин от гриппа ежегодно изменяется в соответствии с рекомендациями ВОЗ. В разработанном иммунобиологическом средстве также подразумевается ежегодная замена последовательностей, кодирующих антигены. В данной работе в качестве примера были использованы следующие последовательности антигенов:
1) аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10;
2) аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11;
3) аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12;
4) аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13.
На основании аминокислотных последовательностей антигенов были получены нуклеотидные последовательности, оптимизированные для экспрессии в клетках млекопитающих. Данные последовательности вошли в состав ДНК-матриц для получения мРНК.
ДНК матрица представляет собой кольцевую плазмидную ДНК, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую целевой антиген. Она сконструирована таким образом, чтобы обеспечивать эффективную наработку мРНК in vitro, а также содержит элементы необходимые для ее репликации в E.coli и ген устойчивости к антибиотику.
Последовательности, кодирующие антигены были синтезированы ЗАО Евроген и были помещены в ДНК матрицы с помощью стандартных генно-инженерных процедур. Наращивание клеток E. Coli, трансформированных ДНК-матрицей, проводилось в жидкой среде 2xYT (1,6% Триптон, 1% Дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl) или на твердой среде 2xYT + 2% агар, с антибиотиком. Плазмидная ДНК выделялась из ночной культуры E. сoli объемом 4 мл с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) или QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) по стандартному протоколу, предложенному производителем. После выделения плазмидной ДНК измеряли её концентрацию на флуориметре Qubit®4.0 (Invitrogene, США) с использованием реагентов из коммерческого набора Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) по стандартному протоколу, предложенному производителем. Правильность сборки финальных плазмид подтверждалась секвенированием по Сэнгеру на аппарате Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), используя коммерческий набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, согласно рекомендациям производителя.
В результате проведенной работы был получен ряд ДНК матриц, кодирующих различные варианты вектора на основе мРНК.
Пример 3. Синтез мРНК на основе полученных ДНК-матриц.
Для синтеза мРНК проводили реакцию транскрипции in vitro с использованием ДНК-матриц, полученных в предыдущем примере.
Для проведения реакции in vitro транскрипции необходимы следующие компоненты:
- смесь нуклеотидов (Аденозин - 5’- трифосфат (ATP), Гуанозин - 5’ - трифосфат (GTP), Цитидин - 5’ - трифосфат (CTP) и N1-метилпсевдоуридин-5'-трифосфат (N1-Me-PseudoUTP)) (Биолабмикс);
- аналог структуры кэпа1 m7GmAmG (Биолабмикс);
- ингибитор РНКаз (Биолабмикс);
- пирофосфатаза;
- T7-РНК-полимераза (Биолабмикс);
- T7-буфер для IVT;
- добавочный буфер.
В таблице 1 представлен состав реакционной смеси, рассчитанный на 100 мкл реакции с количеством ДНК-матрицы от 2 до 5 мкг. При необходимости объем реакции можно уменьшать до 25 мкл кратно снижая количества компонентов. Перед началом IVT все компоненты размораживаются на льду, перемешиваются на вортексе. Далее составляется реакция, компоненты добавляются в представленном порядке.
Таблица 1. Состав реакционной для синтеза мРНК с котранскрипционным кэпированием аналогом кэпа-1 m7GmAmG
Реакционную смесь инкубируют при температуре +37˚С в течение 120 минут, после чего к ней добавляют 1 мкл ДНКазы + 12 мкл буфера для ДНКазы (10х) («Синтол») и смесь инкубируют еще 30 минут.
Таким образом, в результате проведенной работы был получены следующие варианты мРНК:
1) мРНК15-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
2) мРНК16-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
3) мРНК17-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
4) мРНК18-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
5) мРНК19-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
6) мРНК20-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
7) мРНК21-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
8) мРНК22-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
9) мРНК23-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
10) мРНК24-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
11) мРНК25-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
12) мРНК26-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
13) мРНК27-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
14) мРНК28-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
15) мРНК29-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
16) мРНК30-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
17) мРНК31-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
18) мРНК32-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
19) мРНК33-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
20) мРНК34-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
21) мРНК35-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
22) мРНК36-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
23) мРНК37-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
24) мРНК38-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
25) мРНК39-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа AH3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
26) мРНК40-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
27) мРНК41-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
28) мРНК42-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
29) мРНК43-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
30) мРНК44-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
31) мРНК45-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
32) мРНК46-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
33) мРНК47-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
34) мРНК48-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
35) мРНК49-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
36) мРНК50-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
37) мРНК51-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/VictoriaSEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
38) мРНК52-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
39) мРНК53-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
40) мРНК54-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
41) мРНК55-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
42) мРНК56-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
43) мРНК57-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
44) мРНК58-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
45) мРНК59-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
46) мРНК60-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
47) мРНК61-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
48) мРНК62-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
49) мРНК63-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
50) мРНК64-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
51) мРНК65-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
52) мРНК66-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
53) мРНК67-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
54) мРНК68-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
55) мРНК69-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
56) мРНК70-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
Пример 4. Получение липидных наночастиц, содержащих синтезированные мРНК.
мРНК, синтез которых описан в примере 3 инкапсулировали в липидные наночастицы (ЛНЧ) с использованием процесса микрофлюидного смешивания быстрого раствора мРНК (pH 3,0) с раствором липидов, растворенных в спирте. Для этого липиды растворяли в 96 % этаноле при молярных соотношениях 46,3:9:42,7:1,6 (ионизируемый липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин: пегилированный липид (ПЭГ-липид)). Ионизируемый липид Acuitas (ALC-0315) и ПЭГ-липид (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль 2000) были приобретены в Cayman Chemical Company. Раствор мРНК с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4 °C до использования.
Таким образом, в результате проведенной работы был получены липидные наночастицы, содержащие один из вариантов мРНК вектора:
1) мРНК15-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
2) мРНК16-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
3) мРНК17-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
4) мРНК18-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
5) мРНК19-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
6) мРНК20-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
7) мРНК21-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
8) мРНК22-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
9) мРНК23-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
10) мРНК24-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
11) мРНК25-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
12) мРНК26-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
13) мРНК27-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
14) мРНК28-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:10; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
15) мРНК29-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
16) мРНК30-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
17) мРНК31-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
18) мРНК32-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
19) мРНК33-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
20) мРНК34-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
21) мРНК35-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
22) мРНК36-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
23) мРНК37-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
24) мРНК38-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
25) мРНК39-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа A H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
26) мРНК40-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
27) мРНК41-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
28) мРНК42-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:11; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
29) мРНК43-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
30) мРНК44-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
31) мРНК45-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
32) мРНК46-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
33) мРНК47-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
34) мРНК48-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
35) мРНК49-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
36) мРНК50-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
37) мРНК51-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
38) мРНК52-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
39) мРНК53-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
40) мРНК54-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
41) мРНК55-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
42) мРНК56-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:12; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
43) мРНК57-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
44) мРНК58-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
45) мРНК59-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
46) мРНК60-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
47) мРНК61-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
48) мРНК62-Y мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
49) мРНК63-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:6 на 3’ конце;
50) мРНК64-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
51) мРНК65-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
52) мРНК66-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
53) мРНК67-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
54) мРНК68-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
55) мРНК69-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
56) мРНК70-Y мРНК вектор, который содержит последовательность SEQ ID NO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:13; последовательность SEQ ID NO:7 на 3’ конце;
Пример 5. Оценка иммуногенности вариантов компонента иммунобиологического средства, которые содержат мРНК вектора с открытой рамкой считывания, кодирующей гемагглютинин вируса гриппа А H1N1.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения компонента иммунобиологического средства, которое содержит мРНК вектора, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт. и однократно иммунизированы одним из вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства (в дозе 3 мкг/мышь):
1) мРНК15-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
2) мРНК16-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
3) мРНК17-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
4) мРНК18-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
5) мРНК19-H1N1: мРНК вектора, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
6) мРНК20-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
7) мРНК21-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
8) мРНК22-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
9) мРНК23-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
10) мРНК24-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10 последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
11) мРНК25-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
12) мРНК26-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
13) мРНК27-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
14) мРНК28-H1N1: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:10; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген (гемагглютинин вируса гриппа А H1N1) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в планшет добавляли 5%-молоко, растворенное в буфере для блокирования неспецифического сигнала, в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение.
11) Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
12) Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к гемагглютинину вируса гриппа А H1N1 в сыворотке крови мышей, иммунизированных различными вариантами разработанного вектора на основе мРНК.
Как видно из результатов эксперимента, однократное внутримышечное введение всех вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства на основе мРНК вектора, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа H1N1, индуцирует развитие гуморального иммунного ответа.
Пример 6. Оценка иммуногенности вариантов компонента иммунобиологического средства, которые содержат мРНК вектор с открытой рамкой считывания, кодирующей гемагглютинин вируса гриппа А H3N2.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения компонента иммунобиологического средства, которое содержит мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт и однократно иммунизированы одним из вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства (в дозе 3 мкг/мышь):
1) мРНК29-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
2) мРНК30-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
3) мРНК31-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
4) мРНК32-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
5) мРНК33-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
6) мРНК34-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
7) мРНК35-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
8) мРНК36-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
9) мРНК37-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
10) мРНК38-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
11) мРНК39-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
12) мРНК40-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
13) мРНК41-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
14) мРНК42-H3N2: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:11; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген (гемагглютинин вируса гриппа А H3N2) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в планшет добавляли 5%-молоко, растворенное в буфере для блокирования неспецифического сигнала, в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение.
11) Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
12) Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к гемагглютинину вируса гриппа А H3N2 в сыворотке крови мышей, иммунизированных различными вариантами разработанного вектора на основе мРНК.
Как видно из результатов эксперимента, однократное внутримышечное введение всех вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства на основе мРНК вектора, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа H3N2, индуцирует развитие гуморального иммунного ответа.
Пример 7. Оценка иммуногенности вариантов компонента иммунобиологического средства, которые содержат мРНК вектор с открытой рамкой считывания, кодирующей гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения компонента иммунобиологического средства, которое содержит мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт. и однократно иммунизированы одним из вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства (в дозе 3 мкг/мышь):
1) мРНК43-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
2) мРНК44-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
3) мРНК45-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
4) мРНК46-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
5) мРНК47-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
6) мРНК48-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
7) мРНК49-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
8) мРНК50-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
9) мРНК51-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
10) мРНК52-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
11) мРНК53-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
12) мРНК54-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
13) мРНК55-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
14) мРНК56-V: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:12; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген (гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в планшет добавляли 5%-молоко, растворенное в буфере для блокирования неспецифического сигнала, в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение.
11) Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
12) Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к гемагглютинину вируса гриппа B/Victoria в сыворотке крови мышей, иммунизированных различными вариантами разработанного вектора на основе мРНК.
Как видно из результатов эксперимента, однократное внутримышечное введение всех вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства на основе мРНК вектора, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria, индуцирует развитие гуморального иммунного ответа.
Пример 8. Оценка иммуногенности вариантов компонента иммунобиологического средства, которые содержат мРНК вектор с открытой рамкой считывания, кодирующей гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения компонента иммунобиологического средства, которое содержит мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3, SEQIDNO:4, SEQIDNO:5, SEQIDNO:8, SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata; последовательность SEQIDNO:6 или SEQIDNO:7 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт и однократно иммунизированы одним из вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства (в дозе 3 мкг/мышь):
1) мРНК57-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
2) мРНК58-Y:мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
3) мРНК59-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
4) мРНК60-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
5) мРНК61-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
6) мРНК62-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
7) мРНК63-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце;
8) мРНК64-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:1 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
9) мРНК65-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:2 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
10) мРНК66-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
11) мРНК67-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:4 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
12) мРНК68-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:5 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
13) мРНК69-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:8 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце;
14) мРНК70-Y: мРНК вектор, который содержит последовательность SEQIDNO:9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:13; последовательность SEQIDNO:7 на 3’ конце.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген (гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в планшет добавляли 5%-молоко, растворенное в буфере для блокирования неспецифического сигнала, в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение.
11) Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
12) Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к гемагглютинину вируса гриппа B/Yamagata в сыворотке крови мышей, иммунизированных различными вариантами разработанного вектора на основе мРНК.
Как видно из результатов эксперимента, однократное внутримышечное введение всех вариантов компонента разработанного иммунобиологического средства на основе мРНК вектора, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata, индуцирует развитие гуморального иммунного ответа.
Пример 9. Оценка иммуногенности иммунобиологического средства, содержащего два компонента.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения иммунобиологического средства для индукции комплексного иммунного ответа против вируса гриппа, которое содержит:
1) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H1N1; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце,
2) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H3N2; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт и двукратно с интервалом 21 день иммунизированы:
1) разработанным иммунобиологическим средством, содержащим мРНК17-H1N1 (5 мкг/мышь), мРНК31-H3N2 (5 мкг/мышь);
2) Фосфатно-солевым буфером (ФСБ).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по протоколу, описанному в примере 9. В качестве антигена использовали гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 или гемагглютинин вируса гриппа А H3N2.
Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к вирусным антигенам в сыворотке крови мышей, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством.
Как видно из результатов эксперимента, иммунизация животных разработанным иммунобиологическим средством, содержащим два мРНК вектора, индуцирует развитие иммунного ответа.
Пример 10. Оценка иммуногенности иммунобиологического средства, содержащего три компонента.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса гриппа, которое содержит:
1) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H1N1; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце,
2) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H3N2; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце.
3) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Victoria; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт и двукратно с интервалом 21 день иммунизированы:
1) разработанным иммунобиологическим средством, содержащим мРНК17-H1N1 (5 мкг/мышь), мРНК31-H3N2 (5 мкг/мышь), мРНК45-H3N2 (5 мкг/мышь);
2) Фосфатно-солевым буфером (ФСБ).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по протоколу, описанному в примере 9. В качестве антигена использовали гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 или гемагглютинин вируса гриппа А H3N2, гемагглютинин вируса гриппа B/Victoria.
Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к вирусным антигенам в сыворотке крови мышей, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством.
Как видно из результатов эксперимента, иммунизация животных разработанным иммунобиологическим средством, содержащим три вектора на основе мРНК, индуцирует развитие иммунного ответа.
Пример 11. Оценка иммуногенности иммунобиологического средства, содержащего четыре компонента.
Цель данного эксперимента заключалась в оценке гуморального иммунного ответа у млекопитающих после введения иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса гриппа, которое содержит:
1) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H1N1; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце,
2) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H3N2; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце.
3) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Victoria; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце.
4) мРНК вектор, который содержит последовательность выбранную из SEQIDNO:3 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Yamagata; последовательность SEQIDNO:6 на 3’ конце.
В данном эксперименте использовали мышей линии Balb/c массой 18-20 г, которые были разделены на группы по 5 шт и двукратно с интервалом 21 день иммунизированы:
1) разработанным иммунобиологическим средством, содержащим мРНК17-H1N1 (5 мкг/мышь), мРНК31-H3N2 (5 мкг/мышь);
2) Фосфатно-солевым буфером (ФСБ).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по протоколу, описанному в примере 9. В качестве антигена использовали гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 или гемагглютинин вируса гриппа А H3N2.
Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 8.
Таблица 8 - Среднее геометрическое значение титра IgG антител к вирусным антигенам в сыворотке крови мышей, иммунизированных разработанным иммунобиологическим средством.
Как видно из результатов эксперимента, иммунизация животных разработанным иммунобиологическим средством, содержащим четыре мРНК вектора, индуцирует развитие иммунного ответа.
Пример 12. Оценка иммуногенности разработанного иммунобиологического средства, содержащего 4 компонента, на животной модели.
В данном эксперименте использовали самок мышей линии С57Bl6 18-20 г, которые были разделены на несколько групп по 5 животных:
1) Вакцинированы разработанным иммунобиологическим средством (мРНК17-H1N1, мРНК31-H3N2, мРНК45-Y мРНК59-V), содержащим по 5 мкг мРНК каждого компонента
2) Вакцинированы контрольным препаратом: зарегистрированной инактивированной сплит вакциной (ИСВ, в дозировке 1/5 человеческой дозы на мышь);
3) Группа отрицательного контроля, которым вводили фосфатно-солевой буфер.
Все животные были вакцинированы дважды с интервалом 21 день. Кровь отбирали дважды на 14 день (из хвостовой вены) и 39 день (тотально из сердца) после первой иммунизации. Оценку иммуногенности проводили с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в сыворотках мышей с различными антигенами, входящими в состав иммунобиологического средства. Результаты эксперимента представлены на фиг.2.
Результаты эксперимента показали, что животные, иммунизированные разработанным иммунобиологическим средством, демонстрируют выраженный гуморальный иммунный ответ в отношении гемагглютинина различных вариантов вируса гриппа А и Б. При этом титр антител в РТГА в группе животных, иммунизированных разработанным средством, был достоверно выше титра антител в контрольной группе, иммунизированной коммерческой сплит вакциной.
Таким образом была показана способность разработанного иммунобиологического средства индуцировать мощный иммунный ответ против вирусов гриппа А и В.
Пример 13. Оценка протективности разработанного иммунобиологического средства, содержащего 4 компонента.
Способность разработанного иммунобиологического средства защищать иммунизированных ими животных от летального исхода проверялась в экспериментах с заражением адаптированным к мышам штаммом вируса гриппа А (H1N1) Victoria/2570/2019.
Для этого самцы мышей линии B.6Cg-Tg(K18-ACE2), возрастом 4-5 недель были вакцинированы согласно двукратной схеме (вторая вакцинация спустя 21 день после первой). Животным внутримышечно вводили:
1) Разработанное иммунобиологическое (мРНК17-H1N1, мРНК31-H3N2, мРНК45-Y мРНК59-V), по 5 мкг мРНК каждого компонента
2) Фосфатно-солевой буфер.
Спустя 21 день после полной схемы вакцинации мыши были заражены вирусом гриппа. Доза вируса гриппа А (H1N1) Victoria/2570/2019 составляла 20 ЛД50 на животное, доза коронавируса составляла 106 ЦПД50. После заражения гриппом наблюдали за выживаемостью и динамикой потери веса (Фиг. 3).
Полученные данные показывают, что иммунизация животных разработанном иммунобиологическим средством полностью защищает животных от гибели в результате заражения вирусом гриппа.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность всех вариантов разработанного иммунобиологического средства, а также возможность их применения для создания вакцины против гриппа.
--->
Список последовательностей
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2024-10-15
Грипп.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2024-10-15">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText/>
<FilingDate>2024-06-25</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>20240706</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное
бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр
эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи"
Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology and
Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the
Ministry of Health of the Russian Federatio</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Иммунобиологическое средство для
индукции иммунного ответа против вируса гриппа и его применение.
</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>13</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>87</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..87</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggaccgccgagaccgcgtccgccccgcgagcacagagcctcgcctttgccg
atccgccgcccgtccacacccgccgccagctcacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggtgctctgagtttttggtttctgtttcaccttgtgtctgagctggtctga
aggctggttgttcagactgagcttcctgcctgcctgtaccccgccaacagcttcagaagaaggagcagcc
cctgggtgcgtccactttctgggcacgtgaggttgggccttggccgcctgagcccttgagttggtcactt
gaaccttgggaatattgag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggatcggcgctttgccacttgtacccgagtttttgattctcaagatggcgg
ca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>217</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..217</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggaacggctagcctgaggagctgctgcgacagtccactacctttttcgaga
gtgactcccgttgtcccaaggcttcccagagcgaacctgtgcggctgcaggcaccggcgcgtcgagtttc
cggcgtccggaaggaccgagctcttctcgcggatccagtgttccgtttccagcccccaatctcagagccg
agccgacagagagcagggaaccggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>205</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..205</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggactctcttcgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggtt
gaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactcc
gccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccag
tcacagtcgcaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc</INSDSeq
_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>203</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..203</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaatataagctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccc
cccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>142</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..142</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaatataacctcgccccggacctgccctcccgccaggtgcacccacctgca
ataaatgcagcgaagccgggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>60</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q59">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggaaagaataatacaagaataaagaaacaacgaatagaataaggaagtaaa
gcgccacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>566</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..566</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MKAILVVMLYTFTTANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLED
KHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTARSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQL
SSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSDNGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGKSYPKINQTYINDKGKEVLV
LWGIHHPPTIADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIATRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEAT
GNLVAPRYAFTMERDAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNVHPITIGKCPKYVKSTKLRLA
TGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEK
MNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKN
NAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREKIDGVKLDSTRIYQILAIYSTVASSLV
LVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>565</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..565</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MKTIIALSNILCLVFAQKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDRIEV
TNATELVQNSSIGEICGSPHQILDGGNCTLIDALLGDPQCDGFQNKEWDLFVERSRANSNCYPYDVPDYA
SLRSLVASSGTLEFKNESFNWTGVKQNGTSSACIRGSSSSFFSRLNWLTSLNNIYPAQNVTMPNKEQFDK
LYIWGVHHPDTDKNQISLFAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRGIPSRISIYWTIVKPGDILLIN
STGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKL
ATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIG
KTNEKFHQIEKEFSEVEGRVQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLR
ENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNETYDHNVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAMSCFL
LCIALLGFIMWACQKGNIRCNIC</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>582</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..582</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPT
KSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQL
PNLLRGYEHVRLSTHNVINTEDAPGGPYEIGTSGSCLNITNGKGFFATMAWAVPKNKTATNPLTIEVPYI
CTEEEDQITVWGFHSDDETQMARLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDY
MVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGKSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGN
CPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQE
AINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDE
HLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLD
NHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFVVYMVSRDNVSCSICL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>584</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..584</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q58">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPT
KSYFANLKGTKTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQL
ANLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVP
YICAEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVV
DYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAI
GNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKST
QEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSE
DEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDG
LDNHTILLYYSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVSRDNVSCSICL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Иммунобиологическое средство для индукции комплексного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и вируса гриппа и его применение | 2024 |
|
RU2836687C1 |
| Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения | 2023 |
|
RU2811791C1 |
| Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 | 2021 |
|
RU2751485C1 |
| Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора. | 2024 |
|
RU2828631C1 |
| Способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих | 2024 |
|
RU2828654C1 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ГРИППА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ COVID-19 И ГРИППА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ | 2022 |
|
RU2802058C1 |
| Вектор на основе мРНК для увеличенной продукции целевого белка в клетках млекопитающих (варианты) | 2022 |
|
RU2792231C1 |
| НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2721706C2 |
| ЭНХАНСЕРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ CPMV | 2015 |
|
RU2699982C2 |
| ПОВЫШЕНИЕ ВЫХОДА ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ В РАСТЕНИЯХ | 2012 |
|
RU2682752C2 |
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться в качестве двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной вакцины для профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа А H1N1, вирусом гриппа А H3N2, вирусом гриппа B/ Victori, вирусом гриппа B/Yamagata. Описано средство на основе мРНК вектора, где мРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3’ конце. Технический результат заключается в создании безопасного иммунобиологического средства на основе мРНК вектора, которое обеспечивает индукцию иммунного ответа против вируса гриппа. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 13 пр.
1. Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса гриппа на основе мРНК вектора, где мРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H1N1; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3’ конце, а также мРНК вектора, где мРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа А H3N2; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3’ конце.
2. Иммунобиологическое средство по п.1, которое дополнительно содержит мРНК вектора, где мРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Victoria; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3’ конце.
3. Иммунобиологическое средство по п.2, которое дополнительно содержит мРНК вектора, где мРНК содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, на 5’ конце; открытую рамку считывания, кодирующую антиген вируса гриппа B/Yamagata; последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 на 3’ конце.
4. Применение иммунобиологического средства по пп. 1-3 для индукции иммунного ответа против вируса гриппа, включающее введение иммунобиологического средства по любому из пп. 1-3 в организм млекопитающих.
| WO 2010144797 A2, 16.12.2010 | |||
| WO 2017070620 A2, 27.04.2017 | |||
| US 20230099147 A1, 30.03.2023 | |||
| Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом клещевого энцефалита, на основе мРНК | 2024 |
|
RU2823754C1 |
