Технология полноэкзомного обогащения на основе различия в кинетике реассоциации фрагментов ДНК Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, клинико-лабораторной диагностики, молекулярной биологии, геномики и генетики, в частности, к способам выполнения ферментативной реакции с использованием молекулярно-генетических технологий, способам получения библиотек фрагментов нуклеиновых кислот из двухцепочечной нуклеиновой кислоты для последующего определения последовательности фрагментов ДНК методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения, к способам процессинга молекул нуклеиновых кислот в библиотеки нуклеиновых кислот с использованием фрагментирования, гибридизации и амплификации и может быть использовано для получения библиотеки фрагментов геномной ДНК, обогащенной уникальными (в том числе белок-кодирующими) регионами геномной ДНК.

Существует множество способов и сфер применения, для которых желательно создать библиотеку молекул фрагментированной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) из целевых молекул двуцепочечной нуклеиновой кислоты (например, двуцепочечной геномной ДНК). Часто целью является отбор (экстракция) определенных участков нуклеиновой кислоты (например - белок-кодирующих регионов генома, CoDing Sequence (CDS), Open Reading Frame (ORF)) для снижения расходов на секвенирование неинформативных участков молекулы. Так, экзом человека составляет менее 2% генома, но содержит более 85% известных вариантов последовательности ДНК, связанных с фенотипом (в частности - с заболеваниями).

Известно, что сложные эукариотические геномы на 40-80% состоят из умеренно и часто повторяющихся последовательностей (геномных повторов) и до 90%) геномов эукариот, вероятно, представляет собой нефункциональную ДНК (мусорную ДНК) [1, 2]. Геном человека более чем на 50% состоит из повторяющихся последовательностей [1, 3].

Известно, что скорость реассоциации денатурированных последовательностей ДНК пропорциональна их концентрации в третьей степени. В свою очередь, концентрация фрагментов ДНК со схожей последовательностью зависит от числа повторов того или иного региона в геноме (чем выше частота повтора, тем выше его концентрация в смеси фрагментов ДНК после фрагментирования генома и тем выше скорость реассоциации гомологичных последовательностей в ДНК-дуплексы) [4-7].

На принципе разной скорости реассоциации денатурированных последовательностей ДНК различной концентрации основан ряд методик, позволяющих выровнять представленность фрагментов в сложной смеси нуклеиновых кислот.

В том числе нормализацию представленности фрагментов ДНК с разной последовательностью используют для подготовки NGS-библиотек (для высокопроизводительного секвенирования).

Из уровня техники известны следующие аналоги предлагаемого изобретения:

1) В научной статье Lai с соавт.(2012) предложен протокол создания нормализованных библиотек кДНК в эукариотических системах, подходящий для секвенирования на секвенаторе второго поколения Roche 454 GS FLX и требующий лишь небольших количеств исходного материала.

Lai Z, Zou Y, Kane NC, Choi JH, Wang X, Rieseberg LH. Preparation of normalized cDNA libraries for 454 Titanium transcriptome sequencing. Methods Mol Biol. 2012; 888:119-33. doi: 10.1007/978-l-61779-870-2_8.

2) Патент № WO 2018048957 A2, AU 2017324946 A1 (2016) Normalization of NGS library concentration (Нормализация концентрации библиотеки NGS). Изобретение предлагает новый вариант нормализации концентрации библиотеки NGS, не зависящий от размера фрагмента. Метод представляет собой простую альтернативу количественному определению библиотеки с последующей ручной регулировкой концентрации библиотеки. Нормализация ДНК-библиотеки происходит либо в один этап, либо в несколько этапов для получения множества образцов, представленных эквимолярным количеством. Способ, требующий одного этапа, представляет собой нормализацию на основе ПЦР (N-PCR), где амплификацию каждой библиотеки NGS выполняют с использованием ограниченной концентрации праймеров для нормализации (праймеров N-PCR) с ускоренной кинетикой отжига и условиями амплификации для исчерпывающего использования праймера во время реакции ПЦР, обеспечивая тем самым указанное молярное количество каждой библиотеки NGS. А также способ, требующий нескольких этапов, представляет собой нормализацию на основе ферментов, которая включает в себя:

а. ПЦР-амплификацию до избыточного количества каждой библиотеки NGS с использованием праймеров предварительной нормализации (праймеры pre-N), которые приводят к 5'- или 3'-выступлению на одном или обоих концах либо во время ПЦР, либо после ферментативного расщепления после ПЦР, с последующим этап очистки;

