Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки Illumina для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования ДНК на платформах технологии DNBSEQ фирмы MGI, которые до этого были приготовлены для секвенирования на инструментах фирмы Illumina.

Высокопроизводительное секвенирование (NGS) требует подготовки т.н. NGS библиотеки - фрагментов ДНК типичной длины 200-500 п.н. исследуемого генома, фланкированных определенными

последовательностями (адаптерами). Это относится к наиболее востребованным методам секвенирования короткой длины прочтения: секвенирование синтезом, используемое в инструментах Illumina (регистрация каждого присоединенного нуклеотида по временной метке) (Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. Bentley et al., 2008 Nov 6;456(7218):53-9); секвенирование лигированием (принцип комплементарности цепей ДНК), используемое в инструменте SOLiD Life Technologies Thermo Fisher Scientific (Massively parallel signature sequencing. Methods Mol Biol. Zhou et al., 2006. 331:285-311), а также в более новых инструментах MGI (cPAS-based sequencing on the BGISEQ-500 to explore small non-coding RNAs. Clinical Epigenetics. Fehlmann et al., 2016 November 21; 8,123).

Само приготовление библиотек имеет общий порядок действий, не зависит от технологии секвенирования, однако последний шаг до непосредственного считывания нуклеотидных последовательностей прибором, называемый подготовкой NGS-библиотеки к секвенированию, производится по-разному в зависимости от технологии секвенирования.

В платформах Illumina библиотеку денатурируют в растворе щелочи, после чего наносят на подложку проточной ячейки, в которой происходит секвенирование. На подложке каждая молекула копируется множество раз (амплифицируется) в т.н. кластеры, с которых потом происходит считывание флуоресцентного сигнала в ходе секвенирования (WO1998044151 (А1), GLAXO GROUP LTD et al., 08.10.1998).

В платформе DNBSEQ фирмы MGI, библиотеку также подвергают множественному копированию для формирования похожих на кластеры повторяющихся последовательностей каждой молекулы NGS библиотеки: это происходит в ходе репликации по типу катящегося кольца Rolling Circle Amplification (RCA). Получающиеся ДНК молекулы являются множественными копиями фрагментов библиотеки, они наносятся на проточную ячейку, и они являются источником флуоресцентного сигнала в ходе секвенирования. Для осуществления RCA необходимо иметь фрагменты NGS библиотеки в кольцевом виде, т.е. соединить два конца каждого одноцепочечного фрагмента ДНК библиотеки в непрерывную молекулу ДНК. Так как изначально NGS библиотека имеет линейную форму, ДНК библиотеки переводится в кольцевой вид ферментативной реакцией, производящей лигирование концов некоторой доли молекул из всего образца. Реакция называется циркуляризацией NGS-библиотеки. В зависимости от технологии этой реакции доля фрагментов образца, подвергнутого циркуляризации, может отличаться.

Известен следующий способ создания кольцевых форм библиотек для NGS (WO2007133831 (А2), COMPLETE GENOMICS INC et al., 22.11.2007). Он предлагает использовать несколько методов циркуляризации NGS-библиотеки, каждый из которых имеет недостатки. Так, первый предлагаемый метод подразумевает, что на NGS библиотеку доращивается дополнительная последовательность поли-Аденинов. Длину наращиваемого поли-А невозможно контролировать, что приводит к общей низкой эффективности циркуляризации.

Кроме того, достраиваемые фрагменты уменьшают возможность секвенирования фрагмента ДНК, относящегося непосредственно к образцу, что снижает количество данных получаемых в секвенировании в сравнении с другими методами.

Вторым методом предлагается иммобилизовать фрагменты библиотеки, что приводит к потере большого количества образца (более 90%).

В еще одном способе предлагается использовать длинный (более 40 нуклеотидов), соединяющий два конца каждого фрагмента, олигонулеотид (т.н. сплинт), что является неэффективным с точки зрения дороговизны используемого сплинт олигонуклеотида. При этом отсутствует какая-либо гибридизация сплинт олигонуклеотида с фрагментами NGS библиотеки. Это приводит к тому, что требуется большое количество NGS библиотеки, около 10 пмоль, что как минимум 10 раз превышает требования других известных методов.

