КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИ-PD-1/HER2 БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 A61K9/08 A61K9/19 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области композиций на основе антител. Более конкретно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в частности к стабильной жидкой композиции, содержащей рекомбинантное биспецифическое антитело против рецептора белка 1 программируемой смерти (PD-1) и рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) (также известное как анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело), способу получения этой фармацевтической композиции, а также терапевтическому и/или профилактическому применению этой фармацевтической композиции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сверхэкспрессия рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) (также известного как NEU, ERBB-2, CD340 или р185) связана с различными злокачественными новообразованиями, включая рак молочной железы, рак яичников, рак желудка, рак матки, меланому и холангиокарциному. Например, сверхэкспрессия HER2 наблюдается при инвазивном и метастатическом раке молочной железы и при раке молочной железы с высокой частотой рецидивов и/или неблагоприятным прогнозом для пациента.

Один из подходов к лечению злокачественных новообразований со сверхэкспрессией HER2 состоит в использовании антител против HER2, подавляющих передачу сигнала, опосредованного HER2. Примером терапевтического антитела против HER2, блокирующего внутриклеточную передачу сигнала, опосредованного HER2, является трастузумаб, который широко применяется для лечения опухолей, сверхэкспрессирующих HER2. К сожалению, в случае клинического применения таких антител их противоопухолевый эффект часто выражен слабее, чем в доклинических исследованиях. На предыдущем уровне техники антитела против HER2 обычно применяют в комбинации с химиотерапевтическими препаратами и тому подобным (Slamon DJ et al., N Engl J Med, 344:783-792, 2001).

В последние годы, в ходе изучения молекул иммунных контрольных точек, было показано, что активация ингибирующих сигнальных путей иммунных контрольных точек вызывает неспособность Т-лимфоцитов эффективно уничтожать опухолевые клетки (Yao S, Zhu Y and Chen L, Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation, Nat Rev Drug Discov, 2013, 12(2): 130-146), что приводит, в одном аспекте, к слабому противоопухолевому эффекту препаратов, которые действуют исключительно на молекулы-мишени на опухолевых клетках (например, трастузумаба).

Белок-1 программируемой клеточной смерти (PD-1) - важный белок иммунной контрольной точки и трансмембранный белок I типа с молекулярной массой 55 кДа. Он экспрессируется главным образом в результате индукции на поверхности активированных Т-лимфоцитов; также он экспрессируется на таких клетках, как В-лимфоциты, природные киллеры (NK-клетки), моноциты и дендритные клетки (DC). Установлено, что у PD-1 есть два гликопротеиновых лиганда клеточной поверхности - белковый лиганд 1 программируемой смерти (PD-L1) и белковый лиганд 2 программируемой смерти (PD-L2). Лиганды PD-1 в значительном количестве экспрессируются на многих опухолевых клетках. Связывание PD-1 с лигандом PD-1 приводит к апоптозу Т-лимфоцитов, отсутствию иммунного ответа, «деплеции» (истощению) Т-лимфоцитов и секреции ИЛ-10 и т.д.; таким образом, блокирование PD1-зависимого пути может приводить к восстановлению функции Т-лимфоцитов у онкологических пациентов (Sheridan, Nature Biotechnology, 30(2012), 729-730). Разработаны моноклональные антитела против PD-1, например, ниволумаб компанией Bristol-Myers Squibb (BMS) и пембролизумаб компанией Merck. Ниволумаб (торговое название OPDIVO^®) - молекула полностью гуманизированного антитела изотипа IgG4, а пембролизумаб (торговое название KEYTRUDA^®) - молекула гуманизированного антитела изотипа IgG4. Моноклональные антитела против PD-1, связываясь с PD-1 на Т-лимфоцитах, могут подавлять связывание PD-1 с его лигандами PD-L1 и PD-L2, тем самым вызывая активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов и продукцию цитокинов, вовлеченных в иммунную активацию, таких как ИЛ-2, а также ослабляя подавление иммунного мониторинга Т-лимфоцитов с противоопухолевой активностью посредством PD-1.

Ввиду важности молекулы PD-1 иммунной контрольной точки в модуляции иммунных ответов, авторы изобретения провели тщательное исследование и разработали анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело, нацеливающееся на PD-1 и HER2, которое способно одновременно нацеливаться на HER2 на опухолевых клетках и активирующих Т-лимфоцитах, что, таким образом, предполагает преимущество в уменьшении побочных эффектов и усилении противоопухолевого действия. Подана заявка на патент в отношении данного анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела под номером PCT/CN2018/075851 (подана 8 февраля 2018 г. ), в которой описаны конструирование и экспрессия анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, состоящего из полуантитела против PD-1 и полуантитела против HER2. Анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело вводили несущим опухоль мышам, полученным путем инокуляции клеток рака молочной железы человека НСС1954 иммунодефицитным мышам линии NCG, и результаты проведенных экспериментов показали, что по сравнению с моноклональным антителом против HER2 или моноклональным антителом против PD-1, анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело обладает значительно повышенной противоопухолевой активностью и способно заметно уменьшать объем опухоли.

В данной области существует потребность в создании композиций анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, которые могут использоваться для лечения, предотвращения или замедления развития различных заболеваний, связанных с HER2-зависимым сигнальным путем или с PD-1-зависимым сигнальным путем, причем композиции должны обладать хорошей стабильностью в случае, когда анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело изготовлено в виде жидкого препарата, и анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело в жидком растворе не обладает склонностью к разложению, агрегации или нежелательной химической модификации.

КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение удовлетворяет вышеуказанную потребность в фармацевтических композициях, содержащих белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, специфически связывающегося с PD-1 и HER2. Композиция антитела, раскрытая в этом документе, позволяет изготавливать препарат антитела таким образом, что он будет пригоден для введения субъекту, и антитело будет оставаться стабильным при хранении, а также при последующем использовании.

В одном аспекте, предметом настоящего изобретения является жидкая композиция антитела, содержащая (i) белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела; (ii) буфер; (iii) стабилизатор и (iv) поверхностно-активное вещество.

Белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции антитела, раскрытой в этом документе, состоит из первого полуантитела и второго полуантитела, причем первое полуантитело включает первую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с PD-1, а второе полуантитело включает вторую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела способен связываться с PD-1 на поверхности Т-лимфоцитов с константой аффинности по меньшей мере примерно 10⁷ М^-1, предпочтительно примерно 10⁸ М^-1, и, более предпочтительно, примерно 10⁹ М^-1 или выше, тем самым блокируя связывание PD-1 с его лигандами и вызывая активацию или пролиферацию Т-лимфоцитов и продукцию цитокинов, вовлеченных в иммунную активацию, таких как ИЛ-2; и способен связываться с HER2 на поверхности опухолевых клеток с константой аффинности по меньшей мере примерно 10⁷ М^-1, предпочтительно примерно 10⁸ М^-1, и, более предпочтительно, примерно 10⁹ М^-1 или выше, тем самым блокируя внутриклеточную передачу сигнала, опосредованного HER2, и оказывая противоопухолевое действие.

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела является рекомбинантным белком анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, который раскрыт в заявке РСТ №PCT/CN2018/075851 (поданной 8 февраля 2018 г.), содержание которой включено в этот документ посредством ссылки в полном объеме в целях настоящей заявки. В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела состоит из первого полуантитела и второго полуантитела, причем первое полуантитело включает первую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с PD-1, а второе полуантитело включает вторую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с HER2, при этом первая VH/VL-единица включает все CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи, содержащиеся в парных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 10, a вторая VH/VL-единица включает все CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи, содержащиеся в парных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела включает первое полуантитело и второе полуантитело, причем первое полуантитело включает первую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с PD-1, а второе полуантитело включает вторую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с HER2, при этом первая VH/VL-единица включает парные последовательности вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 10 или последовательности, имеющие по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с указанными парными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, а вторая VH/VL-единица включает парные последовательности вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 2 или последовательности, имеющие по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с указанными парными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи.

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела состоит из первого полуантитела и второго полуантитела, причем первое полуантитело включает последовательности тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14 или последовательности тяжелой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С, и включает последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 4 или последовательности легкой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С, а второе полуантитело включает последовательности тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 или последовательности тяжелой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С, и включает последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 или последовательности легкой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С.

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела является белком анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, который рекомбинантным способом экспрессируется в клетках НЕК293, НЕК293Т, HEK293F или НЕК293Е, полученных путем модификации из клеток НЕК293, либо в клетках СНО, CHO-S, CHO-dhfr^-, CHO/DG44 или ExpiCHO, полученных путем модификации из клеток СНО.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 1-150 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 10-100 мг/мл. В других вариантах осуществления изобретения концентрация белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 5-50 мМ. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 10 30 мМ, например примерно 10, 15, 20, 25 или 30 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения буфер выбран из гистидина, гистидина гидрохлорида или их комбинации.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация стабилизатора в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 50-500 мМ. В одном варианте осуществления изобретения концентрация стабилизатора в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 100-400 мМ, например примерно 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения стабилизатор выбран из полиола (например, сорбита), сахарида (например, сахарозы или трегалозы) и их комбинации.

В еще одном варианте осуществления изобретения стабилизатор выбран из комбинаций полиола (например, сорбита), сахарида (например, сахарозы или трегалозы) и любой их комбинации с антиоксидантом. В одном варианте осуществления изобретения общая концентрация стабилизатора в жидкой композиции антитела составляет примерно 50-500 нМ, предпочтительно примерно 100-400 мМ, например примерно 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мМ, причем концентрация антиоксиданта составляет примерно 1-50 мМ, предпочтительно примерно 5-40 мМ, например примерно 5, 10, 20, 30 или 40 мМ. В одном варианте осуществления изобретения антиоксидантом является метионин.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 0,1-1 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 0,2-0,8 мг/мл, например примерно 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 или 0,8 мг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения поверхностно-активное вещество является неионогенным поверхностно-активным веществом. В одном варианте осуществления изобретения поверхностно-активное вещество выбрано из полисорбатных поверхностно-активных веществ. В одном конкретном варианте осуществления изобретения поверхностно-активным веществом в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, является полисорбат-80.

В одном варианте осуществления изобретения рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения рН жидкой композиции может иметь любое значение в диапазоне 5,0-6,5; например составлять примерно 5,0; 5,2; 5,4; 5,6; 5,8; 6,0; 6,2 или 6,4.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция является фармацевтической композицией, предпочтительно инъекционной лекарственной формой, и, более предпочтительно, композицией для подкожной инъекции или внутривенной инъекции. В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция является лекарственной формой для внутривенной инфузии.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 1-150 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 5-50 мМ гистидина и/или гистидина гидрохлорида;

(iii) примерно 50-500 мМ сорбита, сахарозы, трегалозы или любой их комбинации, или

комбинацию сорбита, сахарозы, трегалозы и любой их комбинации с метионином в общей концентрации примерно 50-500 мМ, причем концентрация метионина составляет примерно 1-50 мМ; и

(iv) примерно 0,1-1 мг/мл полисорбата-80, при этом

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0 6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 10-100 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 10-30 мМ гистидина и/или гистидина гидрохлорида;

(iii) примерно 100-400 мМ сорбита, сахарозы и/или трегалозы, или

комбинацию сорбита, сахарозы и/или трегалозы с метионином в общей концентрации примерно 100-400 мМ, причем концентрация метионина составляет примерно 5-40 мМ; и

(iv) примерно 0,2-0,8 мг/мл полисорбата-80, при этом

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 20 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 10 мМ гистидина;

(iii) примерно 50 мг/мл сорбита; и

(iv) примерно 0,3 мг/мл полисорбата-80, причем

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 20 мМ гистидина;

(iii) примерно 50 мг/мл сорбита; и

(iv) примерно 0,2 мг/мл полисорбата-80, причем

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 20 мМ гистидина;

(iii) примерно 80 мг/мл сахарозы; и

(iv) примерно 0,2 мг/мл полисорбата-80, причем

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 20 мМ гистидина;

(iii) примерно 80 мг/мл трегалозы; и

(iv) примерно 0,2 мг/мл полисорбата-80, причем

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 50 мг/мл белка анит-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 20 мМ гистидина;

(iii) примерно 80 мг/мл сахарозы и примерно 1,49 мг/мл метионина; и

(iv) примерно 0,2 мг/мл полисорбата-80, причем

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, содержит:

(i) примерно 42 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) примерно 0,85 мг/мл гистидина и примерно 3,17 мг/мл гистидина гидрохлорида;

(iii) примерно 80 мг/мл сахарозы; и

(iv) примерно 0,2 мг/мл полисорбата-80, причем

рН жидкой композиции составляет примерно 5,0-6,5; предпочтительно примерно 5,5.

В другом аспекте предметом настоящего изобретения является твердая композиция антитела, полученная путем перевода в твердую форму жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе. Процедура перевода в твердую форму осуществляется, например, путем кристаллизации, высушивания распылением или высушивания вымораживанием. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения твердой композицией антитела является, например, лиофилизированный порошок для инъекций. Твердая композиция антитела перед использованием может быть переведена в подходящий растворитель для получения восстановленной композиции по настоящему изобретению. Восстановленная композиция также является жидкой композицией антитела, раскрытой в этом документе. В одном варианте осуществления изобретения подходящий растворитель выбран из воды для инъекций, органических растворителей для инъекций (включая, в числе прочего, масло для инъекций, этанол, пропиленгликоль и тому подобное) и их комбинации.