б. инкубацию каждой амплифицированной библиотеки с ограниченным указанным молярным количеством нормализующего зонда (N-зонда) и, в некоторых вариантах реализации, ДНК-лигазы, при этом отжиг зонда и лигирование к 5'- или 3'-выступлению отбирает фракцию библиотеки, эквимолярную N-зонду. - зонд;

в. и в некоторых вариантах реализации выделение фракции, выбранной зондом, осуществляют ферментативным расщеплением невыбранной фракции библиотеки или ферментативно-опосредованным высвобождением фракции, выбранной зондом, из твердофазной иммобилизации.

3) Патент № ЕР 3679135 В1 (2017) NORMALIZATION FOR SEQUENCING LIBRARIES (Нормализация библиотек для секвенирования). Создание библиотек для NGS может включать процессы подготовки библиотек (например, манипуляции с ДНК, амплификация и т.д.), которые могут привносить различные отклонения в части соотношения между представленностью мишеней. Например, чрезмерно представленные целевые молекулы в библиотеке секвенирования могут привести к снижению обнаружения других целевых молекул, которые недостаточно представлены. Кроме того, количество секвенированных ридов не обязательно представляет собой прямую пропорцию молекул нуклеиновой кислоты (например, молекул ДНК), присутствующих в библиотеке (например, секвенированных в одном и том же цикле секвенирования) или в исходной смеси, что может представлять трудности при получении абсолютных количественных данных (например, точных цифр или оценок состава исходного анализируемого биологического образца и т.д.). Предложен метод обогащения и/или истощения продуктов целевых нуклеиновых кислот, основанный на нацеливании на гибридизационные зонды (например, после фрагментации, после генерации нормализованных фрагментов и т.д.).

4) Научная статья Zhulidov с соавт .(2004) «Простая нормализация кДНК с использованием дуплекс-специфичной нуклеазы камчатского краба» описывает методику выравнивания (нормализации) разных по последовательности молекул кДНК на основе дуплекс-специфичной термостабильной нуклеазы камчатского краба (DSN). Предложенный метод позволяет быстро и надежно выравнивать концентрацию разных молекул кДНК, тем самым облегчая создание нормализованных, полноразмерных библиотек кДНК. Нормализация DSN включает денатурацию-реассоциацию кДНК, деградацию двухцепочечной (ds) фракции, образованной высокопредставленными транскриптами с последующей ПЦР-амплификацией о дно цепочечной (ss) фракции ДНК. Ключевым элементом этого метода является деградация фракции ds, образующейся при реассоциации кДНК с использованием дуплекс-специфичной термостабильной нуклеазы камчатского краба. Этот термостабильный фермент демонстрирует явное предпочтение расщеплению дц-ДНК и ДНК в гибридных дуплексах ДНК-РНК по сравнению с оц-ДНК и РНК, независимо от длины последовательности. Предложен протокол нормализации как для кДНК первой цепи (когда доступна поли(А)+ РНК), так и для амплифицированной кДНК (когда можно получить только тотальную РНК) [8].

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является:

5) Научная статья Matvienko с соавт.(2013), в которой предложен адаптированный метод из [8], использующий дуплекс-специфичную термостабильную нуклеазу камчатского краба для уменьшения количества высококопийных компонентов в транскриптомных и геномных библиотеках перед секвенированием. Это сокращает время, стоимость и вычислительные затраты на получение информативных данных о транскриптомных и геномных последовательностях как для полностью секвенированных, так и для несеквенированных геномов. Метод также снижает загрязнение ДНК органелл в препаратах ядерной ДНК. Гибридизация в присутствии 3М хлорида тетраметиламмония (ТМАС), выравнивающего скорости гибридизации пар нуклеотидов GC и AT, уменьшала систематическую ошибку в отношении последовательностей с высоким содержанием GC. О последствиях этого метода для уменьшения высококопийных и обогащения низкокопийных последовательностей сообщается для растений арабидопсиса и салата [9].

Изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, клинико-лабораторной диагностики, молекулярной биологии, геномики и генетики, в частности к способам выполнения ферментативной реакции с использованием молекулярно-генетических технологий, способам получения библиотек фрагментов нуклеиновых кислот из двухцепочечной нуклеиновой кислоты для последующего определения последовательности фрагментов ДНК методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения, к способам процессинга молекул нуклеиновых кислот в библиотеки нуклеиновых кислот с использованием фрагментирования, гибридизации и амплификации, отличающееся тем, что в процессе обогащения при проведении гибридизации используют добавление дополнительной порции ДНК человека, заранее обогащенной повторяющимися последовательностями ДНК, такими как члены семейства Alu и Kpn.

