Технология полноэкзомного обогащения на основе гибридизации с полноэкзомной РНК-библиотекой Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Настоящее изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, клинико-лабораторной диагностики, молекулярной биологии, геномики и генетики, в частности к способам выполнения ферментативной реакции с использованием молекулярно-генетических технологий, способам получения библиотек фрагментов нуклеиновых кислот из двуцепочечной нуклеиновой кислоты для последующего определения последовательности фрагментов ДНК методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения, к способам процессинга молекул нуклеиновых кислот в библиотеки нуклеиновых кислот с использованием фрагментирования, гибридизации и амплификации и может быть использовано для получения библиотеки фрагментов геномной ДНК, обогащенной белок-кодирующими регионами (экзомом).

Существует множество способов и сфер применения, для которых желательно создать библиотеку молекул фрагментированной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) из целевых молекул двуцепочечной нуклеиновой кислоты (например, двуцепочечной геномной ДНК). Часто целью является отбор (экстракция) определенных участков нуклеиновой кислоты (например - белок-кодирующих регионов генома, CoDing Sequence (CDS), Open Reading Frame (ORF)) для снижения расходов на секвенирование неинформативных для исследователя или врача участков молекулы. Так, экзом человека составляет около 1% генома, но содержит более 85% известных вариантов последовательности ДНК, связанных с фенотипом (в частности - с заболеваниями).

Секвенирование всего экзома (whole exome sequencing, WES) - это стратегия секвенирования ДНК, обеспечивающая избирательное определение кодирующих участков генома. Поскольку кодирующая часть генома охватывает лишь около 1% генома, этот подход представляет собой более экономически эффективную стратегию обнаружения изменений ДНК по сравнению с секвенированием всего генома.

Известно два основных способа отбора белок-кодирующих регионов геномной ДНК (обогащения экзома): амплификационный и гибридизационный [1]. Первый способ предполагает наработку белок-кодирующих регионов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймеров, специфичных белок-кодирующим регионам. Второй способ предполагает гибридизацию фрагментов генома с заранее синтезированными ДНК или РНК-зондами, комплементарными белок-кодирующим регионам генома.

Из уровня техники известны следующие аналоги предлагаемого изобретения:

1) В научной статье Liang с соавт. (2018) Whole Exome Library Construction for Next Generation Sequencing (Создание полноэкзомной библиотеки для высокопроизводительного секвенирования) предложен протокол подготовки библиотеки полноэкзомной библиотеки (WES) с использованием набора KAPA Hyper Prep Kit с зондами Agilent SureSelect Human All Exon V5+UTR, демонстрирующий высокую эффективность преобразования ДНК в библиотеку для секвенирования на платформе Illumina HiSeg [2].

2) Патент № US 10894979 В2 Construction of next generation sequencing (NGS) libraries using competitive strand displacement (2019) «Создание библиотек для высокопроизводительного секвенирования (NGS) с использованием конкурентного смещения цепи» относится к адаптерам для секвенирования и способам создания библиотек для высокопроизводительного секвенирования ДНК (NGS) второго поколения для полногеномного секвенирования, целевого обогащения, скрининговых анализов на основе секвенирования, метагеномики или любого другого применения, требующего подготовки библиотек для NGS. Раскрытые способы состоят из двухэтапного процесса лигирования, при котором первый адаптер секвенирования лигируют с концами репарированных фрагментов ДНК посредством лигирования тупых концов, а второй адаптер секвенирования затем лигируют с первым продуктом лигирования посредством шплинтового лигирования концов [3].

Также, известно множество способов инвитро-транскрипции (синтеза РНК в пробирке) с использованием различных вирусных, бактериальных или эукариотических промоторов, присоединенных к целевым фрагментам ДНК (требующим перевода в РНК). Для этих целей чаще всего используют присоединение ДНК-адаптеров, содержащих промоторы Т7- или Sp6-РНК-полимераз.