Жидкая композиция, раскрытая в этом документе, может храниться без потери стабильности в течение длительного периода времени, например в течение по меньшей мере 24 месяцев или дольше. В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, может оставаться стабильной после хранения при температуре от примерно -80°С до примерно 45°С, например при -80°С, примерно -30°С, примерно -20°С, примерно 0°С, примерно 5°С, примерно 25°С, примерно 35°С, примерно 38°С, примерно 40°С, примерно 42°С или примерно 45°С, в течение по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или дольше.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, может храниться без потери стабильности в течение по меньшей мере 24 месяцев.

В другом варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, остается стабильной при температуре по меньшей мере 40°С. В еще одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, остается стабильной при температуре примерно 2-8°С в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 12 месяцев и, более предпочтительно, по меньшей мере 24 месяцев. В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, остается стабильной при комнатной температуре или, например, при температуре примерно 25°С в течение по меньшей мере 2 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 3 месяцев и, более предпочтительно, по меньшей мере 6 месяцев. В еще одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, остается стабильной при температуре примерно 40°С в течение по меньшей мере 2 недель, предпочтительно по меньшей мере 1 месяца.

В одном варианте осуществления изобретения о стабильности композиции после хранения можно судить по изменению ее внешнего вида, наличию видимых частиц, содержанию белка, мутности, чистоте композиции и/или содержанию заряженных изоформ. В одном варианте осуществления изобретения для определения стабильности жидкой композиции, раскрытой в этом документе, может быть использовано форсированное высокотемпературное стресс-испытание, например после хранения при температуре 40±2°С в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель или, предпочтительно, 1 месяца, или ускоренное испытание, например после хранения при температуре 25±2°С в течение по меньшей мере 1 месяца или 2 месяцев, или долгосрочное испытание, например после хранения при температуре 5±3°С в течение по меньшей мере 2 месяцев или 3 месяцев.

В одном варианте осуществления изобретения для определения стабильности после хранения жидкой композиции, раскрытой в этом документе, проводят ее визуальный осмотр, при этом жидкая композиция, раскрытая в этом документе, остается прозрачной или слегка опалесцирующей жидкостью без цвета или слегка желтого цвета, не содержащей видимых частиц. В одном варианте осуществления изобретения при визуальном осмотре композиции на детекторе прозрачности в ней не обнаруживаются видимые частицы. В одном варианте осуществления изобретения стабильность жидкой композиции, раскрытой в этом документе, изучают после хранения путем определения изменений в содержании белка, причем скорость изменения содержания белка составляет не более 20%, предпочтительно не более 10%, например 7-8%, и, более предпочтительно, не более 5%, относительно начального значения в день 0 периода хранения, например, при измерении методом УФ-спектрофотометрии. В одном варианте осуществления изобретения стабильность жидкой композиции, раскрытой в этом документе, изучают после хранения путем определения изменения мутности жидкой композиции, раскрытой в этом документе, причем изменение составляет не более 0,06, предпочтительно не более 0,05 и, более предпочтительно, не более 0,04 относительно начального значения в день 0 периода хранения, например методом измерения оптической плотности ОП₃₅₀ нм. В одном варианте осуществления изобретения стабильность жидкой композиции, раскрытой в этом документе, изучают после хранения путем определения изменения чистоты жидкой композиции, раскрытой в этом документе, причем изменение мономерной чистоты составляет не более 10%, например не более 5%, 4% или 3%, например 12%, предпочтительно не более 1% относительно начального значения в день 0 периода хранения, при измерении, например, методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ). В одном варианте осуществления изобретения стабильность жидкой композиции, раскрытой в этом документе, изучают после хранения путем определения изменения чистоты жидкой композиции, раскрытой в этом документе, причем мономерная чистота уменьшается не более чем на 10%, например не более чем на 5%, 4% или 3% при измерении капиллярным электрофорезом с додецилсульфатом натрия (КЭ-ДСН) в восстанавливающих и/или невосстанавливающих условиях. В одном варианте осуществления изобретения стабильность жидкой композиции, раскрытой в этом документе, изучают после хранения методом капиллярного изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCIEF), причем общее изменение в содержании заряженных изоформ (главного компонента, кислотного компонента и основного компонента) антитела составляет не более 50%, например не более 40%, 30%, 20%, 10% или 5%, относительно начального значения в день 0 периода хранения. В одном варианте осуществления изобретения стабильность жидкой композиции, раскрытой в этом документе, изучают после хранения методом высокоэффективной катионообменной жидкостной хроматографии (КОХ-ВЭЖХ), причем общее изменение в содержании заряженных изоформ (главного компонента, кислотного компонента или основного компонента) антитела составляет не более 40%, например не более 38%, 36%, 34%, 32% или 30%, относительно начального значения в день 0 периода хранения.

В одном варианте осуществления изобретения композиция остается стабильной после хранения, например при температуре 2-8°С в течение по меньшей мере 24 месяцев, при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 месяцев или при температуре 40±2°С в течение 1 месяца и, предпочтительно, имеет одну или более из следующих характеристик:

(i) чистота составляет более 90%, предпочтительно более 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, при измерении методом эксклюзионной ВЭЖХ;

(ii) чистота составляет более 90%, предпочтительно более 92%, 94%, 96% или 98% при измерении методом КЭ-ДСН в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях;

(iii) общее изменение в содержании компонентов (главного компонента, кислотного компонента и основного компонента) белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции составляет ≤50%, например ≤40%, 30%, 20%, 10% или 5%, относительно начального значения в день 0 периода хранения при измерении методом iCIEF; и

(iv) относительная активность связывания белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции составляет 70-130%, например 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% или 130%, относительно начального значения в день 0 периода хранения при измерении методом ELISA.

В одном аспекте предметом настоящего изобретения является устройство для доставки, содержащее жидкую композицию антитела или твердую композицию антитела, раскрытые в этом документе. В одном варианте осуществления изобретения устройство для доставки, раскрытое в этом документе, представлено в форме предварительно наполненного шприца, содержащего жидкую композицию антитела или твердую композицию антитела, раскрытые в этом документе, например для проведения внутривенной, подкожной, интрадермальной или внутримышечной инъекции либо внутривенной инфузии.

В другом аспекте, предметом настоящего изобретения является способ доставки белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела субъекту, например млекопитающему, который состоит во введении жидкой композиции антитела или твердой композиции антитела, раскрытых в этом документе, субъекту, причем доставка осуществляется, например, с помощью устройства доставки в форме предварительно наполненного шприца.

В другом аспекте, предметом настоящего изобретения является использование жидкой композиции антитела или твердой композиции антитела, раскрытых в этом документе, для получения устройства доставки (например, предварительно наполненного шприца) или лекарственного средства для лечения, предотвращения или замедления развития заболевания, связанного с сигнальными путями, опосредованными HER2 и PD-1, у субъекта, где заболевание включает, например, различные заболевания крови и солидные опухоли, включая, помимо прочего, лейкоз, лимфому, миелому, опухоль головного мозга, плоскоклеточную карциному головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, рак носоглотки, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, холангиокарциному, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак эндометрия, саркому матки, рак простаты, рак мочевого пузыря, почечно-клеточную карциному и меланому.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут понятны из подробного описания, приведенного в этом документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, подробно описанные ниже, будет проще понять, если читать их вместе с приведенными ниже фигурами. В целях иллюстрации настоящего изобретения варианты его осуществления, которые в настоящее время являются предпочтительными, показаны на фигурах. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено точными компоновками и средствами осуществления изобретения, показанными на фигурах.

ФИГ. 1 иллюстрирует структуру анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, состоящего из молекулы полуантитела против PD-1 и молекулы полуантитела против HER2.

ФИГ. 2 иллюстрирует динамику изменения мутности в образцах композиции анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела после хранения при рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 и температуре 40±2°С в течение различных периодов времени, как определено по ОП_{350 нм}. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1W соответствует 1 неделе, 2W соответствует 2 неделям, а 1М соответствует 1 месяцу.

ФИГ. 3 иллюстрирует динамику изменения чистоты белка в образцах композиции анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела после хранения при рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 и температуре 40±2°С в течение различных периодов времени при определении методом эксклюзионной ВЭЖХ. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1W соответствует 1 неделе, 2W соответствует 2 неделям, а 1М соответствует 1 месяцу.

ФИГ. 4 иллюстрирует динамику изменения чистоты белка в образцах композиции биспецифического антитела против PD-1/HER2 после хранения при рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 и температуре 40±2°С в течение различных периодов времени при определении методом КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1W соответствует 1 неделе, 2W соответствует 2 неделям, а 1М соответствует 1 месяцу.

ФИГ. 5 иллюстрирует динамику изменения чистоты белка в образцах композиции анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела после хранения при рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 и температуре 40±2°С в течение различных периодов времени при определении методом КЭ-ДСН в восстанавливающих условиях. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1W соответствует 1 неделе, 2W соответствует 2 неделям, а 1М соответствует 1 месяцу.

ФИГ. 6 иллюстрирует динамику изменения содержания заряженной изоформы (главного компонента) в образцах композиции анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела после хранения при рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 и температуре 40±2°С в течение различных периодов времени при определении методом iCIEF. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1W соответствует 1 неделе, 2W соответствует 2 неделям, а 1М соответствует 1 месяцу.

ФИГ. 7 иллюстрирует изменение во времени содержания заряженной изоформы (главного компонента) в композициях анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, содержащих различные стабилизаторы (составы 14) после хранения при температуре 40°С в течение 0 дней, 1 недели, 2 недель и 4 недель при определении методом iCIEF. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1W соответствует 1 неделе, 2W соответствует 2 неделям, 4W соответствует 4 неделям; F1 соответствует составу 1, F2 соответствует составу 2, F3 соответствует составу 3, a F4 соответствует составу 4.

ФИГ. 8 иллюстрирует изменение во времени содержания заряженной изоформы (главного компонента) в композициях анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, содержащих различные стабилизаторы (составы 14) после хранения при температуре 25±2°С в течение 0 дней, 1 недели, 2 недель и 4 недель при определении методом iCIEF. На оси абсцисс Т0 соответствует дню 0, 1М соответствует 1 месяцу, а 2М соответствует 2 месяцам; F1 соответствует составу 1, F2 соответствует составу 2, F3 соответствует составу 3, a F4 соответствует составу 4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Прежде чем приводить подробное описание настоящего изобретения, следует подчеркнуть, что настоящее изобретение не ограничено какими-либо конкретными методами или экспериментальными условиями, приведенными в этом документе, так как методы и условия могут варьироваться. Далее следует подчеркнуть, что используемые в настоящем документе термины предназначены лишь для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения его объема.

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в этом документе, имеют общепринятый смысл, понятный специалистами средней квалификации в данной области. В целях настоящего изобретения, ниже даны определения следующих терминов.

Термин «примерно», используемый в комбинации с численным значением, предназначен для охвата численных значений в диапазоне от нижней границы, отличающейся от указанного численного значения на 5% в меньшую сторону, до верхней границы, отличающейся от указанного численного значения на 5% в большую сторону.

Термин «и/или», когда он используется для соединения двух или более вариантов, следует понимать, как относящийся к любому одному из вариантов или к любым двум или более вариантам.

Используемые в этом документе термины «содержать» или «содержащий» означают включение описанных элементов, целых чисел или этапов, но не исключение каких-либо других элементов, целых чисел или этапов. Используемые в этом документе термины «содержать» или «содержащий», если не указано иное, также относятся к ситуации, когда целое состоит из описанных элементов, целых чисел или этапов. Например, если сказано, что вариабельная область антитела «содержит» определенную последовательность, также подразумевается вариабельная область антитела, состоящая из определенной последовательности.

Термин «антитело», используемый в настоящем документе в самом широком смысле, относится к белку, содержащему антиген-связывающий участок, и охватывает как природные, так и искусственные антитела с различными структурами, включая, помимо прочего, интактные антитела и антиген-связывающие фрагменты антител.

Термины «цельное антитело», «полноразмерное антитело», «полное антитело» и «интактное антитело» используются в настоящем документе на равных основаниях и относятся к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелых цепи (Н) и две легкие цепи (L), соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в настоящем документе используется сокращение VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область каждой тяжелой цепи состоит из 3 доменов: CH1, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в настоящем документе используется сокращение VL) и константной области легкой цепи. Константная область каждой легкой цепи состоит из одного домена CL. VH-область и VL-область могут быть дополнительно разделены на гипервариабельные области (определяющие комплементарность области или CDR) и относительно консервативные области (каркасные области или FR), расположенные между ними. Каждая VH или VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые располагаются в следующем порядке в направлении от аминоконца к карбоксильному концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Константные области не принимают непосредственного участия в связывании антител с антигенами, однако проявляют ряд эффекторных функций.

Термин «гуманизированный» относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из не являющихся человеческими HVR-областей и аминокислотные остатки из не являющихся человеческими FR-областей. В некоторых вариантах осуществления изобретения все или практически все HVR (например, CDR) в гуманизированном антителе соответствуют HVR не являющегося человеческим антитела, а все или практически все FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело может необязательно включать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Под «гуманизированными формами» антител (например, не являющихся человеческими антител) понимаются антитела, которые были гуманизированы.