Такая заранее обогащенная повторяющимися последовательностями ДНК коммерчески доступна и выпускается рядом производителей. В частности, ДНК человека Cot-1 (Invitrogen, номер по каталогу: 15279011) представляет собой плацентарную ДНК размером преимущественно от 50 до 300 п.о., обогащенную повторяющимися последовательностями ДНК, такими как члены семейства Alu и Kpn и обычно используется для блокирования неспецифической гибридизации при скрининге на микрочипах. Его также можно использовать для подавления повторяющихся последовательностей ДНК для прямого картирования ДНК человека или картирования геномных клонов на панелях гибридов соматических клеток для локализации хромосом с помощью Саузерн-блоттинга. ДНК человека Cot-1 эффективна в качестве зонда для скрининга библиотек гибридных библиотек соматических клеток и библиотек хромосом с проточной сортировкой, полученных из гибридов соматических клеток.

Предлагаемую генетическую технологию можно применять для различных видов эукариотических организмов, включая лабораторных и сельскохозяйственных растений, животных, а также человека.

Суть изобретения

Изобретение относится к способам выполнения ферментативной реакции с использованием молекулярно-генетических технологий, способам получения библиотек фрагментов нуклеиновых кислот из двухцепочечной нуклеиновой кислоты для последующего определения последовательности фрагментов ДНК методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения, к способам процессинга молекул нуклеиновых кислот в библиотеки нуклеиновых кислот с использованием фрагментирования, гибридизации и амплификации.

Представленный в настоящем документе способ основан на ферментативном разрушении ДНК-дуплексов, образованных вследствие реассоциации денатурированных молекул, для чего используют дуплекс-специфичную термостабильную нуклеазу камчатского краба, при этом эффективность способа обеспечивается добавлением в реакцию дополнительной порции ДНК человека, заранее обогащенной повторяющимися последовательностями ДНК, такими как члены семейства Alu и Kpn.

Представленный в настоящем документе способ можно применять, например, для создания библиотек фрагментов нуклеиновых кислот (например, ДНК) для применения, например, в способах высокопроизводительного секвенирования второго поколения и т.п. В некоторых вариантах осуществления настоящая заявка относится к получению фрагментов ДНК из целевой ДНК, содержащей двуцепочечную геномную ДНК человека для полноэкзомного анализа.

Осуществление изобретения

На старте методики можно использовать любую геномную ДНК человека, очищенную по стандартной методике, соответствующей исходному биологическому материалу. Например, для крови можно использовать набор реагентов Проба-ГС (ДНК-Технология, Россия).

1. Предварительно очищенную геномную ДНК человека фрагментируют с помощью ультразвукового процессора (например, Covaris или Cole-Parmer СР750) в течение 20 циклов по 3 сек с интервалами 10 сек между циклами до средней длины 500 т.п.о. (диапазон длин ДНК 200-750 т.п.н.).

2. Фрагментированную ДНК очищают методом фенольно-хлороформной экстракции, осаждают этанолом и растворяют 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0) до конечной концентрации 1 мкг/мкл.

3. Аликвоту объемом 1 мкл обрабатывают ДНК-полимеразой Т4 (Fermentas, Канада) в соответствии с инструкцией производителя для создания тупых концов (так называемая «полировка» концов).

4. ДНК снова очищают методом фенольно-хлороформной экстракции, осаждают этанолом и растворяют 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0) до конечной концентрации ДНК 100 нг/мкл.

5. 5'-концы фрагментов ДНК фосфорилируют путем инкубации 8 мкл образца ДНК с 1 мкл 10-кратного лигазного буфера, riboATP (конечная концентрация 3 мМ) и 0,7 мкл полинуклеотидкиназы Т4 (5 ед./мкл) при 37°С в течение 15 мин с последующей тепловой инактивацией фермента при 60°С в течение 20 мин.

6. Фосфорилированную ДНК лигируют с адаптером последовательности 5'-GGT CGC GGC CGA GGT-3' и амплифицируют в ПЦР с соответствующим адаптеру праймером (4 нг матрицы на 100 мкл реакционной смеси для ПЦР). После предварительного нагревания при 72°С в течение 2 мин проводят 14 циклов ПЦР в режиме: 95°С - 7 с, 62°С - 20 с и 72°С - 1 мин.