3) В частности, известен метод получения библиотек фрагментов ДНК для высокопроизводительного секвенирования, когда промоторный элемент Т7 используется для инициации транскрипции in vitro и создания РНК-копий целевых фрагментов ДНК [4].

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является:

4) Способ экстракции примерно 50 миллионов пар оснований экзонных областей генома человека путем использования захватывающих РНК-зондов длиной около 120 оснований для захвата известных белок-кодирующих последовательностей ДНК (CDS). Полученную таким образом библиотеку фрагментов можно использовать для целевого высокопроизводительного секвенирования второго поколения [5, 6].

Аналогичный принцип может быть использован для обогащения библиотеки фрагментов ДНК любыми заданными регионами генома любого организма (в зависимости от используемой коллекции захватывающих РНК-зондов).

Настоящее изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, клинико-лабораторной диагностики, молекулярной биологии, геномики и генетики, в частности, к способам выполнения ферментативной реакции с использованием молекулярно-генетических технологий, способам получения библиотек фрагментов нуклеиновых кислот из двуцепочечной нуклеиновой кислоты для последующего определения последовательности фрагментов ДНК методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения, к способам процессинга молекул нуклеиновых кислот в библиотеки нуклеиновых кислот с использованием фрагментирования, гибридизации и амплификации и может быть использовано для получения библиотеки фрагментов геномной ДНК, обогащенной белок-кодирующими регионами (экзомом).

Предложен способ обогащения библиотеки фрагментов генома белок-кодирующими последовательностями (экзомом) для последующего секвенирования методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения (NGS), отличающийся тем, что для отбора белок-кодирующих регионов используют биотинилированные in vitrio транскрипты, полученные с предварительно выполненного полноэкзомного обогащения любым стандартным методом (например, по методике из [6]). Для этого при помощи лигазной реакции к обогащенным любым стандартным методом полноэкзомного обогащения двуцепочечным фрагментам ДНК по концам присоединяют последовательности промотора (например, промотора Т7) и проводят реакцию транскрипции, получая соответствующие фрагменты биотинилированных РНК (таким образом получают захватывающую РНК-библиотеку). Затем проводят гибридизацию захватывающей РНК-библиотеки с фрагментированной целевой геномной ДНК с отделением гетерогибридов на стрептавидине (аналогично методике из [6]).

Предлагаемую генетическую технологию можно применять для различных видов эукариотических организмов, включая лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также человека.

Сущность изобретения.

Настоящая заявка относится к способам процессинга молекул нуклеиновых кислот в библиотеки нуклеиновых кислот с использованием фрагментирования геномной ДНК, гибридизации с библиотекой биотинилированной РНК и ПЦР-амплификации.

Представленный в настоящем документе способ можно применять, для создания библиотек фрагментов ДНК для применения в способах высокопроизводительного секвенирования второго поколения. В некоторых вариантах осуществления настоящая заявка относится к получению фрагментов ДНК из исходной двуцепочечной геномной ДНК из любого источника с целью полноэкзомного анализа.

В соответствии с приведенным в настоящем документе описанием в одном из вариантов осуществления способ выполнения ферментативной реакции с использованием полноэкзомного обогащения включает:

(а) получение полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов ДНК по любой стандартной методике, например, из [6];

(b) получение биотинилированной захватывающей РНК-библиотеки с ранее полученной полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов ДНК за счет присоединения по концам библиотеки адаптеров с последовательностью промотора и проведения in vitro транскрипции;

(с) получение целевой полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов ДНК с использованием биотинилированной захватывающей РНК-библиотеки.

Осуществление изобретения.

(а) Получение полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов «референсной» ДНК.

Получение полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов «референсной» ДНК проводят по любой стандартной методике, например, по следующему известному протоколу: Фрагментация «референсной» ДНК на Covaris

1. На старте взять 500 нг геномной ДНК (очищенной по любой подходящей под стартовый биоматериал методике), довести объем до 130 мкл mQ/ultrapure water.