Известен способ создания библиотек в кольцевой форме, используемый самой компанией MGI (ЕР3192877 (A1), BGI SHENZHEN СО LTD, 19.07.2017). Метод описывает процесс перевода NGS библиотеки в кольцевую форму как часть процесса создания NGS библиотеки из стартового материала РНК. В данном способе эффективность циркуляризации не превышает 15% и, как следствие, требуется сравнительно большое для NGS секвенирования (около 400 нг, или около 1 пмоль) количество ДНК библиотеки.

Кроме того, перед процессом циркуляризации в способе вынужденно выполняется процесс изоляции одноцепочечной ДНК (одной из двух цепей каждого фрагмента NGS библиотеки) путем иммобилизации одной из цепей на магнитных частицах. Это является дополнительным шагом, который приводит к частичной потере образца в ходе очистки на магнитных частицах.

Известен способ создания кольцевой формы NGS библиотек с помощью двойного лигирования адаптеров компании MGI (ЕР3207169 (В1), MGI TECH СО LTD, 01.07.2020). Циркуляризация в нем осуществляется в 5 этапов. Начинается процесс либо с денатурации NGS библиотеки, либо с изоляции одной из ДНК цепей каждого фрагмента NGS библиотеки. Далее, оставшиеся ДНК цепи каждого фрагмента смешиваются с сплинт-олигонуклеотидом. Сплинт имеет комплементарность к обоим концам одноцепочечного фрагмента NGS библиотеки и призван повысить эффективность замыкания ДНК фрагмента в кольцо. Далее, в реакционную смесь добавляется фермент ДНК лигаза и концы фрагмента NGS библиотеки лигируются друг с другом, переводя часть фрагментов NGS библиотеки в кольцевой вид. Далее, в раствор добавляются экзонуклеазы, деградирующие любую ДНК в некольцевой форме, т.е. те фрагменты ДНК, которые не были переведены в кольцевой вид. Наконец, идет очистка кольцевой ДНК от реакционной смеси, после которой получается очищенная от ферментов и солей NGS библиотека в кольцевой форме.

Недостатком этого метода является необходимость модифицировать одну из цепей фрагментов NGS библиотеки биотином, чтобы селективно отбирать только одну из цепей каждого фрагмента NGS библиотеки. Способ также обладает низкой эффективностью циркуляризации и необходимостью создания большого количества NGS библиотеки из большого количества исходного материала: в примерах использовалось по 3 мкг ДНК на каждую NGS библиотеку. Кроме того, метод приводит к созданию больших молекул за счет лигирования фрагментов библиотеки друг с другом, вплоть до размера 50-250 тысяч пар нуклеотидов.

Прототипом изобретения является разработанный нами ранее способ создания кольцевой формы NGS библиотек для платформы DNBSEQ (RU2746960 (С1), РНИМУ им Н.И. Пирогова, 22.04.2021), улучшающий процесс, по сравнению с другими аналогами, с точки зрения эффективности (доли фрагментов) трансформации NGS библиотеки в кольцевую форму и количества требуемого материала ДНК. Метод использует оптимизированный химический состав раствора для процесса циркуляризации и оригинальные температурные программы. Недостаток метода заключается в том, что он направлен на создание кольцевой формы только библиотек платформы DNBSEQ (фирмы MGI). Создание кольцевой формы и секвенирование на платформе DNBSEQ NGS библиотек, изначально созданных для других платформ высокопроизводительного секвенирования, в прототипе не предусмотрено.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в:

- создании возможности секвенирования образцов, существующих в виде NGS библиотек Illumina, на платформе DNBSEQ;

- снижении необходимого количества NGS библиотеки платформы Illumina на подготовку ее к секвенированию на платформах DNBSEQ путем использования оригинальных программ температурного режима.

В настоящем изобретении мы поставили целью создание кольцевой формы NGS библиотеки, созданной для платформы, отличной от DNBSEQ, а именно платформы Illumina. Данный способ позволит секвенировать на инструментах DNBSEQ образцы, которые в силу утраты изначального генетического материала, существуют только в виде NGS библиотек платформы Illumina. В ряде случаев, таких как секвенирование материала единичных клеток, эта утрата неизбежна.