8. Продукты ПЦР переосаждают этанолом и разводят водой mQ до конечной концентрации ДНК 75 нг/мкл.

9. Аликвоту, содержащую ~ 150 нг ДНК объединяют с 1 мкг обогащенной повторами ДНК человека (например, Human Cot-1 DNA, Invitrogen, номер по каталогу: 15279011) в 1× гибридизационном буфере.

10. Реакционные смеси покрывают минеральным маслом, чтобы избежать испарения воды, и денатурируют при 98°С в течение 3 мин.

11. Затем смеси инкубируют для ренатурации (гибридизации) ДНК при 68°С в течение 5 ч.

12. После инкубации к реакционной смеси добавляют 5 мкл 2 × DSN-буфера, предварительно нагретого до 70°С.

13. Далее в реакцию добавляют 1 мкл раствора Par_DSN (1 ед. Куница/мкл) и продолжают инкубацию в течение 20 мин при 65°С.

14. Реакцию останавливают добавлением 10 мкл 5 мМ ЭДТА и разводят в 20 мкл воды.

15. Аликвоты нормализованной одноцепочечной ДНК объемом 5 мкл амплифицируют в пяти реакционных смесях с праймером, комплементарным адаптерам, в общем реакционном объеме 50 мкл в следующем режиме: 95°С - 7 с, 62°С - 20 с и 72°С - 1 мин.

16. Продукты ПЦР переосаждают этанолом и растворяют водой mQ до конечной концентрации ДНК 50 нг/мкл. Полученная смесь фрагментов ДНК готова для приготовления библиотек ДНК для NGS по любой стандартной методике, например, из [10].

Ссылки на использованные источники

1. Graur D (July 2017). An Upper Limit on the Functional Fraction of the Human Genome. Genome Biology and Evolution. 9 (7): 1880-1885. doi:10.1093/gbe/evx121.

2. Biscotti, M.A., Olmo, E. & Heslop-Harrison, J.S. Repetitive DNA in eukaryotic genomes. Chromosome Res 23, 415-420 (2015). https://doi.org/10.1007/s10577-015-9499-z.

3. Duitama J, Zablotskaya A, Gemayel R, Jansen A, Belet S, Vermeesch JR, Verstrepen KJ, Froyen G (2014). Large-scale analysis of tandem repeat variability in the human genome. Nucleic Acids Research. 42 (9): 5728-5741. doi:10.1093/nar/gku212.

4. Muramatsu M., Repeated sequences of DNA in eukaryotes - analysis of reassociation kinetics by so-called "cot curve". Tanpakushitsu Kakusan Koso. 1972 Jul;17(7):509-24.

5. Britten RJ, Davidson EH. Studies on nucleic acid reassociation kinetics: empirical equations describing DNA reassociation. Proc Natl Acad Sci USA. 1976 Feb;73(2):415-9. doi: 10.1073/pnas.73.2.415.

6. Verneau O, Renaud F, Catzeflis FM. DNA reassociation kinetics and genome complexity of a fish (Psetta maxima: Teleostei) and its gut parasite (Bothriocephalus gregarius: Cestoda). Comp Biochem Physiol B. 1991;99(4):883-6. doi: 10.1016/0305-0491(91)90158-a.

7. Rebrikov D.V., Desai S.M., Siebert P.D., Lukyanov S.A. Suppression subtractive hybridization // Methods Mol. Biol. - 2004. - Vol. 258. - P. 107-134.

8. Zhulidov PA, Bogdanova EA, Shcheglov AS, Vagner LL, Khaspekov GL, Kozhemyako VB, Matz MV, Meleshkevitch E, Moroz LL, Lukyanov SA, Shagin DA. Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease. Nucleic Acids Res. 2004 Feb 18;32(3):e37. doi: 10.1093/nar/gnh031.

9. Matvienko M, Kozik A, Froenicke L, Lavelle D, Martineau B, Perroud B, Michelmore R. Consequences of normalizing transcriptomic and genomic libraries of plant genomes using a duplex-specific nuclease and tetramethylammonium chloride. PLoS One. 2013;8(2):e55913. doi: 10.1371/journal.pone.0055913.

10. Belova V, Shmitko A, Pavlova A, Afasizhev R, Cheranev V, Tabanakova A, Ponikarovskaya N, Rebrikov D, Korostin D. Performance comparison of Agilent new Sure Select All Exon v8 probes with v7 probes for exome sequencing. BMC Genomics. 2022 Aug 12;23(1):582. doi: 10.1186/s12864-022-08825-w. PMID: 35962321; PMCID: PMC9375261.

Изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, клинико-лабораторной диагностики, молекулярной биологии, геномики и генетики и представляет собой способ обогащения библиотеки фрагментов ДНК для последующего секвенирования методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения (NGS) белок-кодирующими последовательностями с использованием дуплекс-специфичной термостабильной нуклеазы камчатского краба. При этом при гибридизации используют добавление дополнительной порции ДНК человека, заранее обогащенной повторяющимися последовательностями ДНК, включающими члены семейства Alu и Kpn. Изобретение позволяет повысить эффективность секвенирования.

Способ обогащения библиотеки фрагментов ДНК для последующего секвенирования методом высокопроизводительного секвенирования второго поколения (NGS) белок-кодирующими последовательностями с использованием дуплекс-специфичной термостабильной нуклеазы камчатского краба, отличающийся тем, что при гибридизации используют добавление дополнительной порции ДНК человека, заранее обогащенной повторяющимися последовательностями ДНК, включающими члены семейства Alu и Kpn, для чего:

а) предварительно очищенную геномную ДНК человека фрагментируют с помощью ультразвукового процессора в течение 20 циклов по 3 с с интервалами 10 с между циклами до средней длины 500 т.п.о.;

б) полученную фрагментированную ДНК очищают методом фенольно-хлороформной экстракции, осаждают этанолом и растворяют 20 мМ Трис-HCl с рН 8,0 до получения аликвоты конечной концентрации 1 мкг/мкл, которую объемом 1 мкл обрабатывают для создания тупых концов ДНК-полимеразой Т4; после чего

в) ДНК снова очищают методом фенольно-хлороформной экстракции, осаждают этанолом и растворяют 20 мМ Трис-HCl с рН 8,0 до конечной концентрации ДНК 100 нг/мкл; далее

г) 5´-концы фрагментов ДНК фосфорилируют путем инкубации 8 мкл образца ДНК с 1 мкл 10-кратного лигазного буфера, riboATP с конечной концентрацией 3 мМ и 0,7 мкл полинуклеотидкиназы Т4 с концентрацией 5 ед./мкл при 37°С в течение 15 мин с последующей тепловой инактивацией фермента при 60°С в течение 20 мин; после чего

д) фосфорилированную ДНК лигируют с адаптером последовательности 5´-GGT CGC GGC CGA GGT-3´ и амплифицируют в ПЦР с соответствующим адаптеру праймером, причем 4 нг матрицы используют на 100 мкл реакционной смеси для ПЦР по программе предварительного нагревания при 72°С в течение 2 мин и 14 циклов ПЦР в режиме: 95°С - 7 с, 62°С - 20 с и 72°С - 1 мин; далее

е) продукты ПЦР переосаждают этанолом и разводят водой mQ до конечной концентрации ДНК 75 нг/мкл; после чего

ж) аликвоту, содержащую 150 нг ДНК объединяют с 1 мкг обогащенной повторами ДНК человека в 1-кратном гибридизационном буфере; далее

з) реакционные смеси покрывают минеральным маслом и денатурируют при 98°С в течение 3 мин; затем

и) смеси инкубируют для ренатурации (гибридизации) ДНК при 68°С в течение 5 ч; после чего

к) к реакционной смеси добавляют 5 мкл 2-кратного DSN-буфера, предварительно нагретого до 70°С и 1 мкл раствора Par_DSN в концентрации 1 ед. Кунитца/мкл и продолжают инкубацию в течение 20 мин при 65°С; далее

л) реакцию останавливают добавлением 10 мкл 5 мМ ЭДТА и разводят в 20 мкл воды; после чего

м) аликвоты нормализованной одноцепочечной ДНК объемом 5 мкл амплифицируют в пяти реакционных смесях с праймером, комплементарным адаптерам, в общем реакционном объеме 50 мкл в следующем режиме: 95°С - 7 с, 62°С - 20 с и 72°С - 1 мин; затем

н) продукты ПЦР переосаждают этанолом и растворяют водой mQ до конечной концентрации ДНК 50 нг/мкл с получением конечного продукта библиотеки фрагментов ДНК для последующего секвенирования.