2. Поставить пробирки с ДНК в штатив прибора Covaris, опустить в воду.

3. На приборе запускать программу под названием «frag 300bp».

Отбор фрагментов нужной длины (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 130 μL реакции 78 μL бидов (0,6x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно перенести супернатант в новые 1,5 мл пробирки, не задевая биды. Пробирки с бидами выкинуть

4. Добавить к 208 μL реакции 26 μL бидов (0,125x от объема реакции), перемешать пипетированием;

5. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

6. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив;

7. Добавить 200 μL свежеприготовленного 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

8. Повторить шаг 7 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

9. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта;

10. Добавить 42 μL mQ, ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс- спином, инкубировать RT 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать RT 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК.

Репарация концов: полировка липких концов, кинирование, А-теилинг (используются реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual)

1. Смешать следующие компоненты в стерильной PCR-пробирке:

- ERAT Enzyme mix (во время использования держать на льду) 2,9 μL

- ERAT buffer 7,1 μL

- фрагментированная ДНК 40 μL

Всего: 50 μL

2. Перемешивать пипетированием, затем сбить капли с помощью мини-центрифуги (вортекса);

3. Поместить в термоциклер с нагреваемой крышкой и запустить программу:

30 мин. при 37°С

15 мин. при 65°С

Хранение на 4°С

Лигирование адаптеров для экзомной библиотеки

(используются реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual)

1. Добавить следующие компоненты прямо к смеси после ERAT (50 μL):

- DNA Ligase (во время использования держать на льду) 1,6 μL

-Ligation buffer 23,4 μL

-Adaptor for MGI 5 μL

Всего: 80 μL

2. Смешать пипетированием, после сбить капли мини-центрифугой;

3. Инкубировать при 23°С 1 час в амплификаторе.

Очистка фрагментов ДНК (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 80 μL реакции 20 μL mQ до объема 100 μL.

2. Добавить к 100 μL реакции 50 μL бидов (0,5x от объема реакции), перемешать пипетированием;

3. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

4. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая биды, которые содержат фрагменты ДНК;

5. Добавить 200 μL 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

6. Повторить шаг 4 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

7. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта. Оставить сушиться пробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 2-5 минут, следя за тем, чтобы биды не пересушились (при пересушке они светлеют), но при этом не осталось спирта;

8. Добавить 22 μL mQ, ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК. Наработка (амплификация) библиотеки методом ПЦР

Реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual

1. Смешать следующие компоненты в стерильной PCR-пробирке:

- PCR Enzyme Mix 25 μL

- PCR Primer Mix 6 μL

- фрагменты ДНК 19 μL

Всего: 50 μL

2. Поставить в амплификатор с использованием следующей программы:

Очистка (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 50 μL реакции 50 μL бидов (1x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая биды, которые содержат фрагменты ДНК;

4. Добавить 200 μL свежего(!) 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

5. Повторить шаг 4 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

6. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта;

7. Добавить 37 μL LowTE, ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК. Контроль качества библиотек ДНК

1) Провести контроль качества полученных библиотек фрагментов ДНК на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 с помощью набора High Sensitivity Kit по протоколу производителя.

Хорошим результатом является распределение длин с пиком в области 300-600 bp. Молярность должна составлять не менее 10 nmol/1.

Гибридизация зондов и целевых участков ДНК

1. Дождаться прогрева всех компонентов гибридизации, (программа амплификации в постоянном режиме 65°С).

2. Прямо в амплификаторе открыть пробирки и перенести 14 μL Hybs к 13 мкл Libs, аккуратно перемешать пипетированием;

3. Далее перенести 27 мкл смеси Hybs+Libs к 5 мкл Probes (sum 31 μL), аккуратно перемешать пипетированием и закрыть крышки.