Также, этот способ позволяет избежать затрат на приготовление отдельных NGS библиотек платформы DNBSEQ из исходного генетического материала в тех случаях, когда образцы уже существуют в виде NGS библиотек платформы Illumina. Приготовление геномных, экзомных, транскриптомных и других NGS библиотек может составлять более 30% от общей стоимости секвенирования образца. Секвенирование же именно на платформе DNBSEQ может стать единственным доступным выбором для исследователей в конкретном центре секвенирования.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ включает смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК. При этом NGS библиотеку, приготовленную для платформы Illumina, предварительно амплифицируют с использованием праймеров: 5'- /5Phos/AATGATACGGCGACCACCGAG-3' и 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3'. Затем смешивают со сплинт-олигонулкеотидом 5'-TCGCCGTATCATTC AAGCAGAAGACG-3'. Перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 45°С в течение 2 минут, при температуре 30°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты.

Библиотеки платформы Illumina изначально не предназначены для циркуляризации и секвенирования на платформе DNBSEQ. Для того, чтобы добиться возможности создавать кольцевую форму библиотек платформы Illumina, мы разработали процесс изменения библиотек Illumina методом ПЦР, с последующим процессом циркуляризации, использующим уникальные последовательности ДНК и температурные программы.

Способ осуществляют следующим образом.

Для перевода NGS библиотеки в кольцевую форму (циркуляризации) используются следующие расходные материалы:

Пробирки на 1,5 мл без ДНКаз;

Штативы под 1,5 мл пробирки;

Микропробирки LoBind 1,5 мл (Eppendorf) или аналоги;

96% этанол;

Носы с фильтрами 2-20, 20-300, 300-1200 μL типа Vertex (SSI) или аналоги.

AMPure ХР магнитные частицы или аналогичные им

Набор для Qubit ssDNA или аналоги

Набор для Qubit dsDNA (HS или BR) или аналоги

Сплинт олигонулеотид 5'-TCGCCGTATCATTCAAGCAGAAGACG-3'

Праймеры для ПЦР 5'-/5Phos/AATGATACGGCGACCACCGAG-3' и 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3', где 5'-/5Phos/ означает фосфатную группу в 5' конце праймера

LowTE буфер

NaCl раствор 200 мМ

Лигаза Т4 из расчета 200 ед/мкл с рабочим буфером

Exo I и Exo III нуклеазы

ЭДТА 0.5 М раствор

Exo I и Exo III нуклеазы

Набор для ПЦР с полимеразой KAPA (Kapa Biosystems) или аналог

Вода mQ качества

Лед в форме

Носы к автоматическим пипеткам выбранного производителя.

Для циркуляризации используются следующее оборудование:

Термоциклер ПЦР под 0.2 мл пробирки;

Qubit 2 + версии (Life Technologies) или аналог;

Центрифуга и Вортекс Microspin FV-2400 (Biosan) или аналог;

Автоматические пипетки Eppendorf в диапазоне объемов от 0,5 до 10 мкл, от 2 до 20 мкл, от 200 до 200 мкл, от 100 до 1000 мкл или аналоги с носами на пипетки (к ним необходимы носики с фильтрами);

Протокол проведения циркуляризации библиотек платформы Illumina заключается в следующих шагах:

1. Смешать не менее 4 нг ДНК NGS библиотеки Illumina с ПЦР смесью полимеразы КАРА согласно протоколу производителя. Объем ПЦР реакции должен составлять не менее 20 мкл. Добавить праймеры 5'-/5Phos/AATGATACGGCGACCACCGAG-3' и 5'-CAAGC AGAAGACGGCATACGAG-3' до концентрации в ПЦР смеси не менее 200 нМ.

2. Поставить ПЦР на температурную программу:

2.1. 95°С .3 минуты,

2.2.3-4 цикла:

2.2.1. 98°С 20 секунд,

2.2.2. 65°С 15 секунд,

2.2.3. 72°С 30 секунд,

2.3. 65°С 1 минута,

2.4. 72°С 3 минуты,

2.5. 4°С хранение.

3. Очистить ПЦР реакцию от ферментов и буферного раствора с помощью AMPure ХР магнитных частицы или аналога согласно протоколу производителя. Развести в mQ воде в объеме от 10 до, измерить концентрацию набором Qubit dsDNA (HS или BR) или аналогом.

4. Добавить в ПЦР пробирку нужное кол-во ДНК библиотеки (протестировано на 15-500 нг) объемом V мкл до 30 мкл.

5. Добавить 38 - V мкл (до общего объема 38 мкл) Low ТЕ буфера.