Термин «полуантитело» или «гемимер» относится к моновалентному антиген-связывающему полипептиду. В некоторых вариантах осуществления изобретения полуантитело или гемимер включает VH/VL-единицу и, необязательно, по меньшей мере часть константного домена иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления изобретения полуантитело или гемимер включает одну тяжелую цепь иммуноглобулина, связанную с легкой цепью иммуноглобулина, или их антиген-связывающий фрагмент.В некоторых вариантах осуществления изобретения полуантитело или гемимер является моноспецифическим, то есть связывается с одним антигеном или эпитопом. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полуантитело связывается с HER2 и не связывается с PD-1. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полуантитело связывается с PD-1 и не связывается с HER2. Специалистам в данной области будет понятно, что полуантитело может содержать антиген-связывающий домен, состоящий из одного вариабельного домена, например происходящего из животных семейства Camelidae.

Термин «VH/VL-единица» относится к антиген-связывающему участку антитела, включающему по меньшей мере один VH CDR и по меньшей мере один VL CDR. В некоторых вариантах осуществления изобретения VH/VL-единица включает по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три VH CDR и по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три VL CDR. В определенных вариантах осуществления изобретения VH/VL-единица включает по меньшей мере часть каркасной области (FR). В некоторых вариантах осуществления изобретения VH/VL-единица включает три VH CDR и три VL CDR. В некоторых вариантах осуществления изобретения VH/VL-единица включает по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или все четыре VH FR, и по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или все четыре VL FR.

Используемый в этом документе термин «биспецифическое антитело» включает антиген-связывающие домены, которые специфически связываются с эпитопами на двух разных биологических молекулах. Если не указано иное, порядок антигенов, связывающихся с биспецифическим антителом в указанном названии биспецифического антитела, является произвольным. Иначе говоря, в некоторых вариантах осуществления изобретения термины «анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело» и «анти-HER2/PD-1 биспецифическое антитело» могут использоваться на равных основаниях. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело включает два полуантитела, причем каждое полуантитело включает одну вариабельную область тяжелой цепи и, необязательно, по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи, и включает одну вариабельную область легкой цепи и, необязательно, по меньшей мере часть константной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело включает два полуантитела, причем каждое полуантитело включает одну вариабельную область тяжелой цепи и одну вариабельную область легкой цепи, но не включает более одной вариабельной области тяжелой цепи и не включает более одной вариабельной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит два полуантитела, причем каждое полуантитело включает одну вариабельную область тяжелой цепи и одну вариабельную область легкой цепи, и при этом первое полуантитело связывается с первым антигеном, но не связывается со вторым антигеном, а второе полуантитело связывается со вторым антигеном, но не связывается с первым антигеном.

Термин «композиция антитела» относится к препарату в такой форме, в которой антитело проявляет свою биологическую активность в качестве активного ингредиента, предназначенного оказывать полезное действие, причем препарат не содержит других компонентов, оказывающих неприемлемое токсическое действие у субъекта, которому должна быть введена данная композиция. Такие композиции антитела, как правило, являются стерильными. Как правило, композиция антитела включает фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. «Фармацевтически приемлемое» вспомогательное вещество - это вещество, которое может быть обоснованно введено субъекту-млекопитающему, благодаря чему субъекту может быть доставлена эффективная доза активного ингредиента, используемого в композиции. Концентрация вспомогательного вещества подбирается с учетом способа введения и, например, может быть приемлемой для инъекций.

Термин «композиция анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела», используемый в настоящем документе как «композиция антитела, раскрытая в этом документе», также относится к препарату, содержащему белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела как активный ингредиент пригоден для терапевтического или профилактического применения у человека или животного, отличного от человека, после объединения белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. Композиция антитела, раскрытая в этом документе, может быть изготовлена, например, в виде водной жидкой композиции, например в готовом для использования предварительно наполненном шприце, или в виде лиофилизированной композиции, подлежащей восстановлению (то есть повторному растворению) путем растворения и/или суспендирования в физиологически приемлемом растворе непосредственно перед использованием. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела готовится в форме жидкой композиции.

«Стабильная» композиция антитела - это такая композиция, в которой антитело сохраняет приемлемую степень физической и/или химической стабильности после хранения в конкретных условиях. Хотя антитело в составе композиции антитела может не сохранять на 100% свою химическую структуру после хранения в течение определенного периода времени, композиция антитела считается «стабильной», если антитело после хранения в течение определенного периода времени, как правило, сохраняет свою структуру или функцию на примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99%. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения в композиции белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытой в этом документе, во время производства, изготовления лекарственной формы, транспортировки или длительного хранения обнаруживаются следы агрегации, деградации или химической модификации антитела, что приводит к незначительной потере или не вызывает никакой потери биологической активности белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела и указывает на его высокую стабильность. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытая в этом документе, в существенной степени сохраняет физическую и химическую стабильность после хранения. Предпочтительно, жидкая композиция, раскрытая в этом документе, может оставаться стабильной при комнатной температуре или при температуре 40°С в течение по меньшей мере 2 недель и/или при температуре 25°С в течение по меньшей мере 2 месяцев и/или при температуре 28°С в течение по меньшей мере 24 месяцев.

В данной области известны различные аналитические методики определения стабильности белков, см., например, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Стабильность может определяться для конкретной температуры и для конкретного периода хранения. Например, период хранения может выбираться на основании ожидаемого срока хранения композиции. В альтернативном варианте может проводиться ускоренное исследование стабильности. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследование стабильности проводится с использованием различных стресс-испытаний, которым подвергается композиция антитела. Эти испытания могут проводиться в экстремальных условиях, которым приготовленная композиция антитела может подвергаться в процессе производства, хранения или транспортировки, и они также могут представлять условия, которые могут способствовать ускоренной потере стабильности антитела в составе композиции антитела во время непроизводственных операций, хранения или транспортировки. Например, готовая композиция белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела может быть помещена в стеклянный флакон для изучения стабильности антитела в условиях высокотемпературного стресса.

Антитело может считаться «сохраняющим физическую стабильность» в составе композиции, если после хранения в течение некоторого периода времени в композиции не обнаруживается агрегации, осаждения, мутности и/или денатурации, либо агрегация, осаждение, мутность и/или денатурация обнаруживаются в очень небольшой степени. Агрегация антител в составе композиция создает проблемы для безопасности, так как она может потенциально приводить к более выраженному иммунному ответа у пациента. Соответственно, агрегация антител в составе композиции должна быть сведена к минимуму или предотвращена. Для обнаружения видимых агрегатов в композиции могут быть использованы методы, основанные на рассеянии света. Для обнаружения растворимых агрегатов в композиции может быть использована эксклюзионная хроматография (ЭХ). Кроме того, стабильность композиции можно оценивать путем визуального осмотра внешнего вида, цвета и/или прозрачности композиции либо путем определения мутности композиции по оптической плотности (ОП_{350 нм}) либо путем определения чистоты композиции методом КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях. В одном варианте осуществления изобретения стабильность композиции определяют путем измерения процента мономерного антитела в композиции после хранения при определенной температуре в течение определенного периода времени, причем чем выше процент мономерного антитела в композиции, тем выше стабильность композиции.

О «приемлемой степени» физической стабильности можно говорить, если после хранения при определенной температуре в течение определенного периода времени выявляется по меньшей мере примерно 92% мономерного белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения приемлемая степень физической стабильности соответствует содержанию мономерного белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела по меньшей мере примерно 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% после хранения при определенной температуре в течение по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 28 дней, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или дольше. При оценке физической стабильности определенная температура, при которой хранится фармацевтическая композиция, может иметь любое значение в диапазоне от примерно -80°С до примерно 45°С, например составлять примерно -80°С, примерно -30°С, примерно -20°С, примерно 0°С, примерно 4-8°С, примерно 5°С, примерно 25°С, примерно 35°С, примерно 37°С, примерно 40°С, примерно 42°С или примерно 45°С. Например, фармацевтическая композиция считается стабильной, если после хранения при температуре примерно 40±2°С в течение 1 месяца или 4 недель выявляется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% мономерного белка анти-PD- 1/HER2 биспецифического антитела. Фармацевтическая композиция считается стабильной, если после хранения при температуре примерно 25°С в течение 2 месяцев выявляется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Мономерного белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела Фармацевтическая композиция считается стабильной, если после хранения при температуре примерно 5°С в течение 9 месяцев выявляется по меньшей мере 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% мономерного белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела

Антитело считается «сохраняющим химическую стабильность» в составе композиции, если антитело в составе композиции не претерпевает значительных химических изменений после хранения в течение определенного периода времени. В большинстве случаев химическая нестабильность возникает вследствие образования ковалентно модифицированных форм антитела (например, заряженных изоформ антитела). Основные изоформы могут образовываться, например, за счет изомеризации аспарагиновой кислоты, а также N- и С-концевых модификаций; кислотные изоформы могут образовываться за счет дезаминирования, сиалирования и гликозилирования. Химическую стабильность можно оценивать путем обнаружения и/или количественного определения химически измененных форм антитела. Например, заряженные изоформы антитела в составе композиции могут быть обнаружены с помощью катионообменной хроматографии (КОХ) или капиллярного изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCIEF). В одном варианте осуществления изобретения стабильность композиции определяют путем измерения процентного изменения содержания заряженных изоформ антитела в композиции после хранения при определенной температуре в течение определенного периода времени, причем чем меньше степень изменения, тем выше стабильность композиции.

О «приемлемой степени» химической стабильности можно говорить, если процентное изменение содержания заряженных изоформ (например, главного компонента, кислотного компонента или основного компонента) в композиции после хранения при определенной температуре в течение определенного периода времени не превышает 50%, например не превышает 30% или 20%. В некоторых вариантах осуществления изобретения приемлемая степень химической стабильности может соответствовать процентному изменению содержания заряженной изоформы (главного компонента) не более примерно 50%, 40%, 30%, 20% или 15% после хранения при определенной температуре в течение по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 28 дней, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или дольше. При оценке химической стабильности температура, при которой хранится фармацевтическая композиция, может иметь любое значение температуры от примерно -80°С до примерно 45°С, например примерно -80°С, примерно -30°С, примерно -20°С, примерно 0°С, примерно 4-8°С, примерно 5°С, примерно 25°С или примерно 45°С. Например, фармацевтическая композиция может считаться стабильной, если процентное изменение содержания заряженной изоформы (главного компонента) после хранения при 5°С в течение 24 месяцев составляет менее примерно 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1%. Фармацевтическая композиция может считаться стабильной, если процентное изменение содержания заряженной изоформы (главного компонента) после хранения при 25°С в течение 2 месяцев составляет менее примерно 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1%. Фармацевтическая композиция может считаться стабильной, если процентное изменение содержания заряженной изоформы (главного компонента) после хранения при 40°С в течение 1 месяца составляет менее примерно 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или 4%.

Термин «лиофилизированная композиция» относится к композиции, которая получена или которую можно получить в процессе высушивания жидкой композиции вымораживанием. Предпочтительно, она представляет собой твердую композицию, содержание воды в которой составляет менее 5%, предпочтительно менее 3%.

Термин «восстановленная композиция» относится к жидкой композиции, полученной путем растворения и/или суспендирования твердой композиции (например, лиофилизированной композиции) в физиологически приемлемом растворе.

Термин «комнатная температура», используемый в этом документе, относится к температуре 15-30°С, предпочтительно 20-27°С и, более предпочтительно, 25°С.

Термин «стресс-условия» относится к условиям окружающей среды, которые являются неблагоприятными с точки зрения химической и/или физической стабильности антительных белков, и могут вызывать неприемлемую дестабилизацию антительных белков. Термин «высокотемпературный стресс» относится к хранению композиции антитела при комнатной температуре или при более высокой температуре (например, 40±2°С) в течение определенного периода времени. Стабильность композиции антитела можно изучать в ускоренном испытании в условиях высокотемпературного стресса.

Термин «парентеральное введение», используемый в этом документе, относится к любым введениям, отличным от энтерального и местного введений, как правило, к введению путем инъекции или инфузии, включая, помимо прочего, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. В некоторых вариантах осуществления изобретения стабильная композиция белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытая в этом документе, вводится субъекту парентерально. В одном варианте осуществления изобретения композиция белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытая в этом документе, вводится субъекту подкожной, интрадермальной, внутримышечной или внутривенной инъекцией.

I. Композиция антитела

Предметом настоящего изобретения является стабильная жидкая композиция антитела, содержащая (i) белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, (ii) буфер, (iii) стабилизатор и (iv) поверхностно-активное вещество, причем рН композиции антитела составляет примерно 5,0-6,5. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, представлена в форме для инъекций.

(i) Белок анти-PD-1/1IER2 биспецифического антитела

«Белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела» в композиции антитела, раскрытой в этом документе, состоит из первого полуантитела и второго полуантитела, причем первое полуантитело включает первую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с PD-1, а второе полуантитело включает вторую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с HER2. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела способен связываться с PD-1 на поверхности Т-лимфоцитов с константой аффинности по меньшей мере примерно 10⁷ М^-1, предпочтительно примерно 10⁸ М^-1, и, более предпочтительно, примерно 10⁹ М^-1 или выше, и способен связываться с HER2 на поверхности опухолевых клеток с константой аффинности по меньшей мере примерно 10⁷ М^-1, предпочтительно примерно 10⁸ М^-1, и, более предпочтительно, примерно 10⁹ М^-1 или выше таким образом, что данное антитело может быть использовано в качестве терапевтического агента и/или профилактического средства, обладающего способностью к биспецифичному нацеливанию молекул PD-1 и HER2.

VH/VL-единица, специфически связывающаяся с PD-1 или HER2, содержит 6 CDR из VH/VL-единицы, происходящей из антитела против PD-1, описанного на известном уровне техники, и антитела против PD-1, которое будет разработано в будущем, или последовательности, имеющие одно, два, три, четыре, пять, шесть или более изменений аминокислот (например, замен или делеций аминокислот) по сравнению с одной или более CDR из 6 CDR; или содержит 6 CDR из VH/VL-единицы, происходящей из антитела против HER2, описанного на известном уровне техники, и антитела против HER2, которое будет разработано в будущем, или последовательности, имеющие одно, два, три, четыре, пять, шесть или более изменений аминокислот (например, замен или делеций аминокислот) по сравнению с одной или более CDR из 6 CDR.

В одном варианте осуществления изобретения первая VH/VL-единица белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, специфически связывающаяся с PD-1, включает все 6 CDR тяжелых и легких цепей, содержащихся в парных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, предатавленных в SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 10, происходящих из полуантитела против PD-1, или в последовательностях, имеющих одно, два, три, четыре, пять, шесть или более изменений аминокислот (например, замен или делеций аминокислот) по сравнению с одной или более CDR из 6 CDR.

В одном варианте осуществления изобретения вторая VH/VL-единица белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, специфически связывающаяся с HER2, включает все 6 CDR тяжелых и легких цепей, содержащихся в парных последовательностях вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 2, происходящих из полуантитела против HER2, или в последовательностях, имеющих одно, два, три, четыре, пять, шесть или более изменений аминокислот (например, замен или делеций аминокислот) по сравнению с одной или более CDR из 6 CDR.

Термины «CDR», «область, определяющая комплементарность» или «CDR-область» (в настоящем документе используются на равных основаниях с термином «гипервариабельная область» (HVR)) относятся к образуемой аминокислотами области в вариабельном участке антитела, которая в основном отвечает за связывание с эпитопом антигена. CDR тяжелых и легких цепей, как правило, обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3, причем они нумеруются последовательно от N-конца. В данной области известны различные схемы определения последовательности CDR для данной аминокислотной последовательности VH, VL или VHH. Например, для определения областей, определяющих комплементарность (CDR), чаще всего используют метод Kabat, основанный на вариабельности последовательностей (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Метод Chothia основан на расположениях структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). HVR-области, определяемые методом AbM, представляют собой компромисс между HVR, определяемыми по Kabat, и структурными петлями Chothia, и используются в программном обеспечении Oxford Molecular для моделирования антител AbM. Определение «контактных» HVR-областей основано на анализе имеющихся сложных кристаллических структур.

Изменения аминокислот, например аминокислотные замены, предпочтительно являются консервативными аминокислотными заменами. Термин «консервативная аминокислотная замена» относится к изменению аминокислоты, в результате которого аминокислота замещается на химически сходную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, в которых представлены функционально сходные аминокислоты, хорошо известны специалистам в данной области. В любом из вариантов осуществления изобретения, раскрытых в этом документе, в одном предпочтительном аспекте, консервативно замещенный остаток взят из приведенной ниже таблицы А консервативных замен, предпочтительно предпочитаемые замещенные остатки показаны в таблице А.

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела включает первое полуантитело и второе полуантитело, причем первое полуантитело включает первую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с PD-1, а второе полуантитело включает вторую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с HER2, при этом первая VH/VL-единица включает парные последовательности вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 10 или последовательности, имеющие по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с указанными парными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, а вторая VH/VL-единица включает парные последовательности вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 2 или последовательности, имеющие по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с указанными парными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи.

Константные области тяжелых цепей первого полуантитела и второго полуантитела в белке анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела не имеют особых ограничений по типу и предпочтительно представляют собой константные области тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1, IgG2 или IgG4 или последовательность, в существенной степени ей идентичную (например, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности). Более предпочтительно, константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG1 или последовательность, в существенной степени ей идентичную (например, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности).

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержит константную область тяжелой цепи IgG1 (например, человеческого IgG1). В еще одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержит константную область тяжелой цепи IgG4 (например, человеческого IgG4). Например, каждый из Fc-доменов двух тяжелых цепей анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержит шарнирный участок, включающий аминокислотные остатки «СРРС», и/или Fc-домены содержат замены Y349C и S354C (в соответствии с «нумерацией EU» по Kabat) соответственно, и таким образом полуантитело против PD-1 и полуантитело против HER2 образуют межцепочечные дисульфидные связи в Fc-участках, чем обеспечивается стабилизация правильного спаривания полуантитела против PD-1 и полуантитела против HER2.

В одном варианте осуществления изобретения полуантитело против PD-1 и/или полуантитело против HER2 белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержат в Fc-домене аминокислотные мутации, влияющие на эффекторную функцию антитела. В одном конкретном варианте осуществления изобретения эффекторной функцией является антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ). В одном варианте осуществления изобретения аминокислотные мутации присутствуют в СН2-домене Fc-участка, например белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержит аминокислотные замены в положениях 234 и 235 (нумерация EU) Fc-участка полуантитела против PD-1 и/или полуантитела против HER2. В одном конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотными заменами являются L234A и L235A (также именуемые «мутациями LALA»).

В еще одном варианте осуществления изобретения легкая цепь белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержит константную область легкой цепи каппа или константную область легкой цепи лямбда, например константную область человеческой легкой цепи каппа или константную область человеческой легкой цепи лямбда.

В одном варианте осуществления изобретения две тяжелые цепи белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержат выпуклость (выступ) и полость (впадину) в их Fc-доменах соответственно или, наоборот, выпуклость (или полость) в Fc-домене одной тяжелой цепи может быть помещена в полость (или выпуклость) в Fc-домене другой тяжелой цепи таким образом, что две тяжелые цепи образуют друг с другом стабильную ассоциацию типа «выступ во впадину». В одном варианте осуществления изобретения в одной из двух тяжелых цепей содержится аминокислотная замена T366W, а в другой тяжелой цепи содержатся аминокислотные замены T366S, L368A и Y407V (нумерация EU). Таким образом, выпуклость в одной цепи может быть помещена в полость в другой цепи, что способствует правильному спариванию двух тяжелых цепей белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела.

В одном варианте осуществления изобретения СН1-домен иммуноглобулина и CL-домен тяжелой цепи и легкой цепи в каждом полуантителе белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела содержат выпуклость и полость соответственно или, наоборот, выпуклость (или полость) в СН1-домене может быть помещена в полость (или выпуклость) в CL-домене таким образом, что тяжелая цепь и легкая цепь в каждом полуантителе также образуют друг с другом стабильную ассоциацию типа «выступ во впадину».

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела состоит из первого полуантитела и второго полуантитела, причем первое полуантитело включает последовательности тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14 или последовательности тяжелой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С, и включает последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 4 или последовательности легкой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С, а второе полуантитело включает последовательности тяжелой цепи с SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 или последовательности тяжелой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С, и включает последовательности легкой цепи с SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 или последовательность легкой цепи, имеющую с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности в направлении от N к С.

В данном документе термин «идентичность последовательности» относится к степени, в которой последовательности идентичны по нуклеотидам или аминокислотам в окне сравнения. «Процент идентичности последовательностей» может быть рассчитан с использованием следующих этапов: сравнение двух оптимально сопоставленных последовательностей в окне сравнения; определение числа положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот (например, А, Т, С, G и I) или остатки аминокислот (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений; деление числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (то есть на размер окна); и умножение результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Оптимальное сопоставление для определения процента идентичности последовательностей может быть достигнуто различными методами, известными в данной области, например с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить надлежащие параметры сопоставления последовательностей, включая алгоритмы, необходимые для оптимального сопоставления сравниваемых последовательностей в диапазоне полноразмерных последовательностей или целевых областях последовательностей.

Белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в составе композиции антитела, раскрытый в этом документе, способен одновременно связываться с белками PD-1 и HER2 и сохранять константу аффинности каждого родительского антитела, благодаря чему может блокироваться сигнальный путь, зависимый от HER2, и сигнальный путь, зависимый от PD-1, и поэтому данная композиция антитела может использоваться для лечения, предотвращения или замедления развития различных заболеваний или расстройств, связанных с сигнальным путем, зависимым от HER2, и/или сигнальным путем, зависимым от PD-1.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытый в этом документе, является рекомбинантным белком анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытым в заявке РСТ №PCT/CN2018/075851 (поданной 8 февраля 2018 г. ), который содержит полностью человеческое полуантитело против PD-1 и гуманизированное полуантитело против HER2, причем тяжелая цепь полностью человеческого полуантитела против PD-1 имеет последовательность SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14 в направлении от N к С, а легкая цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 4 в направлении от N к С; тяжелая цепь гуманизированного полуантитела против HER2 имеет последовательность SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 в направлении от N к С, а легкая цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 в направлении от N к С.

В одном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела производят с рекомбинантной экспрессией в клетках НЕК293, НЕК293Т, HEK293F или НЕК293Е, полученных путем модификации из клеток НЕК293, и в клетках СНО, CHO-S, CHO-dhfr^-, CHO/DG44 или ExpiCHO, полученных путем модификации из клеток СНО, после чего белок биспецифического антитела очищают. Предпочтительно, антитело в составе жидкой композиции, раскрытой в настоящем документе, проявляет значительную противоопухолевую активность. Анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело вводили мышам, несущим опухоль, которые были получены путем инокуляции клеток рака молочной железы человека НСС1954 иммунодефицитным мышам линии NCG, и результаты проведенных экспериментов показали, что по сравнению с моноклональным антителом против PD-1 или моноклональным антителом против HER2, анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело обладает значительно повышенной противоопухолевой активностью и способно заметно уменьшать объем опухоли.

Количество белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции антитела, раскрытой в этом документе, может варьировать в зависимости от конкретных требуемых характеристик композиции, конкретных условии окружающей среды и конкретной цели, для которой применяют эту композицию. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция антитела представляет собой жидкую композицию, которая может содержать примерно 1-150 мг/мл, предпочтительно примерно 10 100 мг/мл, например примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мл, белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела.

(ii) Буфер

Буферы - это реагенты, которые способны поддерживать рН раствора в приемлемом диапазоне. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер в композиции, раскрытой в этом документе, способен поддерживать рН композиции, раскрытой в этом документе, в пределах примерно 5,0-6,5; например примерно 5,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения рН композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 5,0; 5,2; 5,4; 5,6; 5,8; 6,0; 6,2 или 6,4.

В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер композиции, раскрытой в этом документе, выбран из гистидина, гистидина гидрохлорида и их комбинации. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 5-50 мМ. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидкой композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет примерно 10-30 мМ, например примерно 10, 15, 20, 25 или 30 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения буфером в композиции, раскрытой в этом документе, является примерно 10 мМ гистидина. В другом варианте осуществления изобретения буфером в композиции, раскрытой в этом документе, является примерно 20 мМ гистидина.

В еще одном варианте осуществления изобретения буфером в композиции, раскрытой в этом документе, является комбинация примерно 5,5 мМ гистидина и примерно 15 мМ гистидина гидрохлорида.

(iii) Стабилизатор

Стабилизаторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, могут быть выбраны из сахарида, полиола и их комбинации. Кроме того, стабилизатор по настоящему изобретению может дополнительно содержать антиоксидант.

Сахарид, используемый в качестве стабилизатора, может быть дисахаридом, трисахаридом и полисахаридом, и сахарид может быть выбран, помимо прочего, из: сахарозы, декстрозы, лактозы, мальтозы, трегалозы, циклодекстрина, мальтодекстрина и глюкана. В одном варианте осуществления изобретения сахарид, используемый в качестве стабилизатора, является сахарозой и/или трегалозой.

Полиол, используемый в качестве стабилизатора, может быть выбран, помимо прочего, из: маннитола, сорбита и ксилитола. В одном варианте осуществления изобретения полиол, используемый в качестве стабилизатора, является сорбитом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сахарид и/или полиол, используемые в качестве стабилизатора, присутствуют в жидкой композиции, раскрытой в этом документе, в концентрации примерно 50-500 мМ, предпочтительно примерно 100-400 мМ, например примерно 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мМ.

Антиоксиданты, которые также могут входить в состав стабилизаторов по настоящему изобретению, выбираются, помимо прочего, из гомоцистеина, цистеина, цистатионина, метионина, глутатиона и пептидов, включающих любую из таких аминокислот, как гомоцистеин, цистеин, цистатионин, метионин и глутатион. В случае если в состав включен антиоксидант, общая концентрация стабилизатора составляет примерно 50-500 нМ, предпочтительно примерно 100-400 мМ, например примерно 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мМ, причем концентрация антиоксиданта составляет примерно 1-50 мМ, предпочтительно примерно 5-40 мМ, например примерно 5, 10, 20, 30 или 40 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, содержит в качестве стабилизатора сорбит.Сорбит может присутствовать в жидкой композиции, раскрытой в этом документе, в количестве примерно 50-400 мМ, например примерно 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, содержит в качестве стабилизатора сахарозу. Сахароза может присутствовать в жидкой композиции, раскрытой в этом документе, в количестве 50-300 мМ, например примерно 50, 100, 150, 200, 250 или 300 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, содержит в качестве стабилизатора трегалозу. Трегалоза может присутствовать в жидкой композиции, раскрытой в этом документе, в количестве примерно 50-300 мМ, например примерно 50, 100, 150, 200, 250 или 300 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, содержит в качестве стабилизатора комбинацию сахарозы и метионина. В этой комбинации общая концентрация стабилизатора составляет примерно 50-500 нМ, предпочтительно примерно 100-400 мМ, например примерно 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 мМ, причем концентрация метионина составляет примерно 1-50 мМ, предпочтительно примерно 5-40 мМ, например примерно 5, 10, 20, 30 или 40 мМ.

(iv) Поверхностно-активное вещество

Термин «поверхностно-активное вещество», используемый в этом документе, относится к органическому веществу с амфифильной структурой, то есть в его структуру входят группы, противоположные по предпочитаемой среде растворения, как правило, жирорастворимая углеводородная цепь и водорастворимая ионная группа.

В одном варианте осуществления изобретения поверхностно-активное вещество в жидкой композиции, раскрытой в этом документе, представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, например алкилполи(этиленоксид). К числу конкретных неионных поверхностно-активных веществ, которые могут быть включены в композицию, относятся, например, полисорбаты, такие как полисорбат-20, полисорбат-80, полисорбат-60 или полисорбат-40, Плюроник и тому подобное. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкая композиция, раскрытая в этом документе, содержит в качестве поверхностно-активного вещества полисорбат-80.

Количество поверхностно-активного вещества в композиции антитела, раскрытой в этом документе, может варьировать в зависимости от конкретных требуемых характеристик композиции, конкретных условий окружающей среды и конкретной цели, для которой применяют эту композицию. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция может содержать полисорбатное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат-80) в концентрации примерно 0,1-1 мг/мл, предпочтительно примерно 0,2-0,8 мг/мл, например примерно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мг/мл.

(v) Другие вспомогательные вещества

Жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, может содержать или не содержать другие вспомогательные вещества. Например, жидкая композиция антитела, раскрытая в этом документе, дополнительно содержит регулятор тоничности. Регулятор тоничности может быть выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, лактата натрия, хлорида натрия, хлорида калия и хлорида кальция.

Эти и другие известные фармацевтические вспомогательные вещества и/или добавки, пригодные для использования в композиции, раскрытой в этом документе, хорошо известны в данной области и перечислены, например, в «The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, edited by Rowe et al., American Pharmaceuticals Association (2003)» и «Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, edited by Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins (2005)».

II. Приготовление композиции

Предметом настоящего изобретения является стабильная композиция, содержащая белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела. Белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, используемый в композиции, раскрытой в этом документе, может быть получен с использованием методик получения антител, известных в данной области. Например, белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела может быть получен рекомбинантными способами. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытый в этом документе, получают рекомбинантной экспрессией в клетках НЕК293, НЕК293Т, HEK293F или НЕК293Е, полученных путем модификации из клеток НЕК293, и в клетках СНО, CHO-S, CHO-dhfr^-, CHO/DG44 или ExpiCHO, полученных путем модификации из клеток СНО. Например, белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела получают рекомбинантным способом, как описано в заявке РСТ №PCT/CN2018/075851.

В настоящее время антитела очень часто используются в лекарственных препаратах в качестве активных ингредиентов. Методики очистки терапевтических антител до фармацевтической степени чистоты хорошо известны в данной области. Например, Tugcu et al. (Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 99 (2008) 599-613) описывает метод очистки антител с использованием трех колонок, в котором после захвата на колонке с белком А используется ионообменная хроматография (анионная ИОХ и/или катионная ИОХ). Kelley et al. (Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 101 (2008) 553-566) описывает метод очистки на двух колонках, в котором после аффинной хроматографии на белке А используется хроматография на слаборазделяющей анионообменной смоле.

Как правило, полученные рекомбинантными способами антитела, могут быть очищены с использованием традиционных методов очистки с получением лекарственной субстанции с достаточной воспроизводимостью и приемлемой чистотой, пригодной для приготовления композиций антитела. Например, после секреции антитела из рекомбинантных экспрессирующих клеток в культуральную среду супернатант из экспрессионной системы можно концентрировать с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например устройства для ультрафильтрации Amicon. Затем антитело можно очищать такими методами, как хроматография, диализ и аффинная очистка. В качестве аффинного лиганда для очистки антител IgG1, IgG2 и IgG4 можно использовать белок А. Можно также использовать другие методы очистки антител, такие как ионообменная хроматография. После получения антитела достаточной степени чистоты композиция, содержащая антитело, может быть получена в соответствии со способами, известными в данной области.

Например, получение может выполняться с использованием следующих этапов: (1) удаление после ферментации примесей, в частности клеток, из ферментативного бульона путем центрифугирования и осветления с получением супернатанта; (2) захват антитела с использованием аффинной хроматографии (например, колонки с белком А, обладающей специфической аффинностью по отношению к антителам IgG1, IgG2 и IgG4); (3) инактивация вирусов; (4) очистка (обычно может подбираться катионообменная хроматография, КОХ) для удаления примесей в белке; (5) фильтрация вирусов (для снижения титра вирусов, например более чем на 4 log10); и (6) ультрафильтрация/диафильтрация (которые могут использоваться для того, чтобы обеспечить перевод белка в буфер композиции, поддерживающий его стабильность, и сконцентрировать раствор до подходящей для инъекций концентрации). См., например, В. Minow, P. Rogge, К. Thompson, BioProcess International, Vol.10, No. 6, 2012, pp.48-57.

III. Метод анализа композиции

В процессе хранения композиций антител антитела могут претерпевать агрегацию, деградацию или химическую модификацию, что приводит к гетерогенности антител (в том числе, гетерогенности по размеру и гетерогенности по заряду), образованию агрегатов или фрагментов и тому подобного, которые могут влиять на качество композиций антител. Поэтому необходимо следить за стабильностью композиций антител.

Для изучения стабильности композиций антител существуют различные методы, которые известны в данной области. Например, могут анализировать чистоту композиции антител и могут оценивать содержание агрегатов антител такими методами, как КЭ-ДСН в восстанавливающих условиях, КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях и эксклюзионной ВЭЖХ; могут анализировать содержание заряженных изоформ в композиции антитела методом капиллярного электрофореза с изоэлектрическим фокусированием (cIEF), капиллярного изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCIEF), ионообменной хроматографии (ИОХ) и тому подобных. Кроме того, стабильность композиции можно быстро оценивать путем ее визуального осмотра внешнего вида композиции. Изменение мутности композиции также можно определять методом измерения ОП_{350 нм}, что дает информацию о количестве растворимых и нерастворимых агрегатов. Также можно определять изменение содержания белка в композиции с использованием метода спектрофотометрии в ультрафиолете (метод УФ-спектрофотометрии).

КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях представляет собой метод определения чистоты антител с использованием капилляра в качестве разделительного канала. В методе КЭ-ДСН миграция белка определяется поверхностным зарядом, который зависит от количества связанного ДСН и пропорционален молекулярной массе белка. Поскольку все комплексы ДСН-белок имеют сходные соотношения «масса/заряд», находящийся внутри капилляра гель, представляющий собой матрицу молекулярного сита, позволяет проводить электрофоретическое разделение, основанное на размере или гидродинамическом радиусе молекул. Этот метод широко используется для контроля чистоты денатурированных интактных антител. Как правило, при КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях исследуемый образец смешивают с буфером для образцов, содержащим ДСН, и йодацетамидом. После этого смесь можно инкубировать при 68-72°С в течение примерно 10-15 мин, и затем охладить до комнатной температуры с последующим центрифугированием супернатанта для проведения анализа. Миграцию белков обнаруживают с помощью ультрафиолетового детектора для получения электрофоре граммы. Чистоту композиции антитела можно количественно выражать как процент, приходящийся на площадь основного пика IgG, от общей площади всех пиков. Более подробное описание метода КЭ-ДСН приведено, например, в статье Richard R. et al., Application of СЕ SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products, Electrophoresis, 2008, 29, 3612-3620.

Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (эксклюзионная ВЭЖХ) представляет собой другой важный метод стандартизации и контроля качества антител. В этом методе молекулы разделаются главным образом на основе различий в их размерах или гидродинамических радиусах. С помощью метода эксклюзионной ВЭЖХ антитела могут быть разделены на три основные фракции: высокомолекулярная фракция (ВМФ), основной пик (главным образом, мономерное антитело) и низкомолекулярная фракция (НМФ). Чистоту антитела можно количественно выражать как процент, приходящийся на площадь основного пика, от общей площади всех пиков на хроматограмме. Метод эксклюзионной ВЭЖХ позволяет измерять процентное содержание мономерного антитела в композиции, из чего можно сделать вывод о содержании растворимых агрегатов и продуктов расщепления. Более подробное описание метода эксклюзионной ВЭЖХ приведено, например, в статьях J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994); Pharm. Res., 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal, 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986). Помимо этих статей, также см., например, R. Yang et al., High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography (SE-UHPLC), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032 и Alexandre Goyon et al., Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies, I-Non-denaturing chromatographic techniques, Journal of Chromatography, http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010.

Метод капиллярного изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCIEF) может быть использован для анализа гетерогенности антител по заряду. С помощью этого метода можно количественно оценивать распределение заряженных изоформ. В методе iCIEF разделяются молекулы на основе различий в их зарядах в градиенте рН (по кажущемуся значению pI). В методе iCIEF разделительная колонка, как правило, представляет собой короткий капилляр (например, кварцевый капилляр длиной 5 см и внутренним диаметром 100 мкм), белки фокусируются в капиллярной колонке, находящейся под высоким напряжением, и за их фокусировкой наблюдают онлайн в режиме реального времени благодаря системе визуализации с детектированием всей колонки при 280 нм. Преимущество этого метода заключается в том, что система детектирования всей колонки позволяет одновременно регистрировать различные заряженные изоформы, присутствующие в образце антитела. Как правило, при анализе методом iCIEF образец смешивают с мочевиной и буфером для iCIEF, содержащим метилцеллюлозу, стандарты pI и молекулярной массы, и амфолиты. Затем, после фокусировки образца в течение определенного периода времени в iCIEF-анализаторе, таком как анализатор iCE280 (Protein Simple, Santa Clara, CA, США), с помощью iCIEF-колонки, такой как сборная iCIEF-колонка ProtionSimple, измеряют поглощение при 280 нм для получения спектра сфокусированных заряженных изоформ антитела. В iCEIF-спектре связанные с белком пики, которые элюируются до основного пика (то есть главного компонента), определяют, как кислотные компоненты, а связанные с белком пики, которые элюируются после основного пика, определяют как основные компоненты. Относительные количества главного компонента, кислотного компонента и основного компонента, можно выразить в виде процента от общей площади пиков. Более подробное описание метода iCIEF приведено, например, в статьях Salas-Solano О et al., Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies: an interlaboratory study, J Sep Sci. 2012 Nov.; 35(22):3124-9. doi: 10.1002/jssc.201200633. Epub 2012 Oct. 15; и Dada OO et al., Characterization of acidic and basic variants of IgG1 therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation, Electrophoresis. 2015 Nov.; 36(21-22):2695-2702. doi: 10.1002/elps.201500219. Epub 2015 Sep.18.

Заряженные изоформы антитела в композиции антитела также можно определять методом катионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (КОХ-ВЭЖХ). В этом методе пики, которые элюируются с колонки для КОХ-ВЭЖХ раньше времени удерживания основного пика, обозначают как «кислотные пики», а пики, которые элюируются с колонки для КОХ-ВЭЖХ позже времени удерживания основного пика, обозначают как «основные пики».

Для проверки стабильности препаратов можно использовать ускоренные исследования стабильности, которые облегчают скрининг стабильных фармацевтических композиций. Например, для ускоренного исследования стабильности образцы композиции можно помещать на хранение при повышенной температуре, например при температуре примерно 40±2°С или 25±2°С. К числу исследуемых параметров могут относиться внешний вид, содержание видимых частиц, содержание белка, мутность, чистота (эксклюзионной ВЭЖХ и КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях) и содержание заряженных изоформ (iCIEF и КОХ-ВЭЖХ).

Кроме того, можно анализировать эффективность или биологическую активность антитела. Например, можно проверять способность антитела в составе композиции связываться со своими антигенными молекулами (молекулой HER2 и молекулой PD-1). Специалистам в данной области известны различные методы количественной оценки специфического связывания антитела с антигеном, такие как иммуноферментные анализы, например ELIS А.

Композиция белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытая в этом документе, является стабильной. В одном варианте осуществления изобретения чистота белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции антитела, раскрытой в этом документе, составляет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, или выше после хранения при температуре примерно 5°С, 25°С, 37°С, 40°С или 45°С в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев или 3 месяцев, например после хранения при температуре 5±3°С в течение 3 месяцев, при измерении методом эксклюзионной хроматографии или КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции антитела, раскрытой в этом документе, приходится на неосновные и некислотные изоформы (то есть на основной пик или главную заряженную изоформу) после хранения при температуре примерно 5°С, 25°С, 37°С, 40°С или 45°С в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев или 3 месяцев, например после хранения при температуре 5±3°С в течение 3 месяцев при измерении методом iCIEF.

IV. Использование композиции

Композиция антитела, содержащая белок анти-PD- 1/HER2 биспецифического антитела, раскрытый в этом документе, может использоваться для лечения, предотвращения или замедления развития различных заболеваний или расстройств, связанных с сигнальным путем, зависимым от HER2, и/или сигнальным путем, зависимым от PD-1. «Заболевания или расстройства, связанные с сигнальным путем, зависимым от HER2», и/или «заболевания или расстройства, связанные с сигнальным путем, зависимым от PD-1», в настоящем документе относятся к заболеваниям или расстройствам, которые можно лечить (например, улучшать) или предотвращать с помощью композиции белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытой в этом документе. Для настоящего изобретения подходит любое заболевание или расстройство, для которого лечение композицией антитела, раскрытой в этом документе, может принести пользу.

Композиция, содержащая белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, раскрытая в этом документе, может использоваться для профилактики или лечения различных заболеваний крови или солидных опухолей, включая, помимо прочего, лейкоз, лимфому, миелому, опухоль головного мозга, плоскоклеточную карциному головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, рак носоглотки, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, холангиокарциному, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак эндометрия, саркому матки, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, почечно-клеточную карциному и меланому.

Предметом настоящего изобретения также является использование композиции, раскрытой в этом документе, для приготовления лекарственного средства для доставки белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела млекопитающему или для лечения, предотвращения или улучшения течения одного или более заболеваний и расстройств, описанных выше. Предпочтительно, млекопитающим является человек.

Композицию антитела, раскрытую в этом документе, можно вводить субъекту или пациенту различными способами. Например, введение может быть осуществлено инфузией или с помощью шприца. Соответственно, в одном аспекте, предметом настоящего изобретения является устройство для доставки (например, шприц), содержащее композицию антитела, раскрытую в этом документе (например, предварительно наполненный шприц). Пациент получит эффективное количество белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в качестве первичного активного ингредиента, то есть количество, достаточное для лечения, предотвращения или улучшения течения заболевания или расстройства, представляющего интерес.

Терапевтический эффект может включать ослабление физиологических симптомов. Оптимальные эффективные количество и концентрация антитела для любого конкретного субъекта будет зависеть от различных факторов, включая возраст, вес, состояние здоровья и/или пол пациента, природу и степень распространения заболевания, активность конкретного антитела, его выведение из организма, а также любые другие возможные препараты, применяемые в комбинации с композицией антитела. В конкретном случае, эффективное доставляемое количество врач может определять, основываясь на своем суждении. В зависимости от заболевания, которое требуется лечить, эффективная доза может варьировать от примерно 0,005 мг/кг массы тела до примерно 50 мг/кг массы тела, или от 0,1 мг/кг массы тела до примерно 20 мг/кг массы тела. В этом аспекте, определенный ориентир может дать опыт применения известных лекарственных препаратов на основе антител. Дозировка может вводиться однократно или многократно.

Для того чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, ниже приведены следующие примеры. Эти примеры не предназначены для ограничения объема правовой охраны настоящего изобретения и не должны каким-либо образом интерпретироваться как таковые.

Сокращения

КЭ-ДСН: капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия ELIS А: твердофазный иммуноферментный анализ

iCIEF: капиллярное изоэлектрическое фокусирование под визуализационным контролем Эксклюзионная ВЭЖХ: эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография Примеры

Для того чтобы разработать состав композиции, пригодный для длительного стабильного хранения инъекционного раствора рекомбинантного биспецифического антитела против рецептора белка 1 программируемой смерти (PD-1) и рецептора 2 эпидермального фактора человека (HER2), а также для обеспечения контролируемого качество препарата в течение всего его срока годности (по меньшей мере 24 месяцев), было спланировано скрининговое исследование составов с целью изучения влияния различных вспомогательных веществ на стабильность композиции анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела. Ниже перечислены материалы и методы, использованные в этих исследованиях.

Материалы и методы

1.1. Материалы, использованные в исследовании составов композиции по настоящему изобретению

Примечание: НП означает «неприменимо».

1.2. Приборы и оборудование

1.3. Исследуемые параметры и методы изучения стабильности композиции

Определяли следующие параметры композиции антитела: (1) внешний вид и присутствие видимых частиц; (2) содержание белка в композиции, которое определяли методом спектрофотометрии в ультрафиолете (УФ-спектрофотометрия); (3) мутность, которую определяли путем измерения поглощения света при 350 нм; (4) чистота композиции антитела, которую определяли методом эксклюзионной хроматографии (например, эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ)) и выражали в виде процента, приходящегося на площадь пика мономера, от суммы площадей всех пиков; (5) чистота композиции антитела, которую определяли методом капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих условиях (КЭ-ДСН в восст.усл.) и/или капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в невосстанавливающих условиях (КЭ-ДСН в невосст.усл.) и выражали в виде процента, приходящегося на площадь пика мономера, от суммы площадей всех пиков; (6) содержание заряженных изоформ в композиции антитела, которое определяли методом капиллярного изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCIEF) и выражали в виде процента, приходящегося на главный компонент, кислотный компонент и основный компонент; (7) относительная активность связывания анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела в композиции антитела с антигенами PD-1 и HER2, которую определяли методом иммуноферментного анализа, например прямым методом ELISA.

Обнаружение видимых частиц

Видимые частицы в образце обнаруживали с помощью детектора прозрачности (модель YB-2, Tianda Tianfa, Тяньцзинь) с использованием метода, описанного в Фармакопея Китайской народной республики Национального фармакопейного комитета (издание 2015 г., том IV

Общие правила 0904 «Испытание на видимые частицы»), Пекин, China Medical Science Press, 2015.

Определение содержания белка

Содержания белка в образце определяли с помощью спектрофотометра в ультрафиолетовой области спектра (модель UV-1800, Shimadzu, Япония).

Определение мутности

Мутность образца определяли путем измерения поглощения света при 350 нм с использованием спектрофотометра в ультрафиолетовой области спектра (модель UV-1800, Shimadzu, Япония).

Чистота (эксклюзионная ВЭЖХ)

Разделение проводили с использованием колонки для ЭХ с фосфатным буфером (3,12 г натрия дигидрофосфата дигидрата, 8,77 г натрия хлорида и 34,84 г аргинина, растворенных в ультрачистой воде, с доведением рН до 6,8 путем добавления хлористоводородной кислоты, и доведением объема до 1000 мл) в качестве подвижной фазы. В качестве защитного раствора для хроматографической колонки использовали 0,05% (масс./об.) раствор NaN₃, объем вводимого раствора составлял 50 мкл, скорость потока составляла 0,5 мл/мин, время сбора составляла 30 мин, температура колонки составляла 25°С, а длина волны детектирования составляла 280 нм. Для использования в качестве испытуемого раствора образец разводили до концентрации 2 мг/мл ультрачистой водой. Для приготовления холостого раствора буфер композиции разводили, как описано выше. Холостой раствор и испытуемый раствор по отдельности вводили в жидкостной хроматограф в количестве 50 мкл на одно определение.

Чистота (КЭ-ДСН в восстанавливающих условиях)

Исследование проводили методом капиллярного гель-электрофореза. Использовали непокрытый капилляр с внутренним диаметром 50 мкм, общей длиной 30,2 см и эффективной длиной 20,2 см. До проведения электрофореза капиллярную колонку промывали раствором гидроксида натрия 0,1 моль/л, хлористоводородной кислотой 0,1 моль/л и ультрачистой водой, и промывали гель для электрофореза при давлении 70 фунтов на кв. дюйм. Образец разводили до концентрации 2,0 мг/мл надлежащим количеством ультрачистой воды. Переносили 50 мкл разведенного образца в пробирку для центрифугирования объемом 1,5 мл и добавляли 45 мкл буфера для образца с рН 6,5, 1 мкл внутреннего стандарта (белок 10 кДа, 5 мг/мл; Beckman Coulter, № по каталогу 390953) и 5 мкл β-меркаптоэтанола. Буфер для образца готовили следующим образом: 0,32 г моногидрата лимонной кислоты и 2,45 г динатрия фосфата додекагидрата растворяли в 45 мл ультрачистой воды и доводили объем до 50 мл для получения цитрат-фосфатного буфера; к 200 мкл полученного буфера добавляли 80 мкл 10% (масс./об.) раствора додецилсульфата натрия, доводили объем до 1 мл водой и хорошо перемешивали смесь. Смесь хорошо перемешивали, нагревали до температуры 70±2°С в течение 10±2 мин, охлаждали до комнатной температуры и переносили во флакон для образца для дальнейшего использования в качестве испытуемого раствора. Буфер композиции того же объема, что и образец, обрабатывали тем же способом, как описано выше, для получения холостого раствора. Условия для ввода образца: -5 кВ в течение 20 с; напряжение разделения: -15 кВ в течение 35 мин. Температура капиллярной колонки поддерживалась на уровне 25°С а длина волны детектирования составляла 220 нм.

Чистота (КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях)

Исследование проводили методом капиллярного гель-электрофореза. Использовали непокрытый капилляр с внутренним диаметром 50 мкм, общей длиной 30,2 см и эффективной длиной 20,2 см. До проведения электрофореза капиллярную колонку промывали раствором гидроксида натрия 0,1 моль/л, хлористоводородной кислотой 0,1 моль/л и ультрачистой водой, и промывали гель для электрофореза при давлении 70 фунтов на кв. дюйм. Образец разводили до концентрации 2,0 мг/мл надлежащим количеством ультрачистой воды. Переносили 50 мкл разведенного образца в пробирку для центрифугирования объемом 1,5 мл и добавляли 45 мкл буфера для образца с рН 6,5, 1 мкл внутреннего стандарта (белок 10 кДа, 5 мг/мл; Beckman Coulter, № по каталогу 390953) и 5 мкл раствора NEM 250 ммоль/л (62 мг N-этилмалеимида, растворенного в 2 мл ультрачистой воды). Буфер для образца готовили следующим образом: 0,32 г лимонной кислоты моногидрата и 2,45 г динатрия фосфата додекагидрата растворяли в 45 мл ультрачистой воды и доводили объем до 50 мл для получения цитрат-фосфатного буфера; к 200 мкл полученного буфера добавляли 80 мкл 10% (масс./об.) раствора додецилсульфата натрия, доводили объем до 1 мл водой и хорошо перемешивали смесь. Смесь хорошо перемешивали, нагревали до температуры 70±2°С в течение 10±2 мин, охлаждали до комнатной температуры и переносили во флакон для образца для дальнейшего использования в качестве испытуемого раствора. Буфер композиции того же объема, что и образец, обрабатывали тем же способом, как описано выше, для получения холостого раствора. Условия для ввода образца: -5 кВ в течение 20 с; напряжение разделения: -15 кВ в течение 35 мин. Температура капиллярной колонки поддерживалась на уровне 25°С а длина волны детектирования составляла 220 нм.

Заряженные изоформы (iCIEF)

Определение проводили методом капиллярного изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCIEF). Использовали капилляр с внутренним диаметром 100 мкм и общей длиной 5 см. Перед проведением электрофореза капиллярную колонку промывали 0,5%-ным раствором метилцеллюлозы (далее сокращенно «раствор МЦ») и ультрачистой водой. Образец вводили в вакууме, предварительное фокусирование проводили при 1,5 кВ в течение 1 мин, фокусирование проводили при 3 кВ в течение 8 мин, время введения образца составляло 55 с, температура лотка для образцов составляла 10°С, а длина волны детектирования составляла 280 нм. В качестве катодного стабилизатора использовали раствор аргинина 500 ммоль/л, а для уменьшения адгезии между белком и капилляром добавляли 0,5% раствор МЦ. Образец разводили до концентрации 1,0 мг/мл водой, 20 мкл разведенного образца добавляли к 78 мкл предварительно перемешанного раствора и хорошо перемешивали смесь для получения испытуемого раствора. Предварительно перемешанный раствор содержал следующие компоненты: 70 мкл 0,5% раствора МЦ (pI), 4 мкл амфолита (рН 3-10), 2 мкл катодного стабилизатора, 1 мкл маркера с pI 5,85 и 1 мкл маркера с pI 9,99. Испытуемый раствор вводили в хроматограф для анализа, и содержание главного компонента, кислотного компонента и основного компонента рассчитывали с помощью метода нормализации площадей.

Относительная активность связывания (прямой метод ELISA)

Антиген разводили до концентрации 0,5 мг/мл с помощью CBS, после чего покрывали антигеном лунки 96-луночного микропланшета путем внесения в них полученного раствора в количестве 100 мкл/лунку и инкубировали при 4°С в течение ночи (для определения относительной активности связывания анти-PD-1 компонента анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела с PD-1 использовали рекомбинантный человеческий PD-1 компании Sinobiological (№ по каталогу: 10377-Н08Н); для определения относительной активности связывания анти-HER2 компонента анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела с HER2 использовали человеческий белок HER2/ErbB2 (с His-меткой) компании Sinobiological (№ по каталогу: 10004-Н08Н-100)). После промывки лунки микропланшета блокировали блокирующим раствором (2% BSA-PBST, 300 мкг/лунка) при 37°С в течение 2 ч. Анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело разводили до концентрации 3 мкг/мл 2%-ным BSA-PBST и делали серию 3-кратных разведений для получения 11 концентраций (0,05-3000 нг/мл). После удаления блокирующего раствора в лунки микропланшета добавляли растворы, полученные в результате серии разведений образца, в количестве 100 мкл/лунку. В лунки с отрицательным контролем добавляли только 100 мкл раствора для разведения (2% BSA-PBST). Планшет инкубировали при температуре 37°С в течение 60 мин в термостатируемом инкубаторе. После промывки планшета в лунки добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антитела против Fc-фрагмента человеческого IgG (BETHYL, США, № по каталогу: А80-104Р), разведенные в 2%-ном BSA-PBST, в качестве вторичного антитела (разведение в 100000 раз, 100 мкл/лунку), и проводили реакцию при температуре 37°С в течение 30 мин. После промывки планшета в лунки добавляли по 100 мкл хромогенного раствора ТМВ, и через 10 мин останавливали хромогенную реакцию путем добавления 100 мкл раствора H₂SO₄ с концентрацией 1 моль/л в каждую лунку. Измеряли значение оптической плотности (ОП) при 450 нм с использованием длины волны 620 нм в качестве референтной. Принимая значения концентрации образца при всех градиентах концентрации за значения по оси абсцисс, а значения ОП_{450 нм}-ОП_{620 нм} образца при всех градиентах концентрации за значения по оси ординат, с помощью четырех-параметрической аппроксимации с помощью программы Prism рассчитывали значения ЕС₅₀, отражающие активность связывания антитела с каждым антигеном.

Пример 1. Получение и очистка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела

Анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело получали и очищали, как описано в заявке РСТ №PCT/CN2018/075851.

Конкретно, были сконструированы экспрессионные векторы X0GC, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь антитела против PD-1 человека соответственно (конструирование экспрессионных векторов X0GC описано в китайской заявке на патент №200780038403.3), в которых нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи имеет SEQ ID NO: 9, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 10; нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи имеет SEQ ID NO: 3, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 4; нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 11, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 12; нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 14.

Были сконструированы экспрессионные векторы X0GC, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь антитела против HER2 человека соответственно, в которых нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи имеет SEQ ID NO: 1, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 2; нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи имеет SEQ ID NO: 3, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 4; нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 5, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 6; нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 7, а ее аминокислотная последовательность имеет SEQ ID NO: 8.

Экспрессионные векторы, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь антитела против PD-1 человека соответственно, переносили путем трансфекции в клетки 293F (клетки FreeStyle™ 293-F, № по каталогу: R79007, Invitrogen), после чего осуществляли процессы их экспрессии, очистки и восстановления, в результате чего получали молекулу полуантитела против PD-1, содержащую одну тяжелую цепь и одну легкую цепь.

Сходным образом, экспрессионные векторы, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь антитела против HER2 человека соответственно, переносили путем трансфекции в клетки 293F (клетки FreeStyle™ 293-F, №по каталогу: R79007, Invitrogen), после чего осуществляли процессы их экспрессии, очистки и восстановления для получения молекулы полуантитела против HER2, содержащей одну тяжелую цепь и одну легкую цепь.

Восстановленные молекулы полуантитела против PD-1 и восстановленные молекулы полуантитела против HER2 смешивали в эквимолярном отношении, и подвергали смесь реакции рекомбинации при 4°С в течение 24 ч, в результате чего получали раствор биспецифического антитела, содержащий гетеродимеры молекулы полуантитела против PD-1 и молекулы полуантитела против HER2. Раствор концентрировали методом ультрафильтрации с использованием пробирки для ультрафильтрационного концентрирования, а затем очищали при 4°С с использованием системы для очистки белков АКТА explorer 100 type (GE Healthcare) и колонки для ионной хроматографии Source 15S (внутр. диам. 16 мм, 17 мл, GE Healthcare), в результате чего получали анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело с чистотой 99,96%.

Пример 2. Исследование влияния рН на стабильность композиции (I)

В этом примере изучали стабильность композиций анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела, рН которых варьировал от 5,0 до 6,5. Всего использовали 4 разные значения рН, а именно: 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5.

2.1. Методики эксперимента

Готовили буфер 10 мМ гистидина-5% (масс./об.) сорбита, и доводили его рН до 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 разбавленной хлористоводородной кислотой. Очищенное анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело, полученное в примере 1, путем смены буфера методом ультрафильтрации переводили в растворы с различными значениями рН. Содержание белка биспецифического антитела в образцах после смены буфера доводили примерно до 20 мг/мл, а затем добавляли полисорбат-80 до конечной концентрации полисорбата-80 равной 0,30 мг/мл. Растворы фильтровали и распределяли по флаконам, которые затем закрывали пробками и укупоривали колпачками. Стабильность образцов исследовали при температуре 40±2°С; конкретная схема эксперимента приведена в таблице 1.

Примечание: (1) х указывает отбор образца, выполняемый в этот момент времени. (2) После отбора образцов в указанные моменты времени их сначала помещали в морозильную камеру для хранения при сверхнизкой температуре и замораживали при -80°С до последующего исследования, а затем по мере необходимости размораживали для проведения исследования.

2.2. Критерии

Исходя из известных характеристик препарата, а также точности прибора и метода, были установлены критерии отсутствия изменений в параметрах исследуемого образца по сравнению с начальными значениями, которые позволяли определить, изменился ли образец (подробности см. в таблице 2).

2.3. Экспериментальные результаты скринингового исследования (I) составов

(1) Внешний вид и видимые частицы

После хранения при температуре 40±2°С в течение одного месяца образцы с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 по-прежнему соответствовали стандарту в отношении внешнего вида и видимых частиц.

(2) Содержание белка

Результаты определения содержания белка в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 после хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени показаны в таблице 3. Из этих результатов видно, что образцы с разными рН после хранения при температуре 40±2°С в течение 1 месяца существенно не изменились.

(3) Мутность

Результаты определения мутности в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 после хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени показаны в таблице 4, а динамика изменения мутности показана на ФИГ. 2. Результаты показывают, что мутность образцов с разными рН после хранения при температуре 40±2°С в течение 1 месяца увеличивалась, причем чем выше значение рН, тем выше степень изменения мутности.

(4) Чистота

После хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени чистоту белка в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 5, а динамика изменения показана на ФИГ. 3. Из этих результатов видно, что чистота образцов с разными рН после исследования при температуре 40±2°С в течение 1 месяца существенно не изменилась.

После хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени чистоту белка в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 определяли методом КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях. Результаты приведены в таблице 6, а динамика изменения показана на ФИГ. 4. Из этих результатов видно, что по сравнению с чистотой образца в день 0, значения чистоты образцов с разными рН после исследования при температуре 40±2°С в течение 1 месяца уменьшилась на 2,6%; 2,5%; 2,5% и 3,2% соответственно.

После хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени чистоту белка в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 определяли методом КЭ-ДСН в восстанавливающих условиях. Результаты приведены в таблице 7, а динамика изменения показана на ФИГ. 5. Из этих результатов видно, что, по сравнению с чистотой образца в день 0, значения чистоты образцов с разными рН после исследования при температуре 40±2°С в течение 1 месяца уменьшилась на 0,4%; 0,7%; 0,6% и 1,4% соответственно.

(5) Заряженные изоформы

После хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени содержание заряженных изоформ в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 определяли методом iCIEF. Результаты приведены в таблице 8, а динамика изменения показана на ФИГ. 6. Из этих результатов видно, что после исследования при температуре 40±2°С в течение 1 месяца содержание главного компонента, а также кислотного и основного компонентов в образцах с разными рН существенно не изменилось. Чем выше значение рН, тем быстрее снижалось содержание главного компонента в образце и тем быстрее увеличивалось содержание кислотного компонента.

(6) Относительная активность связывания

После хранения при температуре 40±2°С в течение различных периодов времени относительную активность связывания в образцах с рН 5,0; 5,5; 6,0 и 6,5 определяли прямым методом ELISA. Результаты приведены в таблице 9. Результаты показывают, что: после исследования при температуре 40±2°С в течение 2 недель относительная активность связывания с антигеном PD-1 и с антигеном HER2 для каждого образца составляла более 70%; относительная активность связывания анти-HER2 компонента в образцах с рН 6,0 и 6,5 заметно снизилась и в обоих этих случаях составляла менее 70%; после исследования при температуре 40±2°С в течение 1 месяца относительная активность связывания с антигеном PD-1 для каждого образца по-прежнему составляла более 70% и только в случае образцов с рН 6,0 и 6,5 относительная активность связывания с антигеном HER2 была ниже 70%, но все еще выше 50%.

Результаты, полученные в исследовании влияния рН на стабильность композиций, показывают, что: после хранения анти-PD-1/HER2 биспецифических антител при рН 5,0-6,5 при температуре 40±2°С в течение 2 недель образцы продолжали соответствовать стандарту в отношении внешнего вида и видимых частиц, содержание белка в них существенно не изменилось, а относительная активность связывания с антигеном HER2 и антигеном PD-1 также заметно не изменилась; кроме того, после хранения анти-PD-1/HER2 биспецифических антител при рН 5,0-6,5 при температуре 40±2°С в течение одного месяца образцы продолжали соответствовать стандарту в отношении внешнего вида и видимых частиц, содержание белка в них существенно не изменилось, и относительная активность связывания с антигеном PD-1 также заметно не изменилась, а относительная активность связывания анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела с антигеном HER2 в условиях хранения при рН 6,0 и 6,5 снизилась, но все еще была выше 50%. Таким образом, для экспериментов, описанных в приведенных ниже примерах, из рН 5,0-6,5 было выбрано значение рН 5,5.

Пример 3. Скрининговое исследование составов

3.1. Скрининговое исследование стабилизаторов

Была изучена способность различных стабилизаторов (сорбита как полиола; сахарозы и трегалозы как сахаридов; метионина как антиоксиданта и т.п.) оказывать влияние на стабильность композиции, содержащей анти- PD-1/HER2 биспецифическое антитело.

3.1.1. Методики скрининга стабилизаторов

Готовили 4 состава, как указано в таблице 10. Буферы, входящие в эти составы, готовили в соответствии с таблицей 10, а анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело переводили в растворы соответствующих составов путем смены буфера методом ультрафильтрации. Содержание белка в каждом растворе состава после смены буфера доводили примерно до 50,0 мг/мл, а затем добавляли полисорбат-80 до конечной концентрации полисорбата-80 равной 0,20 мг/мл. Растворы фильтровали и распределяли по флаконам, которые затем закрывали пробками и укупоривали колпачками. Стабильность образцов исследовали при температурах 40°С, 25°С и 5°С; конкретная схема исследования показана в таблице 11. К числу исследуемых параметров относились внешний вид, содержание видимых частиц, содержание белка, чистота (ЭХ-ВЭЖХ и КЭ-ДСН) и содержание заряженных изоформ (iCIEF).

3.1.2. Критерии оценки

Конкретные критерии оценки приведены в таблице 2 в примере 2.

3.1.3. Скрининговое исследование стабилизаторов (1) Внешний вид и видимые частицы

Параметры стабильности определяли в течение 1 месяца в случае хранения при 40°С, в течение 2 месяцев в случае хранения при 25±2°С и в течение 3 месяцев в случае хранения при 5±3°С; результаты показывают, что образцы всех составов соответствовали стандарту в отношении внешнего вида и видимых частиц.

(2) Содержание белка

Параметры стабильности определяли в течение 1 месяца в случае хранения при 40°С, в течение 2 месяцев в случае хранения при 25±2°С и в течение 3 месяцев в случае хранения при 5±3°С; результаты определения содержания белка в образцах всех составов показаны в таблице 12. Результаты показывают, что содержание белка в четырех составах в условиях хранения при разных температурах 40°С, 25±2°С и 5±3°С не изменилось.

(3) Чистота

Чистота (ЭХ-ВЭЖХ): результаты приведены в таблице 13. Результаты показывают, что: в образцах всех составов после исследования при температуре 40°С в течение 4 недель чистота существенно не менялась; в образцах всех составов после исследования при температуре 25±2°С в течение 2 месяцев чистота существенно не менялась; в образцах всех составов после исследования при температуре 5±3°С в течение 3 месяцев чистота существенно не менялась.

Чистота (КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях): результаты приведены в таблице 14. Результаты показывают что: в образцах всех составов после исследования при температуре 40°С в течение 4 недель чистота существенно не менялась; в образцах всех составов после исследования при температуре 25±2°С в течение 2 месяцев чистота существенно не менялась; в образцах всех составов после исследования при температуре 5±3°С в течение 3 месяцев чистота существенно не менялась.

Чистота (КЭ-ДСН в восстанавливающих условиях): результаты приведены в таблице 15. Результаты показывают, что: в образцах всех составов после исследования при температуре 40°С в течение 4 недель чистота существенно не менялась; в образцах всех составов после исследования при температуре 25±2°С в течение 2 месяцев чистота существенно не менялась; в образцах всех составов после исследования при температуре 5±3°С в течение 3 месяцев чистота существенно не менялась.

(4) Заряженные изоформы (iCIEF)

Заряженные изоформы (iCIEF): результаты приведены в таблице 16. Динамика изменения в содержании заряженной изоформы (главного компонента) в образцах разных составов, хранившихся при температуре 40°С и 25±2°С, показана на ФИГ. 7 и ФИГ. 8 соответственно.

Результаты показывают, что: после исследования при температуре 40°С в течение 4 недель содержание главного компонента, а также содержание кислотного и основного компонентов заряженных изоформ в образцах всех составов существенно изменились: содержание главного компонента снизилось, а содержание кислотного компонента увеличилось; при этом динамика изменения в образцах была практически одинаковой, и существенных различий между составами 1-4 не наблюдалось. После ускоренного испытания с хранением при температуре 25±2°С в течение 2 месяцев содержание главного компонента, а также содержание кислотного и основного компонентов заряженных изоформ в образцах всех составов существенно изменились: содержание главного компонента снизилось, а содержание кислотного компонента увеличилось; при этом динамика изменения в составах была практически одинаковой, и существенных различий между составами 1-4 не наблюдалось. После исследования при температуре 5±3°С в течение 3 месяцев содержание главного компонента, а также содержание кислотного и основного компонентов заряженных изоформ в образцах всех составов существенно не изменились.

Результаты эксперимента по оценке составов показывают, что составы 14 относительно воспроизводимы с точки зрения динамики изменений параметров стабильности, и существенных различий между ними не наблюдается. С точки зрения простоты состава, составы 1, 2 и 3, содержащие только один стабилизатор, существенно не различались по способности защищать белок, и был выбран состав 2, учитывая последующую разработку лиофилизированной лекарственной формы. Для обеспечения безопасности дальнейшего производства концентрированная хлористоводородная кислота, входящая в состав 2 в качестве компонента буферной системы и используемая для доведения рН, была заменена на гистидин и гистидина гидрохлорид. Чтобы гарантировать стабильность композиции обновленного состава, был проведен следующий эксперимент.

Пример 4: Эксперимент для подтверждения стабильности состава

4.1. Разработка состава и схема эксперимента

Был разработан состав 5, и подробное описание получения состава 5 показано в таблице 17.

Схема эксперимента для подтверждения состава приведена в таблице 18.

4.2. Результаты эксперимента

Результаты форсированного испытания (хранение при 40°С) приведены в таблице 19. После хранения при температуре 40°С в течение 4 недель образец соответствовал стандарту в отношении внешнего вида, видимых частиц и биологической активности, содержание белка и чистота (ЭХ-ВЭЖХ и КЭ-ДСН) существенно не изменились; а изменились только содержание главного компонента (заряженной изоформы) (iCIEF) (снизилось на 16,0%), содержание кислотного компонента (увеличилось на 14,0%) и содержание основного компонента (увеличилось на 2,0%).

Результаты показывают, что по динамике изменения параметров стабильности раскрытая в этом документе композиция, содержащая 42,0 мг/мл биспецифического антитела, включающего рекомбинантное полностью человеческое полуантитело против рецептора белка 1 программируемой смерти (PD-1) и гуманизированное полуантитело против рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) состава 5 (0,85 мг/мл гистидина, 3,17 мг/мл гистидина гидрохлорида, 80,00 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата-80, рН 5,5), в целом совпадает с композицией состава 2 из примера 3.

Таким образом определено, что наиболее предпочтительным составом композиции является следующий состав: примерно 42,0 мг/мл биспецифического антитела, включающего рекомбинантное полностью человеческое полуантитело против рецептора белка 1 программируемой смерти (PD-1) и гуманизированное полуантитело против рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), 0,85 мг/мл гистидина, 3,17 мг/мл гистидина гидрохлорида, 80,00 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата-80, рН 5,5.

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения описаны выше. Специалисты в данной области должны понимать, что эти варианты приведены лишь в целях иллюстрации и что, не выходя за объем настоящего изобретения, могут быть осуществлены их различные другие замены, адаптации и модификации. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления изобретения, перечисленными в этом документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd.; Beijing Hanmi Pharm. Co., Ltd.

<120> КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИ-PD-1/HER2 БИСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА,

СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

<130>

<160> 14

<170> PatentIn, версии 3.3

<210> 1

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела против HER2 человека

<400> 1

gacattcaga tgactcagag cccttcttca ctgtcagctt ccgtgggcga cagagtcact 60

atcacctgcc gcgcaagtca ggatgtgaac accgcagtcg cctggtacca gcagaagcct 120

ggcaaagctc caaagctgct gatctacagc gcatctttcc tgtattctgg agtgcccagt 180

aggtttagtg ggtcacggtc cggtaccgac ttcacactga ctatctccag cctgcagcct 240

gaggattttg ccacatacta ttgccagcag cactatacca caccccctac tttcggccag 300

ggaaccaaag tggagatcaa g 321

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела против HER2 человека

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область легкой цепи антитела против HER2 человека

<400> 3

cgaactgtgg ccgctccaag cgtcttcatt tttccaccct ctgacgaaca gctgaagtca 60

gggacagctt ccgtggtctg tctgctgaac aatttttacc ccagggaggc caaagtgcag 120

tggaaggtcg ataacgctct gcagagcgga aattctcagg agagtgtgac agaacaggac 180

tcaaaagatt ccacttatag cctgtctagt accctgacac tgtccaaggc agactacgaa 240

aagcataaag tgtatgcctg tgaggtcaca catcagggtc tgtcaagccc cgtcactaag 300

tccttcaatc gtggcgaatg c 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область легкой цепи антитела против HER2 человека

<400> 4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела против HER2 человека

<400> 5

gaggtgcagc tggtcgaaag tgggggtggg ctggtgcagc caggcggatc actgaggctg 60

tcctgcgccg ctagcggctt caacatcaaa gacacctata ttcactgggt ccgacaggca 120

ccagggaagg gtctggaatg ggtggctcgt atctacccta caaatggtta cactagatat 180

gccgactccg tgaaaggccg gtttactatt tctgctgata ccagtaagaa cacagcatac 240

ctgcagatga atagcctgag ggctgaggat accgcagtgt actattgctc tcggtggggg 300

ggtgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggaa ctctggtcac cgtgtccagc 360

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела против HER2 человека

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 990

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи антитела против HER2 человека

<400> 7

gcttcaacaa aaggaccttc cgtgtttcca ctggcaccct ctagtaagag tacttcagga 60

ggaaccgcag cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 120

tggaacagtg gagcactgac ctccggggtc catacatttc ctgccgtgct gcagtcatcc 180

ggtctgtata gcctgagctc tgtggtcaca gtcccaagtt catccctggg cacccagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caaaccttcc aatactaagg tcgacaagaa agtggaacca 300

aaaagctgtg ataagactca tacctgccca ccttgtcctg caccagagct gctgggaggt 360

ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagccc aaagacacac tgatgatttc tcgcacaccc 420

gaagtcactt gtgtggtcgt ggacgtgtcc cacgaggatc ctgaagtcaa gttcaactgg 480

tacgtggatg gcgtcgaggt gcataatgct aagaccaaac ccagagagga acagtacaac 540

agcacctatc gcgtcgtgtc tgtcctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggaaag 600

gagtacaagt gcaaagtgag caacaaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatttct 660

aaggctaaag gccagcctag agaaccacag gtgtatacag agcctccaag tcgcgacgag 720

ctgacaaaaa accaggtctc cctgacttgt ctggtgaagg gattctaccc tagcgatatc 780

gcagtggagt gggaatctaa tgggcagcca gaaaacaatt ataagaccac accccctgtg 840

ctggactcag atggttcctt ctttctgctg agtgtgctga ccgtggacaa gtccaggtgg 900

cagcagggga acgtcttttc ctgcagcgtg atgcatgagg ccctgcacaa tcattacaca 960

cagaaatctc tgagtctgtc accaggaaag 990

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи антитела против HER2 человека

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Glu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Leu Ser Val Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела против PD-1 человека

<400> 9

gacatccaga tgacccagtc ccctagcagc gtgagcgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca gggcctccca gggcatctcc tcctggctgg cctggtatca acagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctccgct gcctcctccc tgcagtccgg agtgccttcc 180

aggttcagcg gttctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag gccaaccacc tgcctttcac cttcggcggc 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела против PD-1 человека

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела против PD-1 человека

<400> 11

caggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctccggcgg caccttctcc tccaccgcca tctcctgggt gaggcaggct 120

cctggccagg gactggagtg gatgggaggc atctggccct ccttcggcac agcctcctac 180

gcccagaagt tccagggcag ggtgaccatc accgccgacg agagcacctc caccgcctac 240

atggagctga gctccctgag gtccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagggccgag 300

tactcctcca ccggcatctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела против PD-1 человека

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Trp Pro Ser Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Glu Tyr Ser Ser Thr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 990

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи антитела против PD-1 человека

<400> 13

gcttcaacaa aaggaccttc cgtgtttcca ctggcaccct ctagtaagag tacttcagga 60

ggaaccgcag cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 120

tggaacagtg gagcactgac ctccggggtc catacatttc ctgccgtgct gcagtcatcc 180

ggtctgtata gcctgagctc tgtggtcaca gtcccaagtt catccctggg cacccagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caaaccttcc aatactaagg tcgacaagaa agtggaacca 300

aaaagctgtg ataagactca tacctgccca ccttgtcctg caccagagct gctgggaggt 360

ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagccc aaagacacac tgatgatttc tcgcacaccc 420

gaagtcactt gtgtggtcgt ggacgtgtcc cacgaggatc ctgaagtcaa gttcaactgg 480

tacgtggatg gcgtcgaggt gcataatgct aagaccaaac ccagagagga acagtacaac 540

agcacctatc gcgtcgtgtc tgtcctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggaaag 600

gagtacaagt gcaaagtgag caacaaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatttct 660

aaggctaaag gccagcctag agaaccacag gtgtatacac tgcctccaag tcgcgacgag 720

ctgacaaaaa accaggtctc cctgctgtgt ctggtgaagg gattctaccc tagcgatatc 780

gcagtggagt gggaatctaa tgggcagcca gaaaacaatt ataagaccac accccctgtg 840

ctgcggtcag atggttcctt ctttctgtac agtaaactga ccgtggacaa gtccaggtgg 900

cagcagggga acgtcttttc ctgcagcgtg atgcatgagg ccctgcacaa tcattacaca 960

cagaaatctc tgagtctgtc accaggaaag 990

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи антитела против PD-1 человека

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Arg Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена жидкая фармацевтическая композиция, содержащая анти-PD-1/HER2 биспецифическое антитело, буфер, стабилизатор и поверхностно-активное вещество. Также предложена твердая композиция антитела в форме лиофилизированного порошка, полученная путем перевода в твердую форму указанной жидкой композиции. Изобретение обеспечивает стабилизацию белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела при хранении. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 20 табл., 4 пр.

1. Жидкая композиция антитела для стабилизации белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела при хранении, содержащая:

(i) белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) буфер;

(iii) стабилизатор и

(iv) поверхностно-активное вещество; причем

белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела включает первое полуантитело и второе полуантитело, причем первое полуантитело включает первую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с PD-1, а второе полуантитело включает вторую VH/VL-единицу, специфически связывающуюся с HER2, причем первая VH/VL-единица включает парные последовательности вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 10, а вторая VH/VL-единица содержит парные последовательности вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 2; и

при этом жидкая композиция антитела содержит:

(i) 42 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) 0,85 мг/мл гистидина и 3,17 мг/мл гистидина гидрохлорида;

(iii) 80 мг/мл сахарозы; и

(iv) 0,2 мг/мл полисорбата 80; или

жидкая композиция антитела содержит:

(i) 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) 20 мМ гистидина;

(iii) 50 мг/мл сорбита; и

(iv) 0,2 мг/мл полисорбата 80; или

жидкая композиция антитела содержит:

(i) 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) 20 мМ гистидина;

(iii) 80 мг/мл сахарозы; и

(iv) 0,2 мг/мл полисорбата 80; или

жидкая композиция антитела содержит:

(i) 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) 20 мМ гистидина;

(iii) 80 мг/мл трегалозы; и

(iv) 0,2 мг/мл полисорбата 80; или

жидкая композиция антитела содержит:

(i) 50 мг/мл белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела;

(ii) 20 мМ гистидина;

(iii) 80 мг/мл сахарозы и 1,49 мг/мл метионина; и

(iv) 0,2 мг/мл полисорбата 80;

при этом pH жидкой композиции составляет 5,0-6,0.

2. Жидкая композиция антитела по п. 1, в которой белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела включает первое полуантитело и второе полуантитело, причем первое полуантитело включает последовательности тяжелой цепи, представленные в SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, или последовательности тяжелой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности, в направлении от N к C, и включает последовательности легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 4, или последовательности легкой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности, в направлении от N к C, и второе полуантитело включает последовательности тяжелой цепи, представленные в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8, или последовательности тяжелой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности, в направлении от N к C, и включает последовательности легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, или последовательности легкой цепи, имеющие с ними по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности, в направлении от N к C.

3. Жидкая композиция антитела по любому из пп. 1, 2, причем белок анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела рекомбинантным способом экспрессирован в клетках HEK293, HEK293T, HEK293F или HEK293E, полученных путем модификации из клеток HEK293, и в клетках CHO, CHO-S, CHO-dhfr^-, CHO/DG44 или ExpiCHO, полученных путем модификации из клеток CHO.

4. Жидкая композиция антитела по любому из пп. 1-3, причем жидкая композиция предназначена для инъекции, предпочтительно для подкожной или внутривенной инъекции, или для инфузии, например для внутривенной инфузии.

5. Жидкая композиция антитела по любому из пп. 1-4, причем pH жидкой композиции антитела составляет 5,5.

6. Твердая композиция антитела, полученная путем перевода в твердую форму жидкой композиции антитела по любому из пп. 1-5, причем твердая композиция имеет форму лиофилизированного порошка, и предназначенная для стабилизации белка анти-PD-1/HER2 биспецифического антитела при хранении.

7. Предварительно наполненный шприц, содержащий жидкую композицию антитела по любому из пп. 1-5 или твердую композицию антитела по п. 6, причем твердую композицию антитела повторно растворяют путем растворения в физиологически приемлемом растворе непосредственно перед применением в виде внутривенной или внутримышечной инъекции.