4. Добавить минеральное масло (заранее прогретое до 65°С), чтобы предотвратить выпаривание образцов (12-15 мкл). Масло добавлять по стенкам пробирок, чтобы оно аккуратно покрыло реакционную смесь. Плотно закрыть крышки.

Поместить на 65°С, затем перенести14 μL Hybs к 13 μL Libs

Перенести 27 μL Hybs+Libs к 5 μL Probes (sum=33 μL)

5. Оставить гибридизацию на 16-24 часа;

Отмывка продуктов реакции обогащения

1. Приготовить Промывочный буфер Wash Buffer 3 в 1,5 ml пробирке (на 1 пул образцов), смешав:

- Hyb4 = 12,1 μL

- MQ Water = 1200 μL

- Wash Buffer 2 = 300 μL

Поставить пробирку с промывочным буфером в термостат на 66°С на 45 минут.

2. Отобрать 50 μL Dynabeads C1 (на 1 пул) в 1,5 mL пробирку LoBind, поставить на магнитный штатив, подождать, пока раствор станет прозрачным, удалить супернатант;

3. Снять пробирку с магнитного штатива, добавить 300 μL Binding Buffer, вортекс+спин, поставить на магнитный штатив, подождать 2 мин, пока раствор станет прозрачным, удалить супернатант;

4. Повторить пункт 3 дважды, чтобы в итоге получилось 3 отмывки;

5. Ресуспендировать биды в 100 μL Binding Buffer.

6. Добавить 7 мкл/пул Blok 2 (Salmon Sperm DNA 1 мг/мкл) поставить на орбитальный шейкер на 10 минут при RT.

7. Перенести 100 μL “заблокированных” Dynabeads в новые 1,5 mL пробирки LoBind, подписать в соответствии с пулами.

8. Поставить пробирки в термостат на 66°С, прогреть 5 минут,

9. Открыть амплификатор, перенести весь объем пулов к бидам Dynabeads в термостате, перемешать пипетированием;

10. Инкубировать пробирки на 66°С 40 минут в орбитальном лабораторном термошейкере для пробирок (если нет возможности поставить в шейкер, то стоит оставить в амплификаторе на 65°С в 0,2 mL пробирках и пипетировать каждые 7-10 мин);

11. Поставить пробирки на магнитный штатив, подождать, пока раствор станет прозрачным (~1 мин), а частицы соберутся у стенки пробирки, удалить супернатант;

12. Добавить 500 μL прогретого Wash Buffer 3, вортекс+спин, поставить в термошейкер на 65°С на 5 минут.

13. Аккуратно сбросить капли, перенести пробирки на магнитный штатив, удалить супернатант;

14. Повторить пункты 12-13 еще два раза (итого 3 отмывки с WB3);

15. Высушить магнитные пеллеты 5-10 мин (их поверхность должна стать матовой).

16. Ресуспендировать в 40 мкл mQ).

Постановка ПЦР-реакции

1. Смешать следующие компоненты в стерильной PCR-пробирке:

- KAPA HiFi GC Buffer (5X) 10 μL

- KAPA d NTP Mix 1,5 μL

- MGI primer 1 5 μL

- MGI primer 2 5 μL

- KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 0,7 μL

- фрагменты обогащенной ДНК 20-22 μL

- mQ up to 50 μL

Всего: 50 μL

2. Поставить в амплификатор с использованием следующей программы:

3. Отобрать 2,5 мкл ПЦР-продукта и сразу поставить ГЭФ 2% 25 мин 135 V для качественной проверки. Хорошим результатом является распределение длин с максимальным свечением в области 300-500 bp.

Очистка (с использованием MagBio)

1. Добавить к 50 μL реакции 65 μL бидов (1,3x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 7 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив. После того как смесь станет прозрачной, удалить супернатант, не задевая магнитные частицы, которые содержат фрагменты ДНК;

4. Добавить 180 μL свежего (!) 80% EtOH, переставлять стрип в штативе таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все магнитные частицы на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

5. Повторить шаг 5 еще один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

6. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта. Оставить сушиться пробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 3-5 минут, не допуская пересушивания (при пересушивании магнитная пеллета трескается), но при этом спирт должен испариться полностью (поверхность пеллеты станет матовой);

7. Добавить 38 μL mQ, ресуспендировать биды на вортексе, осадить пульс-спином, инкубировать 7 мин. Затем поместить на магнитный штатив, инкубировать до полной агрегации бидов на стенке пробирки (до 5 мин). Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная библиотека ДНК.

(b) Получение биотинилированной захватывающей РНК-библиотеки с ранее полученной полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов ДНК за счет присоединения по концам адаптеров с последовательностью промотора и проведения in vitro транскрипции.

Добавление адаптеров по концам подноэкзомной библиотеки может быть выполнено путем лигирования (А) или путем проведения ПЦР с длинными адаптерными праймерами, на 3`-конце комплементарными адаптерам экзомной ДНК-библиотеки, а на 5`-конце содержащими последовательность промотора (Б).

Вариант добавления через ПЦР проще и эффективнее, однако вариант с лигированием не добавляет дополнительные мутации в захватывающую РНК-библиотеку. Ниже описаны оба варианта:

А. Добавление промотора путем лигирования Т7-адаптеров

1. Добавить к полученной библиотеке ДНК следующие компоненты (50 μL):

- DNA Ligase (во время использования держать на льду) 1,6 μL

-Ligation buffer 23,4 μL

-Adaptor Т7 5 μL

Всего: 80 μL

2. Смешать пипетированием, после сбить капли мини-центрифугой;

3. Инкубировать при 23°С 1 час в амплификаторе.

Очистка (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 80 μL реакции 20 μL mQ до объема 100 μL.

2. Добавить к 100 μL реакции 50 μL бидов (0,5x от объема реакции), перемешать пипетированием;

3. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

4. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая биды, которые содержат фрагменты ДНК;

5. Добавить 200 μL свежего 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

6. Повторить шаг 4 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

7. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта. Оставить сушиться пробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 2-5 минут, следя за тем, чтобы биды не пересушились (при пересушке они светлеют), но при этом не осталось спирта;

8. Добавить 22 μL mQ ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная библиотека ДНК с прилигированными Т7-адаптерами.

Проведение in vitro транскрипции с экзомной библиотеки с одновременным биотинилированием РНК

1. Приготовить реакционную смесь следующего состава:

библиотека ДНК с прилигированными Т7-адаптерами 10 μL

Буфер для транскрипции 20 μL

Смесь 0.2 mM dCTP, dATP, dGTP; и 0.5 mM γ-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-5-aminoallyl-dUTP(ШТР (biotin-11-dUTP).

BSA 1 μL

Спермидин 2 μL

RNasin 50 u

Т7 RNA полимераза 500 u

mQ до 100 μL

2. Инкубировать 37°С, 2 часа;

3. Объем реакционной смеси довести до 200 μL mQ

4. Переосадить РНК спиртом, осадок растворить в 140 μL mQ

Хранить при -70°С, желательно по аликвотам

5. Для удаления исходной ДНК обработать RNase-free DNase I (Promega) по стандартной методике.

(также, вместо добавления γ-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-5-aminoallyl-dUTR в реакцию транскрипции можно проводить биотинилирование уже готовой библиотеки РНК, например, при помощи стандартных коммерческих реагентов, в частности: Pierc^TM RNA 3` Еп<1 End Biotinylation Kit, номер по каталогу: 20160, ThermoFisher Scientific).

Б. Добавление промотора путем ПЦР с длинных праймеров, содержащих Т7-промотор в 5`-концевой части.

Наработка (амплификация) библиотеки методом ПЦР

Реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual

1. Смешать следующие компоненты в стерильной ПЦР-пробирке:

- PCR Enzyme Mix 25 μL

- PCR Т7-Adapter Mix 6 μL

- фрагменты ДНК 19 μL

Всего: 50 μL

2. Поставить в амплификатор с использованием следующей программы:

Очистка амплифицированной библиотеки ДНК (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 50 μL реакции 50 μL бидов (1x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая биды, которые содержат фрагменты ДНК;

4. Добавить 200 μL свежего 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

5. Повторить шаг 4 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

6. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта;

7. Добавить 37 μL LowTE, ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК. Проведение in vitro транскрипции с экзомной библиотеки с одновременным биотинилированием РНК

1. Приготовить реакционную смесь следующего состава:

библиотека ДНК с прилигированными Т7-адаптерами 10 μL

Буфер для транскрипции 20 μL

Смесь 0.2 mM dCTP, dATR, dGTR; и 0.5 mM γ-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-5-aminoallyl-dUTR (biotin-11-dUTR).

BSA 1 μL

Спермидин 2 μL

RNasin 50 u

Т7 RNA полимераза 500 u

mQ до 100 μL

2. Инкубировать 37°С, 2 часа;

3. Объем реакционной смеси довести до 200 μL mQ

4. Переосадить РНК спиртом, осадок растворить в 140 μL mQ

Хранить при -70°С, желательно по аликвотам

5. Для удаления исходной ДНК обработать RNase-free DNase I (Promega) по стандартной методике.

(также, вместо добавления γ-[N-(biotin-6-amino-hexanoyl)]-5-aminoallyl-dUTP в реакцию транскрипции можно проводить биотинилирование уже готовой библиотеки РНК, например, при помощи стандартных коммерческих реагентов, в частности: Pierce^TM RNA 3` End Biotinylation Kit, номер по каталогу: 20160, ThermoFisher Scientific).

(с) Получение целевой полноэкзомно-обогащенной библиотеки фрагментов ДНК с использованием биотинилированной захватывающей РНК-библиотеки.

Фрагментация целевой ДНК на Covaris

1. На старте взять 500 нг геномной ДНК (очищенной по любой подходящей под стартовый биоматериал методике), довести объем до 130 мкл mQ/ultrapure water.

2. Поставить пробирки с ДНК в штатив прибора Covaris, опустить в воду.

3. На приборе запускать программу под названием «frag 300bp».

Отбор фрагментов нужной длины (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 130 μL реакции 78 μL бидов (0,6x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно перенести супернатант в новые 1,5 мл пробирки, не задевая биды.

Пробирки с бидами выкинуть

4. Добавить к 208 μL реакции 26 μL бидов (0,125x от объема реакции), перемешать пипетированием;

5. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

6. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив;

7. Добавить 200 μL свежеприготовленного 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

8. Повторить шаг 7 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

9. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта;

10. Добавить 42 μL mQ ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать RT 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать RT 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК.

Репарация концов: полировка липких концов, кинирование, А-теилинг (используются реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual)

1. Смешать следующие компоненты в стерильной PCR-пробирке:

- ERAT Enzyme mix (во время использования держать на льду) 2,9 μL

- ERAT buffer 7,1 μL

- фрагментированная ДНК 40 μL

Всего: 50 μL

2. Перемешивать пипетированием, затем сбить капли с помощью мини-центрифуги (вортекса);

3. Поместить в термоникл ер с нагреваемой крышкой и запустить программу:

30 мин. при 37°С

15 мин. при 65°С

Хранение на 4°С

Лигирование адаптеров

(используются реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual)

1. Добавить следующие компоненты прямо к смеси после ERAT (50 μL):

- DNA Ligase (во время использования держать на льду) 1,6 μL

- Ligation buffer 23,4 μL

- Adaptor for MGI 5 μL

Всего: 80 μL

2. Смешать пипетированием, после сбить капли мини-центрифугой;

3. Инкубировать при 2°С 1 час в амплификаторе.

Очистка фрагментов ДНК (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 80 μL реакции 20 μL mQ до объема 100 μL.

2. Добавить к 100 μL реакции 50 μL бидов (0,5x от объема реакции), перемешать пипетированием;

3. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

4. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая биды, которые содержат фрагменты ДНК;

5. Добавить 200 μL 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

6. Повторить шаг 4 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

7. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта. Оставить сушиться пробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 2-5 минут, следя за тем, чтобы биды не пересушились (при пересушке они светлеют), но при этом не осталось спирта;

8. Добавить 22 μL mQ, ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК.

Наработка (амплификация) библиотеки методом ПЦР

Реагенты из набора FS DNA Library Prep Set User Manual

1. Смешать следующие компоненты в стерильной PCR-пробирке:

- PCR Enzyme Mix 25 μL

- PCR Primer Mix 6 μL

- фрагменты ДНК 19 μL

Всего: 50 μL

2. Поставить в амплификатор с использованием следующей программы:

Очистка (с использованием Agencourt AMPure XP)

1. Добавить к 50 μL реакции 50 μL бидов (1x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив. После того как смесь станет прозрачной (на это требуется до 5 минут), нужно осторожно удалить супернатант, не задевая биды, которые содержат фрагменты ДНК;

4. Добавить 200 μL свежего (!) 80% EtOH, проворачивать пробирку в штативе на 180° таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все биды на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

5. Повторить шаг 4 один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

6. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта;

7. Добавить 37 μL LowTE, ресуспендировать биды на вортексе, осадить их пульс-спином, инкубировать 5 мин, после поместить на магнитный штатив, инкубировать 5 мин. Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная ДНК.

Контроль качества целевой библиотеки ДНК

1) Провести контроль качества полученных библиотек фрагментов ДНК на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 с помощью набора High Sensitivity Kit по протоколу производителя.

Хорошим результатом является распределение длин с пиком в области 300-600 bp. Молярность должна составлять не менее 10 nmol/l.

Гибридизация захватывающей РНК-библиотеки и целевых участков ДНК

1. Дождаться прогрева всех компонентов гибридизации, (программа амплификации в постоянном режиме 65°С).

2. Прямо в амплификаторе открыть пробирки и перенести 5 μL захватывающей РНК-библиотеки к 27 мкл ранее полученной целевой библиотеки ДНК (с NGS-адаптерами), аккуратно перемешать пипетированием и закрыть крышки.

4. Добавить минеральное масло (заранее прогретое до 65°С), чтобы предотвратить выпаривание образцов (12-15 мкл). Масло добавлять по стенкам пробирок, чтобы оно аккуратно покрыло реакционную смесь. Плотно закрыть крышки.

5. Оставить гибридизацию на 16-24 часа;

Отмывка продуктов реакции обогащения

1. Приготовить Промывочный буфер Wash Buffer 3 в 1,5 mL пробирке (на 1 пул образцов), смешав:

- Hyb4 12,1 μL

- MQ Water 1200 μL

- Wash Buffer 2300 μL

Поставить пробирку с промывочным буфером в термостат на 66°С на 45 минут.

Очистка биотинилированной захватывающей библиотеки РНК от примеси исходной

ДНК

2. Добавить стрептавидиновых шариков 50 μL стрептавидиновых шариков (на 1 пул) в 1,5 mL пробирку LoBind, перемешать;

3. Инкубировать в течение 15 минут при 20°С.

4. Гранулы дважды промыть в 150 μL буфера для связывания.

5. Повторить пункт 4 дважды, чтобы в итоге получилось 3 отмывки;

6. Ресуспендировать в 40 мкл mQ.

Постановка ПЦР-реакции

1. Смешать следующие компоненты в стерильной PCR-пробирке:

- KAPA HiFi GC Buffer (5X) 10 μL

- KAPA dNTP Mix 1,5 μL

- MGI primer 1 5 μL

- MGI primer 2 5 μL

- KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 0,7 μL

- фрагменты обогащенной ДНК 20-22 μL

- mQ up to 50 μL

Всего: 50 μL

2. Поставить в амплификатор с использованием следующей программы:

3. Отобрать 2,5 мкл ПЦР-продукта и сразу поставить ГЭФ 2% 25 мин 135 V для качественной проверки. Хорошим результатом является распределение длин с максимальным свечением в области 300-500 bp.

Очистка (с использованием MagBio)

1. Добавить к 50 μL реакции 65 μL бидов (1,3x от объема реакции), перемешать пипетированием;

2. Инкубировать при комнатной температуре 7 минут;

3. Сбить капли мини-центрифугой, перенести пробирки на магнитный штатив.

После того как смесь станет прозрачной, удалить супернатант, не задевая магнитные частицы, которые содержат фрагменты ДНК;

4. Добавить 180 μL свежего (!) 80% EtOH, переставлять стрип в штативе таким образом, чтобы биды пробежали через раствор спирта несколько раз, собрать все магнитные частицы на одной стенке, осторожно удалить EtOH, не задевая бидов;

5. Повторить шаг 5 еще один раз, чтобы в итоге получилось 2 отмывки;

6. Максимально отобрать микропипеткой 2-20 остатки раствора спирта. Оставить сушиться пробирки с открытой крышкой прямо на магнитном штативе на 3-5 минут, не допуская пересушивания (при пересушивании магнитная пеллета трескается), но при этом спирт должен испариться полностью (поверхность пеллеты станет матовой);

7. Добавить 38 μL mQ ресуспендировать биды на вортексе, осадить пульс-спином, инкубировать 7 мин. Затем поместить на магнитный штатив, инкубировать до полной агрегации бидов на стенке пробирки (до 5 мин). Перенести супернатант в новую пробирку. В супернатанте очищенная библиотека ДНК.

Ссылки на использованные источники

1. Singh RR. Target Enrichment Approaches for Next-Generation SequencingApplications in Oncology. Diagnostics (Basel). 2022 Jun 24;12(7):1539. doi: 10.3390/diagnostics512071539. PMCID: 35885445; PMCID: PMC9318977.

2. Liang WS, Stephenson K, Adkins J, Christofferson A, Helland A, Cuyugan L, Keats JJ. Whole Exome Library Construction for Next Generation Sequencing. Methods Mol Biol. 2018;1706:163-174. doi:10.1007/978-1-493 9-7471-9_9. PMID: 29423798.

3. Патент № US 1810894979 В2 Construction of next generation sequencing (NGS) libraries using competitive strand displacement (2019) «Создание библиотек для высокопроизводительного секвенирования (NGS) с использованием конкурентного смещения цепи»

4. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 2014 Feb 1;56(2):61-4, 66, 68, passim. doi: 10.2144/000114133. PMID: 24502796; PMCID: PMC 4351865.

5. US 20150211047 А1 (United States) Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment

6. Chen R, Im H, Snyder M. Whole-Exome Enrichment with the Agilent SureSelect Human All Exon Platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 Mar 11;2015(7):626-33. doi: 10.1101/pdb.prot083659. PMID: 25762417; PMCID: PMC 4490097.

Изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, клинико-лабораторной диагностики, молекулярной биологии, геномики и генетики. Описан способ обогащения библиотеки фрагментов ДНК белок-кодирующими последовательностями (экзомом) для последующего секвенирования методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения (NGS), отличающийся тем, что для отбора белок-кодирующих регионов используют биотинилированные in vitro транскрипты, полученные с предварительно выполненного полноэкзомного обогащения. Изобретение расширяет арсенал способов получения библиотеки фрагментов ДНК для полноэкзомного секвенирования.

Способ обогащения библиотеки фрагментов ДНК белок-кодирующими последовательностями (экзомом) для последующего секвенирования методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения (NGS), отличающийся тем, что для отбора белок-кодирующих регионов используют биотинилированные in vitro транскрипты, полученные с предварительно выполненного полноэкзомного обогащения.