6. Добавить 2 мкл 200 мМ раствора NaCl.

7. Добавить 1 мкл 100 мкМ раствора сплинт олигонуклеотида 5'-TCGCCGTATC ATTCAAGCAGAAGACG-3'

8. Перемешать и поставить на программу гибридизации:

8.1. 95°С 2 минуты,

8.2. 45°С 2 минуты,

8.3. 30°С 2 минуты,

8.4. 4°С хранение.

9. Когда температура опустится до 4°С, переместить образцы на 4°С или на лед на не менее чем 1 минуту.

10. Сбросить капли на микроцентрифуге.

11. На льду добавить 5 мкл 10х буфера для лигирования, 4 мкл Лигазы Т4 (200 ед/мкл), перемешать пипетированием, коротко центрифугировать.

12. Поставить в термоциклер на 37°С на не менее чем 1 час.

13. Достать, сбросить капли на микроцентрифуге.

14. Добавить не менее 6 ед. Exo I и не менее 30 ед. Exo III нуклеаз, соответственно* перемешать пипетированием.

15. Поставить в термоциклер на 37°С на 30 минут.

16. Добавить 2 мкл 0.5 М раствора ЭДТА, перемешать, перенести в 1.5 пробирку.

17. Добавить 120 мкл магнитных частиц (AMPure ХР или аналог).

18.10 минут инкубации на комнатной температуре, поставить на магнитный штатив, отобрать супернатант

19.2 раза промыть 200 мкл 80% этанола на магнитном штативе, отобрать этанол, высушить в течение 5 минут с открытой крышкой.

20. Добавить 20 мкл mQ воды, перемешать, инкубировать 10 минут на столе.

21. Перенести на магнитный штатив, отобрать 18 мкл супернатанта, перенести в новую пробирку.

22. Измерить концентрацию с помощью набора Qubit ssDNA, в зависимости от количества библиотеки в реакции, взять 2 мкл или более.

23. Посчитать соотношение общего количества одноцепочечной ДНК к изначальному количеству добавленной библиотеки в нг. Нормальным выходом является показатель выше 15%. Пример.

В таблице приведены результаты циркуляризации методом, описанным в предлагаемом способе (предлаг. цирк.).

Приведены: количество ДНК NGS библиотек, приготовленных для платформы Illumina, измененных согласно пп. 1-3 протокола проведения циркуляризации, и добавленных в реакцию для их перевода в кольцевую форму (вход, нг); кол-во кольцевой формы ДНК NGS библиотек, полученной из добавленных, после реакции циркуляризации (выход, нг); эффективность циркуляризации, доля переведенной в кольцевую форму ДНК, измеренной в процентах. Видно, что в каждом образце эффективность циркуляризации, сделанной в соответствии с предлагаемым способом, соответствует уровню прототипа. Т.к. в примере были использованы NGS библиотеки платформы Illumina, циркуляризация способом, описанным в прототипе, приведет к эффективности циркуляризации таких образцов 0%.

Таким образом, представленные данные подтверждают возможность создания кольцевой формы библиотек, созданных изначально для платформы Illumina.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ, включающий смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК. При этом NGS библиотеку, приготовленную для платформы Illumina, предварительно амплифицируют с использованием праймеров: 5'-/5Phos/AATGATACGGCGACCACCGAG-3' и 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3'. Затем смешивают со сплинт-олигонулкеотидом 5'-TCGCCGTATCATTCAAGC AGAAGAGG-3'. Перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 45°С в течение 2 минут, при температуре 30°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты. Технический результат заключается в создании возможности секвенирования образцов, существующих в виде NGS библиотек Illumina, на платформе DNBSEQ; снижении необходимого количества NGS библиотеки платформы Illumina на подготовку ее к секвенированию на платформах DNBSEQ путем использования оригинальных программ температурного режима. 1 табл., 1 пр.

Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ, включающий смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК, отличающийся тем, что NGS библиотеку, приготовленную для платформы Illumina, предварительно амплифицируют с использованием праймеров: 5'-/5Phos/AATGATACGGCGACCACCGAG-3' и 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3'; затем смешивают со сплинт-олигонулкеотидом 5'-TCGCCGTATCATTCAAGCAGAAGACG-3'; а перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 45°С в течение 2 минут, при температуре 30°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты.