Способ получения средства, обладающего антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, на основе травы Trifolium pratense L. Российский патент 2024 года по МПК A61K36/48 B01D11/02 A61P17/18 A61P37/02 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время перед медициной и фармацией остро стоит проблема поиска эффективных и безопасных средств, в том числе на основе растительного сырья. К примеру, одним из перспективных направлений медицины и фармации является получение сухих растительных экстрактов, содержащих высокие концентрации биологически активных веществ. Сырьем для получения сухих экстрактов могут послужить различные растения, характеризующиеся содержанием вторичных метаболитов -фенольных соединений, витаминов, микроэлементов. В частности, представляет актуальность использование в качестве сырья для получения сухого экстракта травы Trifolium pratense L., что обусловлено накоплением в данном сырье растительных полифенолов (флавоноидов, гидроксикоричных кислот), витаминов, микроэлементов, обладающих антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью.

Известен способ производства из растительного сырья клевера средства, обладающего биологической активностью (Патент РФ №2279287 «Гемореологическое средство и способ его получения», автор: Л.А. Прокопьева). Данный способ предполагает создание гемореологического средства в виде жидкого или сухого спиртового экстракта клевера красного, которое может быть использовано при лечении заболеваний, сопровождающихся синдромом повышенной вязкости крови, и способа его получения. Недостатком данного способа является использование в технологии получения экстракта клевера дорогостоящего оборудования и дополнительных реактивов (целлюлозы микрокристаллической), а также длительность процесса ввиду трехкратной экстракции.

Известен способ получения средства из травы клевера красного (Патент РФ №2068269 «Способ получения средства, обладающего антисклеротической и желчегонной активностью», авторы: В.А. Компанцев, М.С. Лукьянчиков, А.Л. Казаков). Данный способ предполагает получение экстракта надземной части травы клевера красного (Trifolium sativum Crome L.), обладающего антисклеротической и желчегонной активностью, методом вихревой экстракции. Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость технологического процесса, а также дороговизна ввиду использования дополнительного оборудования.

Известен способ получения водорастворимых полисахаридов из травы клевера лугового (Патент РФ №2421232 «Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью», авторы: Данилец М. Г., Гурьев А. М., Вельская Н. В., Белоусов М. В., Вельский Ю. П., Юсубов М. С, Трофимова Е. С, Агафонов В. И., Учасова Е.Г., Лигачева А. А.). Данный способ предполагает экстракцию водой очищенной полисахаридов из травы Trifolium pratense L, обладающего иммуномодулирующей активностью. Недостатком данного способа является экстракция при высоких температурах, а также извлечение одной группы биологически активных веществ - полисахаридов.

Прототипом данного патента является способ экстракции биологически активных веществ из растительного сырья, представляющего собой высушенную траву дикорастущего клевера лугового (Trifolium pratense L.) (диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук «Разработка технологии лекарственного средства с фитосубстанцией из клевера лугового травы», автор: Нгуен Тхи Шен). В данном способе расчетное количество сырья с размером частиц 0,5-1,0 мм загружают в экстрактор, заливают экстрагентом - этиловым спиртом 75% об. в соотношении сырье: экстрагент 1:20, экстрагируют в течение 50 минут при температуре 50°С на ультразвуковой бане, полученное извлечение упаривают в вакууме до 1/5 исходного объема и проводят очистку извлечения последовательно гексаном для удаления балластных веществ и этилацетатом для извлечения действующих веществ, полученные этилацетатные фракции обезвоживают, сгущают в вакууме и направляют на сушку при температуре 55 - 60°С до остаточного влагосодержания в продукте не более 5% об.

Недостатком прототипа является использование гексана и этилацетата, являющихся более токсичными и дорогими по сравнению с водой очищенной и этиловым спиртом, для очистки получаемого сухого экстракта Trifolium pratense L., а также высушивание полученного экстракта при относительно более низких температурах 55 - 60°С, что предполагает большую длительность данного процесса.

Перспективным направлением, которое активно развивается в настоящее время, является создание лекарственных средств, оказывающих свое действие с помощью таргетной доставки, благодаря которой происходит целенаправленное воздействие на различные звенья имунной системы [7], что обуславливает разработку большого количества препаратов. Было выявлено, что экстракт травы клевера уменьшает воспаление, способствует более быстрому очищению и заживлению раны [1]. Известно, что развитие адекватного противомикробного и противоопухолевого ответа сопровождается активацией системы иммунитета по типу Th1-поляризации, основными характеристиками которой являются, синтез набора провоспалительных цитокинов (интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухолей α (ФНОα), интерферон γ (ИФНγ)) и активацией иммунокомпетентных клеток. При развитии системной воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма. Продукция ИФНτ Т-лимфоцитами запускается при распознавании комплекса антигенного пептида с собственными молекулами гистосовместимости (МНС 1 или 2 класса) соответствующим ТКР и регулируется другими цитокинами: типичным стимулятором -интерлейкином-2 (ИЛ-2) и типичным ингибитором - интерлейкином-10 (ИЛ-10). ФНОα - белок, который наряду с интерлейкинами усиливает воспалительный процесс в организме с целью защиты от чужеродных антигенов. Считается, что ФНОα - это основной цитокин острого воспаления. ИЛ-6 - провоспалительный цитокин, оказывающий влияние на многие органы и системы организма: кровь, печень, иммунную и эндокринную системы, обмен веществ. Он синтезируется активированными моноцитами/макрофагами, фибробластами, эндотелиальными клетками при воспалении, травмах, гипоксии, бактериальных инфекциях. Однако избыточная продукция провоспалительных цитокинов приводит к гипервоспалению с развитием полиорганной недостаточности. Показана роль цитокинов в формировании различной неинфекционной патологии (воспалительные заболевания кишечника, метаболические нарушения, аутоиммунные заболевания, онкология и др.) [8]. Таким образом, ИЛ-6, ФНОα и ИФНγ, которые вырабатываются антигенпрезентирующими клетками и являются основными медиаторами Th1-иммунного ответа, могут быть использованы в качестве «мишени» при создании растительных средств с иммуномодулирующей активностью таргетного действия. Иммуномодуляторы растительного происхождения обладают рядом преимуществ: минимальным количеством побочных эффектов и противопоказаний, возможностью применения в педиатрии, а также у пожилых лиц и при хронических воспалительных заболеваниях.

Задача, на решение которой направлено данное изобретение, заключается в разработке способа получения антиоксидантного и иммуномодулирующего средства растительного происхождения, отличающегося экономичностью и экспрессностью технологии, использованием безопасных растворителей в технологическом процессе.

Настоящее изобретение направлено на создание нового современного эффективного антиоксид анта, проявляющего иммуномодулирующие свойства.

НОВИЗНА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Новизна данного патента заключается в получение экстракта, накапливающего фенольные соединения аналогично прототипу, при этом, в отличие от прототипа, минимизируется риск использования токсичных растворителей - гексана и этилацетата, а также применяется более высокая температура в технологии получения экстракта, что делает процесс менее длительным, но не менее эффективным.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Технический результат, полученный при решении поставленной задачи, выражается в получении универсального антиоксиданта с иммуномодулирующей активностью растительного происхождения для фармации.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Поставленная задача решается тем, что разработан способ получения экстракта, обладающего антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, из травы Trifolium pratense L., который предполагает измельчение травы клевера с помощью мельницы лабораторной до размера частиц 0,5-1,0 мм, загрузку расчетного количества измельченного сырья в экстрактор, заполняющийся экстрагентом - этиловым спиртом 75% об. так, чтобы соблюдалось соотношение сырье: экстрагент 1:20. Экстракцию проводят при температуре 50°С на ультразвуковой бане в течение 50 минут. По окончании экстракции полученное извлечение упаривают в вакууме до 1/5 исходного объема, полученные фракции обезвоживают, очищают последовательно водой очищенной для удаления балластных веществ и этиловым спиртом 50% об. для извлечения действующих веществ, затем сгущают и направляют на сушку при температуре 60-65°С до остаточного влагосодержания в продукте не более 5% об. Полученный экстракт обладает антиоксидантными свойствами, которые определяются в системах in vitro по способности экстракта ингибировать аутоокисление адреналина и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода. Для установления антиоксидантных свойств полученного экстракта к 4 мл 0,2 М натрий-карбонатного буфера, рН=10,65 (устанавливаемое добавлением к 0,2 М раствору Na₂CO₃ сухого реактива NaHCO₃) добавляют 0,2 мл 0,1% об. (5,46 мМ) аптечного раствора адреналина гидрохлорида, тщательно и быстро перемешивают, помещают в спектрофотометр и определяют оптическую плотность через 30 с в течение 10 мин при длине волны 347 нм в кювете толщиной 10 мм (D₁). Далее к 4 мл буфера (рН=10,65) добавляют 0,06 мл экстракта (водного раствора сухого экстракта Trifolium pratense L.) и 0,2 мл 0,1% об. адреналина гидрохлорида, перемешивают и измеряют оптическую плотность (D₂). Для учета влияния собственной окраски экстракта, который поглощает определенную длину волны в видимой части спектра, в качестве контрольной пробы используют буферированный раствор экстракта, без адреналина. Антиоксидантную активность (АА) сухого экстракта Trifolium pratense L. выражают в процентах ингибирования аутоокисления адреналина:

Величина АА более 10% свидетельствует о наличии антиоксидантной активности экстракта.

Иммуномодулирующая активность экстракта оценивается по способности экстракта регулировать продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека. Иммуномодулирующую активность сухого экстракта клевера определяют в супернатантах клеток, получаемых следующим образом. Мононуклеарные лейкоциты выделяют в стерильных условиях из гепаринизированной крови доноров методом градиентного центрифугирования (400g) в градиенте плотности фиколл-верографин («Pharmacia», Швеция) плотностью 1,077 г/см³. Далее пробы центрифугируют 15 мин с частотой 1400 об/мин. Образовавшиеся кольца (преимущественно состоящие из лимфоцитов) отбирают в силиконированные пробирки, добавляют стерильный забуференный физиологический раствор и центрифугируют на холоду 7 мин с частотой 1100 об/мин. Для подсчета лимфоцитов используют 3% об. уксусную кислоту (0,9 мл уксусной кислоты + 0,1 мл лимфоцитов). Выделенные лимфоциты доводят до концентрации 2⋅10⁶ клеток/мл.

Сокультивирование взвеси лимфоцитов с раствором экстракта клевера на стерильной дистиллированной воде [10,0; 5,0; 2,5 мг/мл] проводят в 96-луночных полистероловых планшетах в соотношении 1:4 (опыт) в культуральной среде, содержащей RPMI (ПанЭко), 10% масс, инактивированную эмбриональную телячью сыворотку («Sigma-Aldrich», США), 0,01%) масс.L-глутамин и 80 мкг/мл гентамицин. Пробы инкубируют 24 часа в СО₂-инкубаторе при 37°С. Исследование каждой клеточной культуры проводят в трех дублях. В качестве контрольной используют проба контроля лимфоцитов в культуральной среде. В культуральной среде лимфоцитов, обработанных раствором экстракта клевера, измеряют провоспалительные (IFNγ, TNFα, IL-6) цитокины методом иммуноферментного анализа (тест-систем «Цитокин», Россия). Регистрацию результатов проводят на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия). Результат влияния раствора экстракта клевера на мононуклеары оценивают по изменению концентрации цитокинов в культуральной среде по сравнению с контролем.

Сравнительный анализ признаков предлагаемого технического решения с признаками аналогов и прототипа свидетельствует о его соответствии критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признак, указывающий, что «для очистки вытяжки из растительного сырья, подвергнутой сгущению, применяют воду очищенную (для удаления балластных веществ) и этиловый спирт 50% об. (для извлечения действующих веществ)» обусловлен необходимостью обеспечить экономичность разрабатываемой технологии получения сухого экстракта и минимизировать проникновение остаточных количеств растворителей, более токсичных по сравнению с водой очищенной и этиловым спиртом 50% об., в готовый сухой экстракт Trifolium pratense L.

Признак, указывающий, что «для получения сухого экстракта вытяжку из растительного сырья после сгущения направляют на сушку при температуре 60-65°С» обусловлен необходимостью обеспечить экспрессность разрабатываемой технологии получения сухого экстракта, поскольку более высокая температура высушивания позволяет сократить продолжительность данного процесса, но при этом не действовать губительно на полученные биологически активные вещества.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве исходного сырья используют воздушно-сухую траву Trifolium pratense L., которую измельчают с помощью мельницы лабораторной и просеивают через сито с диаметром 0,5-1 мм. 1 г измельченного сырья, свободно проходящего через сито с данным диаметром, смешивают с экстрагентом так, что на 1 г измельченного сырья приходится 20 мл экстрагента, причем в качестве экстрагента используют этиловый спирт 75% об. Сырье с экстрагентом в конической колбе вместимостью 200 мл помещают на водяную баню при действии ультразвука и при температуре 50°С, присоединяя колбу к обратному холодильнику, и производят экстрагирование в течение 50 минут однократно, после чего колбу охлаждают до комнатной температуры, доводят растворителем до первоначальной массы, перемешивают и фильтруют. Затем отделяют фильтрат, упаривают до 1/5 исходного объема и обрабатывают последовательно водой очищенной для удаления балластных веществ и этиловым спиртом 50% об. для извлечения действующих веществ. Полученные фракции сгущают на водяной бане и направляют на сушку в сушильном шкафу при температуре 60-65°С до остаточного влагосодержания в экстракте не более 5% об.

Пример. Указанным способом был получен сухой экстракт Trifolium pratense L., являющийся источником флавоноидов. В системах in vitro были протестированы антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства полученного экстракта.

Показана высокая активность сухого экстракта Trifolium pratense L. в отношении процессов свободнорадикального окисления (64,14±2,78%), что может быть связано с высоким содержанием разнообразных групп фенольных соединений, в особенности флавоноидов (2,67 мас.%), и их способностью влиять на изучаемый процесс.Установленная антиоксидантная активность сухого экстракта Trifolium pratense L. подтверждает возможность использования полученного средства в качестве природного антиоксиданта.

