ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/775 A61K35/28 A61P37/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к выделенной мезенхимальной стволовой клетке и к клеточной композиции, содержащей указанные мезенхимальные стволовые клетки. Более того, клеточную композицию по настоящему изобретению можно применять при лечении связанных с иммунной системой заболеваний и воспалительных процессов для модуляции иммунной системы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) представляют собой мультипотентные стволовые клетки, характеризующиеся самообновлением, производством популяций клональных клеток и многолинейной дифференцировкой. Они существуют почти во всех тканях и играют значительную роль в восстановлении и регенерации тканей. В дополнение, MSC обладают широкими иммунорегуляторными свойствами посредством взаимодействия с иммунными клетками как врожденной, так и адаптивной иммунной системы, что приводит к иммуносупрессии различных эффекторных функций. Они проявляют свои иммуномодулирующие функции посредством прямых межклеточных контактов, секреции цитокинов и/или комбинации обоих механизмов.

Механизмы взаимодействий MSC с иммунным ответом являются многофакторными и осуществляются посредством прямых межклеточных контактов, секреции цитокинов и/или комбинации обоих механизмов. MSC обладают способностью взаимодействовать со многими видами иммунных клеток, в том числе с В-клетками, Т-клетками, дендритными клетками (DC), клетками-естественными киллерами (NK), нейтрофилами и макрофагами. С другой стороны, взаимодействия, в основе которых лежит функция межклеточного контакта, зависят от секреции растворимых иммунных факторов, индуцирующих MSC-регулируемую иммуносупрессию. Данные специфические модуляторы, в том числе множество иммуномодулирующих факторов, цитокинов и факторов роста, модулируют воспалительные ответы и обеспечивают баланс в иммунных профилях.

Хотя MSC, и в частности аллогенные MSC, обладают большим потенциалом для клеточной терапии при многих заболеваниях, эффективность заживления тканей и/или исход заболевания не гарантированы, поскольку в результате иммунного ответа у организма-реципиента происходит отторжение данных клеток. Были предприняты многочисленные попытки усовершенствовать иммуносупрессивные потенциалы MSC и продлить их приживление, например, путем отбора конкретных MSC.

В документе US 20110311496 предложены композиции на основе MSC для стимуляции заживления ран или заживления переломов и способы стимуляции заживления ран или заживления переломов, предусматривающие стадии введения MSC в эффективном количестве.

В документе US 20140017787 предложены выделенные простимулированные MSC, которые избирательно стимулируют или супрессируют воспаление, а также способы их получения и применения. В публикации US’ 787 используют стимуляцию конкретных Toll-подобных рецепторов, которые влияют на иммуномодулирующие ответы MSC, для осуществления единообразной подготовки клеток с целью усовершенствования способов терапии на основе стволовых клеток.

В публикации ЕР 3429360 предложен способ отбора MSC, обладающих повышенной эффективностью, и доноров, чьи MSC обладают повышенной эффективностью, на основе экспрессии одного или нескольких маркеров.

В публикации EP 1066052 раскрыт способ уменьшения иммунного ответа на трансплантат у реципиента путем обработки указанного реципиента количеством MSC, эффективным для уменьшения или ингибирования отторжения трансплантата организмом-реципиентом. В EP ‘052 большое внимание уделяют ингибированию Т-клеточного ответа на аллоантиген.

Тем не менее, в данной области техники все еще остается потребность в усовершенствованных иммуномодулирующих MSC с высокой терапевтической безопасностью и эффективностью.

Целью настоящего изобретения является получение выделенных MSC, характеризующихся конкретными связанными с иммунной системой свойствами в репрезентативной воспалительной среде.

СУТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящим изобретением предусмотрены выделенные MSC по пункту 1 формулы изобретения.

Во втором аспекте настоящим изобретением предусмотрена клеточная композиция по пункту 7 формулы изобретения, содержащая выделенные MSC.

В последнем аспекте настоящим изобретением предусмотрена клеточная композиция для применения при лечении связанных с иммунной системой заболеваний и воспалительных процессов по пункту 12 формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 показано графическое представление результатов экспериментов по твердофазному иммуноферментному анализу (ELISA), в которых оценивали повышенную секрецию PgE2 клетками MSC и PBMC.

На фигуре 2 показано графическое представление результатов экспериментов по ELISA, в которых регистрировали повышенную экспрессию TGF-β клетками MSC.

На фигуре 3 показано графическое представление результатов экспериментов по ELISA, в которых оценивали повышенную секрецию IL-6 клетками MSC и PBMC.

На фигуре 4 показано графическое представление результатов экспериментов по ELISA, в которых визуализировали сниженную экспрессию TNF-α клетками PBMC.

На фигуре 5 видно отсутствие молекул MHC II класса на MSC, выделенных от лошади.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным MSC с конкретными иммуномодулирующими характеристиками. Более конкретно, настоящее изобретение относится к клеточным композициям, содержащим указанные выделенные MSC, и их применению для лечения связанных с иммунной системой заболеваний и воспалительных процессов.

Выделенные MSC по настоящему изобретению обладают иммуномодулирующими свойствами и поэтому являются востребованными для клеточной трансплантации, поскольку позволяют избежать возникновения иммуногенных реакций у организма-реципиента.

Если не указано иное, то все термины, используемые в описании настоящего изобретения, в том числе технические и научные термины, имеют такое значение, в котором их обычно понимает специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Определения терминов включены как дополнительное руководство для лучшего понимания идей настоящего изобретения.

В рамках данного документа следующие термины имеют следующие значения.

Форма единственного числа, используемая в данном документе, относится как к одиночным, так и к множественным упоминаемым объектам, если из контекста явным образом не следует иное. В качестве примера, термин «компартмент» относится к одному или более чем к одному компартменту.

Термин «приблизительно», используемый в данном документе, относящийся к такой измеримой величине, как параметр, количество, длительность во времени и т. п., подразумевается как охватывающий изменения +/–20% или меньше, предпочтительно +/–10% или меньше, более предпочтительно +/–5% или меньше, еще более предпочтительно +/–1% или меньше и даже еще более предпочтительно +/–0,1% или меньше, от указанной величины и до тех пор, пока такие изменения соответствуют выполнимости раскрытого изобретения. Однако следует понимать, что значение, к которому относится модификатор «приблизительно», само также раскрывается отдельно.

Термины «содержать», «содержащий», и «содержит», и «состоит из», используемые в данном документе, являются синонимами терминов «включать», «включающий», «включает» или «вмещать», «вмещающий», «вещает» и представляют собой инклюзивные, или неограничивающие, термины, которые определяют наличие того, что следует за ними, например компонента, и не исключают или не препятствуют наличию дополнительных неперечисленных компонентов, признаков, элементов, деталей и стадий, известных из уровня техники или раскрытых в данном документе.

Приведение числовых диапазонов по крайним значениям включает все числа и доли, заключенные в пределах такого диапазона, а также приведенные крайние значения.

Определения

Термин «выделенный» относится как к физической идентификации, так и к выделению клеток из культуры клеток или биологического образца, такого как кровь, что можно осуществить с применением соответствующих методик клеточной биологии, которые основаны либо на инспектировании культур клеток, либо на изучении характеристик (и физическом отделении, если это возможно и необходимо) клеток, соответствующих критериям, либо на автоматической сортировке клеток по наличию/отсутствию антигенов и/или по размеру клеток (например, с помощью FACS). В некоторых вариантах осуществления термины «осуществлять выделение» или «выделение» могут включать дополнительную стадию физического отделения и/или количественной оценки клеток, особенно путем проведения проточной цитометрии.

Термин «мезенхимальная стволовая клетка» или «MSC» относится к мультипотентным, самообновляющимся клеткам, которые экспрессируют конкретный набор поверхностных антигенов и могут дифференцироваться в различные типы клеток, в том числе без ограничения в адипоциты, хондроциты и остеоциты, при культивировании in vitro или при нахождении в условиях in vivo.

Используемый в данном документе термин «воспалительная среда» или «воспалительное состояние» относится к статусу или состоянию, характеризующемуся (i) увеличением количества по меньшей мере одного типа провоспалительной иммунной клетки, провоспалительного цитокина или провоспалительного хемокина; и (ii) уменьшением количества по меньшей мере одного типа противовоспалительной иммунной клетки, противовоспалительного цитокина или противовоспалительного хемокина. Предпочтительно, используемый в данном документе термин «воспалительная среда» или «воспалительное состояние» предусматривает по меньшей мере 15% пролиферирующих Т-лимфоцитов, причем к указанным лимфоцитам относятся по меньшей мере Т-хелперные (Th)1 и Th2 клетки, и они продуцируют по меньшей мере 7 пг на мл TNF-α и/или 13 пг на мл TGF-β.

Термины «противовоспалительный», «антивоспалительный», «иммунодепрессивный» и «иммуносупрессивный» относятся к любому статусу или состоянию, характеризующемуся уменьшением по меньшей мере одного признака локализованного воспаления (такого как без ограничения жжение, боль, отек, покраснение и утрата функции) и/или к изменению системного статуса, характеризующемуся (i) уменьшением количества по меньшей мере одного типа провоспалительной иммунной клетки, провоспалительного цитокина или провоспалительного хемокина; и (ii) увеличением количества по меньшей мере одного типа противовоспалительной иммунной клетки, противовоспалительного цитокина или противовоспалительного хемокина.

Термин «мононуклеары периферической крови» или «PBMC» по настоящему изобретению охватывает любые клетки периферической крови, являющиеся лимфоцитами (Т-лимфоцитами, B-лимфоцитами и клетками-естественными киллерами (NK)) и моноцитами. В настоящем изобретении предпочтительно по меньшей мере 20,5% указанных Т-лимфоцитов являются положительными в отношении CD3 и/или по меньшей мере 19,8% указанных В-лимфоцитов являются положительными в отношении CD138.

Используемый в данном документе термин «положительный» относится к наличию на поверхности клетки, внутриклеточных и/или секретируемых биологически активных молекул и/или биологических маркеров. Предпочтительно, клетка или клеточная композиция по настоящему изобретению при измерении является положительной по биологически активной молекуле и/или биологическому маркеру, если значение каждого составляет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%, или от 60% до 99%, или от 70% до 90%.

Используемый в данном документе термин «отрицательный» относится к отсутствию на поверхности клетки, внутриклеточных и/или секретируемых биологически активных молекул и/или биологических маркеров. Предпочтительно, клетка или клеточная композиция по настоящему изобретению при измерении является отрицательной по биологически активной молекуле и/или биологическому маркеру, если значение каждого составляет менее 20%, менее 15%, менее 10%, менее 5% или менее 2%.

«Время удвоения популяции» или «PDT» по настоящему изобретению следует рассчитывать по следующей формуле: PDT = ln(N_f/N_i)/ln(2), где N_f обозначает конечное количество клеток после открепления клеток, а N_i обозначает начальное количество клеток в нулевой момент времени.

Под термином «антикоагулянт» подразумевают композицию, которая может ингибировать свертывание крови. Примеры антикоагулянтов, применяемых в настоящем изобретении, включают EDTA или гепарин.

Термин «лейкоцитарная пленка» в настоящем изобретении следует понимать как фракцию несвернувшейся крови, предпочтительно полученную посредством центрифугирования в градиенте плотности, в результате чего данная фракция обогащена лейкоцитами и тромбоцитами.

Термин «межфазная фракция крови» следует понимать как ту фракцию крови, предпочтительно полученную с помощью градиента плотности, которая расположена между нижней фракцией, в основном состоящей из эритроцитов и полиморфно-ядерных клеток, и верхней фракцией, в основном состоящей из плазмы крови. Межфазная фракция крови является источником мононуклеаров крови (BMC), куда входят моноциты, лимфоциты и MSC.

Используемый в данном документе термин «суспензионный диаметр» понимают как средний диаметр клеток, когда они находятся в суспензии. Способы измерения диаметров известны в уровне техники. Возможными способами являются проточная цитометрия, конфокальная микроскопия, цитометрия изображений или другие способы, известные в уровне техники.

Термины «пациент», «субъект», «животное» или «млекопитающее» используют взаимозаменяемо, и они относятся к подлежащему лечению млекопитающему.

Термин «индукция» или «индуцированный» следует понимать как процесс активации специфичных для типа клеток генов или молекул в мультипотентной или плюрипотентной клетке, тем самым переводя такую клетку в состояние более определенной, специализированной или дифференцированной клеточной линии или клеточного типа.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает минимальное количество или минимальную концентрацию соединения или композиции, которые эффективны для уменьшения симптомов или облегчения состояния заболевания.

Термин «лечение» относится как к терапевтическим, так и к профилактическим или превентивным мерам для уменьшения или предотвращения патологических состояний или нарушений.

Термин «in vitro», используемый в данном документе, означает внешний или наружный по отношению к организму. Термин «in vitro», используемый в данном документе, следует понимать как включающий «ex vivo». Термин «ex vivo» обычно относится к тканям или клеткам, удаленным из организма и поддерживаемым или размноженным вне организма, например в культуральном сосуде или биореакторе.

Описание

Настоящее изобретение относится к конкретному типу MSC, композициям, содержащим такие MSC, и их клиническому применению.

В первом аспекте настоящим изобретением предусмотрена выделенная MSC, причем указанная клетка при измерении является положительной в отношении мезенхимальных маркеров CD29, CD44 и CD90 и отрицательной в отношении молекул МНС II класса. Если указанная клетка присутствует в воспалительной среде или при воспалительном состоянии, она секретирует иммуномодулирующий цитокин PgE2.

Воспалительные среды или состояния характеризуются рекрутингом иммунных клеток крови. К медиаторам воспаления относятся простагландины, воспалительные цитокины, такие как IL-1β, TNF-α, IL-6 и IL-15, хемокины, такие как IL-8, и другие воспалительные белки, такие как TNF-α, IFN-γ. Данные медиаторы преимущественно продуцируются моноцитами, макрофагами, Т-клетками, В-клетками для рекрутинга лейкоцитов в участок воспаления и последующей стимуляции сложной сети стимулирующих и ингибирующих взаимодействий для одновременного разрушения и восстановления ткани от воспалительного процесса.

Простагландин E2 (PgE2) является подтипом семейства простагландинов. PgE2 синтезируется из арахидоновой кислоты (AA), высвобождаемой из мембранных фосфолипидов в ходе последовательных ферментативных реакций. Циклооксигеназа-2 (COX-2), известная под названием синтаза простагландинэндопероксидазы, превращает AA в простагландин H₂ (PgH₂), а PgE₂-синтаза изомеризирует PgH₂ в PgE₂. Как ограничивающий скорость фермент СОХ-2 контролирует синтез PgE₂ в ответ на физиологические условия, в том числе стимуляцию факторами роста, воспалительными цитокинами и стимуляторами опухолевого роста.

В конкретном варианте осуществления указанные MSC, присутствующие в воспалительной среде, секретируют растворимый иммунный фактор простагландин Е2 (PgE2) в концентрации, находящейся в диапазоне от 10³ до 10⁶ пикограмм на мл, индуцируя MSC-регулируемую иммуносупрессию.

Секреция PgE2 из MSC в этих конкретных диапазонах концентраций стимулирует противовоспалительные процессы in vitro и вместе с их способностью дифференцироваться в соответствующие типы клеток делает их востребованными для клеточной трансплантации.

Выделенные MSC по настоящему изобретению характеризуются наличием мезенхимальных маркеров CD29, CD44 и CD90. Посредством последнего можно анализировать степень чистоты полученных MSC и можно определить процентное содержание MSC.

CD29 представляет собой рецептор клеточной поверхности, кодируемый геном интегрина бета 1, причем данный рецептор формирует комплексы с другими белками, регулируя физиологические активности при связывании лигандов. Антиген CD44 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности, задействуемый в межклеточных взаимодействиях, адгезии и миграции клеток. В дополнение, CD44 является рецептором для гиалуроновой кислоты и может также взаимодействовать с другими лигандами, такими как остеопонтин, коллагены и матриксные металлопротеиназы (MMP). Антиген CD90 является консервативным белком на клеточной поверхности, который считается маркером для стволовых клеток, например MSC. Выделенная MSC по настоящему изобретению, являющаяся трижды положительной в отношении CD29/CD44/CD90, позволяет специалисту в данной области быстро и однозначно отобрать MSC и получить биологические свойства MSC, которые представляют интерес для дополнительных последующих применений.

В конкретном варианте осуществления MSC по настоящему изобретению при измерении являются положительными в отношении виментина, фибронектина, Ki67 или их комбинации, которые являются типичными маркерами MSC.

Более того, выделенная MSC по настоящему изобретению характеризуется отсутствием молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса, предпочтительно всех в настоящее время известных молекул МНС II класса, классифицируя клетку как клетку, которую можно применять при клеточной терапии на млекопитающих, такой как клеточная терапия на лошадях. Даже когда выделенные MSC являются частично дифференцированными, MSC остаются отрицательными в отношении молекул MHC II класса.

MSC обычно экспрессируют на своей поверхности антиген MHC I класса, но ограниченное количество MHC II класса. В отдельном варианте осуществления выделенная MSC по настоящему изобретению при измерении также является отрицательной в отношении маркера MHC I класса. В наиболее предпочтительном варианте осуществления указанная MSC при измерении является отрицательной в отношении маркеров MHC I и II класса, причем указанная клетка проявляет фенотип с чрезвычайно низкой иммуногенностью.

Данные иммунологические свойства MSC ограничивают способность иммунной системы реципиента распознавать и отторгать клетки, предпочтительно аллогенные клетки, после клеточной трансплантации. Продуцирование клетками MSC факторов, которые модулируют иммунный ответ, вместе с их способностью дифференцироваться в соответствующие типы клеток под действием локальных стимулов, делает их востребованными стволовыми клетками для клеточной терапии.

В другом и дополнительном варианте осуществления MSC при измерении являются отрицательному в отношении антигена CD45, маркера для гемопоэтических клеток.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления выделенная MSC при измерении является:

- положительной в отношении мезенхимальных маркеров CD29, CD44 и CD90;

- положительной в отношении одного или нескольких маркеров, входящих в группу, состоящую из виментина, фибронектина, Ki67 или их комбинации;

- отрицательной в отношении молекул MHC I и/или II класса и

- отрицательной в отношении гемопоэтического маркера CD45,

причем если указанная клетка присутствует в воспалительной среде или воспалительном состоянии, то она секретирует иммуномодулирующий цитокин PgE2 в концентрации от 10³ до 10⁶ пикограмм на мл.

В целом, для изучения характеристик MSC подходящими можно считать любые опубликованные в литературе технологии по идентификации и изучению характеристик клеточных маркеров для конкретного типа клеток (например, мезенхимальных, печеночных, гемопоэтических, эпителиальных, эндотелиальных маркеров) или с определенной локализацией (например, внутриклеточных, на клеточной поверхности или секретируемых). Такие технологии можно сгруппировать в две категории: технологии, которые позволяют сохранить целостность клеток во время анализа, и технологии, основанные на экстрактах (содержащих белки, нуклеиновые кислоты, мембраны и т. д.), которые получают с применением таких клеток. Среди технологий по идентификации таких маркеров и по измерению их как положительных или отрицательных предпочтительными являются иммуноцитохимия или анализ среды клеточной культуры, поскольку они позволяют выявлять маркеры даже с низким количеством клеток без их разрушения (как это было бы в случае вестерн-блоттинга или проточной цитометрии).

Соответствующие биологические признаки выделенных MSC можно идентифицировать с помощью таких технологий, как проточная цитометрия, иммуноцитохимия, масс-спектрометрия, гель-электрофорез, иммуноанализ (например, иммуноблоттинг, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация, ELISA), амплификация нуклеиновых кислот (например, RT-PCR в режиме реального времени), определения ферментативной активности, технологии различных «омиков» (протеомика, липидомика, гликомика, транскриптомика, метаболомика) и/или определение другой биологической активности.

В предпочтительном варианте осуществления, если MSC присутствует в воспалительной среде или при воспалительном состоянии, то она характеризуется повышенной секрецией по меньшей мере одной из молекул, выбранных из IL-6, IL-10, TGF-β, NO или их комбинации, и пониженной секрецией IL-1. Сравнение можно проводить с мезенхимальной стволовой клеткой, имеющей те же характеристики, что и представленные выше, но которая не подвергается влиянию указанной воспалительной среды или указанного воспалительного состояния.

Предпочтительно, MSC характеризуется повышенной секрецией PgE2 в комбинации с двумя или более из вышеупомянутых факторов.

PgE2, IL-6, IL-10, TGF-β и NO способствуют ингибированию пролиферации и функции основных популяций иммунных клеток, таких как Т-клетки и В-клетки. Кроме того, MSC характеризуются низкими уровнями экспрессии молекул MHC I класса и/или являются отрицательными в отношении молекул MHC II класса на своей поверхности, что позволяет избежать иммуногенных реакций. Кроме того, выделенные MSC по настоящему изобретению могут супрессировать пролиферацию лейкоцитов за счет повышенной секреции у них вышеупомянутых факторов, что, опять же, помогает избежать иммуногенных реакций у организма-реципиента.

MSC согласно настоящему изобретению могут происходить из различных тканей или жидкостей организма, в том числе без ограничения костного мозга, жировой ткани, мышечной ткани, пуповинной крови, периферической крови, печени, плаценты, кожи, амниотической жидкости. Предпочтительно, MSC происходят из крови, более предпочтительно из периферической крови. MSC по настоящему изобретению можно получить с помощью любого стандартного протокола, известного в уровне техники.

В одном варианте осуществления указанные MSC можно получить посредством способа, при котором MSC выделяют из крови или кровяной фазы и при котором указанные клетки культивируют и размножают в среде с низким содержанием глюкозы.

В одном варианте осуществления такой способ может предусматривать следующие стадии:

a. сбор одного или более образцов крови от доноров в покрытый антикоагулянтом флакон для образцов;

b. центрифугирование образцов крови с получением 3-фазного распределения, состоящего из плазменной фазы, лейкоцитарной пленки и эритроцитарной фазы;

c. сбор лейкоцитарной пленки и ее загрузку на градиент плотности;

d. сбор межфазной фракции крови, полученной с помощью градиента плотности на стадии с);

e. выделение MSC из межфазной фракции крови с помощью центрифугирования;

f. посев от 2,5 x 10⁵/см² до 5 x 10⁵/см² MSC в культуру и содержание их в среде для выращивания с низким содержанием глюкозы, дополненной дексаметазоном, антибиотиками и сывороткой крови.

Количество при посеве является крайне важным для получения в конечном итоге чистой и жизнеспособной популяции MSC в приемлемой концентрации, поскольку слишком плотный посев приведет к массовой гибели клеток в ходе размножения и неоднородной популяции MSC, а слишком диспергированный посев приведет к образованию небольшого количества или к отсутствию образования колоний MSC, так что размножение будет невозможным или маловозможным, или оно займет слишком много времени. В обоих случаях это отрицательно повлияет на жизнеспособность клеток.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные MSC обладают высокой жизнеспособностью клеток, причем жизнеспособными являются по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100% указанных клеток.

Межфазная фракция крови является источником мононуклеаров крови (BMC), куда входят моноциты, лимфоциты и MSC. Предпочтительно, лимфоциты вымывают при 37°C, при этом моноциты в отсутствие цитокинов, необходимых для поддержания их в живом состоянии, погибают за 2 недели. Таким образом производят очистку MSC. Выделение MSC из межфазной фракции крови предпочтительно производят посредством центрифугирования межфазной фракции крови, после чего осадок клеток промывают по меньшей мере один раз подходящим буфером, таким как фосфатный буфер.

В дополнительном варианте осуществления выделенные MSC по настоящему изобретению являются отрицательными в отношении моноцитов и макрофагов, как первые, так и вторые имеют содержание в диапазоне от 0% до 7,5%.

В частности, мезенхимальные клетки выдерживают в питательной среде по меньшей мере 2 недели. Предпочтительно применять питательную среду с 1% дексаметазона, поскольку в указанной среде сохраняются характерные особенности выделенных MSC.

Спустя минимальный период в 2 недели (14 дней), предпочтительно 3 недели (21 день), колонии MSC станут видны в бутылях для культивирования. На следующей стадии g) по меньшей мере 6 x 10³ стволовых клеток/см² переносят в среду для размножения с низким содержанием глюкозы, содержащую сыворотку и антибиотики, с целью размножения MSC. Предпочтительно, рост MSC займет минимум пять пассажей клеток. Таким образом можно получить достаточное количество клеток. Предпочтительно, клетки разделяют при конфлюэнтности от 70% до 80%. MSC можно поддерживать в культуре до 50 пассажей. После этого возникает риск потери жизнеспособности, старения или формирования мутаций.

В дополнительном варианте осуществления время удвоения популяции (PDT) между каждым пассажем во время размножения выделенной MSC должно составлять от 0,7 до 3 дней после трипсинизации.

Указанное PDT между каждым пассажем во время размножения выделенных MSC предпочтительно составляет от 0,7 до 2,5 дней после трипсинизации.

В предпочтительном варианте осуществления выделенная MSC имеет веретенообразную морфологию.

По результатам изучения морфологических характеристик выделенной MSC по настоящему изобретению клетку классифицируют как удлиненную, фибробластоподобную, веретенообразную клетку. Данный тип клеток отличается от других популяций MSC небольшими самообновляющимися клетками, которые обнаруживаются в основном с треугольной или звездообразной формой клеток, и популяциями MSC с большой, кубовидной или уплощенной структурой с выступающим ядром. Отбор MSC с данной конкретной морфологической характеристикой наряду с биологическими маркерами позволяет специалисту в данной области выделить MSC по настоящему изобретению. Морфологический анализ клеток может быть легко произведен специалистом в данной области с помощью фазово-контрастной микроскопии. Кроме того, размер и гранулярность MSC можно оценить с помощью диаграмм прямого и бокового рассеяния в проточной цитометрии или других методик, известных специалисту в данной области.

При необходимости, выделенные MSC можно индуцировать или заставить дифференцироваться во взрослые клетки. Индукцию или дифференцировку предпочтительно производят путем добавления в среду клеток конкретных факторов роста и/или других факторов дифференцировки и/или индуцирующих факторов. Природа этих факторов существенно будет зависеть от дифференцировки и требуемого типа взрослых клеток. В предпочтительном варианте осуществления MSC согласно настоящему изобретению можно заставить дифференцироваться в теноциты, хондроциты, остеоциты, миоциты, адипоциты или фибробласты. Дифференцировка in vitro приводит к увеличению экспрессии MHC I и II классов. Таким образом, большое значение имеет то, что наш протокол дифференцировки не демонстрировал увеличения уровня этих маркеров. Тогда как у MSC экспрессия MHC II класса отсутствовала полностью, у MSC имели место низкие уровни экспрессии MHC I класса.

В более предпочтительном варианте осуществления MSC характеризуется суспензионным диаметром от 10 мкм до 100 мкм.

Выделенные MSC по настоящему изобретению были отобраны по размеру/суспензионному диаметру. Предпочтительно, MSC имеют размер клеток от 10 до 100 мкм, более предпочтительно от 15 до 80 мкм, более предпочтительно от 20 до 75 мкм, более предпочтительно от 25 до 50мкм. Предпочтительно, отбор клеток по размеру клеток происходит на стадии фильтрации. Например, выделенные MSC с концентрацией клеток в диапазоне от 10⁴ до 10⁷ MSC на мл, причем указанные клетки предпочтительно разведены средой DMEM с низким содержанием глюкозы, отбирают по размеру посредством системы фильтрации, при этом клетки пропускают через стадию двойной фильтрации с применением 40-мкм фильтра. Предпочтительны стадии двойной или множественной фильтрации. Последняя обеспечивает получение пиковой популяции одиночных клеток и позволяет избежать наличия клеточных агрегатов. Такие клеточные агрегаты могут вызывать гибель клеток во время сохранения клеток путем замораживания и в итоге могут повлиять на дополнительные последующие применения клеток. Например, клеточные агрегаты могут повышать риск возникновения капиллярной эмболии при внутривенном введении.

В дополнительном варианте осуществления выделенная MSC индуцирует секрецию PgE2, IL-6, IL-10, NO или их комбинации и/или ингибирует секрецию TNF-α, IFN-γ, IL-1 или их комбинации у PBMC.

В воспалительной среде MSC секретируют множество факторов, которые модулируют иммунный ответ у организма-реципиента. В дополнение, MSC оказывают стимулирующий эффект с индукцией секреции одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из PgE2, IL-6, IL-10, NO или их комбинации. Помимо стимулирующего эффекта MSC в отношении PBMC в воспалительной среде, MSC также оказывают ингибирующий эффект на секрецию у PBMC, что приводит к снижению уровня одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из TNF-α, IFN-γ, IL-1 или их комбинации. MSC оказывают регулирующий эффект в воспалительной среде, что делает их применимыми при лечении всех видов заболеваний, особенно нарушений со стороны иммунной системы.

В предпочтительном варианте осуществления иммуномодулирующие активности MSC в воспалительной среде являются оптимальными, когда MSC и PBMC присутствуют в соотношении от 1:0,001 до 1:1000. Особенно предпочтительное соотношение между MSC и PBMC составляет 1:500, более предпочтительно 1:100, более предпочтительно 1:10.

В особенно предпочтительном варианте осуществления MSC выделена из крови, предпочтительно периферической крови. Кровь представляется оптимальным источником MSC. Кровь является не только неинвазивным и безболезненным источником, но также проста и безопасна для сбора и, следовательно, легкодоступна. Кровь может иметь происхождение от всевозможных млекопитающих, особенно лошади, человека, кошки, собак, грызунов и т. д. Предпочтительно, указанное происхождение — от лошади.

Во втором аспекте настоящим изобретением предусмотрена клеточная композиция, содержащая по меньшей мере 60% выделенных MSC по настоящему изобретению, причем по меньшей мере 95% указанных клеток представляют собой одиночные клетки.

Предпочтительно, указанная композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 90% MSC. Более предпочтительно, клеточная композиция содержит по меньшей мере 95% MSC, более предпочтительно по меньшей мере 99%. В одном варианте осуществления указанная клеточная композиция представляет собой чистую композицию, содержащую 100% MSC согласно настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция содержит по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% одиночных клеток. Предпочтительно, указанные клетки характеризуются суспензионным диаметром от 10 мкм до 100 мкм, одноклеточная природа клеток и диаметр клеток являются крайне важными для любого последующего применения, такого как клеточная терапия, и для жизнеспособности клеток.

В более предпочтительном варианте композиции выделенные MSC при измерении являются положительными в отношении CD29 со значением в диапазоне от 95% до 100%, CD90 в диапазоне от 95% до 100% и CD44 в диапазоне от 80% до 100%, более предпочтительно от 90% до 100%, наиболее предпочтительно от 95% до 100%, и при измерении являются отрицательными в отношении молекул MHC II класса со значением в диапазоне от 0% до 5%, более предпочтительно от 0% до 2%. Более того, MSC при измерении являются отрицательными в отношении молекул MHC I класса со значением в диапазоне от 0% до 60%, более предпочтительно от 0% до 50%, более предпочтительно от 0% до 45%. В дополнительном варианте осуществления композиции MSC при измерении являются отрицательными в отношении CD45 со значением в диапазоне от 0% до 7,5%.

В более предпочтительном варианте осуществления MSC, содержащиеся в композиции, характеризуются жизнеспособностью клеток по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, более предпочтительно 99%, более предпочтительно 100%.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к клеточной композиции, полученной путем дифференцировки композиции с MSC согласно любому из предыдущих вариантов осуществления, при этом клетками указанной клеточной композиции являются теноциты, хондроциты, остеоциты, миоциты, адипоциты, кератиноциты, нейроны или фибробласты.

В предпочтительном варианте осуществления клеточная композиция содержит терапевтически эффективное количество выделенных MSC, предпочтительно указанная композиция содержит от 10⁵ до 10⁷ указанных выделенных MSC на мл.

Минимальная терапевтически эффективная доза, которая дает терапевтический эффект для субъекта, составляет по меньшей мере 10⁵ выделенных MSC на мл. Указанные MSC могут быть разведены в клеточной композиции. Предпочтительно, клеточная композиция содержит от 10⁵ до 5 x 10⁵ выделенных MSC на мл.

В другом варианте осуществления клеточную композицию можно дополнить применяемыми компонентами, выбранными из группы, состоящей из богатой тромбоцитами плазмы крови (PRP), гиалуроновой кислоты, композиций на основе гиалуроновой кислоты, гликозаминогликанов или композиций на основе гликозаминогликанов. Смешивание композиции с такими веществами-носителями в некоторых случаях может быть целесообразным для повышения эффективности композиции или получения синергического эффекта. Например, указанные вещества-носители содействуют увеличению хоминг-индексов и иммуномодулирующим эффектам MSC в клеточной композиции.

В дополнительном варианте осуществления клеточной композиции выделенные MSC экспрессируют PgE2, IL-6, IL-10, TGF-β, NO или их комбинацию в присутствии PBMC.

В предпочтительном варианте осуществления клеточной композиции выделенные MSC индуцируют экспрессию pgE2, IL-6, IL-10, NO или их комбинации у PBMC и/или ингибируют секрецию TNF-α, IFN-γ, IL-1 или их комбинации у PBMC в присутствии PMC.

Выделенные MSC сохраняют свои биологические способности секретировать иммуномодулирующие факторы в присутствии PBMC. Опосредованный PBMC иммунный ответ после стимулирующего эффекта MSC, например секреция PgE2 или других факторов, имеет важнейшее значение для дополнительного иммуносупрессивного действия MSC.

Кроме того, важнейшим фактором является соотношение MSC и PBMC. Следовательно, более предпочтительный вариант осуществления клеточной композиции относится к присутствию MSC и PBMC в соотношении от 1:0,001 до 1:1000. Указанное соотношение MSC и PBMC составляет предпочтительно 1:500, более предпочтительно 1:100, более предпочтительно 1:10.

По результатам тестов in vitro было видно, что эти соотношения приводят к эффективной иммуномодуляции MSC в воспалительной среде. Такие же результаты ожидаются и in vivo, что приведет к эффективной и безопасной клеточной терапии.

В другом и дополнительном варианте осуществления клеточная композиция в присутствии PBMC будет экспрессировать PgE2 в концентрации от 10³ до 10⁶ пикограмм на мл.

Концентрация от 10⁵ до 10⁷, более предпочтительно от 10⁵ до 10⁶, выделенных MSC на мл в присутствии PBMC в указанной клеточной композиции отмечается секрецией иммуносупрессивного фактора PgE2, причем указанное количество клеток секретирует PgE2 в диапазоне от 10³ до 10⁶ пикограмм на мл. Чтобы в достаточной степени сдерживать иммунокомпетентные клетки предпочтительно, чтобы PgE2 в клеточной композиции секретировался клетками MSC в количестве от 10⁴ до 10⁵ пикограмм на мл.

В предпочтительном варианте осуществления клеточная композиция согласно настоящему изобретению составлена для введения субъекту посредством внутривенной, внутрисуставной, внутримышечной, внутриочаговой, внутриартериальной, местной, субконъюнктивальной инъекции или регионарной перфузии.

В отдельном варианте осуществления вышеупомянутые композиции можно применять для аллогенного введения субъекту. Аллогенное применение позволяет лучше контролировать качество MSC, поскольку скринингу можно подвергнуть различных доноров и можно подобрать оптимальных доноров. В свете получения функциональных MSC последнее является совершенно необходимым. Это контрастирует с аутологичным применением MSC, поскольку качество клеток в этом случае нельзя гарантировать.

Например, при выделении MSC из крови применяли кровь донора, который позже также был реципиентом своих выделенных MSC. В другом варианте осуществления применяют кровь от доноров, при этом донор предпочтительно принадлежит к той же семье, полу или расе, что и реципиент MSC, выделенных из крови доноров. В частности, эти доноры будут протестированы в отношении распространенных существующих передаваемых заболеваний или патологий во избежание риска горизонтальной передачи этих патологий или заболеваний через стволовые клетки. Предпочтительно, животных-доноров выдерживают на карантине. При использовании лошадей-доноров их можно, например, протестировать на следующие патологии, вирусы или паразиты: инфекционную анемию лошадей (EIA), ринопневмонит лошадей (EHV-1, EHV-4), вирусный артериит лошадей (EVA), вирус Западного Нила (WNV), африканскую чуму лошадей (AHS), случную болезнь (трипаносому), пироплазмоз лошадей, сап (malleus, сап), конский грипп, боррелиоз Лайма (LB) (Borrelia burgdorferi, болезнь Лайма).

Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно будет замороженной для того, чтобы сделать возможным долгосрочное хранение композиции. Предпочтительно, композицию будут замораживать при низкой и постоянной температуре, такой как температура ниже -20°C. Данные условия позволяют безопасно хранить композицию и позволяют клеткам в композиции сохранять свои биологические и морфологические характеристики, а также высокую их жизнеспособность во время хранения и после размораживания.

В более предпочтительном варианте осуществления клеточную композицию можно хранить в течение по меньшей мере 6 месяцев при максимальной температуре -80°C, необязательно в жидком азоте.

Очень важным фактором при замораживании MSC является композиция криогенной среды, в частности, концентрация DMSO. DMSO предотвращает образование кристаллов льда в среде во время процесса замораживания, но в высоких концентрациях может быть токсичным для клеток. В предпочтительном варианте осуществления концентрация DMSO составляет до 20%, более предпочтительно до 15%, более предпочтительно концентрация DMSO в криогене составляет 10%. Криогенная среда дополнительно содержит среду с низким содержанием глюкозы, такую как DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла) с низким содержанием глюкозы.

После этого клеточную композицию перед введением предпочтительно размораживают при температуре около комнатной температуры, предпочтительно при температуре от 20°C до 37°C, более предпочтительно при температуре от 25°C до 37°C и в течение периода времени максимум 20 минут, предпочтительно максимум 10 минут, более предпочтительно максимум 5 минут.

Более того, для сохранения жизнеспособности композиции композицию вводят в течение 2 минут после разморозки.

Предпочтительно, настоящее изобретение находит свое применение в области ветеринарии. Композицию можно вводить субъекту, при этом указанный субъект является млекопитающим, предпочтительно собакой, кошкой, лошадью или обезьяной.

В третьем аспекте настоящим изобретением предусмотрена клеточная композиция по настоящему изобретению для применения при лечении связанных с иммунной системой болезней и/или воспалительных процессов у субъекта, предпочтительно у субъекта-млекопитающего.

В частности, указанные связанные с иммунной системой болезни выбраны из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, атопического дерматита, видов аллергии, ревматоидного артрита и артрита; а указанные воспалительные процессы выбраны из группы, состоящей из дегенеративного заболевания суставов, остеоартрита, лихорадки, легочной астмы и тендинита.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клеточную композицию применяют при перечисленном выше лечении, причем за курс лечения вводится от 10⁵ до 10⁷ указанных выделенных MSC, причем указанное введение осуществляется предпочтительно посредством внутривенной, внутрисуставной, внутримышечной, внутриочаговой, внутриартериальной, местной, субконъюнктивальной инъекции или регионарной перфузии.

Далее настоящее изобретение описано с помощью следующих неограничивающих примеров, которые дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение и не предназначены, а также не могут быть интерпретированы для ограничения объема настоящего изобретения.

Примеры

Предполагается, что настоящее изобретение не ограничивается никакой из ранее описанных форм реализации, и что некоторые модификации могут быть добавлены в представленный пример изготовления без пересмотра приложенной формулы изобретения.

Пример 1. Количественная оценка секреции PgE2 выделенными MSC методикой иммуноанализа, ELISA

Мононуклеары периферической крови лошади (ePBMC) получали от лошади с хроническим воспалением сухожилия путем сбора 50 мл периферической крови в пробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) в качестве антикоагулянта. Пробирки с EDTA центрифугировали в течение 20 минут с последующим сбором лейкоцитарной пленки в стерильную 15-мл пробирку. Лейкоцитарную пленку дважды разводили фосфатным буфером, 1x PBS. Затем раствор обрабатывали перколлом (1,35 г/мл) и центрифугировали в течение 15 минут. Затем собирали межфазную фракцию и промывали ее 1x PBS путем центрифугирования в течение 8 минут и данную процедуру повторяли дважды. Осадок ресуспендировали и подсчитывали клетки. После подсчета РВМС сначала метили, высевали в 96-луночные планшеты и выращивали в среде для выращивания, содержащей бета-меркаптоэтанол, в присутствии MSC или без них. Высевали 25 x 10⁶ ePBMC на колбу (колба T75) в конкретном соотношении с MSC, причем указанное соотношение MSC и PBMC составляло 1:10. Спустя 96 часов инкубации получали супернатанты MSC и РВМС и использовали их для иммуноанализа. Наряду с тестируемым образцом, содержащим стимулированные PBMC и MSC, оценивали положительный и отрицательный контроль в отношении экспрессии секреции PgE2.

Секрецию PgE2 количественно оценивали с применением набора для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA, конкурентного ELISA (Enzo Life Sciences, Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США). На планшет для ELISA в течение ночи наносили покрытие моноклонального антитела к лошадиному PgE2, промывали и инкубировали с образцами, тестируемыми и контрольными образцами. Планшет снова промывали, инкубировали с меченным биотином моноклональным антителом к конскому PgE2, промывали, инкубировали с авидином, пероксидазой хрена, снова промывали, инкубировали с субстратом пероксидазы и считывали на 405 нм на планшет-ридере.

Как видно на фигуре 1, у MSC в воспалительной среде индуцировалась секреция PgE2, которая была оценена как увеличение свыше 500000 пг/мл клеток.

Пример 2. Количественная оценка секреции TGF-β и IL-6 клетками MSC и РВМС способом ELISA

Количественно оценивали секрецию TGF-β и IL-6 с применением набора для конкурентного ELISA (Cusabio, США). Методика конкурентного иммуноферментного анализа ингибирования следует тем же идеям, что и набор для конкурентного ELISA PgE2, который описан ранее в примере 1.

Отслеживали повышенную секрецию TGF-β и IL-6 клетками MSC, а также повышенную секрецию IL-6 у PBMC. На фигуре 2 видна увеличенная секреция TGF-β клетками MSC с почти удвоением концентрации TGF-β. Секреция IL-6 клетками MSC и РВМС была почти в восемнадцать раз выше, чем у отрицательного контроля, как видно на фигуре 3.

Пример 3. Количественная оценка экспрессии TNF-α клетками РВМС способом ELISA

Измеряли экспрессию TNF-α с применением набора для конкурентного ELISA (Invitrogen, США). На планшет для ELISA в течение ночи наносили покрытие моноклонального антитела к лошадиному TNF-α, промывали и инкубировали с образцами, тестируемыми и контрольными образцами. Планшет снова промывали, инкубировали с меченным биотином моноклональным антителом к конскому PgE2, промывали, инкубировали со стрептавидином-пероксидазой хрена, снова промывали, инкубировали с субстратом пероксидазы и считывали на 405 нм на планшет-ридере.

Количественно оценивали снижение секреции TNF-α клетками PBMC в присутствии MSC. Регуляторный эффект MSC ингибировал секрецию TNF-α у PBMC на треть, что было количественно выявлено как снижение с 231 пг/мл по 77 пг/мл, как видно на фигуре 4.

Пример 4. Иммунофенотипическая характеристика MSC способом проточной цитометрии

Для иммунофенотипической характеристики MSC оценивали экспрессию нескольких маркеров стволовых клеток способом проточной цитометрии. Экспрессию типичных белков отторжения, главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса оценивали на нативных MSC и MSC в воспалительной среде. В каждой серии использовали 4 x 10⁵ клеток и метили их первичными антителами, которые представляли собой мышиный IgG1 к лошадиному MHC II класса (Abd Serotec, 1:50). Клетки инкубировали с первичными антителами в течение 15 минут на льду в темноте и дважды промывали промывочным буфером, состоящим из DMEM с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Для идентификации положительных клеток после 15 минут инкубации на льду в темноте использовали вторичное кроличье антитело к мышиному FITC (Abcam, 1:100). Наконец, все клетки трижды промывали в промывочном буфере и по меньшей мере 10³ клеток оценивали с применением проточного цитометра Canto (Becton Dickinson Immunocytometry systems) для сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS), оснащенного твердотельным электродом на 488 нм и HeNe-лазером с длиной волны 633 нм, и эти данные затем анализировали с помощью программного обеспечения для FACS Diva. Все анализы были основаны на (i) аутофлуоресценции и (ii) контрольных клетках, инкубированных с изотип-специфическими IgG, для выявления фонового сигнала. Все изотипы соответствовали подтипу иммуноглобулина и были использованы с той же концентрацией белка, что и соответствующие антитела.

Нативные (данные не показаны) MSC и MSC в воспалительной среде (см. фигуру 5) были отрицательными в отношении молекул MHC II класса.

Группа изобретений относится к выделенной мезенхимальной стволовой клетке, клеточной композиции на ее основе и ее применению. Выделенная мезенхимальная стволовая клетка (MSC), полученная из крови, предпочтительно периферической крови, при измерении является положительной в отношении мезенхимальных маркеров CD29, CD44 и CD90 и отрицательной в отношении молекул MHC II класса, причем указанная MSC при совместном культивировании с мононуклеарами периферической крови (PBMC) и по сравнению с MSC, имеющей такие же характеристики, но не подвергнутой совместному культивированию с PBMC, секретирует иммуномодулирующий цитокин простагландин E2 (PgE2), характеризуется повышенной секрецией IL-6 и IL-10 и ингибирует секрецию TNF-α и IFN-γ клетками PBMC. Клеточная композиция, содержащая по меньшей мере 60% указанных выделенных MSC, где по меньшей мере 95% указанных клеток представляют собой одиночные клетки, подходит для лечения связанных с иммунной системой заболеваний и/или воспалительных процессов у субъекта. Изобретения обеспечивают иммуномодулирующие MSC с высокой терапевтической безопасностью и эффективностью. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.

1. Выделенная мезенхимальная стволовая клетка (MSC), полученная из крови, предпочтительно периферической крови, где при измерении указанная клетка является:

a) положительной в отношении мезенхимальных маркеров CD29, CD44 и CD90 и

b) отрицательной в отношении молекул MHC II класса,

где указанная MSC при совместном культивировании с мононуклеарами периферической крови (PBMC) и по сравнению с MSC, имеющей такие же характеристики, но не подвергнутой совместному культивированию с PBMC:

- секретирует иммуномодулирующий цитокин простагландин E2 (PgE2);

- характеризуется повышенной секрецией IL-6 и IL-10 и

- ингибирует секрецию TNF-α и IFN-γ клетками PBMC.

2. Мезенхимальная стволовая клетка по п. 1, где указанная MSC характеризуется суспензионным диаметром от 10 до 100 мкм.

3. Мезенхимальная стволовая клетка по любому из предыдущих пп. 1, 2, где указанная MSC имеет веретенообразную морфологию.

4. Мезенхимальная стволовая клетка по любому из предыдущих пп. 1-3, где указанная MSC дополнительно характеризуется повышенной секрецией NO при совместном культивировании с PBMC и/или ингибирует секрецию IL-1 клетками PBMS при совместном культивировании с PBMC.

5. Мезенхимальная стволовая клетка по любому из предыдущих пп. 1-4, где при дополнительном измерении указанная MSC является положительной в отношении виментина, фибронектина, Ki67 или их комбинации.

6. Мезенхимальная стволовая клетка по любому из предыдущих пп. 1-5, где при дополнительном измерении указанная MSC является отрицательной в отношении CD45.

7. Мезенхимальная стволовая клетка по любому из предыдущих пп. 1-6, где указанная MSC в присутствии PBMC экспрессирует PgE2 в концентрации от 10³ до 10⁶ пикограмм на мл.

8. Клеточная композиция, подходящая для лечения связанных с иммунной системой заболеваний и/или воспалительных процессов у субъекта, содержащая по меньшей мере 60% выделенных MSC по любому из пп. 1-7, где по меньшей мере 95% указанных клеток представляют собой одиночные клетки.

9. Применение клеточной композиции по предыдущему п. 8 при лечении атопического дерматита, остеоартрита, хронического гингивостоматита и хронической болезни почек у субъекта, предпочтительно у субъекта - млекопитающего.

10. Применение по п. 9, где за курс лечения вводится от 10⁵ до 10⁷ указанных выделенных MSC, где указанное введение осуществляется предпочтительно посредством внутривенной, внутрисуставной, внутримышечной, внутриочаговой, внутриартериальной, местной, субконъюнктивальной инъекции или регионарной перфузии.