На модели моноцитов периферической крови человека показана иммуномодулирующая активность экстракта (табл.1), обусловленная подавлением растворами сухого экстракта клевера провоспалительных цитокинов. Установлено, что растворы сухого экстракта клевера подавляют продукцию IFNγ во всех разведениях [10,0; 5,0; 2,5 мг/мл]: 10,0 мг/мл - в 4,4 раза (25,0±0,7 пг/мл), 5,0 мг/мл - в 3,6 раза до 30,2±0,8 пг/мл, 2,5 мг/мл - в 3,5 раза (31,1±0,6 пг/мл). Концентрация TNFα снижается практически на три порядка при влиянии раствора экстракта 10,0 мг/мл с 57,2±0,3 пг/мл в контроле до 21,0±0,3 пг/мл в опытных пробах, при влиянии концентраций 5,0 и 2,5 мг/мл ингибирующий эффект сохраняется. Данное ингибирующее действие наблюдается и при оценке влияния растворов изучаемых экстрактов в различных концентрациях на продукцию IL-6 лимфоцитами, содержание которого в опытных пробах снижается в 2-3 раза по сравнению с контролем.

Литература

1. Бабаскин, В.С./ Клевера европейской части России и их лекарственное применение: автореф. дис.док. фарм.

2. Данилец М.Г. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью (Патент РФ №2421232) / М. Г. Данилец, А. М. Гурьев, Н. В. Вельская, М. В. Белоусов, Ю. П. Вельский, М.С. Юсубов, Е. С. Трофимова, В. И. Агафонов, Е.Г. Учасова, А. А Лигачева - 2011 г.

3. Компанцев, В.А. Способ получения средства, обладающего антисклеротической и желчегонной активностью (Патент РФ №2068269). / В.А. Компанцев, М.С.Лукьянчиков, А.Л. Казаков. - 1993 г.

4. Нгуен Тхи Шен. Разработка технологии лекарственного средства с фитосубстанцией из клевера лугового травы: автореф. дисс. … канд. биол. наук. - Санкт-Петербург, 2020. - 24 с.

5. Прокопьева, Л.А. Гемореологическое средство и способ его получения (Патент РФ №2279287) / Л.А. Прокопьева. - 2006 г.

6. Рябинина, Е.И. Новый подход в оценке антиоксидантной активности растительного сырья при исследовании процесса аутоокисления адреналина / Е.И. Рябинина, Е.Е. Зотова, Е.Н. Ветрова [и соавт.] // Химия растительного сырья.-2011.-№3.-С.117-121.

7. Сепиашвили Р.И. От иммунотерапии к персонализированной таргетной иммуномодулирующей терапии и иммунореабилитации // Аллергология и иммунология. 2015. Т. 16. №4. С.323-327. наук. - Москва. - 1993. - 50 с

8. Симбирцев А.С., Тотолян А.А. Цитокины в лабораторной диагностике // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2015. №2. С.82-98.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения экстракта из травы Trifolium pratense L., обладающего антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью. Способ получения средства, обладающего антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, из травы Trifolium pratense L., заключающийся в получении экстракта, включающий загрузку расчетного количества сырья с размером частиц 0,5-1,0 мм в экстрактор, который далее наполняют экстрагентом - этиловым спиртом 75% об. в соотношении сырье: экстрагент 1:20, экстрагируют в течение 50 минут при температуре 50°С на ультразвуковой бане, полученное извлечение упаривают в вакууме до 1/5 исходного объема, после чего вытяжку обезвоживают, очищают, сгущают и направляют на сушку до остаточного влагосодержания в продукте не более 5% об., при этом вытяжку очищают последовательно водой очищенной для удаления балластных веществ и этиловым спиртом 50% об. для извлечения действующих веществ, а сушку экстракта осуществляют при температуре выше 60 и до 65°С. Экстракт, полученный вышеописанным способом, характеризуется содержанием флавоноидов 2,67 мас.%, обладает антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами. 1 табл.

Способ получения средства, обладающего антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью, из травы Trifolium pratense L., заключающийся в получении экстракта, включающий загрузку расчетного количества сырья с размером частиц 0,5-1,0 мм в экстрактор, который далее наполняют экстрагентом - этиловым спиртом 75% об. в соотношении сырье: экстрагент 1:20, экстрагируют в течение 50 минут при температуре 50°С на ультразвуковой бане, полученное извлечение упаривают в вакууме до 1/5 исходного объема, после чего вытяжку обезвоживают, очищают, сгущают и направляют на сушку до остаточного влагосодержания в продукте не более 5% об., отличающийся тем, что вытяжку очищают последовательно водой очищенной для удаления балластных веществ и этиловым спиртом 50% об. для извлечения действующих веществ, а сушку экстракта осуществляют при температуре выше 60 и до 65°С.